Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективность целенаправленного поиска прямых антикоагулянтов среди бутеноатов гетариламмония (обзор литературы) 16
1.1. Современное состояние проблемы применения в медицинской практике прямых антикоагулянтов 16
1.2. Биологическая активность бутеноатов гетариламмония 28
Глава 2. Материалы и методы исследований. 33
Глава 3. Скрининговые исследования новых продуктов органического синтеза .49
3.1. Влияние на время свертывания крови бутеноатов гетариламмония 49
3.2. Влияние на время свертывания крови производных ацилпировиноградных кислот 53
3.3. Влияние на время свертывания крови 2-(4-ариламино)-1-(пиперазин-1-ил)-4-арилбут-2-ен-1,4-диона гидрохлоридов 55
3.4. Влияние на время свертывания крови производных аминокарбоновых кислот 56
3.5. Влияние на время свертывания крови производных морфолинуксусной кислоты .58
3.6. Влияние на время свертывания крови 1[2-(имидазол-4-ил)этил]-4-ацил-5 арил-3-гидрокси-3-пирролин-2-онов 59
3.7. Влияние на время свертывания крови амидов и гидразидов 1,4 дикарбоновых кислот 60
3.8. Влияние на время свертывания крови 4(гет)арил-2-гидрокси-4-оксо-2 бутеновых кислот, содержащих в своей структуре адамантан 68
3.9. Влияние на время свертывания крови производных изохинолинов 69
3.10. Влияние на время свертывания крови 6-метил-4-хлорпиримидин-2 аммония 4-арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-аноатов 73
Глава 4. Фармакологические исследования соединения ФС 169 84
4.1. Влияние соединения ФС 169 на время свертывания крови in vitro 84
4.2. Исследование острой токсичности соединения ФС 169 при различныхспособах введения 86
4.3. Сравнительное влияние на время свертывания крови подкожного введения соединения ФС 169 и гепарина 87
4.4.Влияние соединения ФС 169 на время свертывания крови при однократном накожном нанесении в составе кремнийтитаносодержащего глицерогеля 88
4.5. Влияние соединения ФС 169 на время свертывания крови при внутрижелудочном введении 90
4.6. Влияние концентрации и дозы на эффективность прямого антикоагулянтного действия соединения ФС 169 91
4.7. Влияние соединения ФС 169 на длительность кровотечения при внутрижелудочном введении мышам 94
4.8. Влияние соединения ФС 169 при внутрижелудочном введении мышам на развитие острого тромбоза вызванного внутривенным введением тромбина 95
Глава 5. Изучение механизма действия соединения ФС 169 .101
5.1. Влияние соединения ФС 169 на свертывание компонентов крови in vitro 101
5.2. Влияние соединения ФС 169 на показатели коагулограммы 102
5.3. Влияние соединения ФС 169 на факторы свертывания крови in vitro 104
5.4. Влияние соединения ФС 169 на активность Х фактора свертывания крови в опытах in vivo 105
5.5. Влияние апиксабана на время свертывания крови in vitro и in vivo при внутрижелудочном введении .106
Глава 6. Изучение фармакокинетики соединения ФС 169 110
6.1. Определение концентрации соединения ФС 169 в крови при различных способах введения 110
6.2. Изучение фармакокинетики соединения ФС 169 при различных способах введения .114
Заключение .120
Выводы .138
Практические рекомендации 139
Список сокращений 140
Список литературы 141
- Современное состояние проблемы применения в медицинской практике прямых антикоагулянтов
- Влияние на время свертывания крови амидов и гидразидов 1,4 дикарбоновых кислот
- Влияние соединения ФС 169 при внутрижелудочном введении мышам на развитие острого тромбоза вызванного внутривенным введением тромбина
- Изучение фармакокинетики соединения ФС 169 при различных способах введения
Современное состояние проблемы применения в медицинской практике прямых антикоагулянтов
До недавнего времени длительная антикоагулянтная терапия осуществлялась за счет приема непрямых антикоагулянтов [18, 155], серьезным недостатком действия которых является медленное развитие эффекта. Максимальное антикоагуляционное действие наступает через 4-5 суток после начала лечения [18, 155, 262, 313]. Попытки ускорить наступление желаемого эффекта, используя тактику применения в начале терапии ударных доз, зачастую приводят к развитию кровотечений [18, 38, 314]. Длительный процесс восстановления свертывания [18, 313], небольшая широта терапевтического действия [39, 61, 313] требуют тщательного контроля степени коагуляции [61, 89, 155], на которую еще влияют лекарственное взаимодействие и особенности питания. Усиливают эффект непрямых антикоагулянтов клюква, грейпфрут, чеснок, корень имбиря, ананас, куркума [89, 313]. Ослабляют антикоагулянтный эффект белокочанная, брюссельская и китайская капуста, свекла, петрушка, шпинат, зеленый лук [89, 313]. На антикоагулянтный эффект могут оказать воздействие пол, возраст, масса тела, прием других лекарств, включая препараты растительного происхождения [89, 134]. Так, ацетилсалициловая кислота и большинство других нестероидных противовоспалительных средств, гепарин, дипиридамол, симвастатин - значительно усиливают эффект, а холестирамин, слабительные препараты ослабляют его [89, 134]. Восстановление процессов свертывания крови происходит быстрее при лечении препаратами с более коротким сроком действия - прямыми антикоагулянтами [19, 38, 39].
