Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Эпилепсия (определение, эпидемиология, классификация, основные проблемы при лечении) 13
1.1.1 Определение и эпидемиология эпилепсии .13
1.1.2 Классификация, клиника и осложнения при эпилепсии 15
1.1.3 Патофизиологические механизмы эпилепсии .19
1.1.4 Нейрохимические механизмы эпилепсии 20
1.2 Основные противоэпилептические препараты 24
1.2.1 Фармакологические свойства, клиническое применение и механизмы действия противоэпилептических препаратов первой линии 24
1.3 Препараты рацетамового ряда 27
1.3.1 Клиническое применение препаратов рацетамового ряда .29
1.3.2 Нейрохимические механизмы действия препаратов рацетамового ряда 38
1.4 Фармакология кумаринов .44
2 Материалы и методы 50
2.1 Животные 50
2.2 Используемые вещества. Установки и приборы 50
2.3 Дизайн исследования 52
2.4 Методики оценки противосудорожного действия 54
2.4.1 Методика максимального электрошока 54
2.4.2 Методика антагонизма с коразолом 55
2.4.3 Метод антагонизма с пилокарпином 56
2.4.4 Метод антагонизма с пилокарпином с предварительным введением раствора хлорида лития .57
2.4.5 Метод антагонизма с тиосемикарбазидом 58
2.5 Методы оценки неврологического дефицита и острой токсичности 59
2.5.1 Метод вращающегося стержня – тест Rotarod 59
2.5.2 Метод – подтягивание на перекладине 59
2.5.3 Метод оценки острой токсичности 59
2.6 Электрофизиологические методики 59
2.6.1 ЭЭГ-исследование первично-генерализованной эпилептической активности, вызванной бемегридом 59
2.6.2 Тест создания хронического эпилептогенного очага, вызванного аппликацией кобальта 61
2.7 Методики изучения нейропсихотропныхэффектов .62
2.7.1 Тест водного лабиринта Морриса 62
2.7.2 Тест закрытого крестообразного лабиринта .64
2.7.3 Метод нормобарической гипоксии .65
2.8 Нейрохимические методы .66
2.8.1 Метод радиорецепторного связывания 66
2.8.1.1 Выделение плазматических мембран структур головного мозга с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами мозга 66
2.8.1.2 Радиолигандный анализ связывания с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами мозга крыс 68
2.8.2 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией .70
2.9 Статистическая обработка результатов .71
3 Результаты исследования .72
3.1 Изучение противосудорожных свойств в базисных тестах скрининга .72
3.1.1 Изучение противосудорожных свойств производных 4-фенилпирролидона и кумарина в тесте максимального электрошока .72
3.1.2 Изучение противосудорожных свойств производных 4-фенилпирролидона и кумарина в тесте антагонизма с коразолом .78
3.1.3 Анализ зависимости «структура-активность» .83
3.2 Расширенное изучение противосудорожных свойств производных 4-фенилпирролидона и кумарина .87
3.2.1 Исследование соединений в тесте антагонизма с пилокарпином .88
3.2.2 Исследование соединений в тесте антагонизма с пилокарпином с предварительным введением раствора хлорида лития .88
3.2.3 Исследование соединений в тесте антагонизма с тиосемикарбазидом 90
3.3 Изучение острой токсичности и способности вызывать неврологический дефицит 92
3.4 Изучение противосудорожного действия соединения ГИЖ-290 и леветирацетама на электрофизиологических моделях судорожных состояний 93
3.4.1 Исследование влияния веществ на ЭЭГ модели первично-генерализованной эпилептической активности, вызванной бемегридом .93
3.4.2 Исследованиевлияния веществ на первично- и вторично-генерализованные судороги в различных структурах мозга в условиях хронической модели очаговой (фокальной) эпилепсии, индуцированной кобальтом .98
3.5 Изучение нейропсихотропных свойств соединения ГИЖ-290 и леветирацетама 101
3.5.1 Влияние веществ на выработку и воспроизведение пространственного навыка в тесте водного лабиринта Морриса 101
3.5.2 Влияние веществ на поведение мышей линий BALB/c и С57ВL/6 в тесте закрытого крестообразного лабиринта .104
3.5.3 Противогипоксическое действие веществ в тесте нормобарической гипоксии .106
3.6 Изучение нейрохимических механизмов действия соединения ГИЖ-290 и леветирацетама 106
3.6.1 Изучение влияния ГИЖ-290 на содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в гиппокампе и коре мозга крыс 107
3.6.2 Влияние ГИЖ-290 на рецепторы ГАМК и глутамата .110
3.6.2.1 Связывание с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами ex vivo .110
3.6.2.2 Связывание с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами in vitro .115
4 Обсуждение результатов 117
Выводы 126
Практические рекомендации 127
Список литературы 128
- Нейрохимические механизмы эпилепсии
- Фармакология кумаринов
- Анализ зависимости «структура-активность»
- Связывание с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами ex vivo
Введение к работе
Актуальность исследования. Эпилепсией в мире страдает около 50 млн. человек,
что составляет 0,5-1% населения. Для лечения этого заболевания используется большое
число противоэпилептических препаратов (ПЭП), которые, однако, не всегда эффективны,
и часто оказывают значительное побочное действие, а поскольку больные принимают их
длительно и часто пожизненно, качество жизни пациентов остается
неудовлетворительным. В России, по данным клинико-эпидемиологических исследований,
доля пациентов без приступов в течение 2012 года не превышала 14%, а в среднем по
Российской Федерации 9,89%, а недостаточный контроль приступов наблюдается у 80-
95% пациентов (Гусев Е.И. и соавт. Современная эпилептология / под ред. Е.И.Гусева. А.Б.
