Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 14
1.1.Патофизиологическиемеханизмыразвития воспаления при бронхите 14
1.1.1. Роль оксидативного стресса в патогенезе острого бронхита 14
1.1.2. Роль Toll-рецепторов в развитии воспаления 18
1.1.3. Роль МАР-киназ в развитии воспаления 24
1.1.4. Роль цитокинов в развитии воспаления 28
1.1.5. Роль эйкозаноидов в развитии воспаления 37
1.2.Перспективыиспользованиялекарственныхсредствна основе биологически активных веществ, выделенных из гидробионтов 41
1.2.1. Фармакологические эффекты пептидов из морских организмов 41
1.2.2. Потенциальные противовоспалительные свойства полисахаридов и пептидов из морского сырья 45
1.2.3. Лекарственные препараты из морских организмов 48
Глава II. Материалы и методы исследования 52
2.1 Объекты исследования 52
2.1.1 Комплекс гликозилированных полипептидов (субстанция) 52
2.1.2 Стронгилостин (кандидат в лекарственные средства) 53
2.2.Экспериментальные животные 53
2.3.Методы изучения механизмов противовоспалительного действия комплекса гликозилированных полипептидов 56
2.3.1. Анализ влияния комплекса гликозилированных полипептидов на активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2 56
2.3.2. Анализ влияния комплекса гликозилированных полипептидов на активность 5-ЛОГ 57 2.3.3. Анализ влияния комплекса гликозилированных полипептидов на фосфорилирование внутриклеточных МАР-киназ 58
2.3.4. Метод оценки взаимодействия комплекса гликозилированных полипептидов с TLR 4 типа 58
2.3.5. Анализ влияния комплекса гликозилированных полипептидов на основные звенья иммунного ответа 59
2.4.Методы изучения фармакологической активности комплекса гликозилированных полипепидовна экспериментальных моделях 61
2.4.1. Модель острого бронхита, индуцированного формалином у крыс 61
2.4.2. Модель острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс 64
2.5.Оценка безопасности кандидата в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов 68
2.6.Статистический анализ данных исследования 71
Глава III. Результаты исследований 72
3.1.Анализ механизмов противовоспалительного действия комплекса гликозилированных полипептидов 72
3.1.1. Влияние комплекса гликозилированных полипептидов на энзиматическую активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2 72
3.1.2. Влияние комплекса гликозилированных полипептидов на активность 5-ЛОГ 73
3.1.3. Результаты оценки действия комплекса гликозилированных полипептидов на внутриклеточные MAP-киназы 75
3.1.4. Результаты оценки действия комплекса гликозилированных полипептидов на TLR 4 типа 80
3.1.5. Оценка иммунотропного действия комплекса гликозилированных полипептидов 82
3.2.Анализ фармакологической активности комплекса гликозилированных полипептидов на экспериментальных моделях 83
3.2.1. Противовоспалительное действие комплекса гликозилированных полипептидов на модели острого бронхита, индуцированного формалином у крыс 83
3.2.2 Противовоспалительное действие комплекса гликозилированных полипептидов на модели острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс 94
3.3.Результаты оценки безопасности кандидата в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов 106
Глава IV. Обсуждение результатов исследования 115
Заключение 130
Выводы 132
Практические рекомендации 133
Список сокращений и условных обозначений 134
Список литературы 137
- Роль цитокинов в развитии воспаления
- Лекарственные препараты из морских организмов
- Результаты оценки действия комплекса гликозилированных полипептидов на внутриклеточные MAP-киназы
- Противовоспалительное действие комплекса гликозилированных полипептидов на модели острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс
Введение к работе
Актуальность исследования. По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации и Федеральной службы государственной статистики, в России в 2012 г. заболевания органов дыхания у взрослых по частоте занимали 2-е место и составляли 20 209,7 случаев на 100 тыс. населения. Высокая заболеваемость, как общая, так и первичная, была зарегистрирована в Северо-Западном и Приволжском федеральных округах (Иванова Е.В. и др., 2015). За период 2012-2015 г. в России зарегистрирован рост встречаемости заболеваний органов дыхания, который в 2015 г. составил 33 790,0 на 100 тыс. взрослого населения (Росстат…, 2016), в большинстве случаев обусловленный ухудшением экологического состояния окружающей среды.
Наиболее распространенным заболеванием органов дыхания в популяции является острый бронхит. Обычно бронхит развивается в ходе острой респираторной инфекции (Носуля Е.В., 2013), но может возникать и под влиянием химических, физических факторов и аллергенов. Рецидивированию бронхита способствует ослабление иммунитета, загрязнение воздуха, табачный дым, в том числе при пассивном курении, и предрасположенность к аллергическим реакциям (Becker S. et al., 2005; Lee J. et al., 2012). Социально-экономический потенциал России обуславливает уровень здоровья населения трудоспособного возраста, что активизирует исследования по поиску новых лекарственных средств, которые способны адекватно воздействовать на ключевые звенья патогенеза болезней органов дыхания.
На современном фармацевтическом рынке присутствуют безрецептурные препараты, позиционирующиеся как средства лечения бронхита. Зачастую установление диагноза острого бронхита ассоциируется у врача с необходимостью назначения антибактериальной терапии без веских доказательств целесообразности их применения (Утешев Д.Б., 2010). Хотя антибиотики и обеспечивают этиотропную терапию, тем не менее, кардинально не изменяют течение острого бронхита ни по тяжести, ни по длительности заболевания. Они, прежде всего, снижают риск осложнений, например развитие пневмоний (Scaparrotta А. et al., 2013). Поскольку осложнения антибактериальной терапии весьма разнообразны и варьируют от невыраженных дискомфортных состояний до тяжелых и даже смертельных исходов (анафилактический шок, синдромы Лайела, Стивенсона-Джонса), предпочтительнее использовать препараты, позволяющие уменьшить выраженность воспаления, число осложнений, и предотвращающие переход болезни в хроническую форму.
