Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Применение материалов для костной пластики 13
1.2. Синтетические карбонат-фосфаты кальция. Строение и свойства 19
1.3. Структура костной ткани 20
1.4. Изменение костной ткани после перелома 23
1.5. Роль микроэлементов в физиологии костной ткани 25
1.6. Наноразмерные кристаллические карбонат-фосфаты кальция 29
1.7. Взаимодействие фосфатов кальция с физиологической средой 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Материалы 36
2.2. Методы исследования 40
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 52
3.1. Результаты исследования острой токсичности 52
3.2. Результаты исследования хронической токсичности 53
3.3. Оценка биологической совместимости образцов с организмом экспериментальных животных 56
3.4. Результаты исследования спонтанной двигательной активности и ориентировочно-исследовательских реакций крыс в «открытом поле» 56
3.5. Исследование возможного отсроченного токсического влияния новых нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция на организм экспериментальных животных 60
3.6. Исследование влияния новых допированных карбонат-фосфатов кальция на организм экспериментальных животных в динамике лечения 71
3.7. Результаты исследования прочности костной ткани мышей после применения нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция 82
3.8. Результаты исследования прочности костной ткани крыс после лечения перелома костей голени нанодисперсными допированными карбонат-фосфатами кальция 84
3.9. Результаты рентгенологического исследования места перелома костей голени экспериментальных животных 87
3.10. Влияние исследуемых композиций на гистоморфологические структуры
костной ткани в области перелома 91
Заключение 96
Выводы 102
Практические рекомендации 104
Список сокращений 105
Список литературы
- Синтетические карбонат-фосфаты кальция. Строение и свойства
- Методы исследования
- Исследование возможного отсроченного токсического влияния новых нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция на организм экспериментальных животных
- Результаты исследования прочности костной ткани крыс после лечения перелома костей голени нанодисперсными допированными карбонат-фосфатами кальция
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Значительная часть населения в настоящее время подвержена заболеваниям
костной ткани, связанным с воспалительными процессами, онкологическими
заболеваниями, снижением плотности и разрушением костной структуры (Al
Ruhaimi K. A. Bone graft substitutes: a comparative qualitative histologic review of
current osteoconductive grafting materials. Int. J. Oral Maxillofac Implants. 2001. Vol.
16. P. 105–114). Серьезной проблемой является также бытовой и
производственный травматизм. Лечение заболеваний костной ткани часто требует
хирургического вмешательства, что может приводить к обширным
послеоперационным дефектам (Johnson K. D., Frierson K. E. et al. Porous ceramics as bone graft substitutes in long bone defects: a biomechanical, histological, and radiographic analysis. J. Orthop. Res. 1996. Vol. 14. P. 351–369).
В связи с этим актуальной является задача создания эффективных и
доступных методов лечения, главное требование к которым – способность в
кратчайшее время восстановить разрушенную костную ткань (Соловьв В. А. и
соавт. Морфологическое обоснование применения биокомпозиционного
материала при новом методе периостеопластики. Морфология. 2002. Т. 121. № 2-
3. С. 147–148). Особой задачей является решение проблемы восстановления
костной ткани при переломах длинных трубчатых костей на фоне остеопороза,
когда структура костной ткани настолько изменена, что обычные методики
зачастую обречены на неудачу. С целью замещения костных дефектов в
клинической практике используются аллографты и аутографты (Hench L. L., Polak
J. M. Third-generation biomedical materials. Science. 2002. Vol. 295. P. 1014–1017).
Однако применение для костной пластики аллографтов сопряжено с опасностью
инфицирования, отрицательных иммунных реакций, неконтролируемой
резорбируемостью имплантата. Использование собственной костной ткани пациента связано с необходимостью вторичных хирургических вмешательств, что может отрицательно сказаться на его здоровье, поэтому не может использоваться для замещения обширного костного дефекта (Bauer, T. W. Muschler G. F. Bone graft materials: an overview of the basic science. Clin. Orthop. Rel. Res. 2000. Vol. 371. P. 10–27). В последние десятилетия во всм мире активизировался поиск биосовместимых с костной тканью препаратов с целью их использования в травматологии, ортопедии, стоматологии (Хлусов И. А. и соавт. Зависимость остеогенных свойств клеток костного мозга от рельефа и растворимости кальций фосфатных покрытий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Т. 141. № 1. С. 107–112).