Гехт, М.: АПКИППРО, 2011. С. 77-85). Стабильно высоким остается процент (30%)
фармакорезистентных эпилепсий (Andres-Mach, M. Pharmacol. Rep. 2011.V.63(6). P.1316-1323).
К ПЭП первой линии в настоящее время относятся вальпроаты, карбамазепин,
фенитоин, топирамат, леветирацетам. ПЭП нового поколения являются: ретигабин
(модулятор калиевых каналов), перампанел (модулятор постсинаптических АМРА-рецепторов), лакосамид (взаимодействует с Na-каналами), леветирацетам и бриварацетам (взаимодействуют с белком SV2A).
В России в настоящее время основные ПЭП закупаются за рубежом. Поиск оригинальных, отечественных, эффективных и малотоксичных препаратов для лечения эпилепсии и, в том числе, средств преодоления фармакорезистентности, остается актуальной задачей фармакологии.
Степень разработанности проблемы. В последние годы в России и за рубежом в
качестве ПЭП первой линии (наряду с вальпроатами и карбамазепином) с успехом
применяется производное фенилпирролидона - леветирацетам (ЛЕВ), механизм действия
которого связан с влиянием на синаптический везикулярный протеин SV2A в
пресинаптическом нервном окончании, который модулирует экзоцитоз
нейротрансмиттеров. (Vogl C. et al. Mol. Pharmacol., 2012. 82(2), P.199-208). ЛЕВ
используется как при монотерапии для лечения парциальных и генерализованных судорог, так и при комбинации с другими ПЭП. Преимуществами ЛЕВ является его способность преодолевать фармакорезистентость при лечении некоторых форм эпилепсии традиционными ПЭП, низкая токсичность и возможность комбинирования с другими ПЭП, благодаря уникальному механизму действия, а также применения у пациентов, находящимися на политерапии со смешанными медицинскими проблемами (заболевания печени, онкология и др.). Тем не менее, имеются экспериментальные и клинические исследования, подтверждающие несовершенство ЛЕВ как ПЭП. В частности, ЛЕВ может вызывать агггравацию эпилептических приступов и ЭпА на ЭЭГ (Холин А.А. и соавт., Российский журнал детской неврологии. 2014. Т.9. С.5-22.; Szucs А. et all . Epilepsia. 2008. V.49(7). P.1174–1179) и провоцировать когнитивные нарушения (Cramer J.A. et all. Epilepsy Behav. 2003. V.4(2). P.124–32; Mukhin К.and Pylaeva О. Russ. J. Child Neurology. 2015. V.2(10). P.38; Mula М., Drug Saf. 2007. V.30(7). P.555–567). Поиски ПЭП в ряду
пирролидонов продолжаются, и за рубежом в клиническую практику внедряются такие препараты как селетрацетам и бриварацетам.
Перспективным классом соединений для создания новых ПЭП являются также производные кумарина (Luszczki J.J. et all. Eur.J.Pharmacol. 2009a. V.607, P.107–109; Luszczki J.J. et all. Epilepsy Res. 2009b. V.85. P.293–299), отдельные представители которых проявляют противосудорожные свойства (Venugopala K.N., Rashmi V. and Odhav B. Biomed. Res.Int. 2011. V.2013, Article ID 963248, 14 pages).
В отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» с целью поиска новых ПЭП были синтезированы (к.х.н. Л.А.Жмуренко и к.х.н. Г.В.Мокровым) оригинальные производные 4-фенилпирролидона - аналоги ЛЕВ и производные кумарина, которые и были изучены в настоящем исследовании.
Цель исследования. Провести поиск соединений с противосудорожной активностью в рядах оригинальных производных 4-фенилпирролидона и кумарина.
Задачи исследования:
1. Провести изучение противосудорожных свойств производных 4-фенилпирролидона и
кумарина в базисных тестах скрининга (максимальный электрошок и антагонизм с
коразолом).
2. Исследовать закономерности зависимости между химическим строением и
противосудорожной активностью в рядах производных 4-фенилпирролидона.
3. Провести расширенное изучение противосудорожных эффектов наиболее активных
соединений: производных 4-фенилпирролидона (ГИЖ-290, ГИЖ-295, ГИЖ-296) и
кумарина (ГГМ-03) в сравнении с леветирацетамом, выбрать соединение-лидер и
исследовать его нейротоксичность и острую токсичность.
-
Исследовать действие соединения лидера ГИЖ-290 в сравнении с леветирацетамом в структурах мозга крыс на модели ЭЭГ-исследования первично-генерализованной эпилептической активности, вызванной бемегридом.
-
Исследовать особенности действия соединения ГИЖ-290 и леветирацетама на моторные проявления и Эпи-активность в структурах мозга крыс на хронической модели очаговой эпилепсии, индуцированной кобальтом.
6. Исследовать нейропсихотропные эффекты и противогипоксическое действие
соединения ГИЖ-290 в тестах водного лабиринта Морриса, закрытого крестообразного
лабиринта, нормобарической гипоксии в гермообъеме в сравнении с леветирацетамом,
пирацетамом и мексидолом.
-
Исследовать влияние соединения ГИЖ-290 на уровни аминокислот и их метаболитов в различных структурах мозга крыс.
-
Исследовать роль глутаматных и ГАМК рецепторов ионотропного и метаботропного типов в механизме реализации противосудорожного действия соединения ГИЖ-290.
Научная новизна. Впервые выявлены соединения, обладающие выраженной
противосудорожной активностью, среди новых производных 4-фенилпирролидона -
ГИЖ-290, ГИЖ-295, ГИЖ-296, и кумарина – ГГМ-03.
