Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор . 13
1.1. Некоторые аспекты амилоидогенеза при болезни Альцгеймера 13
1.2. Нейромедиаторные системы и их роль в нейропатологии . 18
1.2.1. Ацетилхолинергическая нейромедиаторная система 18
1.2.2. Глутаматергическая нейромедиаторная система 19
1.2.3. Серотонинергическая нейромедиаторная система 21
1.3. Терапия болезни Альцгеймера 22
1.3.1. Холинергическая терапия . 23
1.3.2. Модуляторы глутаматергической системы 26
1.3.3. Терапия ноотропными препаратами 27
1.3.4. Противовоспалительная и гормональная терапия 29
1.3.5. Антиамилоидная стратегия терапии 30
1.4. Биологическая активность среди производных карбазола . 31
1.4.1. Противоопухолевая и антиканцерогенная активности 31
1.4.2. Противомикробная активность 34
1.4.3. Противовоспалительная активность 35
1.4.4. Нейропротекторная активность 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Материалы исследования . 41
2.1.1. Экспериментальные животные 41
2.1.2. Материалы для in vitro исследований 42
2.2. Исследуемые соединения 42
2.3. Определение когнитивно-стимулирующих свойств фторсодержащих производных тетрагидрокарбазолов . 52
2.3.1. Тест «Новая клетка». 52
2.3.2. Тест «Узнавание новой локализации известного объекта 53
2.3.3. Тест «Условный рефлекс пассивного избегания» 53
2.4. Изучение двигательной активности, ориентировочно-исследовательского поведения и уровня ситуативной тревожности животных в тесте «Открытое поле» 54
2.5. Определение острой токсичности исследуемых соединений 55
2.6. Изучение влияния соединений на глутаматные NMDA-рецепторы 55
2.7. Определение концентрации белка по методу Лоури. 57
2.8. Изучение действия химических соединений на каталитическую активность моноаминоксидазы формы А и В 57
2.9. Исследование ингибиторной активности соединений к ацетилхолинэстеразе и бутирилхолинэстеразе 58
2.10. Определение интенсивности перекисного окисления липидов 59
2.11. Определение антирадикальной активности соединений методом хемилюминесценции. 60
2.12. Исследование мембранотропной активности изучаемых соединений 62
2.12.1. Приготовление суспензии фосфатидилхолиновых липосом 62
2.12.2. Исследование мембранотропности исследуемых соединений по регистрации тушения флуоресценции зондов 63
2.13. Исследование нейропротекторного действия изучаемых веществ на трансгенных животных 5xFAD с моделью болезни Альцгеймера. 63
2.13.1. Генотипирование трансгенных животных. 63
2.13.2. Гистологические методы исследований 65
2.13.2.1. Взятие мозга, фиксация и приготовление срезов 65
2.13.2.2. Окраска срезов и подсчет амилоидных бляшек 65
2.14. Статистический анализ.. 66
Глава 3. Результаты и обсуждение 67
3.1. Исследование когнитивно-стимулирующей активности новых фторсодержащих производных тетрагидрокарбазолов 67
3.1.1. Изучение влияния новых фторсодержащих производных тетрагидрокарбазолов на ориентировочное поведение животных в тесте «Новая клетка» 67
3.1.2. Исследование когнитивно-стимулирующего действия фторсодержащих производных тетерагидрокарбалозов на аутбредных мышах CD1 в тесте «Узнавание новой локализации известного объекта» 71
3.1.3. Изучение влияния исследуемых соединений на гиппокамп-зависимую память аутбредных мышей CD1 в тесте «Условный рефлекс пассивного избегания» 75
3.1.4. Оценка влияния исследуемых соединений на двигательную активность, уровень ситуативной тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение аутбредных мышей CD1 в тесте «Открытое поле» 77
3.2. Сравнительная оценка терапевтической эффективности исследуемых соединений-лидеров с препаратами сравнения мемантином и димебоном в тестах «Узнавание новой локализации известного объекта» и «Открытое поле». 82
3.3. Определение основных параметров острой токсичности соединений СА-7043х и СА-7050х 86
3.4. Исследование возможных механизмов действия соединений СА-7043х и СА-7050х 90 3.4.1. Изучение ингибиторной активности соединений СА-7043х и СА-7050х в отношении ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы 90
3.4.2.Изучение влияния исследуемых соединений на связывание с NMDA подтипом глутаматных рецепторов 92
3.4.3. Изучение влияния СА-7043х и СА-7050х на процесс перекисного окисления липидов и тушения свободных радикалов 95
3.4.4. Изучение влияния соединений CA7043x и CA7050x на каталитическую активность МАО-В и МАО-А 99
3.4.5. Изучение взаимодействия соединений СА-7043х и СА-7050х с фосфолипидной мембраной 102
3.5. Исследование нейротропного действия СА-7043х и СА-7050х на трансгенных животных 5хFAD 106
3.5.1. Оценка влияния исследуемых производных на трансгенных мышах при однократном введении 106
