Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Современные представления о механизмах формирования и восприятия боли 12
1.1.1. Ноцицептивная система 13
1.1.2. Антиноцицептивная система 15
1.1.3. Ноцицептивная боль 15
1.1.4. Нейропатическая боль 17
1.1.5. Психогенная боль 20
1.2. Современные представления о механизмах воспалительной реакции 22
1.3. Семейство TRP-каналов и их биологическая роль в организме 31
1.4. TRPА1 каналы как мишень для поиска новых лекарственных препаратов 35
1.4.1. Экспрессия TRPA1 каналов 35
1.4.2. Структура и функция TRPA1 канала 36
1.4.3. Агонисты ионного канала TRPA1 37
1.4.4. Антагонисты ионного канала TRPA1 39
1.4.5. Роль TRPA1 в ноцицепции 42
1.4.6. Роль ионного канала TRPA1 при воспалительных заболеваниях 45
1.4.7. Роль ионных каналов TRPA1 в восприятии воспалительной боли 46
1.4.8. Роль TRPA1 в воспалительных заболеваниях органов дыхания 47
1.4.9. TRPA1 и воспалительные заболевания органов ЖКТ 50
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Материалы исследования 55
2.1.1. Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению экспериментальных исследований 55
2.1.2. Перечень используемых реактивов и веществ 56
2.2. Методы исследования 66
2.2.1. Методы исследования in vitro 66
2.2.2. Методы исследования in vivo 79
2.2.3. Статистический анализ результатов исследования 104
Глава 3. Результаты собственных исследований 106
3.1. Результаты исследований in vitro 106
3.1.1. Поиск молекул-кандидатов в селективные ингибиторы ионного канала TRPA1 106
3.2. Результаты исследований in vivo 113
3.2.1. Экспериментальное изучение общетоксического действия активной фармацевтической субстанции селективного ингибитора ионного канала TRPA1, вещества под шифром ZC02-0012 при острой затравке 113
3.2.2. Результаты исследования анальгетической активности селективного ингибитора ионных каналов TRPA1, вещества под шифром ZC02-0012 113
3.2.3. Результаты исследования противовоспалительной активности селективного ингибитора ионных каналов TRPA1, вещества под шифром ZC02-0012. 119
3.2.4. Результаты исследования поведенческих реакций в тесте «открытое поле» 123
3.2.5. Результаты исследования поведенческих реакций в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» 127
3.2.6. Определение показателей фармакокинетики и биодоступности селективного ингибитора TRPA1, вещества под лабораторным шифром ZC02 0012 в плазме кроликов 133
3.2.7. Определение показателей распределения ZC02-0012 по органам кроликов 136
3.2.8. Результаты исследования экскреции ZC02-0012 у кроликов 140
Обсуждение результатов 143
Заключение 153
Выводы 156
Перечень сокращений и условных обозначений 158
Список литературы 162
Приложение 188
- Современные представления о механизмах воспалительной реакции
- TRPA1 и воспалительные заболевания органов ЖКТ
- Поиск молекул-кандидатов в селективные ингибиторы ионного канала TRPA1
- Определение показателей распределения ZC02-0012 по органам кроликов
Современные представления о механизмах воспалительной реакции
Воспаление является одним из типовых патологических процессов и представляет собой сложный комплекс реакций живых тканей организма в ответ на повреждающий фактор, направленных на локализацию и нейтрализацию повреждения с последующим восстановлением целостности органа или ткани [44, 47].
По своей природе флогогены могут быть биологическими (бактерии и вирусы), физическими (термические, механические, лучевые), химическими (кислоты, щелочи). Также в определенных условиях флогогенами могут выступать эндогенные агенты, образующиеся в процессе метаболизма (гипоксия) или иммунных реакций организма (антитела, иммунные комплексы) [30].