Анализ структура-активность показал, что наиболее существенное значение для проявления противосудорожной активности в ряду 4-фенилпирролидона имеет наличие
метильной группы в положении 6 на анилидной части молекулы и меньшее значение имеет фенильный радикал в 4-м положении пирролидонового кольца.
Отобрано соединение-лидер ГИЖ-290 (2,6-диметиланилид (2-оксо-4-
фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты), обладающее наибольшей активностью и терапевтической широтой, установлены преимущества ГИЖ-290 перед леветирацетамом. Показано, что ГИЖ-290 оказывает противосудорожный эффект в тестах антагонизма с пилокарпином, литий-пилокарпином, коразолом и максимальным электрошоком в диапазоне доз 2,5–10 мг/кг, а леветирацетам (600 мг/кг) эффективен только в тестах антагонизма с пилокарпином и литий-пилокарпином.
При ЭЭГ- исследовании на модели первично-генерализованной ЭпА, вызванной бемегридом, установлено, что ГИЖ-290 (5 мг//кг) уменьшает число Эпи-разрядов в сенсомоторной коре, а леветирацетам (500 мг/кг) не оказывает влияния на ЭпА, а на модели хронической очаговой кобальтовой эпилепсии показано, что ГИЖ-290 уменьшает число Эпи-разрядов и их длительность в гиппокампе, тогда как леветирацетам усиливает ЭпА в гипоталамусе и ипсилатеральной коре.
Установлено, что ГИЖ-290, подобно пирацетаму, в водном лабиринте Морриса улучшает обучение и воспроизведение навыка, тогда как леветирацетам не влияет на обучение и улучшает только воспроизведение навыка. В тесте закрытого крестообразного лабиринта соединение ГИЖ-290, в противоположность леветирацетаму, не усиливает тревожность.
Установлены различия в нейрохимических эффектах ГИЖ-290 и леветирацетама. Методом радиолигандного анализа ex vivo показано, что ГИЖ-290 предупреждает развивающееся при литий-пилокарпиновых судорогах снижение плотности ГАМКВ-рецепторов и не влияет на снижающиеся при судорогах показатели плотности (Bmax) для ГАМКА-, NMDA- и mGluII-рецепторов. Леветирацетам предупреждает снижение плотности NMDA- и ГАМКА-рецепторов, не и не влияет на снижающиеся при судорогах количество мест связывания ГАМКВ- и mGluII-рецепторов.
Показано, что ГИЖ-290 в дозах от 0,5 до 20 мг/кг не вызывает неврологического дефицита в тестах вращающегося стержня и подтягивания на перекладину, а в дозах 50, 100, 150 и 200 мг/кг не вызывает гибели животных через 1, 2 и 5 суток после однократного внутрибрюшинного введения.
Теоретическая и практическая значимость. В ряду производных
4-фенилпирролидона выявлено оригинальное по структуре соединение ГИЖ-290, обладающее широким спектром противосудорожных эффектов и ноотропным действием, имеющее преимущества перед его структурным аналогом - ПЭП первой линии леветирацетамом. Показано, что соединение ГИЖ-290 обладает оригинальным механизмом действия, оказывая влияние на ГАМКВ рецепторы, что расширяет представления о мишенях действия ПЭП.
Полученные в работе данные определяют перспективы поиска соединений с
противосудорожной активностью среди производных 4-фенилпирролидона и проведения
расширенных доклинических исследований соединения ГИЖ-290 в качестве
потенциального средства лечения эпилепсии.
На оригинальные соединения из ряда 4-фенилпирролидона подана заявка на патент РФ регистрационный номер 2017105413, входящий №009698, от 20.02.2017.
Методология и методы исследования. Методология исследования заключалась в комплексном анализе поведенческих, электроэнцефалографических и нейрохимических показателей, характеризующих различные стороны действия и механизмы реализации эффекта изучаемых соединений. В работе использован широкий набор современных валидизированных методов оценки противосудорожной и нейропсихотропной активности соединений, электроэнцефалографические методы изучения особенностей эпилептической активности в структурах мозга и нейрохимические методы.
Связь темы диссертации с научными планами учреждения. Диссертационная работа выполнена в рамках темы ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств».
Положения, выносимые на защиту.
1. Производные 4-фенилпирролидона и кумарина обладают противосудорожной
активностью в тестах максимального электрошока и антагонизма с коразолом,.
Противосудорожная активность производных 4-фенилпирролидона зависит от наличия
метильной группы в положении 6 на анилидной части молекулы, меньшее значение имеет
фенильный радикал в 4-м положении пирролидонового кольца.
-
Соединение ГИЖ-290 (2,5–10 мг/кг) по спектру противосудорожных эффектов и активности превосходит ЛЕВ (300-600 мг/кг), в дозах от 0,5 до 20 мг/кг не вызывает неврологического дефицита, а в дозах 50, 100, 150 и 200 мг/кг - гибели животных.
-
Соединение ГИЖ-290 имеет перед ЛЕВ ряд преимуществ: обладает отчетливым ноотропным эффектом, не усиливает ЭЭГ пароксизмальную активность и тревожность.
4. Механизмы реализации противосудорожного эффекта соединения ГИЖ-290 и
ЛЕВ различны. Соединение ГИЖ-290 оказывает влияние на ГАМКВ-рецепторы и не
влияет на ГАМКА-, NMDA- и mGluII-рецепторы, а ЛЕВ воздействует на ГАМКА и NMDA
рецепторы.
Степень достоверности. Научные положения и выводы, основаны на анализе достаточного объема экспериментальных исследований, применении современных методик оценки поведения, изучения биоэлектрической активности и нейрохимических эффектов. Для статистической обработки использовались современные методы сбора и обработки данных.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки» (2015 г.); 6-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (2015 г.); ежегодной научно-практической конференции молодых ученых ФГБОУ ДПО РМАНПО (2017 г.).