3.5.1.1. Изучение влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на угашение ориентировочной активности трансгенных мышей 5хFAD в тесте «Новая клетка» 106
3.5.1.2. Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на гиппокамп-зависимую память трансгенных мышей 5хFAD в тесте «Узнавание новой локализации известного объекта» 108
3.5.1.3. Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на двигательную активность, уровень ситуативной тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение трансгенных мышей 5xFAD в тесте «Открытое поле» 109
3.5.2. Изучение влияния многократного введения исследуемых соединений СА-7043х и СА-7050х на поведение трансгенных животных 5хFAD 111
3.5.2.1. Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на гиппокамп-зависимую память мышей 5хFAD в тесте «Узнавание новой локализации известного объекта» 112
3.5.2.2. Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на двигательную активность, уровень ситуативной тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение трансгенных мышей 5xFAD в тесте «Открытое поле» 113
3.5.2.3. Изучение влияния соединений СА-7043х и СА-7050х при многократном введении на изменение массы тела трансгенных животных 5xFAD 118
3.5.2.4. Изучение влияния соединений СА-7043х и СА-7050х при многократном введении на образовние амилоидных бляшек в гиппокампе и коре головного мозга трансгенных животных 5xFAD 120
Заключение 122
Выводы 123
Практические рекомендации 124
Список литературы 125
- Некоторые аспекты амилоидогенеза при болезни Альцгеймера
- Изучение влияния соединений на глутаматные NMDA-рецепторы
- Изучение влияния СА-7043х и СА-7050х на процесс перекисного окисления липидов и тушения свободных радикалов
- Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на двигательную активность, уровень ситуативной тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение трансгенных мышей 5xFAD в тесте «Открытое поле»
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время нейродегенеративные заболевания, наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями, являются серьезной медико-социальной проблемой. Самой распространенной среди нейродегенеративных заболеваний считается болезнь Альцгеймера (БА). Во всем мире насчитывается 47,5 миллиона людей с деменцией и ежегодно происходит увеличение на 7,7 миллиона новых случаев. По прогнозам, общее число людей с деменцией составит 75,6 миллиона человек в 2030 году и почти утроится к 2050 году и составит 135,5 миллиона. (ВОЗ, информационный бюллетень, № 362, март 2015). Эпидемиологические данные показывают, что распространенность БА увеличивается с возрастом и удваивается каждые 5 лет после достижения 65 летнего возраста (Mancuso С, Siciliano R., Barone Е., Butterfield D. A., Preziosi P. 2011. V. 20(9). P. 1243-1261). В клинической практике используют всего 4 лекарственных средства для лечения БА, три из которых ингибиторы холинэстеразы (ривастигмин, галантамин, донепезил) и четвертый - модулятор глутаматергической системы, антагонист NMDA-рецепторов (мемантин). Эти препараты симптоматического лечения, поэтому в настоящее время ведется интенсивная разработка новых препаратов.
Степень разработанности проблемы. Поиск стимуляторов когнитивной функции осуществляется среди различных классов химических соединений. Одними из перспективных и широко изучаемых соединений, обладающих когнитивно-стимулирующей активностью, являются вещества, содержащие в молекуле индольный остов: производные карболина (Peters О. М., Connor-Robson N., Sokolov V. В., Aksinenko A. Yu., Kukharsky М. S., Bachurin S. О., Ninkina N. N., Buchman V. L. 2013. 33(4). P. 1041-1049), карбазола (Zhu D. Q., Chen M. H., Li M., Luo B. L., Zhao Y., Huang P., Xue F. Т., Rapposelli S., Pi R. В., Wen S. J. 2013. 68. P. 81-88), тетрагидрокарбазолов (Бачурин С.О., Соколов В.Б., Аксиненко А.Ю., Епишина Т.А., Горева Т.В., Габрельян А.В., Григорьев В.В. Известия академии наук. Серия химическая. 2015. 6. С. 1354-1361). Важным моментом при синтезе нейроактивных веществ является правильно выбранные фармакофоры. Известно, что введение атома фтора в биологически активные соединения с нейротропной активностью (Wilcken R. , , , 2013. 56. P. 1363-1388) вызывает улучшение их проницаемости (Muller К., Faeh С, Diederich F. Science. 2007. 317. P. 1881-1886), метаболической стабильности (Purser S., Moore P. R, Swallow S., Gouverneur V. 2008. 37. P. 320-330), повышение сродства связывания с белком-мишенью (Schweizer Е.; Hoffmann-Roder A.; Scharer К.; Olsen J. A.; Fah С; Seiler P.; Obst-Sander U.; Wagner В.; Kansy M.; Diederich F. Chem Med Chem. 2006. 1. P. 611-621).