В настоящее время перспективными лекарственными средствами являются препараты, действующее вещество которых выделено из природного сырья. Значительное число научно-исследовательских работ направленно на выделение и синтез из морских организмов биологически активных соединений и веществ (Blunt J.W. et al., 2017). По некоторым литературным данным, соединения морского происхождения способны оказывать значительно
больший эффект в сравнение с известными биологически активными веществами из животных и растений суши (Crawford A.D. et al., 2016; Martins A. et al., 2014). Выделенные из гидробионтов линейные и цикличные пептиды способны проявлять выраженные противовоспалительные, антиоксидантные, цитотоксические, антимикробные свойства, выступать в роли специфических блокаторов ионных каналов (Беседнова Н.Н., 2014; Крыжановский С.П., 2013; Blunt J.W. et al., 2017; Crawford A.D. et al., 2016).
Степень разработанности темы исследования. На фармацевтическом рынке США и стран Европейского союза зарегистрировано 7 лекарственных препаратов из морских гидробионтов, четыре из которых являются противоопухолевыми препаратами (Crawford A.D. et al., 2016; Montaser R., Luesch H., 2011). На I - III фазах клинических испытаний находятся около 26 лекарственных препаратов, из них 23 соединения – противоопухолевые, два соединения – для лечения шизофрении и болезни Альцгеймера и одно – для лечения хронической боли (Crawford A.D. et al., 2016).
В Российской Федерации зарегистрированы следующие лекарственные препараты из морских организмов: Нуклеоспермат натрия, «Гистохром для офтальмологии», «Гистохром для кардиологии», «Коллагеназа КК» (Регистр лекарственных средств России, 2018).
Из-за широкого набора пептидов, изучение комплексов биологически
активных веществ из морских ежей, представляет собой особый интерес
(Крыжановский С.П., 2013). Помимо уже доказанных антиоксидантного,
гиполипидемического, противовоспалительного, противоопухолевого,
антибактериального и противовирусного действий, биологически активные вещества (БАВ) из морских ежей способны регулировать уровень сахара в крови, за счет ингибирования дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4) (Макаренко И.Е. и др., 2015). Коллективом сотрудников ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» по запатентованной технологии (патент РФ 2481119, приоритет от 05.03.2012 г.) был выделен комплекс гликозилированных полипептидов (КГП) из внутренностей морских ежей S. droebachiensis. Литературные данные дают основание предполагать наличие у исследуемой субстанции фармакологической активности и соответствующих механизмов действия (Крыжановский С.П., 2013; Abubakar L. et al., 2012; Teixeira M.M., Hellewell P.G., 1997).
Цель исследования – изучить механизмы действия, эффективность на моделях воспаления дыхательных путей у животных и безопасность комплекса гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей вида
Задачи исследования
1. Изучить механизмы противовоспалительного действия комплекса гликозилированных полипептидов, в частности, влияние на активность циклооксигеназы-1, циклооксигеназы-2 и 5-липооксигеназы in vitro, влияние на индуцированное фосфорилирование митоген-активированных протеинкиназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 in vitro, взаимодействие с Toll-подобными рецепторами 4
типа in vitro и определить влияние на основные звенья иммунного ответа (гуморальный и клеточный) in vivo.
-
Биохимическими и морфогистологическими методами на модели формалин-индуцированного бронхита и бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс, подтвердить наличие противовоспалительных свойств у изучаемого комплекса гликозилированных полипептидов, в сравнении с препаратом, общепринятым в лечении острого бронхита (референтным).
-
Оценить безопасность кандидата в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов в моделях острой и хронической токсичности.
Научная новизна исследования. Впервые проведен анализ механизмов
противовоспалительного действия комплекса гликозилированных
полипептидов, выделенного из морских ежей. По результатам исследования in
vitro мишенями противовоспалительного действия комплекса
гликозилированных полипептидов являются: ЦОГ-2, МАР-киназа p38 и TLR4 .
Впервые проведено изучение специфической фармакологической
активности на двух моделях острого бронхита у крыс комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей, в сравнении
с известным синтетическим препаратом Амброксол. Установлено, что комплекс
гликозилированных полипептидов оказывает противовоспалительное действие,
снижая уровни ключевых показателей острого воспаления (общее количество
лейкоцитов и гранулоцитов) в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) в модели
острого бронхита, индуцированного формалином и модели острого бронхита,
вызванного сигаретным дымом, у крыс. Кроме того, в модели острого
бронхита, вызванного сигаретным дымом, комплекс гликозилированных
полипептидов, снижал уровни провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-,
IL-6, IL-8) в БАЛ и нормализовал антиоксидантный статус, за счет снижения
уровня малонового диальдегида и увеличения содержания восстановленного
глутатиона в крови животных. Противовоспалительное действие изучаемого
комплекса гликозилированных полипептидов подтверждено результатами
гистологического исследования. Установлено, что комплекс
гликозилированных полипептидов предотвращал развитие осложнений в виде острого катарально-гнойного бронхита и пневмонии у животных на фоне индукции патологии.