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах проведения исследования и анализа результатов: осуществлял поиск и анализ литературы
по теме диссертации, проводил экспериментальные исследования, статистическую обработку и обобщение полученных результатов, написание статей и диссертации.
Публикации: по материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 2 статьи в журнале из базы РИНЦ и 3 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации: Диссертация содержит введение, обзор
Нейрохимические механизмы эпилепсии
Нейрохимические процессы составляют неотъемлемую часть причин возникновения эпилепсии. В первую очередь это относится к нарушениям функционирования нейромедиаторных систем [37; 193]. Нарушение биохимических процессов синтеза и взаимодействия в нейромедиаторных системах ведет к патологическим изменениям уровня возбудимости нейронов.
Учитывая, что основным механизмом нейрональной возбудимости является потенциал действия, гипервозбудимое («эпилептическое») состояние нейрона может быть результатом, по разным теориям, или повышением возбуждающей синаптической нейротрансмиссии, или уменьшением тормозной синаптической нейротрансмиссии, или изменениями в вольтаж-зависимых ионных каналах, или изменением внутри- или внеклеточных концентраций ионов, приводящих к деполяризации мембраны. Гипервозбуждённое состояние («гиперсинхронизация») может также возникать в результате временной суммации потенциалов действия нескольких синхронных подпороговых возбуждающих стимулов в постсинаптических нейронах [132]. Процессы активации и ингибирования нейронов обусловлены различными механизмами, контролирующими уровень электрической активации в одной или нескольких зонах. Эти механизмы могут действовать внутри нейрона или в клеточной среде, включая другие клетки (например, соседние нейроны, глию и сосудистые эндотелиальные клетки), а также во внеклеточном пространстве.
Первые можно назвать «нейрональными» или «внутренними» причинами, а вторые «экстранейрональными» или «внешними» [70].
К нейрональным факторам относятся:
1) Тип, количество и распределение вольтаж- и лиганд-зависимых каналов. Такие каналы определяют направление, степень и скорость изменений в трансмембранном потенциале, которые, в свою очередь, определяют возникновение потенциала действия. Например, натриевые каналы являются основой быстрой деполяризации мембраны, создающей потенциал действия. Среди лиганд-зависимых каналов ГАМКА-рецепторный комплекс опосредует приток ионов хлора, которые гиперполяризуют клетку, формируя основу ингибирования нейронов, как описано выше.
2) Биохимическая модификация рецепторов. Например, фосфорилирование рецептора NMDA поднимает проницаемость для ионов Ca2+, что приводит к повышенной возбудимости.
3) Активация систем вторичных мессенджеров. Связывание норадреналина с его альфа-рецептором, например, опосредованно открывают ионотропные каналы K+, тем самым уменьшая возбудимость клеток.
4) Модулирование экспрессии генов.
Примерами экстранейрональных факторов являются:
1) Изменения концентрации внеклеточных ионов вследствие изменения объема внеклеточного пространства. Например, уменьшение внеклеточного объема приводит к увеличению внеклеточной концентрации. К+, что ведет к сопротивлению к наружному движение ионов K+, необходимого для реполяризации клетки, тем самым эффективно увеличивая возбудимость нейрона.
2) Ремоделирование синаптических контактов. Например, перемещение афферентного терминала аксонов ближе к рецептору-мишени. Клетка увеличивает вероятность того, что входящие в синапс ионные токи приведут нейрон-мишень к пороговым значениям возбуждения.
3) Модулирование метаболизма нейромедиаторов глиальными клетками. Возбудимость повышается, например, если метаболизм глиальных клеток или обратный захват нейромедиаторов, таких как глутамат или ацетилхолин, уменьшается.
Таким образом, гиперактивность систем возбуждающих аминокислот, недостаточная нейропередача, опосредованная ГАМК-рецепторами, и нарушения внутренних свойств нейрональных мембран по-прежнему рассматриваются как наиболее важные механизмы судорог [132].
Глутаматные рецепторы связывают нейромедиатор глутамат. При связывании глутамата рецепторы облегчают поток ионов натрия и кальция в клетку, в то время как ионы калия выходят из клетки, что приводит к возбуждению [161]. Все ионотропные глутаматные рецепторы проницаемы для ионов Na+ и K+, и, соотвественно, приток Na+ и отток K+ через эти каналы вносят вклад в деполяризацию мембраны и генерируют потенциал действия. NMDA-рецептор также имеет канал для ионов Ca2+, который блокируется ионами Mg2+ в состоянии покоя, но в условиях локальной деполяризации мембраны ионы Mg2+ удаляются и канал становится проницаемым для ионов Са2+. Приток дополнительных ионов Ca2+ способствует дальнейшей деполяризации клетки и, как полагают ученые, также способствует опосредуемому Ca-зависимому повреждению нейронов в условиях чрезмерной активации нейронов (таких как эпилептический статус и ишемия).
Глутамат (основной возбуждающий нейромедиатор в центральной нервной системе) связывается с несколькими сайтами рецептора, которые различаются по времени активации и времени инактивации, кинетике десенситизации, проводимости и ионной проницаемости. Три основных ионотропных подтипа рецептора глутамата представляют собой NMDA-, AMPA- и каинатный рецепторы, а также метаботропный (mGluR) [55].
Экспериментальные исследования с использованием различных моделей эпилепсии животных показали, что активация NMDA-, AMPA- и каинатных рецепторов вызывает судорожную активность, тогда как их антагонисты этих рецепторов подавляют судорожную активность. Метаботропные агонисты, по-видимому, имеют переменные эффекты, вероятно зависящие от их различного местоположения и механизмов передачи сигнала.