Таким образом, интерес представляет изучение производных тетрагидрокарбазолов, имеющих в своем скелете атом фтора, в качестве потенциальных когнитивных стимуляторов.
Цель и задачи исследования.
Целью работы является поиск когнитивных стимуляторов среди производных фторсодержащих тетрагидрокарбазолов, с определением их возможных механизмов действия.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Провести в тестах «Новая клетка», «Узнавание новой локализации
известного объекта», «Условный рефлекс пассивного избегания»
фармакологический скрининг вновь синтезированных производных
фторсодержащих тетрагидрокарбазолов на выявление у них когнитивно-
стимулирующих свойств.
-
Определить класс токсичности соединений СА-7043х и СА-7050х.
-
Исследовать способность фторсодержащих производных связываться с фенциклидиновым сайтом NMDA рецепторов глутаматергической системы нейронов головного мозга.
-
Исследовать влияние соединений СА-7043х и СА-7050х в условиях in vitro на уровень перекисного окисления липидов, каталитическую активность моноаминоксидазы - А и -В, ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы и их мембранотропность.
5. Изучить действие соединений СА-7043х и СА-7050х на когнитивную
функцию и на агрегацию бета-амилоидного пептида у трансгенных мышей
5хFAD после многократного введения веществ.
Научная новизна работы.
В ходе скрининга новых производных фторсодержащих
тетрагидрокарбазолов в тесте «Новая клетка» и «Узнавания новой локализации известного объекта» показана когнитивно-стимулирующая активность четырех соединений – СА-7043х, СА-7050х, СА-7053х и Ес-2894.
Установлено, что соединения СА-7043х и СА-7050х оказывают выраженное когнитивно-стимулирующее действие на мышей в возрасте 3 и 6 месяцев, сопоставимое с препаратами сравнения – мемантина и димебона.
Соединения СА-7043х и СА-7050х в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 относятся к третьему классу токсичности - умеренно токсичным веществам.
Установлено, что вещества СА-7043х и СА-7050х способны проникать в гидрофобные сайты фосфолипидной мембраны.
Показано ингибирующее действие в отношении моноаминоксидазы форм -А и -В соединениями СА-7050х и СА-7043х.
Выявлены антиоксидантная и антирадикальная активности веществ СА-7043х и СА-7050х.
Показано отсутствие связывания фторсодержащих производных с фенциклидиновым сайтом NMDA подтипа глутаматных рецепторов.
Установлено, что вещества СА-7050х и СА-7043х не обладают
ингибиторной способностью в отношении ацетилхолинэстеразы и
бутирилхолинэстеразы.
Соединение СА-7043х в дозе 0,01 мг/кг обладает хорошей переносимостью при хроническом воздействии на трансгенных мышей линии 5xFAD, а также способностью ингибировать процесс амилоидогенеза.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты данной работы могут быть использованы для разработки новых потенциальных лекарственных средств в качестве перспективных стимуляторов когнитивной функции, на основе изучения взаимосвязи «структура-активность».
Методология и методы исследования. Сформирована батарея
поведенческих тестов, характеризующие различные виды памяти, для
выявления когнитивно-стимулирующих свойств у вновь синтезированных
веществ. Использованные методы in vitro позволяют установить спектр
фармакодинамического действия веществ с высокой специфической
активностью, включающие оценку действия соединений на каталитическую активность моноаминоксидазы, ацетилхолинестеразы, бутирилхолинестеразы, способность связываться с NMDA рецепторами и их антирадикальную и антиоксидантную активности.
Положения, выносимые на защиту.
1. В ряду изученных 33 производных фторсодержащих
тетрагидрокарбазолов выявлены два соединения - СА-7043х и СА-7050х,
обладающие выраженными когнитивно-стимулирующими и
нейропротекторными свойствами.
2. Соединения СА-7043х и СА-7050х относятся к третьему классу
токсичности - веществам умеренно токсичным - в соответствии с ГОСТ
12.1.007-76.
-
В экспериментах in vitro показана способность соединений СА-7043х и СА-7050х ингибировать каталитическую активность МАО-В, проявлять антиоксидантную и антирадикальную активности.