Острое воспаление характеризуется быстрым развитием локальной воспалительной реакции в ответ на флогоген и системной реакцией организма в виде острофазового ответа. Если чужеродный агент сохраняет свое присутствие в организме длительное время, развивается дисбаланс между противовоспалительными и провоспалительными медиаторами в сторону последних, и острое воспаление переходит в хроническую фазу [10]. В реализации воспалительной реакции принимают участие микроциркуляторное сосудистое русло, клетки крови и соединительной ткани, а также комплекс про- и противовоспалительных медиаторов.
Воспаление является базовым адаптивным процессом, лежащим в основе многих заболеваний (грипп, пневмония, артрит, дифтерия и т.д.). В основе развития воспалительной реакции лежит комплекс клеточных и гуморальных факторов, вырабатываемых в ответ на повреждение и направленных на его локализацию и купирование. Огромная роль в воспалительном процессе принадлежит цитокинам, которые являются важными про- и противовоспалительными медиаторами, вовлеченными во все этапы воспалительного ответа. Соотношение про- и противовоспалительных цитокинов может служить прогностическим фактором при оценке тяжести заболевания и динамики его развития [16, 181].
Реакция воспаления протекает в несколько фаз, каждая из которых характеризуется своим набором ключевых клеток и служит для подготовки и запуска последующей.
Первая фаза, альтеративная, характеризуется первичным и вторичным повреждением тканей и развитием дистрофических изменений в месте повреждения. Под действием флогогена происходит активация тканевых макрофагов и секреция ими факторов воспаления, наиболее значимым из которых является цитокин ИЛ-1. Именно этот цитокин запускает весь дальнейший комплекс локальной воспалительной реакции, направленной на элиминацию повреждающего агента и восстановление целостности ткани. Также повреждение тканей сопровождается выбросом низкомолекулярных медиаторов воспаления (простагландины, гистамин), необходимых для развития характерных для воспаления процессов [44]. Под первичной альтерацией понимается непосредственное нарушение целостности ткани и клеток под действием флогогена, в результате чего повышается проницаемость клеточных мембран. На начальных этапах первичной альтерации в очаге повреждения наблюдается интенсификация обмена веществ, однако по мере нарастания повреждения процессы метаболизма замедляются, накапливаются недоокисленные продукты, а в тканях развиваются дистрофические изменения вплоть до некроза. Из разрушенных клеток высвобождаются протеолитические, липолитические и гликолитические ферменты, оказывающие вместе с провоспалительными медиаторами повреждающее действие на здоровые клетки, что способствует развитию вторичной альтерации [38]. В результате альтеративно-дистрофических изменений в первой фазе воспалительной реакции в очаге воспаления развивается гиперосмия, гиперонкия и ацидоз.
В ответ на высвобождение медиаторов воспаления в первой фазе развивается вторая фаза воспаления – экссудативная. Медиаторы воспаления по происхождению подразделяются на гуморальные и клеточные. Однако независимо от этого, их действие опосредовано либо через рецептор, либо наличием ферментативной активности. Исключение из этого правила составляют свободные радикалы кислорода, имеющие прямое повреждающее действие на клетки. Для всех медиаторов характерен ряд общих признаков: полифункциональность, т.е. один и тот же медиатор может иметь несколько мишеней; взаимозаменяемость – одинаковые эффекты у разных медиаторов и избыточность синтеза и высвобождения, что и является причиной их патологического действия [44].
К гуморальным медиаторам воспаления относятся кинины (брадикинин, каллидин), система комплемента и факторы свертывающей системы крови (фибринопептиды, продукты деградации фибрина), а к клеточным – вазоактивные амины (гистамин, серотонин), лизосомальные ферменты, нейромедиаторы (адреналин, ацетилхолин), производные арахидоновой кислоты, свободные формы кислорода и цитокины (ИЛ, ИНФ, ФНО, КСФ и ТФР).
В основе фазы экссудации лежит реакция микроциркуляторного русла в виде нарушения кровотока в месте повреждения, повышения проницаемости сосудистой стенки, экссудации плазмы и эмиграции клеток крови из просвета сосудов в окружающие ткани и фагоцитоза.