Впервые использован ингаляционный способ введения комплекса гликозилированных полипептидов с противовоспалительным механизмом действия на моделях острого воспаления бронхов у животных, за счет влияния на TLR4 и ингибирования МАР-киназы p38, а также фермента ЦОГ-2, что позволило воздействовать непосредственно на орган-мишень.
Впервые проведена оценка токсических эффектов кандидата в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов. Показано отсутствие токсического действия у готового лекарственного средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов при эндотрахеальном способе введения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Доказанные фармакологическая эффективность и безопасность позволяют рекомендовать комплекс гликозилированных полипептидов, выделенный из морских ежей вида в качестве противовоспалительного средства для лечения воспалительных заболеваний дыхательных путей.
Материалы диссертационной работы внедрены в учебные программы и используются при чтении лекций и проведении практических занятий кафедр фармакологии и биологической и общей химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедры фармакологии факультета фундаментальной медицины федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", кафедры фармакологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Смоленский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Методология и методы исследования. Методология исследования включала оценку механизмов, эффектов и токсического действия комплекса гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей, в экспериментах in vitro и in vivo. Механизмы действия комплекса гликозилированных полипептидов анализировали в условиях in vitro на клеточных линиях HEK-Blue-hTLR4, U937 и А549. Противовоспалительную активность комплекса гликозилированных полипептидов оценивали в экспериментах in vivo на двух моделях острого бронхита, индуцированного формалином, и вызванного сигаретным дымом у крыс. Оценку проводили по следующим показателям: клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа, уровни провоспалительных цитокинов (IL-1, TNF-, IL-6 и IL-8) и показатели антиоксидантной системы (восстановленный глутатион, малоновый диальдегид) (модель сигаретного дыма), гистологические исследования. Безопасность кандидата в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов оценивали на двух моделях острой и хронической токсичности. В рамках острой токсичности изучали летальность, клинические симптомы интоксикации, поведенческие реакции, массовые коэффициенты внутренних органов, местно-раздражающее действие. Критериями оценки хронической токсичности являлись: летальность, клинические симптомы интоксикации, поведенческие реакции, масса тела, данные клинико-лабораторных исследований (клинический и биохимический анализ крови), массовые коэффициенты внутренних органов, местно-раздражающее действие, микроскопическое изучение внутренних органов и тканей.
Положения, выносимые на защиту:
-
Механизмы противовоспалительного действия обусловлены тем, что комплекс гликозилированных полипептидов является антагонистом TLR4, ингибирует липополисахарид-индуцированное фосфорилирование МАР-киназы р38 и подавляет активности ЦОГ-2.
-
Противовоспалительное действие КГП в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг, подтвержденное биохимическими и морфогистологическими методами в моделях острого формалин-индуцированного бронхита и бронхита, вызванного сигаретным дымом, соответствует или превосходит референтный препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг.
-
Кандидат в лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей рода S. droebachiensis, является безопасным для организма экспериментальных животных и лишен токсических эффектов.
Степень достоверности исследования. Достоверность полученных в ходе выполнения работы данных определяется достаточным для статистической обработки количеством экспериментальных животных 188 мышей и 580 крыс в экспериментах in vivo, где выборка в каждой группе составляла не меньше 6-12 мышей (крыс), в экспериментах на клеточных линиях in vitro постановкой в нескольких параллелях.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на межвузовской студенческой конференции «Мечниковские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, Россия, 2012), XVIII международном съезде «Phytopharm 2014» (Санкт-Петербург, Россия, 2014), (Москва, Россия, 2016), 89-й конференции студенческого научного общества «Мечниковские чтения - 2016» (Санкт-Петербург, Россия, 2016), XX международном съезде «Phytopharm 2016» (Санкт-Петербург, Россия, 2016), III Всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, Россия, 2016), V Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы науки XXI века» (Смоленск, Россия, 2017), VII Ежегодного, международного партнеринг-форума «Life Sciences Invest. Partnering Russia» (Санкт-Петербург, Россия, 2017).
Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании (протокол №12 от 22 мая 2017 г.) кафедр фармакологии и биологической и общей химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов.
Личное участие автора в выполнении исследования. Исследования были выполнены на базе кафедры фармакологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Санкт-Петербургском институте фармации.
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов (90%), их непосредственном выполнении (80%), обработке полученных результатов (85%), обсуждении результатов, написании статей и тезисов (90%), написании диссертации и автореферата (100%).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста. Список литературы включает 273 источника (48 отечественных и 225 иностранных). Диссертация иллюстрирована 35 рисунками и 26 таблицами.
Роль цитокинов в развитии воспаления
Цитокины представляют собой внеклеточные сигнальные белки, которые регулируют межклеточное взаимодействие в нормальных и патофизиологических условиях (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Chung K.F., 2001). К цитокинам относят интерлейкины (синтезируемые лейкоцитами и отвечающие за межклеточное взаимодействие), хемокины, интерфероны, ростовые и колониестимулирующие факторы и др. (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). При остром воспалении происходит значительная выработка иммунными клетками провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-) (Лискова Е.В., 2011; Притулина Ю.Г. и др., 2014; Gao H. N. et al., 2012). При превышении резервных возможностей организма развивается цитокиновый шторм (Притулина Ю.Г. и др., 2014; Сергеева И.В. и др., 2012; Gao H. N. et al., 2012).