-
В условиях in vivo при многократном введении СА-7043х избирательно снижает количество амилоидных отложений в гиппокампе мышей 5xFAD.
Степень достоверности результатов. Высокая достоверность
полученных результатов основана на использовании общепринятых в фармакологии поведенческих методов выявления когнитивно-стимулирующих свойств для вновь разрабатываемых лекарственных средств, достаточном объеме экспериментальных данных, а также на применении современных методов статистической обработки данных.
Апробация результатов исследования. Результаты диссертационной
работы были представлены на: IV Международной научной конференции:
«Актуальные проблемы биологической и химической экологии» 4-5 декабря
2014, г. Мытищи Московская обл., Россия; X Международном
междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Россия, 6-12 июня 2014 год; XI Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Россия, 2-12 июня 2015 год; V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологической и химической экологии», 21-23 ноября 2016, г. Мытищи, Московская обл., Россия.
Публикации. По теме работы опубликовано 7 печатных работ, 3 из которых - статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья и 3 тезиса - в сборниках докладов научных конференций.
Личный вклад автора. Автором поставлены цель и задачи работы, проведены поведенческие эксперименты на аутбредных и трансгенных мышах. Выполняла эксперименты по определению вероятных механизмов действия исследуемых соединений. Диссертант принимал непосредственное участие в обсчете и интерпретации данных, написании статей по теме диссертации и апробации результатов исследования.
Структура и объем работы. Диссертационная работа представлена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения; трех глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения; выводов; списка используемой литературы, представленного 283 источниками. Работа содержит 29 рисунков, 22 таблицы и 1 микрофографию.
Некоторые аспекты амилоидогенеза при болезни Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера (БА) – прогрессирующее нейродегенеративное заболевание и наиболее распространенный случай деменции.
Эпидемиологические данные показывают, что распространенность БА увеличивается с возрастом и удваивается каждые 5 лет после 65 лет [11, 157]. Основными нейропатологическими признаками БА являются амилоидные бляшки и нейрофибриллярные клубки (НФК), образующиеся преимущественно в гиппокампе и коре головного мозга [195, 229]. Однако, они не являются узко характерными для БА, и могут быть найдены при других нейродегенеративных заболеваниях, а также у клинически здоровых лиц.
Выделяют семейную и спорадическую формы развития БА [9]. Для семейных форм характерно аутосомно-доминантный тип наследования [17]. Семейные формы заболевания встречаются относительно редко – не более 5-10% всех случаев.
На сегодняшний момент известно, что мутации в следующих генах способствуют раннему началу семейной формы БА: белка-предшественника амилоида (APP), пресенилина 1 (PS1) и пресенилина 2 (PS2) [166]. В ходе мутаций образуется повышенное количество бета-амилоида (А) (как А1-40, так и А1-42), что приводит к апоптозу нейронов и деменции [61]. Известно также, что в возникновении поздней семейной и спорадической форм БА участвует аллель 4 гена аполипопротеина Е (АпоЕ). Ген АРР располагается на 21-й хромосоме [17], ген PS1 - на 14-й хромосоме, ген PS2 - на 1-й хромосоме [103], а ген АпоЕ - на 19-й хромосоме [11].
АпоЕ - главный носитель холестерина в мозге, который участвует в восстановлении нейронов. ApoE связывается с рецепторами на клеточной поверхности, которые участвуют в передаче и транспорте липидов, метаболизме глюкозы, нейрональной передаче и митохондриальной функции. В норме АпоЕ связывается с А и участвует в его выведении [68].
Существуют три основные формы гена АпоЕ, которые называют 2, 3 и 4 аллели. Среди пациентов с БА наиболее часто встречается аллель - 4 [68]. Существует мнение, что аллель 2 защищает от БА, так как распространенность этого аллеля значительно ниже у людей с деменцией [147]. Более того, аллели 2 и 3 могут поддерживать восстановление нейронов [155].
АРР является интегральным мембранным белком I типа [104]. Выделяют 8 изоформ APP, три из которых - APP695, APP751, и APP770 - наиболее распространены, причем APP695 в основном находится в нейронах, а APP751 и APP770 – повсеместно в организме. APP синтезируется в эндоплазматическом ретикулюме (ЭПР) и переносится к транспортной сети аппарата Гольджи (АГ), где находится его самая высокая концентрация в нейронах. АРР участвует в росте нейритов и синаптогенезе, нейрональном транспорте белка, трансдукции трансмембранного сигнала, клеточной адгезии и метаболизме кальция.