На начальных этапах экссудативной фазы в ответ на нарушение целостности сосудистого эндотелия и тромбоцитов происходит высвобождение эндотелинов, катехоламинов, тромбоксана А2 и лейкотриенов, рефлекторно повышается тонус вазоконстрикторов и в месте повреждения развивается кратковременный локальный спазм артериол длительностью от нескольких секунд до нескольких минут [37].
Провоспалительные медиаторы ИЛ-1, ИЛ-6 и брадикинин увеличивают активность eNOS и повышается выработка оксида азота, под действием которого кратковременный вазоспазм сменяется вазодилатацией. ИЛ-1 способствует высвобождению гистамина из тучных клеток. Параллельно с расширением сосудов данные медиаторы повышают их проницаемость и способствуют экссудации плазмы и развитию отека в месте воспаления. Данные изменения знаменуют начало следующего этапа сосудистой реакции – артериальной гиперемии, в развитии которой главенствующая роль принадлежит производным арахидоновой кислоты и фактору активации тромбоцитов. Эти медиаторы увеличивают проницаемость сосудов, изменяют агрегацию тромбоцитов и вызывают болевые ощущения в месте воспаления [9].
На стадии артериальной гиперемии увеличивается число функционирующих капилляров, возрастает приток артериальной крови, лимфообразование, лимфоотток и венозный отток. Вследствие интенсификации кровотока в месте воспаления увеличивается содержание окисленного гемоглобина в оттекающей крови, что вместе с расширенными капиллярами приводит к покраснению в месте воспаления. Следствием артериальной гиперемии является активизация процессов метаболизма в очаге воспаления, возрастает локальная теплопродукция и теплоотдача.
На смену артериальной гиперемии приходит стадия венозной гиперемии, которая характеризуется замедленным кровотоком, особенно венозным оттоком, расширением капилляров и венул и нарастанием в них гидростатического давления. Венозная гиперемия является самой продолжительной стадией и сопровождает процесс воспаления на всех его этапах. Нарастает артерио-венозная разница по кислороду и понижается его парциальное напряжение, что приводит к изменению цвета очага воспаления на багрово-синюшный [47]. На стадии венозной гиперемии процессы экссудации и связанные с ней хемотаксис, эмиграция лейкоцитов и фагоцитоз достигают своего максимума на фоне замедленного кровотока и изменения формы и поверхностных свойств эндотелиоцитов с активацией в них трансцитоза под действием медиаторов воспаления. Параллельно формируется краевое стояние лимфоцитов. Прогрессирующее замедление кровотока в очаге воспаления в сочетании с нарушением эластических свойств сосудов микроциркуляторного русла ведет к развитию предстатических изменений с маятникообразным движением крови, постепенно переходящих в стаз. Именно венозная гиперемия и стаз лежат в основе реализации барьерной функции процесса воспаления, так как препятствуют всасыванию тканевой жидкости из очага повреждения [38].
TRPA1 и воспалительные заболевания органов ЖКТ
ЖКТ характеризуется постоянным присутствием многочисленных и разнообразных комменсальных микроорганизмов, играющих важнейшую роль в правильном переваривании пищи и функционировании иммунной системы [8]. Однако дисбаланс во взаимодействии между врожденным иммунитетом и адаптивной иммунной системой, тканевыми барьерными функциями слизистой оболочки ЖКТ и комменсальной микрофлорой могут вызывать воспалительные заболевания кишечника, такие как язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), которые являются хроническими заболеваниями нижних отделов ЖКТ. Важность иннервации кишечника в поддержании его здорового состояния доказывается клиническими наблюдениями повышения уровней нейропептидов, таких как субстанция Р и CGRP в плазме крови и образцах тканей кишечника у пациентов с хроническими заболеваниями ЖКТ, а также различными экспериментальными моделями, демонстрирующими важнейшую роль сенсорных нервных волокон, нейропептидов и их рецепторов в патогенезе воспалительных заболеваний органов ЖКТ [92]. Кроме того, пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника часто страдают от боли в животе, которая, вероятно, возникает из-за сенсибилизации висцеральных ноцицепторов, иннервирующих желудочно-кишечный тракт. Роль TRPA1 в воспалении органов ЖКТ и возникновении абдоминальной боли подтверждается его экспрессией в нейронах чувствительных нервных волокон, иннервирующих ЖКТ, а также его участием в высвобождении нейропептидов. Кроме того, посредством ионного канала TRPA1 реализуется гиперчувствительность ЖКТ к механическим раздражениям [68].