Физико-химические свойства и структура материалов на основе карбонат-фосфатов кальция (КФК) дают возможность использовать их в качестве матрицы для образования новой костной ткани, обеспечивая пластическим материалом для замещения костных дефектов и стимулируя остеогенез при сниженных репаративных возможностях костной ткани (Федонюк, Я. И. Строение длинных костей при коррекции экспериментального остеопороза. Морфология. 2004. Т. 126. № 4. С. 128). Синтетические КФК по химическому составу и
кристаллографическим показателям практически идентичны апатитам нативной кости. Значительное преимущество их использования перед другими имплантационными материалами доказано экспериментально и клинически (Bohner, M. Calcium orthophosphates in medicine: from ceramics to calcium phosphate cements. Injury. 2000. Vol. 31. P. 37–47). Это позволяет использовать новые имплантационные материалы на основе КФК в современной медицине (Rajan G. P., Fornaro J. et al. Cancellous allograft versus autologous bone grafting for repair of comminuted distal radius fractures: a prospective, randomized trial. J. Trauma. 1993. Vol. 60. P. 1322–1329). Отмечено, что значительное влияние на механические свойства и процессы, связанные с образованием костной ткани, оказывают неорганические компоненты, входящие в состав КФК, такие как катионы натрия, стронция, меди, цинка, анионы фтора, карбоната и хлора (Yamaguchi M., Weitzmann M. N. Zinc stimulates osteoblastogenesis and suppresses osteoclastogenesis by antagonizing NF-B activation. Mol. Cell Biochem. 2011. Vol. 355. P. 179–186). Это принципиально важно при лечении патологических состояний, связанных с разрушением костной ткани (Медков М. А., Грищенко Д. Н. и соавт. Получение кальцийфосфатных порошков и стеклокерамических покрытий. Химическая технология. 2013. № 5. С. 257–262).
Современная технология позволяет создать частицы КФК
нанометрической величины, в которой они присутствуют в клетках организма,
что позволяет повысить резорбируемость, и биоактивность материала по
сравнению с обычными КФК (Дыгай А. М. [и др.]. Нанотехнологии в
фармакологии. М., 2011. 136 с). Наноразмерные частицы кальция способны
проникать сквозь стенки клеток и действовать непосредственно на
находящуюся в ядре клетки ДНК, запуская или значительным образом ускоряя
процессы репарации (Li H., Gong M. et al. Degradable biocomposite of nano
calcium-deficient hydroxyapatite-multi (amino acid) copolymer. Int. J.
Nanomedicine. 2012. Vol. 7. P. 1287–1295).
Вместе с тем влияние нанокристаллических композиций допированных микроэлементами КФК на организм малоизучено, что позволило определить цель и задачи нашего исследования.
Цель исследования
Обосновать рецептуру новых фармацевтических композиций, содержащих нанодисперсные допированные карбонат-фосфаты кальция, выявить их фармако – физиологические особенности и восстановительную возможность в отношении костной ткани.
Задачи исследования
-
Обосновать выбор фармакологически активных составляющих для создания новых фармацевтических композиций, содержащих нанодисперсные карбонат-фосфаты кальция, допированные микроэлементами: первый состав -Mg2+, Fe3+, К+, Li+; второй состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, К+; третий состав - Mg2+, Fe2+, (SiO3)2-, четвртый состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+.
-
В эксперименте оценить возможную острую и хроническую токсичность, биологическую совместимость с организмом экспериментальных
животных новых фармацевтических композиций, содержащих нанодисперсные допированные карбонат-фосфаты кальция.
-
Изучить отсроченное влияние лечения новыми композициями и динамику изменений периферической крови экспериментальных животных на введение новых нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция.
-
Изучить влияние созданных экспериментальных биологически активных фармацевтических композиций, содержащих нанодисперсные допированные карбонат-фосфаты кальция, на формирование костной мозоли и прочность костной ткани на модели перелома при различных путях введения, в том числе рентгенологически и гистоморфологически.