APP может расщепляться -секретазой, которая является цинковой металлопротеиназой. Некоторые члены семейства ADAM (a disintegrin and metalloproteinase) обладают секретазно-подобной активностью, три из которых выступают в качестве -секретазы: ADAM9, ADAM10 и ADAM17. При расщеплении АРР -секретазой образуются N-терминальный фрагмент - sAPP и С-терминальный фрагмент - С83, при последующем расщеплении которого -секретазой образуется белок p83. -Секретаза – комплекс ферментов, который содержит PS1 или PS2, никастрин – первый тип трансмембранного гликопротеина, два трансмембранных белка - Aph-1 (anterior pharynx-defective 1) и Pen-2 [59].
Фрагмент sAPPa играет роль в нейрональной пластичности и защите от эксайтотоксичности, а также имеет нейропротекторные функции [254]. Рядом авторов показано способность sAPPa ингибировать стресс-вызванную активацию циклин-зависимой киназы 5 (CDK5) [151, 159]. Растворимая форма sAPP, участвует в контроле высвобождения глутамата, синаптотрофической функции и экспрессии нейропротекторных генов.
При расщепление АРР -секретазой (-site APP cleaving enzyme, BACE), которая является мембрано-связанной аспартильной протеазой с характеристикой трансмембранного домена 1 типа, образуются фрагменты sAPP и С99. В дальнейшем С-терминальный фрагмент подвергается последующему дополнительному расщеплению до А -секретазой [209].
На сегодняшний день известен ряд факторов, которые могут привести к расщеплению АРР по амилоидогенному пути. К числу таких факторов относятся: сдвиг рH межклеточной среды в кислую сторону, недостаточность процессов митохондриального окисления, повышение содержания свободных радикалов [35].
Считается, что аномальное расщепление АРР через амилоидогенный путь приводит к разным фрагментам, наиболее токсичным из которых является пептид А1-42. Было предположено, что А1-42 в основном отвечает за инициирование каскада событий, приводящих к нейрональной дисфункции, с последующей смертью нейрона. А1-42 способен к самоагрегации и образованию клубков нерастворимых фибрилл в головном мозге, тем самым вызывает образование сенильных или амилоидных бляшек [157]. Амилоидные бляшки имеют вид сферических образований диаметром около 0,2 мм [17], состоящих из дегенерирующих аксонов, переплетенных с видоизмененными филаментами и внеклеточными амилоидными волокнами [11]. В их состав входят также глюкозаминогликан, гепарансульфатпротеогликан, амилоид Р сыворотки, АпоЕ, 2-макроглобулин, 1-антихимотрипсин, факторы комплемента и др. [228]. Отложения A в виде сенильных бляшек происходит в экстрацеллюлярных пространствах, а также в паренхиме головного мозга и стенках сосудов мозга [120], которые вызывают разрушение синапсов и гибель нейронов в гиппокампе и неокортексе [35]. Также внутриклеточное накопление A в ЭПР или эндосомах нейронов может активировать механизм апоптоза с изменением соотношения каспазных белков и их ингибиторов, так отмечается дисбаланс про- (Bax, Bak и Bad, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk) и анти- (Bcl-2 и Bcl-xL, Bcl-w, Bfl-1, Brag-1, Mcl-1, A-l) каспазных ферментов.
Проявление нейротоксичности A бляшек может быть связано с его действием на другие системы, так, например, A приводит к избыточной активации NMDA-рецепторов возбуждающими аминокислотами с последующим увеличением входа Са2+ в клетку и развитием эксайтотоксичности [35, 163].
Предполагают, что накопление A является причиной уменьшения холинергических нейронов в базальных отделах переднего мозга у пациентов с БА [208].