К семейству интерлейкина-1 (IL-1) относится более 10 гомологичных цитокинов. Наиболее известными являются два полипептида IL-1 и IL-1. IL-1 -цитокин, играющий важную роль в иммунной регуляции и воспалительных процессах, индуцируя экспрессию многих эффекторных белков, например цитокинов/хемокинов, синтазы оксида азота, матричных металлопротеиназ (ММР), также он влияет на продукцию простагландинов и острофазовых белков в сторону их увеличения, активацию нейроэндокринной системы и центр терморегуляции (Dinarello C.A., 2002). Чрезмерная дизрегуляторная активность данного медиатора связана с повреждением тканей и, следовательно, синтез, секреция и биологическая активность IL-1 идентифицированы в качестве терапевтических мишеней при воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит (РА), периодонтит и др. (Burger D. et al., 2006; Salvi G.E., Lang N.P., 2005).
Индукторы транскрипции IL-1 разнообразны: они включают PAMPs, куда входят, ЛПС и провоспалительные цитокины TNF-, IFN- и IFN- и сам IL-1. Рецепторы для IL-1 структурно связаны с TLR рецепторами, которые распознают ЛПС и другие PAMPs (Najafian L., Babji A.S., 2012). Внутриклеточные сигнальные молекулы, опосредующие действие PAMPs идентичны тем, которые занимаются сигнализацией IL-1 через рецепторы IL-1, тип I (IL-1RI) (Akira S., Takeda K., 2004). Активация IL-1RI приводит к набору молекул адаптера, таких как MyD88 и активации IL-1R-ассоциированных киназ (IRAK), что приводит к активации ядерного фактора NF-kB и МАРК, регулирующей факторы транскрипции, такие как JNK и р38 (Akira S. et al., 2006) (рисунок 3).
Передача сигнала при взаимодействии IL-1 со своими мембранными рецепторами (Barksby H. E. et al., 2007). Адаптированный рисунок Условные обозначения: NEMO – важный модулятор NF-kB, также известный как ингибитор субъединицы гамма-каппа-канта-B-киназы ядерного фактора (IKK-); NF-kB – ядерный фактор-kB; IKK – киназа ферментного комплекса; TAK1 – трансформирующий фактор роста связанный с киназой-1; TRAF6 – фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли; RIP1 – рецептор-взаимодействующий белок; IRAK – IL-1 receptor associated kinase; MyD88 – белок первичного ответа миелоидной дифференцировки 88; TRAM, TRIF, TIRAP – адаптер-подобные белки.
Интерлейкины-1/ являются ключевыми медиаторами иммунных реакций, воспаления и деструкции тканей. Например, при РА уровни IL-1 повышены в синовиальной жидкости за счет продукции макрофагами синовиальной ткани (Kay J., Calabrese L., 2004; Milner J.M., Cawston T.E., 2005). Интерлейкин-1 также определяется в периодонтальной ткани и десневой жидкости из десневой борозды пациентов с периодонтитом (Graves D.T., Cochran D., 2003). Чрезмерный синтез IL-1 увеличивает приток крови, местную инфильтрацию нейтрофилами и активацию роста соединительной ткани путем стимуляции секреции ММР из остеокластов, фибробластов и нейтрофилов (Barksby H. E. et al., 2007; Hoffman H.M., Firestein G.S., 2006).
Успешное лечение ревматоидного артрита блокаторами TNF- и IL-1 установило, что терапия цитокинами, вполне осуществимый способ лечения хронических воспалительных заболеваний. В отличие от TNF-, IL-1/, обнаруживаются не только на ранних стадиях заболевания, что оправдывает применение анти-IL-1 в терапии на всех этапах прогрессирования заболевания (Burger D. et al., 2006). Более детальное изучение путей транскрипции IL-1 выявило ряд потенциальных терапевтических мишеней (рисунок 4).
Адаптированный рисунок Условные обозначения: NEMO – важный модулятор NF-kB, также известный как ингибитор субъединицы гамма-каппа-канта-B-киназы ядерного фактора (IKK-); NF-kB – ядерный фактор-kB; IKK – киназа ферментного комплекса; TAK1 – трансформирующий фактор роста связанный с киназой-1; TRAF6 – фактор 6, ассоциированный с рецептором фактора некроза опухоли; RIP1 – рецептор-взаимодействующий белок; IRAK – IL-1 receptor associated kinase; MyD88 – белок первичного ответа миелоидной дифференцировки 88; TRAM, TRIF, TIRAP – адаптер-подобные белки.
Негликозилированный рекомбинантный препарат Sil-1ra, известный как Анакинра (Кинерет, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, США), используют для лечения РА и других ревматических заболеваний, таких как болезнь Стилла и системный ювенильный идиопатический артрит (Burger D. et al., 2006). Недавние клинические исследования указывают на то, что Анакинра является безопасным и хорошо переносимым препаратом, который подходит для длительного использования (Burger D. et al., 2006). Препарат также использовали для лечения генетического расстройства мультисистемного воспалительного заболевания новорожденных, которое приводит к избыточной продукции IL-1 (Hoffman H.M., Firestein G.S., 2006).
Направление в сторону сигнальных путей IL-1/TLR является предметом интенсивных исследований. Появился ряд перспективных соединений, которые могут модулировать IL-1 сигнализацию с терапевтической целью (O Neill L.A., 2006; Davis C.N., 2006).
Семейство типа IL-6 содержит IL-6, IL-11, LIF (лейкемия-ингибирующий фактор), OSM (онкостатин M), CNTF (цилиарный нейротрофический фактор), СТ-1 (кардиотрофин-1) и CLC (кардиотропин-подобный цитокин). Они активируют гены-мишени, участвующие в дифференцировке, выживание, апоптозе и пролиферации. Члены этого семейства цитокинов обладают про-, а также противовоспалительными свойствами, участвуют в кроветворении, острой фазе и иммунных реакциях организма (Heinrich P.C. et al., 2003).