Методология и методы исследования
Основным методологическим принципом работы явился комплексный
фармакологический подход к оценке влияния новых фармацевтических
композиций на основе нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов
кальция (ДКФК) на организм лабораторных животных. Экспериментальная часть
работы была осуществлена на лабораторных животных (мыши, крысы, кролики) с
использованием различных методических подходов: методики «открытого поля»,
методики исследования острой и хронической токсичности, биосовместимости
изучаемых образцов с организмом экспериментальных животных. Для
исследования прочности костной ткани экспериментальных животных
применялись оригинальная методика и методика исследования прочности костной ткани с помощью универсальной испытательной машины на базе Уральского государственного университета путей сообщения.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Полученные в ходе исследования результаты, сформулированные положения и выводы соответствуют теме диссертации, адекватны поставленным целям и решаемым задачам, статистически достоверны и основаны на анализе достаточного количества экспериментального материала с использованием современных методов и подходов.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на всероссийской молоджной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), конгрессе «1-й национальный конгресс по регенеративной медицине» (Москва, 2013), XVI Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI Веке" (Москва, 2014), Втором Евразийском Конгрессе с международным участием «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2015), XVII Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI Веке" (Москва, 2015), XII Международной научно-практической конференции (Белгород, 2016). На Международной конференции «IRAJ Research Forum» (Индия, 2016) устный доклад получил первое место и был отмечен медалью.
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационной работы. Цель, задачи, выводы сформулированы соискателем
совместно с руководителем д.м.н., проф. Ларионовым Л.П. Проведение
экспериментальных исследований, оформление первичной документации,
статистическая обработка и анализ полученных данных, их интерпретация,
подготовка публикаций основных результатов диссертационной работы в
журнальных статьях и тезисах конференций проводились автором лично. Синтез
образцов новых нанодисперсных ДКФК осуществлялся д.х.н, Королвой Л.Ф.,
Институт Машиноведения УрО РАН. Состав для наружного применения,
содержащий нанодисперсные ДКФК на основе кремнийсодержащего
глицерогидрогеля, приготовлен совместно с коллективом Института
органического синтеза им. И. Я. Постовского УрО РАН (под руководством д.х.н. Хониной Т.Г.). Гистологические исследования проводились на базе ЦНИЛ ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России.
Положения, выносимые на защиту
-
Обоснована рецептура четырех новых фармацевтических композиций для восстановления костной ткани на основе нанодисперсных карбонат-фосфатов кальция, допированных микроэлементами: 1-й состав - Mg2+, Fe3+, К+, Li+; 2-й состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, К+; 3-й состав - Mg2+, Fe2+, (SiO3)2-, 4-й состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+.
-
Новые фармацевтические композиции на основе нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция при различных путях и длительности их введения не вызывают явления острой и хронической токсичности, совместимы с организмом экспериментальных животных и не оказывают влияния на функциональное состояние центральной нервной системы.
-
В динамике лечения и отдаленном периоде применения новых нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция не выявлено отрицательных изменений в периферической крови экспериментальных животных, обнаружено положительное действие на обмен железа и кальция опытных крыс.
-
На фоне применения представленных образцов фармацевтических композиций, содержащих нанодисперсные допированные карбонат-фосфаты кальция, повышается прочность костной ткани на модели перелома костей лабораторных животных.
Научная новизна
В процессе экспериментальных исследований впервые обоснована
рецептура четырех новых фармацевтических композиций на основе
нанодисперсных ДКФК в виде порошка и в мягкой лекарственной форме на
основе кремнийорганического глицерогидрогеля. В экспериментах in vivo на трх
видах животных показана безопасность применения изучаемых
фармацевтических композиций.
В сравнительном аспекте на модели перелома большеберцовой и малоберцовой костей голени у крыс доказана эффективность в отношении ускорения регенерации костной ткани, в том числе морфологически. Кроме того,
впервые показаны особенности и закономерности поведенческих реакций крыс на фоне применения различных форм новых фармацевтических композиций в процессе лечения перелома костей голени. Выявлены некоторые закономерности и особенности гематологических и биохимических изменений в крови экспериментальных животных при использовании новых фармацевтических композиций. Обнаружено значительное повышение прочности костной ткани животных, получавших композиции нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенных доклинических исследований и полученный экспериментальный материал по выявлению не токсичности, безопасности применения, биосовместимости с тканями организма экспериментальных животных и способности новых фармацевтических композиций на основе нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция положительно влиять на регенерацию поврежднной костной ткани дают основание представить документы в Фармакологический комитет Министерства здравоохранения Российской Федерации для получения разрешения на клиническую апробацию указанных фармацевтических композиций для лечения патологии костной ткани.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры
фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава
России. Результаты диссертационной работы используются в научно-
исследовательской деятельности ФГБУН ИОС УрО РАН по разработке новых
кремний-, кальций-, фосфорсодержащих фармацевтических композиций,
обладающих остеотропным действием.