Ионные каналы TRPA1 обнаружены в нейронах нодозного ганглия и ганглиях задних корешков спинного мозга, чувствительные волокна которых иннервируют ЖКТ. Также экспрессия TRPA1 была обнаружена в сенсорных волокнах, иннервирующих желудок и толстую кишку, во внутренних нейронах кишечника, энтерохромаффиновых клетках, которые являются слизистыми эндокринными клетками, выстилающими кишечник. Таким образом, ионные каналы TRPA1 идеально расположены для того чтобы обнаруживать воспалительные агенты в кишечнике.
На модели ТНБС-индуцированного воспаления ЖКТ показано TRPA1-зависимое увеличение висцеромоторного ответа кишечника в ответ на раздувание толстой кишки, а также увеличение экспрессии мРНК ионного канала TRPA1 в нейронах ганглиев задних корешков спинного мозга, иннервирующих толстую кишку [154]. Интересно, что у контрольной группы животных без воспаления висцеромоторный ответ кишечника происходил без участия ионного канала TRPA1. Полученные результаты позволяют сделать предположение, что ионный канал TRPA1 требуется для развития гиперчувствительности кишечника в условиях колита, либо для ответа на очень сильные раздражители в условиях здорового кишечника.
TRPA1-опосредованная механическая гиперчувствительность толстого кишечника развивается также и в случае стимуляции сенсорных нервных волокон. Так, воздействие брадикинина на афферентные волокна толстой кишки приводит к TRPA1-опосредованной механической гиперчувствительности, а введение в толстую кишку горчичного масла увеличивает экспрессию TRPA1 в ганглиях задних корешков спинного мозга у новорожденных животных, в то время как у взрослых особей развивается гиперчувствительность к механическим раздражениям [68]. При этом признаки воспаления у взрослых особей отсутствовали. Таким образом, повышенная активность TRPA1 на этапах раннего развития может привести к длительной механической гиперчувствительности кишечника, не зависящей от наличия повреждения тканей.
В нервных волокнах, иннервирующих органы ЖКТ, TRPA1 зачастую коэкспрессируется совместно с нейропептидами субстанцией Р и CGRP. Применение AITC на препарате изолированного блуждающего нерва стимулировало TRPA1-опосредованное высвобождение CGRP [224], а акролеин, 4-HNE и 4-ONE активировали TRPA1-опосредованное высвобождение CGRP и субстанции Р на препарате изолированной толстой кишки [198]. Результаты этих исследований позволяют сделать предположение, что в ЖКТ TRPA1 выполняет роль посредника между высвобождением нейропептидов и воспалительными медиаторами.
Интересно, что ТНБС, индуцирующая развитие колита в экспериментальных моделях на животных, стимулирует высвобождение CGRP и субстанции Р на препарате изолированной толстой кишки. В культивированных нейронах задних корешков спинного мозга ТНБС вызывает приток кальция внутрь клетки у животных дикого типа, в то время как в нейронах TRPA1 нокаутных животных данный эффект отсутствует [198]. Вероятно, что ТНБС непосредственно активирует ионный канал TRPA1, так как для ТНБС-индуцированного тока ионов требуются остатки цистеина и лизина, активированные путем ковалентной модификации. Таким образом, при данной модели колита прямая активация TRPA1 ТНБС приводит к высвобождению нейропептидов из сенсорных волокон.