A способен вызывать увеличение окислительного стресса [31]. Окислительный стресс - это нарушение баланса между биохимическими механизмами образования и элиминации активных форм кислорода (АФК) [173, 237]. Уровень АФК возрастает с увеличением возраста человека в результате снижения работы антиоксидантной системы (АОС) [16]. Окислительная активация ключевых ферментов, участвующих в синтезе аденозинтрифосфата (АТФ), несомненно, нарушает дыхание митохондрий, приводит к потере мембранного потенциала [157]. Повышенное образование АФК, в свою очередь, способствует перекисному окислению липидов (ПОЛ), повреждению ДНК нейронов. Перекисные радикалы взаимодействуют с молекулами жирных кислот, образуя высокотоксичные гидроперекиси, и новый свободный радикал. Кроме этого, стимулируемое АФК расстройство внутриклеточного метаболизма Са2+ и функции ионных каналов приводит к гиперактивации глутаматных рецепторов [85], что приводит к эксайтотоксичности. Окислительный стресс стимулирует высвобождение апоптоз-индуцирующего фактора (apoptosis inducing factor, AIF), являющийся особым митохондриальным белком, вызывающий активацию каспазы-9, и выход цитохрома c из митохондрий, которые, в свою очередь, активируют каспазу-3 и другие цитозольные ферменты апоптоза [16]. Таким образом, дисфункция митохондрий заканчивается апоптозом - программируемой клеточной смертью [210]. Окислительный стресс и воспаление характеризуются высвобождением цитокинов и реакционноспособными видами кислорода, которые, как известно, активируют ядерный фактор транскрипции NF-кВ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) [174]. NF-B представляет собой плейотропный регулятор многих клеточных сигнальных путей, обеспечивающий механизм клеток в ответ на широкий спектр стимулов, связанных с воспалением [231]. NF-B наблюдается в клетках, окружающих A бляшки [73]. Между NF-B и A бляшками происходит обратная связь, посредством которой А активирует NF-B, который, в свою очередь, регулирует образование пептидов A [74]. В физиологических условиях NF-B снижает транскрипционную активность промоторов APP, BACE1 и четырех белковых компонентов (Aph-1, Pen-2, никастрина, PS1 или PS2) -секретазы в клетках HEK293 [73].
Изучение влияния соединений на глутаматные NMDA-рецепторы
Исследование действия соединений на радиолигандное связывание с NMDA подтипом глутаматных рецепторов проводили по методу [279] в модификации. В эксперименте был использован меченный тритием МК-801 (дизоцилпин) с удельной активностью 210 Кюри/моль. Мембранный препарат для радиолигандного анализа готовили по методу [185]. Ткань гиппокампа гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера («тефлон-стекло») в соотношении 1г ткани мозга к 10 объемам буфера №2 (5 мМHEPES(Sigma-Aldrich), 4,5 мМ Трис буфера (Sigma-Aldrich), 0,32 М сахароза; рН 7,6). Гомогенат разводили буфером №2 в соотношении 1:50 и центрифугировали в роторе JA 25.15 на Avanti J-25 (Beckman Coulter, США) 10 минут при 1000g. После отбирали супернатант и центрифугировали 20 мин при 25000g. Получившийся осадок разбавляли 50-ю объемами буфера №2 и снова центрифугировали 20 мин при 8000g. Отбирали супернатант и его зыбкий надслой и центрифугировали еще 20 мин при 25000g. Полученный осадок суспендировали в буфере №3 (буфер №2 + 1 мМ Na4EDTA (Sigma); рН 7,6) и вновь центрифугировали. Такую процедуру отмывки проводили четырежды, причем при последней отмывке EDTA был исключен из состава. Конечный осадок ресуспендировали в 5 объемах буфера №2 и сохраняли в жидком азоте.
Исследуемые пробы (конечный объем 0,5 мл) подразделялись на общее связывание (250 мкл буфера №2, 50 мкл меченного лиганда и 200 мкл белковой суспензии); неспецифическое связывание (200 мкл буфера №2, 50 мкл меченного лиганда и 200 мкл белковой суспензии, 50 мкл немеченого (+)МК801) и проба с исследуемыми веществами (50 мкл вещества в концентрации от 10-4до 10-10моль/л, 200 мкл буфера №2, 50 мкл меченного МК-801 и 200 мкл белковой суспензии). Специфическое связывание рассчитывали, как разницу между общим и неспецифическим связыванием.
Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончанию инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman, England), которые предварительно были смочены в 0,3 % полиэтиленамине (Sigma) в течение 2 часов при температуре 40С. Фильтрование проводили холодным буфером №2 (по 5 мл в 1 раз): дважды обмыв каждую пробирку, а затем дважды – фильтр. Затем фильтры оставляли на воздухе до полного высыхания, после чего их переносили в сцинтилляционные флаконы, в которые добавляли по 5 мл сцинтилляционной жидкости (4 г РРО, 0.2 г РОРОР на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2800 TR (PerkinElmer, Packard, США) с эффективностью счета около 45%.