Публикации
Соискатель имеет 13 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 10 научных работ общим объемом 2,5 печатных листа, в том числе 5 статей в научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, 2 работы в материалах всероссийских и международных конференций, 1 научная статья в издании, входящем в базу РИНЦ, 2 публикации в зарубежных научных изданиях.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 122 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 16 таблицами, 38 рисунками. Список литературы содержит 148 источников, из которых 26 опубликовано в отечественной литературе и 122 – в зарубежных изданиях.
Синтетические карбонат-фосфаты кальция. Строение и свойства
Имплантаты, выполненные из титанового, никелевого или кобальтового сплава с биосовместимым многокомпонентным наноструктурным покрытием обладают биоактивной поверхностью и биосовместимостью [95]. Вместе с тем длительный контакт имплантата с живой средой организма неизбежно приводит к деградации свойств покрытия за счет растворимости в живой среде компонентов покрытия [9]. Вследствие этого ухудшается биологическая совместимость и биологическая активность поверхности имплантата [63].Одним из примеров является имплантат из пористого материала на основе титана (сплав Ti-6A1-4V) с биосовместимым покрытием из гидроксиапатита. Этот имплантат имеет большую силу сцепления с костью только на ранних стадиях его фиксации. При длительной фиксации покрытие резорбируется и процесс интеграции имплантата с покрытием становится идентичным процессу интеграции имплантата без покрытия. Кроме того, выход алюминия, не обладающего толерантностью к живой ткани, из сплава в близлежащие к имплантату ткани организма, а также последующее накопление алюминия в этих тканях в период нахождения имплантата в теле пациента, ухудшает биологическую совместимость материала имплантата.
Одним из примеров рационализации модели имплантата на основе пористого титана явилась разработка Осипенко А.В., Шлыкова И.Л. и соавторов. В имплантате из пористого материала на основе титана с размером основных пор в материале 150-250 мкм и дополнительных пор размером 2-5 мкм, покрытие выполнено из алмазоподобного нанокомпозита CNx, (0 x 0,4) с толщиной 20-50 нм. Поры размером 150-250 мкм обеспечивают прорастание костной ткани в имплантат. Дополнительные поры размером 2-5 мкм обеспечивают снабжение питательными веществами новообразованные ткани и выведение продуктов метаболических процессов, что способствует нормальному функционированию тканей в имплантате и повышает биосовместимость имплантата. Алмазоподобный нанокомпозит, являясь химически инертным, биологически совместим с окружающими тканями. Алмазоподобный нанокомпозит повышает адгезию клеток за счет быстрого покрытия углерод-азотсодержащей поверхности имплантата молекулами, содержащимися в питательной среде, активирует метаболические процессы и пролиферацию клеток, что повышает биоактивность имплантата.
Нашли применение и различные комбинированные трансплантаты. Так, например, деминерализованный кортикальный трансплантат используют в сочетании с изолирующими прокладками, что объединяет остеоиндуктивные свойства и достаточную механическую прочность. Большое внимание так же отдатся применению синтетических фосфорно-кальциевых соединений в комбинации с аллопластическими материалами [64, 89]. Так, композит на основе гидроксиапатита и деминерализованной кости обладает остеоиндуктивными свойствами и сохраняет форму и объм имплантат [31]. Гидроксиапатит в комбинации с костным субстратом при его имплантации положительно влияет на рост костной ткани [55, 141].
