Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. ABC транспортеры 13
1.2. Гликопротеин-Р. Локализация. Физиологические функции 16
1.3. Синтез гликопротеина-Р 19
1.4. Строение, описание первичной, вторичной и третичной структуры гликопротеина-Р 19
1.4.1. TMDs (трансмембранные домены (transmembrane binding domens)) гликопротеина-Р 22
1.4.1.1. Cубстрат-связывающий “карман” гликопротеина-Р 23
1.4.2. NBDs (нуклеотид связывающие домены (nucleotid binding domens)) гликопротеина-Р 26
1.4.3. Линкерная область гликопротеина-Р 28
1.4.4. Третичная структура гликопротеина-Р 1.5. Транспортный цикл гликопротеина-Р 32
1.6. Модели функционирования гликопротеина-Р 38
1.7. Субстраты, индукторы, ингибиторы гликопротеина-Р 41
1.8. Эндогенные регуляторы гликопротеина-Р 44
1.9. Фармакологическая характеристика вилдаглиптина 46
1.10. Фармакологическая характеристика гликвидона 50
2. Материалы и методы исследования 54
2.1. Объект экспериментальных наблюдений 54
2.2. Дизайн исследования 54
2.3 Моделирование аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа и измерение уровней инсулина и глюкозы 58
2.4. Определение функциональной активности гликопротеина-Р 59
2.5. Определение экспрессии гликопротеина-Р 64
2.6. Математико-статистические методы исследования 65
3. Результаты исследования 68
3.1. Влияние вилдаглиптина на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне нормы 68
3.2. Влияние гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне нормы 79
3.3. Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне нормы 87
3.4. Функциональная активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа
3.5. Влияние вилдаглиптина на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа 104
3.6. Влияние гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа 117
3.7. Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа 130
4. Обсуждение результатов 145
5. Выводы 160
6. Практические рекомендации 162
7. Список сокращений 163
8. Список литературы
- Синтез гликопротеина-Р
- Моделирование аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа и измерение уровней инсулина и глюкозы
- Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне нормы
- Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа
Введение к работе
Актуальность. По мнению Международной Диабетической Федерации (IDF)), сахарный диабет (СД) является настоящей эпидемией современного общества. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 347 миллионов человек в мире страдают от данного заболевания, при этом на диабет 2-го типа приходится 90% всех случаев. Предполагается, что к 2035 г. количество людей с СД в мире возрастет на 55%. СД 2-го типа с присущим ему патологическим комплексом и рядом осложнений часто приводит к полипрагмазии, в условиях которой возрастает риск межлекарственных взаимодействий. Комбинированная терапия СД противодиабетическими препаратами различных классов с различными механизмами действия является одним из этапов лечения у пациентов, которые не достигают целей контроля на фоне монотерапии. Одной из рациональных комбинаций является сочетание ингибиторов дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) (вилдаглиптина) и производных сульфонилмочевины (гликвидона) (Дедова И.И., Мельниченко Г.А. Алгоритм специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. М. 2015. 120 с.).
Степень разработанности проблемы. В последнее время все большее значение в
фармакокинетике придается белкам-транспортерам, так как для большого числа
лекарственных препаратов существует вероятность фармакокинетических лекарственно-
опосредованных взаимодействий. Многие лекарственные препараты способны
модулировать функциональную активность и/или уровень экспрессии транспортеров, что
приводит к межлекарственным взаимодействиям. Наиболее клинически значимым
переносчиком лекарственных веществ является – гликопротеин-Р (P-gp, ABCB1 белок),
что определяется его локализацией в организме и широкой субстратной специфичностью,
50% существующих препаратов являются его субстратами или ингибиторами (Keogh J. P.,
Kunta J. R. European journal of pharmaceutical sciences. 2006. 27. 5. P. 543-554).
Таким образом, изучение влияния вилдаглиптина, гликвидона и их комбинации на активность и экспрессию гликопротеина-Р необходимо для мотивированной и комплексной оценки рисков межлекарственных взаимодействий на фоне терапии сахарного диабета 2-го типа.
Цель исследования. Оценка действия вилдаглиптина, гликвидона и их комбинации на функциональную активность и экспрессию P-gp в норме и при аллоксан-индуцированном СД 2-го типа.
Основные задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние вилдаглиптина на функциональную активность и экспрессию P-gp в условиях нормы.
-
Изучить влияние гликвидона на функциональную активность и экспрессию P-gp в условиях нормы.
-
Изучить влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и экспрессию P-gp в условиях нормы.