Изучение влияния СА-7043х и СА-7050х на процесс перекисного окисления липидов и тушения свободных радикалов
Литературные данные последних лет свидетельствуют о том, что при БА наряду с основными патоморфологическими признаками, такими как сенильные бляшки и нейрофибриллярные клубки, наблюдается также наличие окислительного стресса [202], который приводит к нейрональной дисфункции и гибели клеток [122]. Окислительный стресс происходит при дисбалансе между образованием и гашением свободно радикальных форм кислорода [78]. Повышенное количество АФК наблюдается при различных нейродегенеративных заболеваниях [122, 233], раке [165]. АФК вызывают свободнорадикальные реакции окисления белков, липидов, ДНК. Одним из наиболее распространенных и губительных для клеток является токсическое поражение нервной ткани конечными продуктами ПОЛ [93]. Продукты ПОЛ способны вызывать ионный дисбаланс и нарушать метаболизм, ослабляя клеточные мембраны [154]. Основными субстратами для ПОЛ являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) [272], окисление которых, в конечном итоге приводит к потере целостности мембраны путем изменения ее текучести, что в итоге вызывает инактивацию мембраносвязанных белков.
Кроме ПОЛ и образования АФК при БА наблюдаются изменения в деятельности антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза [190]. Снижение активности ферментов антиоксидантной защиты, может дополнительно увеличить уровни АФК, что способствует потере митохондриального мембранного потенциала и, в конечном счете, приводит к активации каспаз и апоптозу [46]. Таким образом, антиоксидантная стратегия при поиске препаратов от БА рассматривается как одна из перспективных и важных.
Для определения антиоксидантной активности исследуемых соединений СА-7043х и СА-7050х, мы изучили их действие на процесс ПОЛ. Оценивали изменение образования МДА, вторичного конечного продукта перекисного окисления жирных кислот, в гомогенате головного мозга крыс. МДА широко применяется в качестве маркера ПОЛ, измеряемого в результате химической реакции с ТБК [177].
Установлено, что СА-7043х в концентрации 510-4 М снижает образование МДА на 48%, а в концентрации 10-4 М – на 40%. При понижении концентрации СА-7043х до 10-5 М не наблюдалось отличий от группы контроля. Вещество СА-7050х в концентрации 10-4 М оказывает схожий эффект - ингибирует процесс образования МДА на 31% (рис. 17). Снижение МДА указывает на снижение процессов ПОЛ, тем самым можно предположить, что исследуемые соединения проявляют антиоксидантные свойства.
Для уточнения механизма антиоксидантного действия изучаемых соединений, а также в связи с тем, что активацию ПОЛ может вызывать повышенное количество свободных радикалов, мы решили изучить возможную антирадикальную активность наших соединений.
С помощью метода хемилюминесценции (по свечению хромофора люминола) оценивали способность соединений инактивировать АФК, тем самым, возможно, исследовать вероятные физиологически активные про-/и антиоксиданты. Люминол в присутствии АФК способен окисляться и образовывать люминесцирующие хромофоры [8].
На рисунке 18 показано снижение светосуммы люминола под действием соединений СА-7043х и СА-7050х в концентрации 10-4 М (на 69% и 49%, соответственно). Подобное снижение свечения люминола указывает на то, что соединения обладают антиоксидантной активностью путем дезактивирования АФК.
Таким образом, показана способность соединений ингибировать процесс ПОЛ и проявлять антирадикальную активность, тем самым изучаемые соединения обладают антиоксидантной активностью. Предположительно, один из путей снижения процесса ПОЛ является их способность тушить свободные радикалы, в результате чего тормозится цепная реакция перекисного окисления и образуется меньше продуктов окисления липидов, в частности, МДА. Способность соединений проявлять антиоксидантную активность является важной фармакодинамической характеристикой для потенциальных стимуляторов когнитивных функций, так как, понижая окислительный стресс, предотвращаются многие патологические процессы, в частности апоптоз клеток. Кроме того, известно, что окислительный стресс и АФК, в частности, связаны с главным признаком БА - бета амилоидом. Приводятся данные, что как A способен вызывать окислительный стресс, так и наоборот, дефекты в антиоксидантной системе вызывают повышенный окислительный стресс и значительно увеличивают отложение A у трансгенных мышей [184]. Кроме этого показано, что окислительный стресс снижает активность -секретазы, способствуя экспрессии и активации - и -секретаз, ферментов,участвующих в образовании А из АРР [187, 273], стимулирует путь C-Jun N-концевой киназы (JNK), являющийся главным клеточным сигнальным каскадом и обнаруженный при БА [138], который в свою очередь вызывает экспрессию BACE1 и PS1 и активацию -секретазы.