Важным направлением в реконструктивной медицине является разработка синтетических материалов, которые обладали бы всеми необходимыми для замещения костной ткани свойствами [121, 137]. Революционным можно считать направление, названное инженерией костной ткани, согласно которому организм может восстанавливать поврежднную ткань, если имеется соответствующий по параметрам матрикс для наращивания этой ткани [33, 40]. То есть при инженерии костной ткани стромальные клетки пациента культивируются в совместимом с организмом остеокондуктивном матриксе, после чего такой имплантат помещается в дефект костной ткани [45, 86]. В матрикс могут вводиться факторы роста, протеины, лекарственные вещества, коллаген [101]. Архитектура матрикса может быть разработана с помощью томографа и компьютерного моделирования с учтом всех анатомических особенностей закрываемого дефекта [58]. Ключевым для развития данной технологии является создание матрикса соответствующего по своим характеристикам поставленной задаче имплантации в дефект костной ткани [112]. Для этого были опробованы многие виды материалов [35, 93]. Наиболее перспективными представляются кальций-фосфатная керамика, биосткла и некоторые полимеры [94, 105]. Биосовместимые полимеры имеют как ряд преимуществ (технология изготовления, механические свойства), так и существенные недостатки (возможная токсичность продуктов, возникающих при деструкции, в связи с наличием мономеров, низкомолекулярных олигомеров и технологических примесей, низкая биоактивность и несовместимая с процессом остеогенеза кинетика резорбции). В связи с этим значительное внимание исследователей привлекают керамические матриксы [49, 83]. Для этой цели широко используется апатитовая кальций-фосфатная керамика, в связи с тем, что минеральная составляющая костной ткани представлена в основном гидроксиапатитом кальция [105, 145]. Керамика должна обладать определнными свойствами: пористостью для прохождения биологических потоков, которая должна быть достаточно крупной для обеспечения жизнедеятельности остеобластов [12, 57, 100]. Так же необходим достаточный запас прочностных свойств, способный выдерживать значительную нагрузку до формирования полноценной костной ткани на месте дефекта [32, 50]. Материал должен медленно резорбироваться, сохраняя при этом свои структуру и свойства, а так же активно адсорбировать протеины из плазмы крови, то есть иметь тонкие поры и шероховатые поверхности [2, 42]. Для заполнения костного дефекта и создания точной его архитектоники используют костные цементы, схватывающиеся и твердеющие in situ. Это возможно благодаря двум типам взаимодействий. Первый заключается в химической реакции основного ортофосфата с относительно кислым с образованием нейтрального ортофосфата (pH=7). Второй основан на реакции гидратации, например, бета-модификации трхкальциевого фосфата с образованием гидроксиапатита [48, 80].
Методы исследования
Для проведения данного исследования были использованы две методики. Согласно первой методике были отобраны белые беспородные мыши в количестве 50 особей обоего пола массой 18-21г. Животные были поделены на 5 групп по 10 мышей в каждой. Четыре группы были опытными, пятая контрольная. Контрольная группа получала свой обычный корм без каких-либо добавок. Опытные группы получали вместе с едой в течение 21 дня ежедневно по 100 мг исследуемой композиции (5г/кг). Затем после гуманной эвтаназии подопытных животных, извлекали обе большеберцовые кости. Каждую из опытных групп разделили на 2 части для изучения прочности костной ткани: на растяжение и поперечный слом. Контрольную группу так же разделили на 2 части для сравнения с опытными группами.
Вид введения образца Группа животных Вид образца Введение с кормом (5г/кг) Группа 1(n=10) Образец Группа 2(n=10) Образец Группа 3(n=10) Образец Группа 4(n=10) Образец Группа 5(n=10) Контроль (обычная диета) Для исследования костной ткани мышей на поперечный перелом применяли оригинальную методику, разработанную на кафедре фармакологии и клинической фармакологии УГМУ профессором Ларионовым Л.П. и Добринской М.Н. Конструкция данной методики представляет собой штатив с подвижно закреплнной на нм металлической перекладиной по типу пресса, и весов. Образцы костной ткани контрольной и экспериментальной групп сдавливали до возникновения перелома кости в поперечном направлении, результаты фиксировали. Для исследования костной ткани растяжение использовали пружинные весы и леску. Две самозатягивающиеся петли набрасывали на метафизы бедренных костей. Один край кости леской прикрепляли к неподвижной опоре, другой край крепился к весам. Создавалось постепенное натяжение, вплоть до разрыва кости. Цифровые значения, отображаемые на весах в момент разрыва, регистрировали подвижным ограничителем.
Исследование прочности костной ткани крыс, подвергавшихся оперативному вмешательству (перелом костей голени), с последующим применением исследуемых композиций путм введения состава в виде порошка в костную рану, нанесение накожно в виде мази, введение исследуемой субстанции внутрижелудочно. Эпифизы выделенных образцов большеберцовой и малоберцовой костей испытуемых животных (после перелома) фиксировали в Рисунок 2 - Фиксация образцов цилиндрических мкостях диаметром 2,8 см, глубиной 2,5см, с помощью состава содержащего смолу эпоксидно-диановую неотвержденную марки ЭД - 20 (ГОСТ 10587-84) (рисунок 2). Отвердевание состава происходило в течение 3 дней, в результате чего испытуемые образцы прочно фиксировались в области диафизов большеберцовой и малоберцовой костей. Для оценки на прочность растяжения использовали Универсальную испытательную машину фирмы Testometric М500-100AТ (максимальная нагрузка 100 килоньютонов, встроенный компьютер) (рисунок 3). Испытания проводили на базе Уральского государственного университета путей сообщения. Измерение считалось завершенным, когда осуществлялся перелом либо разрыв кости. Исследовали показатели прочности костной ткани при растяжении, поперечном и продольном сжатии. Рисунок 3 - Универсальная испытательная машина Testometric М500-100AТ
Подготовка животных к забору крови проводилась путм введения в эфирный наркоз при помощи ингаляционной анестезиологической камеры (стеклянный колпак). Затем животных фиксировали на операционном столе, после чего производили разрез в области грудины и осуществляли забор крови из полостей сердца. После проведения манипуляций животных подвергали эвтаназии (путем извлечения сердца).