В настоящее время в качестве прямых антикоагулянтов используют непрямые и прямые ингибиторы тромбина и Xа фактора.
К непрямым ингибиторам тромбина относят нефракционированный гепарин и низкомолекулярные гепарины.
Нефракционированный гепарин представляет собой смесь гликозаминогликанов с большими колебаниями молекулярной массы от 3 до 30 кДа и выраженным отрицательным зарядом. Этот разброс молеклярной массы приводит к вариабельности антикоагулянтной активности и фармакокинетики препаратов [18, 19, 22, 27].
Основную противосвертывающую активность нефракционированного гепарина определяет его тропность к антитромбину III. Гепарин, связываясь с антитромбином III через пентасахаридный активный центр, меняет его конфигурацию и делает активнее во много раз [279].Таким образом, антитромбин из медленно действующего ингибитора тромбина превращается в быстродействующий ингибитор нескольких факторов коагуляционного каскада, инактивируя сериновые протеазы - IIa- (тромбин), IXa-, Xa-, XIa- и XIIa-факторы свертывания крови, в основном, факторы IIа (тромбин) и Xа [27, 249, 279, 280, 282].
Цепи нефракционированного гепарина разной длины работают по-разному. Длинные цепи могут блокировать все сериновые протеазы, включая тромбин. Короткие же цепи связываются только одним концом и инактивируют преимущественно Х-фактор [38, 39, 279].
Период полувыведения гепарина из плазмы составляет 30 - 60 мин [39]. Процесс выведения гепарина состоит из быстрой и медленной фазы [259, 280]. В быстрой фазе эндотелиальные клетки и макрофаги связываются с гепарином, нейтрализуя его. Медленная фаза выведения гепарина осуществляется путем почечной фильтрации. Биодоступность составляет около 30%. Эффективность является дозозависимой [89, 228, 230].
Основными недостатками стандартного нефракционированного гепарина являются низкая биодоступность - влияние на активность содержания в плазме антитромбина III [27, 282, 334]. Эффективного действия гепарина для профилактики тромбоэмболических осложнений можно ожидать лишь при условии достаточной активности антитромбина III, которая должна быть не менее 80 % [282, 283, 328]. При снижении активности антитромбина III в плазме крови ниже 60 % значительно возрастает риск тромбозов, который пропорционален степени снижения активности антитромбина [347]. Это редко наблюдается при остром инфаркте миокарда, но часто при венозных тромбоэмболиях [253, 303, 324, 328].
Причиной гепаринорезистентности может быть то, что гепарин связывается различными клетками: тромбоцитами, макрофагами и эндотелием [40, 323, 335], а также крупномолекулярными белками [27, 261]. Больше всего связывают гепарин так называемые белки острой фазы – фибриноген, фактор Виллебранда, фибронектин и другие [27]. Их содержание в крови может резко повышаться при остром инфаркте миокарда, сепсисе, массивной пневмонии и приводить к так называемой гепаринорезистентности [350]. Поэтому отсутствует достоверная прямая связь между величиной дозы и выраженностью эффекта. Отсюда возникает необходимость частых повторных определений показателей гемостаза для подбора адекватной дозы [19, 20, 193, 249].
Другим недостатком применения гепарина является риск возникновения геморрагических осложнений [239, 344]. Опасность кровотечения коррелирует с дозой гепарина, с сопутствующей терапией, особенно с применением массивной дезагрегантной терапии и с тяжелым состоянием пациента [295, 303]. При применении гепарина возможны реакции в местах инъекций (уплотнение, раздражение, боль, гематома, некрозы кожи), головная боль, озноб, гипертермия, тошнота, рвота, запор [27, 193, 202].
При введении препарата более 3 дней может произойти развитие иммунной реакции вследствие образования антител к комплексу "гепарин+фактор 4 тромбоцитов" [38, 202, 210, 271, 349]. Эти антитела могут активировать сами тромбоциты, а также могут связываться с ними и формировать агрегаты тромбоцитов, которые удаляются из кровотока, что, в свою очередь, приводит еще и к тромбоцитопении [33, 271, 272, 344]. Есть литературные данные об увеличении циркулирующих тромбоцитарно-моноцитарных агрегатов и повышении в крови уровня CD 40L при использовании нефракционированного гепарина [286]. Лиганд CD 40L играет центральную роль в стимуляции и регуляции иммунного ответа посредством праймирования Т-клеток и активации иммунных клеток, экспрессирующих CD 40 [286].