Накопленные данные указывает на патологическую роль IL-6 при воспалительных, аутоиммунных и злокачественных заболеваниях (Kishimoto T., 2010). Традиционно IL-6 считается активатором реакции острой фазы и лимфоцит стимулирующего фактора. Важно отметить, что IL-6-дефицитные мыши остаются устойчивыми к индукции ряда экспериментальных аутоиммунных состояний, в то время как использование препаратов, ингибирующих продукцию IL-6, показали значительные перспективы в клинических испытаниях (Jones S. A., 2005). Примером может служить применение блокатора анти-IL-6-рецептора Ab MRA (Atlizumab, Tocilizumab), который доказал свою высокую эффективность при лечении таких воспалительных заболеваний, как РА и болезнь Крона (Choy E.H.S. et al., 2002; Ito H. et al., 2004).
Эндогенные тканевые производные хемотактильные полипептиды (хемокины) являются ключевыми посредниками в миграции лейкоцитов к участкам воспаления. IL-8 является прототипом хемокинов привлекающих нейтрофилы. Он участвует в самых разнообразных физиологических и патофизиологических процессах, начиная с защиты от бактериальных инфекций, фагоцитоза некротических тканей, многочисленных аутоиммунных заболеваний, включая ревматоидный артрит и псориаз до артериосклероза (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Кроме того, под действием IL-1 увеличивается высвобождение IL-8 из бронхиальных эпителиальных клеток, что играет важную роль в нейтрофильном воспалении дыхательных путей (Bellon H. et al., 2017).
Одним из ранних внутриклеточных событий после активации рецепторов IL-8 является увеличение внутриклеточной концентрации свободного Ca2+, что является одним из шагов в активации нейтрофила. Классический путь приводит к освобождению из эндоплазматического ретикулума и включает в себя активацию Gi белков семи трансмембранных рецепторов и высвобождению G субъединицы, которая активирует фосфолипазу C. Активация фосфолипазы приводит к увеличению инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG), ведущей к Ca2+ высвобождению и активации протеинкиназы С (Zeilhofer H. U., Schorr W., 2000).
Лекарственные препараты из морских организмов
История изучения биологически активных веществ из морских организмов началась с небольшого симпозиума под названием «Лекарственные препараты из моря» в Род-Айленде, США, в 1967 г. (Abad M.J. et al., 2008). Несмотря на нерешительность и скептический настрой некоторых тем (одна статья называлась «Отбросы [оригинал] моря»), название симпозиума, прозвучавшее в качестве метафоры для разработки лекарственных средств, пережило не одно десятилетие, чтобы достигнуть своей цели. Начиная с 1951 г., Вернер Бергман опубликовал три отчета о необычных нуклеозидах, полученных из морских губок, собранных во Флориде, США (Bergmann W., Feeney R.J., 1951; Bergmann W., Burke D.C., 1956; Bergmann W., Stempien M.F., 1957). Полученные соединения, в конечном счете, привели к производству ара-А (Видарабин) и Ara-C (Цитарабин), двух нуклеозидов со значительными противораковыми свойствами, которые используются в клинической практике с 1969 г. до сегодняшнего времени (Crawford A.D. et al., 2016). В 2004 г. под торговой маркой Приалт для лечения острой и хронической болей при травмах с повреждением спинного мозга в Соединенных Штатах был одобрен лекарственный препарат из гидробионтов - Зиконтид (-конотоксин MVIIA) - пептид, выделенный из конуса морской тропической улитки. Следующий препарат - противоопухолевое соединение трабектидин (Йондели/эктинэсайдин-743/ET-743), изолированный из морского оболочечника -асцидии - был одобрен Европейским Союзом в октябре 2007 г. для лечения саркомы мягких тканей и рака яичников.
Следующей успешный противораковый препарат из морских организмов обязан обнаружению метаболита простого полиэфира халиходрин A из губки Halichondria okadai (Crawford A.D. et al., 2016). Простая структура, содержащая синтетический фармакофор, привела к появлению Эрибулина (Halaven), самого сложного синтетического лекарственного средства, когда-либо изготовленного и одобренного в 2010 г. для лечения лекарственно-рефрактерного рака молочной железы (Menis J., Twelves C., 2011).
Ряд других соединений-кандидатов, таких как Хемиастерлин (HTI-286), Аплидин, Тетрадотоксин, Антрацимицин, Доластатин 10, Холихондрин В и др., в настоящее время находятся в фазах I-III клинических испытаний в Соединенных Штатах и в Европе (Montaser R., Luesch H., 2011; Newman D.J., Cragg G. M., 2007; Newman D.J., Cragg G.M. 2016). В настоящее время в США и Европе на рынке зарегистрировано семь лекарственных препаратов из морских организмов и более 26 находятся в разных фазах клинических испытаний.
К лекарственным препаратам из морских организмов также относится препарат Алфлутоп («Биотехнос», Румыния). Его основой является экстракт из мелкой морской рыбы, состоящий из мукополисахаридов, аминокислот, пептидов, и микроэлементов – ионов натрия, калия, кальция, магния, железа, меди и цинка. Препарат оказывает противовоспалительное, анальгезирующее и хондропротективное действия, стимулируя регенерацию хрящевой ткани (Лукина Г.В. и др., 2004; Пешехонова Л.К. и др., 2016). В Российской Федерации разработаны и зарегистрированы препараты: Нуклеоспермат натрия, «Гистохром для офтальмологии», «Гистохром для кардиологии», «Коллагеназа КК» (Регистр лекарственных средст России, 2018).