При проведении гематологических исследований определялись следующие параметры: количество эритроцитов, количество лейкоцитов с выделением лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов. Определялся также уровень гемоглобина и скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Исследование проводились на гематологическом анализаторе «Adviа 60».
При биохимическом анализе сыворотки периферической крови животных исследовали активность следующих ферментов: аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), Щелочная фосфатаза, а также содержание кальция, фосфора, магния, железа, уровень холестерина, триглицеридов, общего белка, альбуминов. Данные исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе ChemWell Combi (2910) фирмы Awareness (США). Для выполнения данных исследований были использованы наборы, рекомендованные IFCC и немецкой ассоциацией клинической химии. Правильность и точность измерения проверены контрольными сыворотками, рекомендованными производителями наборов.
Гистологическое исследование места перелома позволило оценить процесс формирования костной мозоли на месте экспериментально созданного перелома костей голени крыс. Для микроскопического исследования нами были взяты образцы костной мозоли животных из группы без лечения и с лечением исследуемыми образцами через 60 суток после перелома. Вырезанный участок кости в месте перелома фиксировали 10% раствором формалина с последующей декальцинацией 5% раствором азотной кислоты. Затем исследуемые препараты уплотняли в спиртах восходящей крепости и заключали в целлоидин. Образцы окрашивали гематоксилином и эозином. Исследование проводили на микроскопе Leika DM 2500 (Германия).
Исследование возможного отсроченного токсического влияния новых нанодисперсных допированных карбонат-фосфатов кальция на организм экспериментальных животных
В представленной работе в качестве изучаемых субстанций выбраны новые карбонат-фосфаты кальция, допированные микроэлементами: первый состав - Mg2+, Fe3+, К+, Li+; второй состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, К+; третий состав -Mg2+, Fe2+, (SiO3)2-, четвртый состав - Mg2+, Fe2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+. Данные образцы предоставлены доктором химических наук Королевой Л.Ф., Институт Машиноведения УрО РАН.
Материалы на основе синтетических ДКФК широко применяются в медицине благодаря химическому и фазовому подобию неорганической составляющей нативной костной ткани. Пластический КФК-содержащий материал, обладающий остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами, применяется для замещения костных дефектов.
На процессы восстановления костной ткани после повреждений существенное влияние оказывает состояние баланса так называемых остеотропных макроэлементов (кальций, фосфор магний) и микроэлементов (калий, марганец, цинк, железо, медь, кремний). Вместе с тем в настоящее время в литературе отсутствуют сведения о современных нанодисперсных КФК, допированных микроэлементами, с точки зрения сравнительной оценки их действия на организм. Для восполнения данного недостатка были проведены исследования, целью которых стало обоснование рецептуры новых нанодисперсных ДКФК и изучение их влияния на организм экспериментальных животных, в том числе на прочность костной ткани.
Основным методологическим принципом работы явилась комплексная оценка действия ДКФК с включением различных легирующих микроэлементов на организм экспериментальных животных. В работе было использовано 250 крыс, 150 мышей и 6 кроликов. В процессе исследования использовали разные методические подходы: определение острой и хронической токсичности, создание модели перелома нижних конечностей лабораторных животных, определение влияния на ЦНС (методика «открытого поля»), определение прочности костной ткани. На заключительном этапе проводили гематологический и биохимический анализ крови, рентгенологические и морфологические исследования. Результаты обработаны в рамках правил вариационной статистики.
Исследования по определению острой и хронической токсичности новых нанодисперсных ДКФК, которые проводили в соответствии с Руководством по доклиническому исследованию лекарственных веществ, доказали, что LD50 для изучаемых образцов не определяется. Проведена оценка хронической токсичности, путм изучения реакций сенсибилизации и местно-раздражающего действия. При применении изучаемых образцов хроническая токсичность не выявлена.
Для оценки влияния новых фармацевтических композиций на функциональное состояние центральной нервной системы нами были проведены исследования по общепринятой методике «Открытое поле». Данные показали отсутствие стимулирующего или угнетающего действия на центральную нервную систему.