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) имеет два типа рецепторов: А и В. Рецепторы ГАМКА обнаруживаются постсинаптически, тогда как ГАМКB-рецепторы обнаруживаются пресинаптически, и, таким образом, могут модулировать синаптическое высвобождение нейромедиаторов. Когда ГАМК связывается с ГАМКА-рецептором, прохождение хлорида, отрицательно заряженного иона, в клетку облегчается через хлоридные каналы. Этот приток ионов хлорида увеличивает отрицательный потенциал мембраны. Это приводит к тому, что клетка испытывает большие трудности с достижением потенциала действия. ГАМКB-рецептор связан с калиевым каналом. Активация системы вторичных мессенджеров в метаботропных рецепторах, в т.ч. ГАМКB, часто приводит к открытию ионных каналов для K+, приводя к гиперполяризации мембраны.
Система ГАМК может быть усилена путем связывания непосредственно с рецепторами ГАМКА-типа, блокируя пресинаптическое поглощение ГАМК, ингибируя метаболизм ГАМК с помощью трансаминазы ГАМК и увеличивая синтез ГАМК.
ГАМК получают декарбоксилированием глутамата, опосредуемого ферментом глутаматдекарбоксилазой. Некоторые ПЭП выступают в качестве модуляторов этого фермента, усиливая производство ГАМК и фермента, расщепляющего глутамат. Другие действуют как агонисты для улучшения тока ионов Cl-, либо путем блокирования обратного захвата ГАМК (например, тиагабин), либо путем ингибирования метаболизма ГАМК, опосредованного трансаминазой ГАМК (например, вигабатрин), что приводит к увеличению накопления ГАМК на постсинаптических рецепторах [154, 193].
Синаптический везикулярный белок 2A (SV2A) повсеместно экспрессируется в головном мозге, но его функция не была четко определена. SV2A представляется важным для доступности кальций-зависимых везикул нейромедиаторов, готовых к высвобождению их содержимого [176]. Отсутствие SV2A приводит к уменьшению активности, зависящей от потенциала, нейропередачи, в то время как потенциал-независимая нейропередача остается нормальной. Роль SV2A в эпилепсии подтверждается тем, что у мышей с нокаутом SV2A развивается эпилептический припадок через несколько недель после рождения. [55].
Фармакология кумаринов
Кумарины - природные фенольные гетероциклические соединия производные цис-ортооксикоричной кислоты, в основе строения которых лежит 9,10-бензо--пирон (ненасыщенный ароматический лактон цис- ортооксикоричной кислоты).Свое название кумарины получили от народного названия американского дерева тонка душистого (Dipteriх оdогаtа, сем. Fаbасеае) - кумарун, из плодов которого в 1820 г. Фогель впервые выделил кумарин. К началу XX в. были выделены 26 соединений этой природы. С развитием физико-химических методов анализа развивалась и химия кумаринов. В 30 40-х годах центром по изучению кумаринов считалась Вена (Австрия), где под руководством Е.Шпета было проведено более 50 фундаментальных работ по выделению, изучению и разработке методов анализа кумаринов. Начиная с 50-х годов, крупные исследования по изучению кумаринов развернулись в США, Египте, Италии.
Систематические изучения кумаринов в нашей стране начаты в 1946 году в Ботаническом институте им. Комарова (г. Санкт-Петербург) под руководством профессора Т.А.Кузнецовой, написана монография «Природные кумарины и фурокумарины». В ВИЛРе известна школа Г.К.Никонова, исследования которого направлены на поиск веществ с высокой биологической активностью и создание на их основе лекарственных препаратов.
Известно, что, некоторые из кумаринов проявляют противосудорожные свойства - например, императин, охот, остеоле [204]. Императин проявлял противосудорожное действие у мышей, а значения ED50 составляли от 167 до 290 мг/кг. Острые нейротоксические эффекты в исследовании показали, что значения TD50 для императина варьировались от 329 до 443 мг/кг [60]. Охот проявлял противосудорожное действие у мышей, а значения ED50 варьировались от 253 до 639 мг/кг, а нейротоксический эффект с величинами TD50 составлял от 531 до 648 мг/кг.
Известно, что эскулетин (6,7-дигидрокси-кумарин) может значительно снизить приступы, вызванные тестом максимального электрошока, не вызывая при этом седативный и миорелаксационный эффект. Вероятно, его действие опосредовано через ГАМКергическую рецепторную систему [214]. Luszczki и соавторы исследовали защитные эффекты императорина и остеоле (двух натуральных кумариновых производных) в тесте МЭШ у мышей. Во-первых, они обнаружили, что императорин обладает защитным противосудорожным действием через 30 мин после в/бр введения. Аналогичное действие отмечалось при использовании остеоле, гдемаксимальный противосудорожный эффект наблюдался в интервале от 15 до 30 мин после его введения.Дальнейшее исследование показало, что значение защитного индекса (показатели TD50/ED50) императорина и остеоле было сравнимо с таковыми у вальпроевой кислоты (VPA), что позволило рассматривать эти два активных кумарина как перспективные терапевтические средства против судорог [144; 145]. Данные первичных исследований противосудорожной активности некоторых фуранокумаринов из плодов Heracleum crenatifolium свидетельствовали о существенной противосудорожной активности [202]. Другими авторами отмечалось, что кумарины оказывают противосудорожные эффекты не только через рецепторы ГАМКА-типа, но и взаимодействуя с другими рецепторами [189].