Но не смотря на имеющиеся данные, роль TRPA1 в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника недостаточно ясна. По разным данным, нокаут гена TRPA1 либо предотвращает развитие экспериментального колита, либо не дает эффекта по сравнению с контрольными группами [198]. Эти различные результаты могут объясняться многими факторами, включая различия в генетическом происхождении штаммов. Действительно, различные генетические локусы влияют на восприимчивость к экспериментальному колиту [55]. Кроме того, субстанция Р и CGRP, которые являются основными нисходящими мишенями сигнализации TRPA1, играют противоположные роли в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника. CGRP играет защитную роль при всех формах экспериментального колита, тогда как субстанция Р наоборот необходима для его развития [139]. Генетический анализ показал, что CGRP противодействует эффекту субстанции Р, поэтому незначительные различия в генетике могут привести к абсолютно различным результатам. Для дальнейшей оценки вклада ионного канала TRPA1 в развитие колита необходима раздельная оценка его влияния на секрецию субстанции Р и CGRP.
Поиск молекул-кандидатов в селективные ингибиторы ионного канала TRPA1
Результаты in vitro исследования специфической активности и механизма действия принципиально новых молекул-кандидатов, ингибиторов ионного канала TRPA1
Механизм действия и специфическая активность новых синтезированных молекул были протестированы на клетках с суперэкспрессией ионного канала TRPA1 (рисунок 3.1). Полученные результаты подтверждают, что механизм действия всех молекул заключается в антагонизме ионного канала TRPA1. Активность веществ суммирована в таблице 3.1.
Таким образом, в результате проведенного скрининга in vitro была исследована специфическая активность нескольких синтезированных веществ. Показано, что все они являются антагонистами ионного канала TRPA1. IC50 для всех веществ находилась в диапазоне 100-300 нмоль. Так как соединение ZC02-0012 показало наибольшую активность (IC50 91,3 нмоль), данное вещество было выбрано в качестве основного кандидата на проведение доклинических исследований.
Изучение селективности и безопасности соединения ZC02-0012 на панели ферментов и рецепторов
Результаты исследования суммированы в таблице 3.2. Значимым считается связывание на 50% и более. Видно, что такие значения для ZC02-0012 достигаются только с мелатониновым рецептором МТ1 и транспортером допамина.
С учетом того, что исследование проведено при концентрации ZC02-0012 10 мкмоль, а активность этого соединения на исследуемой мишени TRPA1 почти в 100 раз выше (IC50 91,3 нмоль), можно говорить о высокой селективности ZC02-0012.
Связывание ZC02-0012 с hERG-каналом
С целью определения безопасности наиболее перспективной молекулы проводили исследование in vitro связывания ее с hERG–потенциал-зависимым K+-ионным каналом кардиомиоцита. Блокирование данного канала приводит к фатальным последствиям, а именно нарушению реполяризации миокарда, увеличению продолжительности QT интервала и последующему развитию асистолии.
Возможный эффект препарата ZC02-0012 на К+-канал миокарда hERG изучали с помощью тест-системы Invitrogen PredictorTM hERG при 8 концентрациях в диапазоне 30 мкмоль–0,014 мкмоль. Значение Z-фактора составило 0,77, S/N=18,4, сигнальное окно теста - mP=167.
Концентрационные кривые связывания положительного контроля Е-4031 и ZC02-0012 с hERG представлены на рисунке 3.2. Для Е-4031 полученное значение IC50 = 21 нмоль соответствует спецификации тест-системы [117]. Для тестируемого соединения ZC02-0012 видно, что оно не влияет на hERG во всех тестируемых концентрациях до 30 мкмоль. Полученные данные говорят о низком риске кардиотоксичности ZC02-0012.
Исследование селективности на панели ферментов и рецепторов продемонстрировало высокую селективность ZC02-0012 – на панели из 80-ти мишеней оно показало заметное связывание только по отношению к мелатониновому рецептору МТ1 и допаминовому транспортеру. Таким образом, ZC02-0012 обладает высокой селективностью по отношению к основной мишени.