Полученные результаты опубликованы в статье: Николаева, Н. С. Влияние фторсодержащих производных тетрагидрокарбазолов на ферменты окислительного дезаминирования биогенных аминов и процесс пероксидного окисления липидов / Н. С. Николаева, Ю. В. Солдатова, А. В. Смолина, В. Б. Соколов, А. Ю. Аксиненко, Р. А.Котельникова, В. Н. Штолько, А. И. Котельников, А. С. Кинзирский // Известия академии наук. Серия химическая. - 2017. - № 5. – С. 870-874
Оценка влияния соединений СА-7043х и СА-7050х на двигательную активность, уровень ситуативной тревожности и ориентировочно-исследовательское поведение трансгенных мышей 5xFAD в тесте «Открытое поле»
В тесте «ОП» показано, что мыши в возрасте 3 месяцев в группе 5xFAD, совершают достоверно меньше количество вертикальных стоек и заглядываний в отверстия относительно WT (р 0,05) (табл. 20), что указывает на снижение ориентировочно-исследовательского поведения животных. Эти данные согласуется с работой Шнайдера [226], в которой показана тенденция к снижению ориентировочной активности у трансгенных мышей 5xFAD в возрасте 3-х и 6 месяцев.
Под действием вещества СА-7043х у мышей наблюдается увеличение числа заглядываний в отверстия и продолжительности их обследования относительно животных 5xFAD (р 0,05), что свидетельствует о поддержании исследовательской активности на уровне нетрансгенного контроля. При этом, отмечается понижение времени совершения вертикальных стоек относительно WT (р 0,05), что, вероятно, указывает на снижение ориентировочной активности (табл. 20).
В группе животных, получавших СА-7050х, не наблюдалось никаких изменений в параметрах относительно мышей в группе 5хFAD и WT (табл. 20).
Мыши, которым вводили мемантин в дозе 5 мг/кг, проходят меньшую дистанцию движения (р 0,01) и при более низкой скорости движения (р 0,01) чем животные WT (табл. 20). Это, возможно, указывает на понижение спонтанной двигательной активности под влиянием мемантина, вероятно в результате стрессовой ситуации при помещении в незнакомую остановку. Кроме этого, мыши в этой группе совершают меньшее количество вертикальных стоек (р 0,05) и находятся меньше времени в таком положении (р 0,05) относительно нетрансгенных животных, что может свидетельствовать о снижении уровня ориентировочной активности в результате возможного повышения тревожности, что и находит свое отражение и в двигательной активности. Однако, в этой группе отмечается более продолжительные по времени заглядывания в отверстия относительно 5xFAD мышей контрольной группы (р 0,01), что указывает на сохранение определенного уровня исследовательской активности, сравнимого с уровнем нетрансгенного контроля.
При тестировании животных в возрасте 6 месяцев, выявлено, что в группе 5xFAD у мышей наблюдается еще большее снижение ориентировочно-исследовательской реакции, так как животные затрачивают меньше времени при выполнении вертикальных стоек (р 0,05), а также совершают меньшее количество заглядываний в отверстия (р 0,05) относительно нетрансгенного контроля (табл. 21).
В тесте «ОП» выявлено, что у трансгенных животных уже в 3 месяца отмечается снижение ориентировочно-исследовательского поведения, которое прогрессирующе снижается к 6 месяцам. В группах с исследуемыми препаратами показано поддержание ориентирововно-исследовательской активности на уровне мышей WT и на уровне препарата сравнения мемантина. На основании двух экспериментов при однократном и многократном введении соединений трансгенным животным можно предположить о вероятном нейропротекторном действии соединений на трансгенных животных.
В группе животных, получавших мемантин в дозе 5 мг/кг, наблюдается восстановление двигательной и ориентировочной активностей до уровня нетрансгенного контроля, что вероятно, может быть из-за нейропротекторного действия препарата.
Мыши, под действием СА-7043х, затрачивали больше времени в периметре (р 0,05) установки и меньше - в центре (р 0,05) относительно нетрансгенного контроля. Кроме этого, наблюдалось снижение дистанции движения в центре «ОП» по сравнению с «дикими» мышами (р 0,05) (табл. 21).
При введении СА-7050х регистрируется понижение времени нахождения мышей в центре (р 0,05) и возрастание времени в периметре (р 0,05) установки, а также уменьшение дистанции движения в центре (р 0,05) по сравнению с WT.
Исходя из этих данных, можно сделать заключение о повышении уровня ситуативной тревожности под действием соединения. При анализе ориентировочно-исследовательского поведения, показано, что мыши совершали большее количество вертикальных стоек (р 0,01) и находились в них более длительное время относительно трансгенного контроля (р 0,01), что может свидетельствовать о поддержании ориентировочной активности животных на уровне нетрансгенного контроля (табл. 21). Тем самым, можно предположить, что нахождение животных в периметре установки все-таки связано не с повышением уровня тревожности, а с затраченным временем на совершение вертикальных стоек [22].