Препарат Нуклеоспермат натрия представляет собой смесь нуклеиновых кислот, выделенных из молок осетровых рыб, обладает иммуномодулирующим и гемопоэтическим действием. Активирует противовирусный, противогрибковый и противомикробный иммунитеты (Нуклеоспермат натрия…, 2017). Кроме того, введутся исследования по применению нуклеоспермата натрия для лечения хронического эндометрита и папилломовирусной инфекции, за счет его способности изменять экспрессию TLR 4 и 9 типов и тем самым снижать вирусную нагрузку (Прошин С.Н. и др., 2011; Прошин С.Н. и др., 2013).
Препараты группы «Гистохром» созданы на основе комплекса пигментов, выделенного из морских ежей, обладающих противомикробным, антиоксидантным и противовоспалительным свойствами (Крыжановский С.П., 2013; Мищенко Н.П. и др., 2003). На основе гепатопанкреаса камчатского краба был создан и впоследствии одобрен препарат противоожогового и ранозаживляющего действия «Коллагеназа КК» (Еляков Г.Б., Стоник В.А., 2003). Еще несколько новых лекарственных препаратов из морских организмов находятся на стадии доклинического изучения (Стоник В.А., 2004).
Таким образом, биологически активные соединения из морских гидробионтов являются источником для создания новых лекарственных средств. Полученные препараты из морских организмов доказали свою эффективность в отношении широкого спектра заболеваний, многие из них являются самыми мощными среди своего класса лекарственных средств (Crawford A.D. et al., 2016).
Обзор научной литературы показывает, что комплекс гликозилированных полипептидов, выделенный из зеленого морского ежа, как и большое количество пептидов и гликопептидов из гидробионтов, может воздействовать на многие вне-и внутриклеточные мишени, в том числе оказывать противовоспалительное действие, влияя на ЦОГ, TLR и/или активируя сигнальные пути MAPKs (Hu Y. et al., 2010; Kim K.N. et al., 2010; Choe I.H. et al., 2016). Данное предположение требует проведения исследований по поиску соответствующих механизмов действия и экспериментальных моделей способных подтвердить фармакологическую активность комплекса гликозилированных полипептидов.
Частота встречаемости ОБ и его осложнения имеют высокую экономическую значимость для Российской Федерации, в связи с чем, необходима разработка новых препаратов, обладающих выраженным противовоспалительным действием. На сегодняшний день основными фармако терапевтическими группами для лечения острого бронхита в соответствии с Приказом Министерсва здравоохранения и социального развития от 12.02.2007 № 108 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным острым бронхитом» являются муколитики (ацетилцистеин, амброксол), 2-агонисты (сальбутамол, фенотерол) и антибактериальные средства (азитромицин, амоксиклав и др.). Также, в лечебной практике назначают противовирусные средства (амантадин, осельтамивир, рибаверин) и препараты растительного происхождения (бронхипрет, солодка и др.) (Кукес В.Г., 2009). Применение антибиотиков или противовирусных препаратов, может давать тяжелые побочные эффекты, а применение препаратов других групп не всегда предотвращает осложнения острого бронхита. С целью снижения системных побочных эффектов и воздействия непосредственно на мишень, необходима разработка лекарственных средств с ингаляционным способом введения.
Результаты оценки действия комплекса гликозилированных полипептидов на внутриклеточные MAP-киназы
Для оценки внутриклеточного сигналинга, в частности, фосфорилирования МАР-киназ, использовали культуру U937 (моноциты человека), поскольку данные клетки участвуют в развитии воспаления, продуцируя провоспалительные цитокины (Sundararaj K. et al., 2008).
В качестве агента, запускающего фосфорилирование МАР-киназ, был выбран липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий Escherichia сoli. Это обусловлено тем, что, во-первых, это один из индукторов развития воспалительной реакции у человека и животных; во-вторых, это модельный агент, используемый при изучении внутриклеточного сигналинга, такого как каскад активации МАР-киназ р38, JNK1/2, ERK1/2 (Sundararaj K.P. et al., 2008).
В качестве позитивного контроля исследования выбраны два вещества: неспецифический ингибитор активации ЛПС-сигналинга – антитела к толл-лайк рецептору 4-го типа (anti-hTLR4 IgA2, InvivoGen, USA) и специфический ингибитор активации МАР-киназы ERK1/2 U0126 (Сell signaling Technology, USA), входящий в состав диагностического набора на определение МАР-киназ.
Культуру клеток инкубировали с исследуемым веществом, через 1 ч вносили липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерии E. coli и выдерживали в течение 1 ч при 37С и 5% CO2. Стимуляция клеток бактериальным агентом индуцировала запуск активации сигнальных молекул, в том числе МАР-киназ (р38, JNK1/2, ERK1/2). За 60 мин стимуляции количество фосфорилированных форм МАРК достигает максимальных значений (срок стимуляции установлен в предыдущих исследованиях).
С целью подтверждения того, что исследуемое вещество влияет именно на активацию (фосфорилирование) МАР-киназ, а не на продукцию соответствующих белков, оценивали количество не только фосфорилированных форм МАРК, но и общее содержание оцениваемых белков.