При изучении безопасности ZC02-0012 оценивали кардиотоксичность по связыванию препарата с hERG-каналом. Полученные данные свидетельствуют о низком риске кардиотоксичности ZC02-0012 – вещество не связывается с hERG-каналом.
Определение показателей распределения ZC02-0012 по органам кроликов
Распределение ZC02-0012 изучали после однократного внесосудистого (внутрижелудочного) введения субстанции кроликам в дозе 10 мг/кг. В таблице 3.19 представлены результаты определения содержания ZC02-0012 в исследованных органах и тканях. Профили изменения концентрации ZC02-0012 от времени после введения препарата в органах показаны на рисунке 3.8.
Основные фармакокинетические параметры, отражающие экспозицию ZC02-0012 в органах кроликов, приведены в таблице 3.19. Тканевая доступность (ft) представлена в таблице 3.20. Расчёт среднего времени пребывания (МRTT) ZC02-0012 в тканях у кроликов при внесосудистом введении представлен в таблице 3.21. Расчёт кажущегося коэффициент распределения (Кd) ZC02-0012 между кровью и тканями у кроликов при внесосудистом введении представлен в таблице 3.22.
Селективный ингибитор ионных каналов TRPA1 под шифром ZC02-0012 хорошо распределяется в органы. Максимальная концентрация в исследуемых органах достигалась в пределах 30 минут после введения субстанции. Наибольшее содержание ZC02-0012 наблюдалось в тканях печени (ft=216,9), почек (ft=399,4) и легкого (ft=332,0).
Профили кривых распределения препарата в сердце, мозге и селезенке близки. Для этих органов характерна близкая максимальная концентрация ZC02-0012 и ft в пределах 50-90. Наименьшее распределение препарата ZC02-0012 зафиксировано для мышц, для которых ft составила 32.
Среднее время пребывания вещества ZC02-0012 в тканях составляет в пределах от 90 до 140 минут. Наибольшие значения характерны для почек, селезёнки и лёгких.
Экскрецию ZC02-0012 изучали после однократного внесосудистого (внутрижелудочного) введения субстанции кроликам в дозе 10 мг/кг.
В таблице 3.23 представлен расчёт общего клиренса. В таблице 3.24 представлены результаты по выведению препарата ZC02-0012 из организма кроликов. Определено общее содержание препарата в моче и кале кроликов.
Препарат в неизменном виде обнаруживается в моче в следовых количествах (0,7% от дозы). Таким образом, для ZC02-0012 характерен внепочечный клиренс. С калом препарат выводится преимущественно в промежутке времени 8-24 часа. Общее количество ZC02-0012 в фекалиях, собранных за 24 ч, составляет около 3,5% от введенной дозы. Принимая во внимание полученные результаты, очевидно, что большая часть вещества подвергается биотрансформации в печени и выводится в виде метаболитов.
Полученные результаты показывают, что при внутрижелудочном введении в дозе 10 мг/кг максимальная концентрация ZC02-0012 в плазме крови кроликов достигается в среднем через 10 минут. Период полувыведения непродолжительный (20,6 минут). Среднее время всасывания (МАТ) субстанции ZC02-0012 составило 4,2 минуты. Абсолютная биодоступность fa (%) ZC02-0012 при внутрижелудочном дозировании у кроликов составила 47%. ZC02-0012 хорошо распределяется в органы. Максимальная концентрация в исследуемых органах достигалась в пределах 30 минут после внутрижелудочного введения исследуемой субстанции. Наибольшее содержание ZC02-0012 наблюдалось в тканях печени, почек и легкого. Среднее время пребывания селективного ингибитора TRPA1 под шифром ZC02-0012 в тканях кроликов составляет в пределах от 90 до 140 минут, при этом наибольшие значения зафиксированы для почек селезёнки и лёгких. Изучение экскреции субстанции ZC02-0012 из организма кроликов после однократного внутрижелудочного введения в дозе 10 мг/кг показало, что большая часть введенной субстанции подвергается биотрансформации в печени и выводится в виде метаболитов.