В 1954 году Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) классифицировало кумарин как токсичное вещество и запретило его использование, маркируя все продукты, содержащие кумарин [74]. Этот шаг был скопирован их европейскими коллегами 20 лет спустя. Действие FDA было принято на основании результатов обычных испытаний на токсичность у крыс. Hazelton et al. [108] впоследствии получили аналогичные результаты в своих исследованиях на крысах и собаках, и до настоящего времени многочисленные исследователи сообщали о токсичности кумаринов [87; 90; 114]. Данные по различным параметрам токсичности кумаринов разнятся. По результатм крупного исследования эффектов лечения кумарином у самцов линий Sprague-Dawley, мышей CD-I и сирийских хомяков.
Длительное (4 и 13 недель) пероральное употребление крысами кумарина в дозах 0,3 и 0,5% продуцировало гепатотоксический эффект, который включал вакуолярную дегенерацию, апоптоз, пролиферацию желчных протоков, что сопровождалось устойчивой стимуляцией гепатоцитарного репликативного синтеза ДНК. Такие эффекты были либо менее выраженными или отсутствовали у мышей и у сирийских хомячков. Эти результаты демонстрируют выраженные различия в кумарин-индуцированной гепатотоксичности [128]. Кроме того, описаны и внутривидовые отличия эффектов, в частности по величинам LD50. Например, значения LD50 у крыс варьировались от 290 до 680 мг/кг [104; 110], в зависимости от линии крыс. Рамки значений LD50 у мышей также были широкими, но этот признак оказался зависимым от дозы [87]. Во многих хронических экспериментах было показано, что кумарин не имеет или имеет небольшой негативный эффект. У бабуинов, получавших 22,5 мг/кг/день в течение двух лет, никаких признаков гепатотоксичности выявлено не было [90].
Бабуины, получавшие 67,5 мг/кг/день, имели признаки поражения печени (слегка увеличенный уровень печеночных ферментов). Поэтому экстраполяция данных исследований по кумаринам на животных требует избирательного подхода, в частности, данные, полученные на моделях животных, где использованы бабуины, мыши или сирийские хомячки, или in vitro следует учитывать как основные при оценке кумаринов. В экспериментальных работах [126; 127] указано, что кумарин при однократном введении крысам в высоких дозах вызывает центрилобуллярный некроз гепатоцитов. Это говорит о том, что метаболизм кумарина проходил с образованием токсичных метаболитов. Исследования in vitro показали, что химически активные кумариновые метаболиты, образующиеся при участии цитохром P450-зависимых энзимов, способны ковалентно связывать микросомальные протеины [91]. Было высказано предположение, что токсическим метаболитом может выступать 3,4-эпоксид, который образуется в процессе 3-гидроксилирования кумарина. Предположили, что повреждение желчевыводящих протоков, отмечаемое в экспериментах на крысах, может быть обусловлено биллиарной экскрецией токсического метаболита 3,4-эпоксида. Вместе с тем, такое проявление гепатотоксичности не наблюдается у видов лабораторных животных, для которых показано преобладание метаболической трансформации кумарина с образованием 7-гидроксикумарина, которому не свойственна экскреция с желчью.
Из организма человека (при пероральном введении в дозе 200 мг/кг) кумарин выводится достаточно быстро, при этом 79 % выводится в виде 7-гидроксикумарина [72]. При введении в эквивалентной дозе крысам элиминация составляет только 35 %, из которых 7-гидроксикумарин составляет менее, чем 0,1% [185]. Считается, что эти различия обусловлены быстрой абсорбцией кумарина в кишечнике человека и отсутствием энтерогепатической циркуляции основного метаболита — 7-гидроксикумарина. Норвежский научный комитет по безопасности пищевых продуктов (VKM) по просьбе Норвежского органа по безопасности пищевых продуктов (Mattilsynet) провел оценку риска потребления кумаринов населением Норвегии. VKM было предложено оценить, какая часть населения, использующаяпроизводные кумарина, превышает допустимые нормы ежедневного потребления (TDI). Предписано было также рассмотреть вопрос о том, представляет ли опасность для здоровья потребителя потребление кумарина и его производных в пищу 1-2 раза в неделю в течение нескольких лет. VKM сделало вывод о том, что на основе имеющихся данных неблагоприятное влияние на здоровье возможно, но необязательно. Четкие риски неблагоприятного воздействия на здоровье возникали, когда потребление кумарина превышает TDI в 7-20 раз. В этих случаях у людей проявлялись различные гепатотоксические проявления, описанные в исследовании [219]. Клинические исследования, не показали убедительных данных за дисфункцию печени. Гепатотоксичность идиосинкратического типа наблюдалась в клинических испытаниях 2163 пациентов, фиксировалось 0,37% заболеваемости [79]. Когда прекращалось лечение кумарином повышенные ферменты печени возвращались до нормального уровня, у пациентов с данным ответом.
Различные тесты (Ames, micronucleus) показали, что кумарин и его метаболиты не являются мутагенными [86]. Хотя кумарин может вызывать разрывы ДНК в растительных клетках [103], он проявляет анти-мутагенную защиту в клетках E.Coli при воздействии 4-нитрохинолин-1-оксида [168]. Тем не менее, кумарин тератогенен, а также нефрототоксичен [179] для человека.
Анализ зависимости «структура-активность»
Анализ зависимости фармакологического эффекта от химического строения соединений кумарина выявил, что наибольшее значение для проявления противосудорожной активности в тесте максимального электрошока имеет заместитель cеры в R2 положении молекулы производного. Наличие второй нитрогруппы в положении R3 значительно ослабляет противосудорожные свойства проанализированных веществ при наличии серы в положении R2. Наличие гидроксильного радикала в положении R1 значимо не влиял на проявление противосудорожных свойств в вышеуказанных тестах (Таблица 3-5):
Анализ зависимости фармакологического эффекта производных 4 фенилпирролидона от химической структуры соединений, содержащих пирролидоновое кольцо (пирацетам / леветирацетам / фенотропил) (Таблица3-6) выявил, что значимое, но не решающее значение для проявления противосудорожной активности имеет фенильная группа в положении 4 на пирролидоновом кольце.