-
Оценить влияние экспериментального аллоксан-индуцированного СД 2-го типа на функциональную активность и экспрессию P-gp.
-
Изучить влияние вилдаглиптина на функциональную активность и экспрессию P-gp при экспериментальном аллоксан-индуцированном СД 2-го типа.
-
Изучить влияние гликвидона на функциональную активность и экспрессию P-gp при экспериментальном аллоксан-индуцированном СД 2-го типа.
-
Изучить влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и экспрессию P-gp при экспериментальном аллоксан-индуцированном СД 2-го типа.
Научная новизна. Впервые в эксперименте in vivo на кроликах изучено влияние вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг на функциональную активность и экспрессию P-g на фоне нормы. Выявлено ингибирующее влияние 14-дневного курса вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг на функциональную активность белка-транспортера, сохраняющееся на 5-й день отмены препарата, без изменения его экспрессии и уровней эндогенных регуляторов ABCB1 белка - инсулина и глюкозы крови.
Впервые в эксперименте in vivo на кроликах изучено влияние вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг на экспрессию и функциональную активность P-gp на фоне СД 2-го типа. Установлено, что терапия СД 2-го типа вилдаглиптином приводит к нормализации сниженной на фоне патологии функциональной активности и экспрессии P-gp и восстановлению углеводного обмена.
Впервые показано, что гликвидон в дозе 10 мг/кг массы, применяемый курсом в 14 дней, не оказывает влияния на функциональную активность и экспрессию P-gp на фоне нормы в эксперименте in vivo на кроликах.
Установлено, что терапия СД 2-го типа гликвидоном приводит к нормализации функциональной активности и экспрессии P-gp, на фоне восстановления углеводного обмена.
Впервые в эксперименте in vivo на кроликах изучено совместное влияние вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг и гликвидона в дозе 10 мг/кг курсом в 14 дней на экспрессию
и функциональную активность P-gp на фоне нормы и СД 2-го типа. В условиях нормы установлено ингибирующее влияние указанной комбинации на функциональную активность белка-транспортера без изменения его экспрессии только на 5-й день отмены препаратов.
Выявлено, что терапия СД 2-го типа комбинацией вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг и гликвидона в дозе 10 мг/кг приводит к полному восстановлению сниженных на фоне патологии функциональной активности и экспрессии P-gp и нормализации углеводного обмена.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы позволяют использовать примененную схему введения и дозу вилдаглиптина в качестве положительного контроля пониженной функциональной активности P-gp в экспериментах in vivo с целью поиска веществ аналогичного действия, а также для прогнозирования принадлежности лекарственных/потенциальных лекарственных веществ к субстратам белка-транспортера. Полученные данные обосновывают необходимость учета возможных изменений транспортной функции P-gp при фармакотерапии СД 2-го типа и его осложнений, возникающих на фоне нарушений углеводного обмена. В случае терапии вилдаглиптином необходимо учитывать возможность ингибирования активности ABCB1 белка.
Методология и методы исследования. Применена классическая методология моделирования экспериментального сахарного диабета у кроликов. Использованы современные верифицированные методы изучения функциональной активности и экспрессии P-gp, концентрации инсулина и глюкозы крови. Исследование соответствует пунктам 4, 8 и 14 паспорта специальности «фармакология, клиническая фармакология», шифр 14.03.06.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Вилдаглиптин, вводимый интактным кроликам в дозе 5 мг/кг (в/ж) в течение 14 дней, приводит к ингибированию функциональной активности P-gp, сохраняющемуся на 5-й день отмены препарата, без изменения экспрессии ABCB1 белка в тканях тощей кишки, печени, почек и гематоэнцефалическом барьере.
-
Гликвидон, вводимый интактным кроликам в дозе 10 мг/кг (в/ж) в течение 14 дней, не влияет на функциональную активность P-gp и его экспрессию в тканях тощей кишки, печени, почек и гематоэнцефалическом барьере.
-
Комбинация вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг и гликвидона в дозе 10 мг/кг (в/ж), вводимая интактным кроликам в течение 14 дней, не влияет на функциональную активность P-gp и его экспрессию в тканях тощей кишки, печени, почек и
гематоэнцефалическом барьере, однако на 5-й день отмены препаратов наблюдается ингибирование эффлюксной активности ABCB1 белка без изменения его экспрессии.
-
На фоне аллоксан-индуцированного СД 2-го типа у кроликов наблюдается ингибирование функциональной активности P-gp, сопровождающееся снижением его экспрессии в тканях тощей кишки, печени и почек.