Возможное отдаленное влияние ДГА на показатели крови крыс исследовались на 60 сутки после перелома костей голени и лечения опытными образцами. Для определения возможного отсроченного токсического влияния композиций была выбрана группа животных, получавших после оперативного вмешательства (перелом костей голени) лечение в виде подшивания образца к костным отломкам и внутрижелудочного введения в течение 21 дня, в связи с предполагаемой наибольшей биодоступностью подобного способа введения нанодисперсных ДКФК. Исследование отсроченного влияния на организм экспериментальных животных не выявило токсического действия новых нанодисперсных ДКФК. При этом лечение образцами 1 и 2 после моделирования перелома костей голени позволяет наиболее эффективно восстановить концентрацию гемоглобина до уровня интактных крыс. В данных группах также не выявлено послеоперационного повышения уровня эозинофилов в крови, что может свидетельствовать о благоприятном влиянии на течение послеоперационного периода.
На фоне применение образца 1, содержащего в качестве легирующих микроэлементов Mg2+, Fe3+, К+, Li+, существенно повышается уровень моноцитов в крови опытных животных, что может положительно влиять на протекание процессов регенерации после перелома. Концентрация железа в крови опытных животных, получавших лечение ДКФК, существенно выше уровня контрольных животных. При этом уровень железа в группе с лечением образцом 1 выше показателя интактных животных, что может быть связано с наличием калия в составе образца, обеспечивающего более полное всасывание железа. Максимальный уровень кальция на 60 сутки после перелома, выявленный в этой же группе, является положительным фактором в отношении протекания процессов минерализации костной ткани.
В сравнительном аспекте оценки влияния ДКФК на репаративные процессы после перелома наилучшие показатели были зарегистрированы в группе животных, получавших лечение образцом 1. В связи с этим более углубленные исследования по изучению влияния композиции ДКФК первого состава на показатели крови крыс в динамике были проведены в группе животных, получавших лечение с применением данного образца.
Исследование гематологических показателей крови крыс в динамике внутрижелудочного применения показало, что количество клеток крови повышается к 10 (для тромбоцитов) - 20 (для эритроцитов и лейкоцитов) суткам эксперимента, после чего постепенно возвращается к контрольному уровню. При этом повышение уровня лейкоцитов происходит главным образом за счет гранулоцитарного компонента. Все изменения происходят в рамках референсных значений для каждого из показателей во всех временных точках [26]. Концентрация общего белка и его альбуминовой фракции повышается к 20 дню применения ДКФК, оставаясь при этом в пределах нормы для этого показателя, что может свидетельствовать об усилении синтетической активности на фоне повышения количества клеток крови. Уровень АЛТ повышается с 20 суток после перелома, оставаясь при этом в пределах нормы для этого показателя [26]. На основании литературных данных можно сделать заключение о связи выявленных закономерностей с адаптационной реакцией организма на введение субстанций.
Обращает на себя внимание снижение уровня холестерина ниже референсной нормы [26], выявленное у опытных животных, которое происходит преимущественно за счет фракции ЛПНП. Данный факт требует дальнейшего изучения в отношении влияния на синтез холестерина в печени.
В связи с тем, что основной предполагаемой сферой применения новых биологически активных композиций на основе допированных нанокристаллических карбонат-фосфатов кальция является травматология, важным аспектом для нас явилось определение влияния данных образцов на показатели прочности костной ткани экспериментальных животных после моделирования перелома костей голени крыс.
Исследование прочности костной ткани экспериментальных животных на 60 сутки после моделирования перелома костей голени выявило, что прочность на растяжение и сжатие у животных, получавших лечение в виде подшивания опытного образца к костным отломкам и внутрижелудочно, оказались существенно выше, чем при лечении только подшиванием и подшиванием с накожными аппликациями на основе опытного образца, также достоверно превышая показатели контрольной группы, при этом не отличаясь от интактной группы.
Результаты исследования прочности костной ткани крыс после лечения перелома костей голени нанодисперсными допированными карбонат-фосфатами кальция
Гематологические показатели крови у крыс, как и у людей, реагируют на различные неблагоприятные факторы, такие как, например, контакт с токсическими веществами [5, 7] . Изменение со стороны системы крови могут свидетельствовать о степени выраженности токсических эффектов введенного вещества на организм [6, 11]. Нами был выбран для проведения данного исследования образец 1 состава, содержащий микроэлементы Mg2+, Fe3+, К+, Li+ в связи с полученными данными (раздел 3.5), свидетельствующими о возможно более высоком потенциале в отношении регенерации костной ткани после перелома.