Известное соединение фенотропил имеет противосудорожную активность, но меньшую по силе и спектру воздействия в отличие от леветирацетама и группы исследованных препаратов. Наличие второй бензильной группы на амидном радикале не определило появление у группы исследованных соединений противосудорожных свойств в вышеописанных тестах
Появление различных групп на бензильном кольце в разной степени меняло противосудорожную активность новых соединений и можно утверждать, что наличие метильной группировки в положении 6 на нем определило максимальную противосудорожную активность соединения ГИЖ-290 по сравнению с другими соединениями в вышеописанных тестах
Стоит отметить также, что именно наличие одной этильной группировки определило противосудорожные свойства леветирацетама в отличие от пирацетама, классического ноотропа, и фенотропила - препарата с умеренными противосудорожными свойствами.
Выполненные исследования позволяют утверждать с высокой степенью вероятности, что частичное значение для проявления противосудорожной активности имеет фенильная группа в положении 4 на пирролидоновом кольце, но большую значимость в проявлении противосудорожной активности имеет метильная группа в положении 6 на анилидной части молекулы соединения ГИЖ-290 в отличие от молекул сравнения (основных препаратов (пирацетама, леветирацетама, фенотропила) и других новых соединений (ГИЖ-286, ГИЖ-295, ГИЖ-296, ГИЖ-305) (таблица 3-6).
Результаты теста максимального электрошока свидетельствуют о наличии у вещества ГИЖ-290 защитного противосудорожного эффекта в диапазоне доз от 1,0 мг/кг до 5,0 мг/кг через 30-40 минут после введения. При этом максимальная выраженность защитного эффекта (50%) наблюдалась в дозе 2,5 мг/кг, а при увеличении или уменьшении этой дозы эффект снижался до 40 и ниже процентов. Другие изученные производные пирролидона не проявили активности в данном тесте.
В тесте антагонизма с коразолом можно отметить защитный противосудорожный эффект веществ ГИЖ-290 и ГИЖ-295, превышающий результаты, полученные при введении леветирацетама по показателю показателювыживших животных, и сравнимый по показателю ЛП1. Максимальный эффект у ГИЖ-290 отмечался в дозе 5,0 мг/кг веса через 30-40 минут после введения вещества. Наблюдалось увеличение показателя ЛП первого клонического приступа у мышей в 1,22 раза по сравнению с контрольнойгруппой, а также увеличение числа выживших животных (84%) по сравнению с контролем
У ГИЖ-295 эффект отмечался в дозе 5,0 мг/кг веса: увеличение ЛП1 в 1,68 раза по сравнению с контрольной группой, но без увеличения процента выживших животных. Также было отмечено некоторое увеличение показателя ЛП1 у мышей, которым были введены вещества ГИЖ-296 в дозе 2,5 мг/кг и ГИЖ-305 в дозе 5 мг/кг, но показатели процента выживших животных в этих группах были на 0 или не достаточно достоверными.
Результаты теста максимального электрошока среди производных кумарина свидетельствуют о наличии у вещества ГГМ-01 и ГГМ-03 защитного противосудорожного эффекта в диапазоне доз от 60,0 мг/кг до 80,0 мг/кг и от 20,0 до 40,0 мг/кг соответственно через 30-40 минут после введения. При этом максимальная выраженность защитного эффекта (62,5%) наблюдалась в дозе 40 мг/кг у вещества ГГМ-03, а при увеличении или уменьшении этой дозы эффект снижался до 50% и ниже. Другие изученные производные кумарина не проявили яркой активности в данном тесте.
В тесте антагонизма с коразолом можно отметить достоверный дозо-зависимый защитный противосудорожный эффект веществ ГГМ-01 и ГГМ-03. Эффект у вещества ГГМ-01 отмечался в дозе 20,0 мг/кг: наблюдалось увеличение показателя ЛП1 в 1,5-2 раза по сравнению с контролем и при полном отсутствии выживших животных. У ГГМ-03 максимальный эффект отмечался в дозе 10,0 мг/кг: наблюдалось увеличение показателя ЛП1 практически в 2,5 раза по сравнению с контрольной группой, а также увеличение процента выживших животных до 50% . Также было отмечено некоторое увеличение показателя ЛП1, которым было введены вещество ГГМ-07 в дозах 20 мг/кг и 40 мг/кг, и увеличение показателей процента выживших животных в этих группах до 66,6%.
Важно также отметить, что при проведении тестов с производными кумарина и тиокумарина (ГГМ-01; ГГМ-02; ГГМ-04 и ГГМ-06) в диапазоне доз от 40 до 60мг/кг были отмечены случаи гибели животных в течение 30 минут после введения веществ до введения проконвульсанта. Таким образом, при изучении противосудорожных эффектов производных 4-фенилпирролидона и кумарина в базисных тестах скрининга установлено, что среди производных 4-фенилпирролидона противосудорожным эффектом в тесте МЭШ обладало только соединение ГИЖ-290 (2,5 мг/кг), а в тесте антагонизма с коразолом достоверный противосудорожный эффект оказывали соединения ГИЖ-290, ГИЖ-295, ГИЖ-296 и ГИЖ-305.
Отчетливым эффектом в тесте МЭШ обладали производные кумарина ГГМ-01, ГГМ-03 и ГГМ-07, а в тесте антагонизма с коразолом – соединения ГГМ-01, ГГМ-03, ГГМ-04 и ГГМ-07.
ЛЕВ не оказывал достоверного эффекта в тестах МЭШ и антагонизма с коразолом, что соответствует данным, полученным ранее [48, 122].