-
Вилдаглиптин, вводимый в дозе 5 мг/кг (в/ж) в течение 14 дней кроликам с аллоксан-индуцированным СД 2-го типа, приводит к нормализации функциональной активности P-gp и его экспрессии в тканях тощей кишки, печени и почек; на 5-й день отмены препарата вновь наблюдается снижение эффлюксой функции ABCB1 белка и его экспрессии в указанных тканях.
-
Гликвидон, вводимый в дозе 10 мг/кг (в/ж) в течение 14 дней кроликам с аллоксан-индуцированным СД 2-го типа, приводит к нормализации функциональной активности P-g и его экспрессии в тканях тощей кишки, печени и почек. На 5-й день отмены препарата выявлено снижение эффлюксной функции ABCB1 белка и его экспрессии в тканях тощей кишки и печени.
-
Комбинация вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг и гликвидона в дозе 10 мг/кг (в/ж), вводимая кроликам с аллоксан-индуцированным СД 2-го типа в течение 14 дней, приводит к полному восстановлению функциональной активности P-gp и его экспрессии в тканях тощей кишки, печени и почек. На 5-й день отмены комбинации препаратов установлено снижение эффлюксой функции ABCB1 белка и его экспрессии в ткани тощей кишки.
Степень достоверности. Достаточный объем экспериментальных исследований, проведенных с использованием современных инструментальных и лабораторных методик, последующая систематизация и комплексная статистическая обработка полученных данных обеспечивает высокую степень достоверности полученных результатов.
Личный вклад соискателя состоит в самостоятельной подготовке аналитического обзора литературы по изучаемой проблеме, составлении программы исследования, выполнении экспериментальной части работы, проведении хроматографического исследования, забора крови и тканей для проведения соответствующих анализов, статистической обработки и интерпретации данных, формулировки положений и выводов. Автором подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.
Внедрение результатов в практику
Основные положения работы используются в учебном процессе при обучении студентов, клинических интернов и ординаторов на кафедре фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на
Ежегодной научной конференции университета (Рязань, 2012), Всероссийской
конференции молодых ученых с Международным участием, посвященной 150-летию со
дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 22 – 23 октября 2015 года),
Всероссийской научной конференции студентов и молодых специалистов «Актуальные
вопросы современной медицины: взгляд молодого специалиста» (Рязань, 2016), а также
представлены на межкафедральном совещании кафедр сердечно-сосудистой,
рентгенэндоваскулярной, оперативной хирургии и топографической анатомии;
профилактических гигиенических дисциплин с курсом гигиены, эпидемиологии и организации госсанэпидслужбы ФДПО; факультетской терапии с курсом эндокринологии, клинической фармакологии, профильных болезней; фармакологии с курсом фармации ФДПО; биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО; патофизиологии; общей химии с курсом биоорганической и органической химии; фармацевтической и токсикологической химии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России с привлечением заинтересованных лиц 27 июня 2016 г.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 5 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 патенте РФ, 2 тезисах докладов в материалах Российских конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 197 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 243 источника, из них 18 – отечественных и 225 – зарубежных источников. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 29 рисунками.
Диссертация выполнялась по основному плану научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Синтез гликопротеина-Р
Согласно общепринятой точке зрения у P-gp есть по крайней мере, три субстрат-связывающих сайта и один аллостерический сайт. Структурно все они изолированы друг от друга, тем не менее взаимодействуют между собой для выполнения ABCB1 белка транспортной функции [120]. В ряде экспериментальных работ утверждается, что ингибиторы P-gp, главным образом, обратимо взаимодействуют с одним или несколькими из трех предполагаемых субстрат-связывающих участков, и, следовательно, являются конкурентными ингибиторами [221].
Cубстрат-связывающие участки находятся внутри поры, образованной 12 ТМ сегментами, и представляющей собой «воронку» или «карман». Пора наиболее узкая с внутренней стороны цитоплазматической мембраны, в средней части ее ширина составляет порядка 9-25 и наиболее широкая она с внеклеточной стороны [123]. Рисунок 4. Поперечное схематическое изображение субстрат-связывающего кармана P-gp. Два одновременно связанных субстрата изображены как красный и оранжевый фрагменты [24] Cубстрат-связывающий «карман» достаточно большой и способен разместить одновременно более чем один субстрат, в то же время с помощью органичного сочетания аминокислот из различных ТМ сегментов, формируются уникальные и необходимые субстрат-связывающие сайты, способные связать конкретный субстрат. Таким образом, различные субстраты могут занимать различные сайты связывания [132, 140], что минимизирует конкуренцию субстратов за белок-транспортер.