Образование агрегатов тромбоцитов вызывает активацию плазменного гемостаза [286], кроме того, нефракционированный гепарин может связываться с P2Y12– и IIb/IIIa– рецепторами на поверхности тромбоцитов, приводя к их активации [336]. Вероятно, таким двойным действием и объясняется противоречивость литературных данных о влиянии нефракционированного гепарина на состояние тромбоцитов. Активация тромбоцитов и плазменного гемостаза в комплексе создает тромбогенную опасность [245]. Поэтому при отмене препарата может развиться синдром "рикошета" [240, 254].
При длительном применении гепарина существует риск возникновения гиперкалиемии за счет угнетения синтеза альдостерона и развития остеопороза за счет активации остеокластов [325].
Низкомолекулярные гепарины получают из нефракционированного гепарина при помощи ферментативной обработки, которая позволяет уменьшить длину полисахаридных цепей примерно на треть [19, 281, 285].
Для получения низкомолекулярных гепаринов используются различные методы, поэтому молекулярные массы препаратов значительно различаются [2, 19, 20]. Относительная избирательная активность различных низкомолекулярных гепаринов в отношении Ха–фактора и тромбина колеблется в зависимости от средней молекулярной массы, которая различается у конкретных препаратов [281, 282]. Наибольшей анти–Xa и антитромбиновой активностью обладает эноксапарин 4:1, а наименьшей – дельтапарин, цертопарин и тинзапарин (около 2:1) [19, 42, 78, 243, 253, 306, 307].
Низкомолекулярные гепарины более избирательно блокируют Ха-фактор [2, 281, 282, 285, 306, 307]. Только 35 - 40 % цепей, входящих в состав низкомолекулярных гепаринов, имеют длину, необходимую для инактивации тромбина [2, 281, 285].
Низкомолекулярные гепарины обладают рядом преимуществ по сравнению с нефракционированным гепарином. Они в меньшей степени связываются белками «острой фазы», поэтому сохраняют эффект на фоне эндогенной интоксикации [2, 127, 270, 285, 307], соответственно, реже вызывают резистентность к их действию [139, 282, 283]. Поэтому они не требуют лабораторного контроля и их можно применять в фиксированной дозе для каждого больного [20, 127, 194]. Это делает возможным их применение в амбулаторной практике.
Влияние на время свертывания крови амидов и гидразидов 1,4 дикарбоновых кислот
Результаты изучения 78 соединений, относящихся к группе амидов и гидразидов 1,4-дикарбоновых кислот, представлены в таблице 3.7.
Из 78 веществ данной группы 14 проявили достоверный антикоагулянтный эффект. Это соединения: КНВ25, КНВ41,КНВ43, КНВ 91, КНВ113, КНВ165, КНВ171, КНВ172, КНВ181, КНВ184, КНВ289, КНВ341, КНВ345, КНВ562. Но действие этих соединений на время свертывания крови намного меньше, чем препарата сравнения - гепарина.
Достоверно значимый гемостатический эффект был выявлен у 27 соединений данного ряда. Это вещества: КНВ4, КНВ8, КНВ9, КНВ44, КНВ65, КНВ97, КНВ107, КНВ109, КНВ120, КНВ159, КНВ190, КНВ210, КНВ224, КНВ226, КНВ235, КНВ257, КНВ263, КНВ270, КНВ309, КНВ342, КНВ347, КНВ364, КНВ376, КНВ384, КНВ564, КНВ600, КНВ629. Из них эффект сопоставимый с активностью препарата сравнения проявили 6 веществ. Это соединения: КНВ 97, КНВ 120, КНВ 309, КНВ 347, КНВ 384, КНВ 600. И 8 соединений, оказывающих более значительный эффект по сравннию с этамзилатом: КНВ8, КНВ44, КНВ65, КНВ107, КНВ109, КНВ257, КНВ270, КНВ309.
Из результатов, представленных в таблице 3.8, полученных при изучении влияния на время свертывания крови производных 4 (гет)арил-2 гидрокси-4-окс-2-бутеновых кислот, содержащих в своей структуре адамантан, видно, что из 7 соединений этой группы 3 оказали достоверный гемостатический эффект. Это вещества КАС 87с, КАС 167 и КАС 170. Оказываемое действие соединений КАС 167 и КАС 170 было сопоставимо с эффектом действия этамзилата, а эффект от вещества КАС 87с намного превышал эффективность препарата сравнения.