Анализ зависимости «структура-активность» в ряду производных 4 фенилпирролидона выявил, что наиболее существенное значение для проявления противосудорожной активности в этом ряду соединений имеет наличие метильной группы в положении 6 на анилидной части молекулы 4-фенилпироллидона (соединение ГИЖ-290) и меньшее значение имеет фенильный радикал в 4-м положении пирролидонового кольца. В ряду производных кумарина для проявления противосудорожной активности в тесте МЭШ имеет значение наличие атома кислорода или серы в структуре кумарина.
Исходя из полученных результатов, для проведения 2-го этапа – расширенного скрининга противосудорожной активности были отобраны производные 4-фенилпирролидона – ГИЖ-290, ГИЖ-295, ГИЖ -296 и производное тиокумарина ГГМ-03.
Связывание с ГАМКA-, ГАМКB-, NMDA- и mGluII-рецепторами ex vivo
На первом этапе было изучено влияние ГИЖ-290 (5,0 мг/кг) и ЛЕВ (600 мг/кг) на ионотропные и метаботропные рецепторы ГАМК и глутамата в мозге интактных крыс (группы I-III). Установлено, что однократные дозы обоих веществ приводят к снижению плотности (Вмах) для NMDA- и mGlu-рецепторов, а также ГАМКА-рецепторов. Напротив, величина Вмах для ГАМКВ-рецепторов под влиянием препаратов возрастала. При этом величины константы диссоциации (Kd), отражающие аффинитет мест специфического связывания к лиганду, не изменялись.
Так, леветирацетам и ГИЖ-290 уменьшали Вмах с 2986±160 фмоль/мг белка в контроле до 2336±186 и 1521±113 фмоль/мг белка, соответственно. В отношении метаботропных рецепторов глутамата снижение наблюдалось с 1839±172 фмоль/мг белка в контроле до 1698±200 и 1510±167 фмоль/мг, соответственно. Плотность ионотропных ГАМКА-рецепторов уменьшалась с 1236±86 фмоль/мг в контроле до 949±64 и 826±58 фмоль/мг в группах II и III, а метаботропных ГАМКВ-рецепторов, напротив, возрастала с 209±11 фмоль/мг в контроле до 299±15 и 447±27 фмоль/мг белка, соответственно (таблица 3-21).
На втором этапе оценивали состояние указанных рецепторов на пике судорожной активности под воздействием комбинации лития хлорида и пилокарпина (группа физраствор + Li-пилокарпин), а также под влиянием предварительного введения леветирацетама (600 мг/кг, в/бр) и ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/бр) (таблица 3-22). На рисунках 3-6 и 3-7 представлены кривые насыщения и графики Скетчарда для специфического связывания под воздействием просудорожной комбинации лития хлорида и пилокарпина, а также противосудорожного действия леветирацетама и ГИЖ-290, соответственно. Как и в случае с интактными животными, изменениям подверглись лишь величины Вмах связывания, тогда как показатели сродства рецептора к лигандам не изменились под влиянием препаратов.
Плотность ГАМКА-рецепторов на максимуме судорожной активности уменьшается с 1236±86 фмоль/мг в контроле до 627±40 фмоль/мг (р 0.05), предварительное введение леветирацетама полностью восстанавливает их число до 1207±46 фмоль/мг (р 0.05), тогда как ГИЖ-290 остаётся без эффекта (579±24 фмоль/мг) (рисунок 3-ба).
Величина Вмах для ГАМКВ-рецепторов под воздействием комбинации литий-пилокарпин уменьшается с 209±11 фмоль/мг в контроле до 161+14 фмоль/мг. ЛЕВ в данном случае оказывается неэффективным - 161+14 фмоль/мг, тогда как ГИЖ-290 восстанавливает плотность ГАМКВ-рецепторов до контрольных значений: 212+10# фмоль/мг (рисунок 3-6б).
Сниженное при судорогах количество NMDA-рецепторов гиппокампа (1772+120 фмоль/мг против 2986+160 фмоль/мг в контроле; p 0.05) под влиянием леветирацетама возрастает до Вмах=2482+182 фмоль/мг (p 0.05), при этом предварительное введение ГИЖ-290 не изменяет этого показателя - 1339+175 фмоль/мг (рисунок 3-7а).
На максимуме судорожной активности плотность метаботропных глутаматных рецепторов mGlu падает с 1839±172 фмоль/мг в контроле до величины Вмах=1138±119 (p 0.05). Однако, ни леветирацетам, ни ГИЖ-290 не оказывают при этом своего влияния на этот тип рецепторов, показывая 1004+97 фмоль/мг и 985+90 фмоль/мг, соответственно (рисунок 3-7б).
Полученные данные впервые свидетельствуют о том, что леветирацетам и ГИЖ 290 проявляют противосудорожное действие, используя различные нейрохимические механизмы. В частности, если маркерными рецепторами для защитного действия леветирацетама (600 мг/кг) являются ионотропные NMDA- и ГАМКА-рецепторы, то для производного 4-фенилпирролидона вещества ГИЖ-290 (5 мг/кг) таковым представляется метаботропный ГАМКВ-рецептор (таблица 3-22).
Исследования, представленные в данном разделе, выполнены в лаборатории радиоизотопных методов исследований (зав. лабораторией - д.м.н., профессор Ковалев Г.И.) ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» и опубликованы в статье -Ковалев И.Г. Участие глутаматных и ГАМК-рецепторов в противосудорожном эффекте леветирацетама и производного 4-фенилпирролидона (ГИЖ-290) у крыс. [Текст] / И.Г. Ковалев, Е.В. Васильева, Е.А. Кондрахин, Т.А. Воронина, Г.И. Ковалёв // Нейрохимия. – 2017. – № 4. – С.1-10. [34].