Результаты определения общего уровня (фосфорилированных и нефосфорилированных форм) МАР-киназ в перевиваемой культуре моноцитов человека, обработанной субстанцией КГП и ЛПС, отражены в таблице 12.
Из таблицы 12 видно, что инкубация клеток с ЛПС в течение 1 ч не изменяла содержание в них МАР-киназ JNK2, JNK1, р38, ERK2, ERK1 - значения группы интактных клеток не отличались от данных группы контроля. Полученные данные соответствуют литературным источникам, следовательно, исследование выполнено корректно (Sundararaj К.Р. et al., 2008). Дополнительная инкубация клеток с субстанцией КГП и веществами сравнения (U0126, Anti-hTLR4) также не изменяла общий уровень МАР-киназ (таблица 12). Оценка количества фосфорилированных форм МАР-киназы р38 показала, что субстанция КГП оказывает ингибирующее действие на ЛПС-индуцированную активацию (фосфорилирование) МАР-киназы p38. Данное действие носило дозозависимый характер в виде экспоненциальной зависимости. Рассчитанная эффективная концентрация (IC50) субстанции КГП составило 2,7 ± 0,3 мкг/мл (рисунок 9).
Оценка действия КГП в отношении МАР-киназ ERK1 и ERK2 показала отсутствие эффекта.
Для подтверждения того, что выявленное действие является показателем специфической активности субстанций, а не результатом цитотоксичности, было проведено дополнительное исследование.
Оценку цитотоксического действия КГП проводили методом микротетразолиевого теста с использованием культуры клеток аденокарциномы эпителиоцитов лёгкого человека (А549). Клетки культивировали в среде DMEM с глутамином (ПанЭко, Москва), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (PAA, Австрия) (для создания физиологичных условий) и 80 мг/л гентамицина.
Каждая точка была сделана в 4-х параллелях (лунок планшеты). Время инкубации культуры клеток с веществами составило 24, 48 и 72 ч. Результаты МТТ-теста показаны в таблице 13.
Из таблицы 13 видно, что значения оптической плотности в лунках контроля, измеренные на 0, 1, 2, и 3 сутки, возрастали. Зависимость носила практически прямой характер. Из этого следует, что количество клеток пропорционально увеличивалось во времени, и не была достигнута стационарная фаза роста. Выявленные условия считаются оптимальными для постановки теста на цитотоксичность и позволяют сделать заключение о корректности условий проведенного исследования.
Инкубация клеток линии А549 с исследуемой субстанцией в течение 3-х суток в большинстве случаев не приводила к изменению интенсивности окислительно-востановительных процессов в клетках, однако в отдельных лунках регистрировали снижение значения оптической плотности. Несмотря на статическую значимость, данные изменения носили бессистемный характер (таблица 13). Это позволяет предположить случайность выявленных изменений и сделать вывод об отсутствии токсического действия у субстанции КГП на рост перевиваемой культуры аденокарциномы лёгкого человека А549.
Подводя итог, можно заключить, что исследуемая субстанция не оказывает цитотоксического действия в отношении культуры клеток аденокарциномы эпителиоцитов лёгкого человека (А549). Следовательно, ингибирующее действие КГП в отношении ЛПС-индуцированного фосфорилирования МАР-киназы p38 является следствием не цитотоксического действия, а специфической активности субстанции.
Противовоспалительное действие комплекса гликозилированных полипептидов на модели острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс
Модель острого бронхита курильщика разработана в ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации» на основании публикаций о моделировании повреждения легких сигаретным дымом, включая патологию хронической обструктивной болезни легких (Perez-Rial S. et al., 2011; Yoshida T., Tuder R.M., 2007).
По результатам исследования у всех животных, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, к 7-му дню исследования количество лейкоцитов в крови увеличилось в среднем в 4 раза (ANOVA, p0,05). Количество лейкоцитов в контрольной группе животных с 14-го дня и по 28-й день исследования сохранялось на одном уровне, превышая показатель интактной группы в 1,7-1,9 раз (таблица 16). Концентрации гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в течение 28 дней исследования существенно не изменялись (данные не приведены).
По результатам оценки уровня лейкоцитов в бронхоальвеолярном лаваже на 28-й день исследования, в контрольной группе животных отмечали рост данного показателя за счет повышения популяции гранулоцитов и моноцитов, что свидетельствует о воспалительном процессе в легких (таблица 17). Количество лейкоцитов в БАЛ животных контрольной группы достерно превышало, практически в 2 раза, тот же показатель интактной группы, по популяции моноцитов и нейтрофилов в 4 и 7 раз больше соответственно (ANOVA, p0,05).
В экспериментальных группах состав БАЛ практически не отличался от показателей интактной группы. Тенденция повышения числа гранулоцитов без достоверных отличий от интактной группы отмечена в группах животных, получавших исследуемый КГП в дозе 25 мкг/кг и референтный препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг.
По результатам изучения в бронхоальвеолярном лаваже животных уровней провоспалительных цитокинов установлено, что комплекс гликозилированных полипептидов в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг статистически значимо снижал все исследуемые показатели относительно данных, полученных в контрольной группе (рисунки 21 - 24). Причем КГП в дозе 100 мкг/кг (максимальная доза) снижал уровни провоспалительных цитокинов в среднем на 37% (ANOVA, р0,05). Препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг снижал исследуемые показатели на 32% относительно показателей контрольной группы (ANOVA, р0,05).