Влияние соединения ФС 169 при внутрижелудочном введении мышам на развитие острого тромбоза вызванного внутривенным введением тромбина
Моделирование острого тромбоза у мышей проводилось методом, предложенным Р.М. Зяблицким и соавт., путем внутривенного введения тромбина [68, 137].
Определялась продолжительность жизни мышей после внутривенного введения тромбина и процент выживших животных.
При исследовании влияния соединения ФС 169, введенного внутрижелудочно через атравматичный зонд на развитие острого тромбоза у мышей, вызванного внутривенным введением тромбина, были получены данные, представленные в таблицах 4.11 и 4.12.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что вещество ФС 169 значительно увеличивает количество выживших мышей при моделировании острого тромбоза внутривенным введением тромбина. Так, в контрольной группе доля выживших мышей составила 20 %, а в группе мышей после введения соединения ФС 169 - 70 %.
При введении соединения ФС 169 увеличивается продолжительность жизни животных. Так, средняя продолжительность жизни 8 погибших животных в контрольной группе составила 100,5±6,17 с, а в опытной группе среди 3 погибших животных составила 184,7±36,45 с.
Для сравнения антитромботического эффекта соединения ФС 169 было исследовано влияние на развитие тромбоза гепарина, введенного подкожно в дозе 60 ЕД/кг. Результаты исследования представлены в таблицах 4.13 и 4.14.
В обеих опытных группах количество погибших животных составило 3, в то время как в контрольной группе погибло 8 животных.
Продолжительность жизни животных после введения гепарина увеличивалось на 91,5 %, а после введения соединения ФС 169 на 83,7% по сравнению с контрольной группой.
При сравнении результатов антитромботического эффекта ФС 169 и гепарина видно, что эффект соединения ФС 169 сопоставим с действием гепарина.
Изучение фармакокинетики соединения ФС 169 при различных способах введения
Кинетика соединения ФС 169 при подкожном введении в дозе 35 мг/кг, при внутрижелудочном введении в дозе 90 мг/кг и накожном нанесении в составе кремнийтитансодержащего глицерогеля в дозе 90 мг/кг может быть представлена в виде одночастевой модели с всасыванием, которая описывается уравнением С=А(е-Kel - е-Koi), где С-концентрация препарата во времени, А – степень всасывания, Kel – константа элиминации, Koi – константа всасывания. Параметры биэкспоненциального уравнения определены методом последовательного логарифмирования с использованием специальной программы «Borgia».
По полученным данным рассчитаны уровень максимальной концентрации вещества в крови и время ее достижения, продолжительность периодов полувсасывания и полувыведения, константы всасывания и элиминации, общий клиренс, общая площадь под фармакокинетической кривой.
Изменения концентрации соединения ФС 169 в плазме крови при подкожном введении представлены на рисунке 1.
По полученным результатам были рассчитаны основные параметры фармакокинетики. Изучение показателей фармакокинетики при подкожном введении соединения ФС 169 (таблица 6.4) показало, что соединение быстро всасывается - период полуабсорбции 2,931 мин, при этом константа всасывания составила 0,23647. Максимальная концентрация составила 0,012 мкг/мл, а время максимальной концентрации 0,366 минут. Объем распределения 42535,755, клиренс 240,582 мл/мин. Константа выведения 0,00566. Период полувыведения 122,525 мин. Площадь под фармакокинетической кривой 145,5.
Изменения концентрации соединения при внутрижелудочном введении представлены на рисунке 2.
По полученным результатам были рассчитаны параметры фармакокинетики, представленные в таблице 6.5.
Результаты показателей фармакокинетики, полученные при внутрижелудочном введении ФС 169, показали, что период полуабсорбции составил 7,059 мин, константа всасывания 0,09817. Максимальная концентрация при введении в дозе 90 мг/кг была несколько выше, чем при подкожном введении и составила 0,015 мкг/мл. Время максимальной концентрации, как и при подкожном введении, составило 0,366 мин. Период полувыведения отличался незначительно от соответствующих данных, полученных при подкожном введении, и составил 152,007 мин. Клиренс при введении вещества внутрижелудочно 379,112 мл/мин, что выше, чем при подкожном введении.
Изменение концентрации соединения ФС 169 в плазме крови при накожном нанесении представленов виде графика на рисунке 3.
Результаты изучения фармакокинетики при накожном нанесении соединения ФС 169 в составе глицерогеля показали (таблица 6.6), что вещество быстро всасывается, но период полувсасывания больше, чем при подкожном и внутрижелудочном введении. Период полуабсорбции составил 10,808 мин. Максимальная концентрация вещества в плазме крови ниже, чем при подкожном и внутрижелудочном введении 0,011 мкг/мл. Время максимальной концентрации 0,254 мин. Клиренс при данном способе введения вещества составил 473,436 мл/мин.