Для определения реакции системы крови лабораторных животных на введение исследуемой композиции на основе нанодисперсных ДКФК были сформированы 5 групп животных, 4 опытных из 10 крыс и 1 контрольная из 10 животных популяции линии Wistar.
Всем опытным животным внутрижелудочно через зонд вводили 50% суспензию изучаемой субстанции в объме 1мл ежедневно (1,6г/кг). Контрольным животным вводился физиологический раствор в объеме 1мл. Первую группу опытных животных выводили из эксперимента через 10 дней. Под эфирным наркозом вскрывали грудную клетку животного и осуществляли забор крови из полости левого желудочка. После проведения забора крови перерезали аорту. Второй группе продолжали вводить исследуемую субстанцию и на 20 день эксперимента произвели забор крови из полостей сердца. Третью и четвртую опытные группы вывели из эксперимента на 30 и 40 сутки соответственно, продолжая введение исследуемой композиции до момента забора крови. Контрольную группу выводили их эксперимента через 40 дней. Результаты динамики гематологических показателей представлены в таблице 14.
Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе.Доза исследуемой композиции (образец 1) 1,6 г/кг внутрижелудочно ежедневно
Количество эритроцитов в крови опытных животных существенно повышалось к 20 суткам эксперимента, оставаясь в пределах нормы для этого показателя [26] и к 40 суткам вновь возвращалось к уровню контрольной группы (таблица 14, рисунок 14). Следствием увеличения количества эритроцитов было изменение гематокрита, который, соответственно, повышался к 20 суткам и возвращается к контрольному уровню к 40 суткам (таблица 14, рисунок 15).
Рисунок 14 – Количество эритроцитов в динамике у крыс, применение образца 1. Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе. Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно
Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно Уровень гемоглобина не изменялся существенно в течение 40 дней введения исследуемой композиции (таблица 14). Количество циркулирующих тромбоцитов значительно повышалось спустя 10 дней от начала введения нанодисперсных ДКФК, оставаясь в пределах нормы для этого показателя [26], однако уже к 20 суткам существенных различий с контролем не обнаруживалось (таблица 14, рисунок 16).
Количество тромбоцитов в динамике у крыс, применение образца 1. Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе. Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно
Общее количество лейкоцитов у животных, которым вводились ДКФК, существенно увеличивалось к 20 суткам эксперимента относительно контрольной группы, оставаясь, однако, в пределах нормы для данного показателя у крыс [26] (таблица 14, рисунок 17). При этом статистически значимое увеличение было показано для клеток гранулоцитарного ряда (таблица 14, рисунок 18). Для лимфоцитов повышение клеток не достигало статистической значимости, для моноцитов наблюдалась тенденция к снижению на фоне введения ДКФК.
Повышение количества клеток крови (лейкоцитов) к 20 суткам введения исследуемых ДКФК согласуется с проведенными ранее исследованиями (Witte, Barbul, 1997) и, возможно, связано с адаптационной реакцией организма на введение чужеродных субстанций.
Количество гранулоцитов в динамике у крыс, применение образца 1. Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе. Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно Скорость оседания эритроцитов косвенно свидетельствует об активности воспалительного процесса. Уровень СОЭ не изменялся существенно при введении ДКФК в течение 40 дней.
Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе. Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно Активность АСТ в крови экспериментальных животных не изменялась существенно в течение периода наблюдения.
Активность АЛТ в крови животных, которым вводились ДКФК, постепенно повышалась. Различия с контрольной группой достигали статистической значимости к 20 суткам, оставаясь в пределах нормы для этого показателя [26]. Максимальное повышение активности АЛТ наблюдали к 30 суткам, после чего уровень активности фермента стабилизировался, и к 40 суткам дальнейшего нарастания не происходило, наблюдалась даже тенденция к достижению контрольного уровня активности АЛТ в крови (таблица 15, рисунок 19).
Активность АЛТ в крови крыс в динамике, применение образца 1. Примечание: результаты представлены как медиана [интерквартильный размах]. - различия имеют статистическую значимость по отношению к контрольной группе. Доза исследуемой композиции 1,6 г/кг ежедневно
Уровень холестерина у опытных животных имел тенденцию к снижению с 10 суток эксперимента, достигал статистической значимости к 20 дню и продолжал снижаться до 40 суток, приобретая уровень ниже референсной нормы [26] (таблица 15, рисунок 20). При этом уровень холестерина липопротеинов высокой плотности не изменялся, по сравнению с контрольными животными.