Анализ антиоксидантного статуса животных на фоне длительной экспозиции сигаретным дымом показал, что во всех экспериментальных группах на 14-й день эксперимента регистрировали статистически значимое увеличение маркера оксидативного стресса малонового диальдегида (в 1,8-2,2 раза) и снижение восстановленного глутатиона (в 2-3 раза). До 28 дня эксперимента у животных контрольной группы показатели практически не изменялись (таблица 18, рисунок 25). В группах животных, получавших комплекс гликозилированных полипептидов в исследуемых дозах, и крыс, получавших референтный препарат в дозе 3600 мкг/кг, напротив, содержание восстановленного глутатиона увеличилось и стало сопоставимо с данными в интактной группе (рисунок 25). Причем, содержание GSH в крови животных, получавших КГП в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг и референтного препарата в дозе 3600 мкг/кг, достоверно отличалось от данного показателя животных контрольной группы (p0,05, ANOVA).
При проведении гистологического исследовании в контрольной группе животных были выявлены следующие изменения: гиперплазия эпителия бронхов, инфильтрация слизистого и подслизистого слоев стенки бронха нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами, очаговый некроз слизистой бронхов с деформацией слизистой бронха, а также развитие осложнения виде острой мелкоочаговой бронхопневмонии (рисунок 26). Перечисленные гистологические признаки свидетельствовали о развитии острого катарального/острого катарально-гнойного бронхита, а также в мелкоочаговой бронхопневмонии.
Резко выраженный перибронхиальный и диффузный пневмосклероз, диффузная выраженная воспалительная инфильтрации, деформация стенок бронхов. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. x50. По результатам микроскопического исследования у животных интактной группы бронхи среднего калибра были выстланы двурядным эпителием. В подслизистом слое бронха была слабо выраженная инфильтрация лимфоцитами и макрофагами. Признаки воспаления отсутствовали (рисунок 27).
В экспериментальной группе животных, получавших референтный препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг, в слизистой оболочке бронхиального дерева встречалась преимущественно слабо выраженная лимфо-макрофагальная инфильтрация. Слабая инфильтрация нейтрофилами встречалась в слизистом слое в большинстве случаев, в подслизистом слое преобладала слабовыраженная инфильтрация нейтрофилами. Таким образом, в данной группе крыс имелась гистологическая картина острого катарально-гнойного бронхита.
При гистологическом исследовании среднего бронха у животных, получавших КГП в дозах 25 и 50 мкг/кг, толщина гиперплазированной слизистой была увеличена по сравнению с группой интактных крыс и снижена по сравнению с группой контрольных животных. В слизистой и подслизистом слоях бронхиального дерева регистрировали слабо и умеренно выраженную лимфо-макрофагальную инфильтрацию. Имела место также слабо выраженная инфильтрация нейтрофилами слизистого и подслизистого слоев. Это соответствует гистологической картине преимущественно острого катарального бронхита, и в единичных случаях острого катарально-гнойного бронхита.
Микроскопическая картина бронхов у животных, получавших КГП в максимальной дозе 100 мкг/кг, выглядела следующим образом, в слизистой бронхиального дерева отмечали лимфо-макрофагальную слабовыраженную инфильтрацию, в подслизистом слое инфильтрация была также слабо выражена. Инфильтрация нейтрофилами слизистой и подслизистого слоя – слабо выражена (рисунок 28). Эти признаки соответствуют гистологической картине острого катарального бронхита.
По результатам гистологического исследования была разработана визуально-аналоговая шкала морфологических изменений слизистого и подслизистого слоя в бронхах и ткани легких, по которой была проведена оценка степени выраженности воспалительного инфильтрата (лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы) в баллах. Полученные данные представлены в таблицах 19 и 20.
Полученные результаты свидетельствуют о развитии выраженной патологии в контрольной группе. Толщина слизистой бронхов статистически значимо увеличивалась в 2,4 раза по сравнению с интактными животными, что характеризует наличие воспалительной гиперплазии эпителия бронхов (ANOVA, p0,05).
В отношении показателя толщины слизистой бронхов, референтный препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг и КГП в дозах 50 и 100 мкг/кг статистически значимо снижали величину данного показателя по сравнению с контрольными животными.
Эти данные свидетельствуют о сравнимой эффективности референтного препарата и КГП на нормализацию состояния слизистой бронхиального дерева, однако КГП был эффективен в значительно более низкой дозе по сравнению с Амброксолом.
Таким образом, воспроизведенный в эксперименте ОБ, характеризовался лейкоцитозом в крови и изменениями в антиоксидантной системе (снижение концентрации восстановленного глутатиона). При гистологическом исследовании в ответ на воспалительную реакцию выявлено утолщение слизистой бронхов и наличие острого катарального бронхита, острого катарально-гнойного бронхита, либо острого катарального бронхита + острой мелкоочаговой пневмонии. При этом в тканях легкого и БАЛ отмечена лимфоцитарная и макрофагальная инфильтрация. Все это свидетельствует о развитии воспалительной реакции в бронхах и угнетении антиоксидантной системы организма, как результат длительно протекающего оксидативного стресса.
Субстанция КГП во всех изученных дозах улучшала течение острого катарального бронхита, развившегося у животных, защищала бронхи от негативного воздействия табачного дыма и снижала степень выраженности воспаления, снижая уровни провоспалительных цитокинов и оказывая антиоксидантное действие. По результатам эксперимента, положительное действие КГП сопоставимо с действием референтного препарата Амброксол. Максимальный эффект тестируемого комплекса был достигнут при применении в дозе 100 мкг/кг, что в 36 раз меньше терапевтической дозы препарата Амброксол и эквивалентно 18 мкг/кг для человека.