Согласно механизму «субстрат-индуцированного соответствия» аминокислотные остатки нескольких ТМ сегментов сообща принимают участие в формировании сайта связывания субстрат-связывающего «кармана». При этом каждый субстрат способен генерировать свои собственные сайты связывания, используя различные комбинации аминокислотных остатков из различных ТМ сегментов, которые, как предполагается, достаточно подвижны, а количество и тип остатков определяется их сродством к субстрату. Данный механизм объясняет широкий спектр субстратов P-gp [129, 133, 138].
Принято считать, что значимость ТМ7 N-концевой части белка эквивалента значимости ТМ1 С-концевой части и они совместно принимают участие в связывании субстратов. Предполагается, что во время гидролиза АТФ, значительные конформационные изменения должны происходить между ТМ 5 и ТМ 8, при этом гидролиз АТФ способствует взаимодействию между внеклеточными участками TM1 и TM11 [122, 139].
В 2005 г. K. Pleban и соавторы подтвердили, что субстрат-связывающий «карман» расположен на стыке 1 и 2 TMDs, кроме того, по бокам в центральной части субстрат-связывающего «кармана» находятся отверстия, достаточно большие для прохождения через него субстратов (рисунки 2,4) [170]. Так называемые «ворота» субстрат-связывающего «кармана» локализованы между 5 и 8 трансмембранными доменами с одной стороны, и 2 и 11 с противоположной (рисунок 5). При этом связывание субстрата приводит к конформационным изменениям между 5 и 8, и 2 и 11 трансмембранными сегментами, что может представлять из себя «закрытие ворот» [125, 127].
Установлено наличие по крайней мере двух сайтов связывания, которые вероятно способны эффективно взаимодействовать между собой, они получили название H и R сайтов (из-за их сродства к Hoechst 33342 и Rhodamine 123, соответственно). Предполагается, что R сайт граничит с внутренним слоем цитоплазматической мембраны. Таким образом, P-gp способен функционировать в качестве флоппазы, перемещая субстраты от внутреннего слоя к внешнему слою плазматической мембраны [141].
NBDs (нуклеотид связывающие домены (nucleotid binding domens)) гликопротеина-Р NBDs располагаются с внутренней стороны цитоплазматической мембраны и способны образовывать димер, при этом доказано, что именно они играют важнейшую роль в связывании и гидролизе молекул АТФ.
Каждый NBDs состоит из высоко консервативной последовательности, включающей примерно 220 аминокислот, которые участвуют в процессе гидролиза АТФ. Мотивы, называемые Walker A (WA) и B (WB), принимают участие в связывании фосфатных остатков нуклеотидов. Выделяют также консервативную додекапептидную последовательность, называемую С линкерным участком или LSGGQ доменом, а также D, H, Q, и А петли [40, 70, 225]. В D-loop H-loop A-loop Walker A Q-loop Рисунок 6. Схематичное изображение NBD [225] Аминокислотные последовательности первого NBD: Walker A (WA) (427 435 кислоты) – главный ATФ-связывающий сайт, содержит большое количество остатков лизина; Walker B (WB) (531 542 аминокислоты), содержит большое количество аспарагиновой кислоты и способен связывать Mg2+ и LSGGQ домен (остатки с 551 556). Последовательности аминокислот второго NBD: 1070 1078, 1176 1182 и 1196 1201 соответственно [40]. LSGGQ домен каждого NBD, располагается рядом с Walker A противоположного NBD и, по-видимому, принимает участие в формировании АТФ-связывающих участков. Несмотря на то, что LSGGQ домен присутствует во всех ABC транспортерах, окончательно его функции не установлены [136]. Ряд исследований, в том числе данные криоэлектронной микроскопии Р-gp, показали, что NBDs находятся вблизи друг от друга [70]. Среди всех петель NBDs полагают, что именно А-петля играет ключевую роль в гидролизе АТФ, так как ароматическое кольцо Y401 А-петли почти параллельно кольцу аденина лежащего в основе молекулы АТФ. В результате эффекта - взаимодействия наблюдается стабилизация промежуточной конформации, формируемой молекулой АТФ и каталитическим центром NBD [104]. Кроме того, обе молекулы АТФ, по-видимому, связываютcя на границе двух NBDs [221]. При этом оба АТФ-связывающих сайта P-gp равноценны и вместе составляют каталитический домен белка, ответственный за трансдукцию энергии в транспортировку субстратов ABCB1 белком [63, 78].
Моделирование аллоксан-индуцированного сахарного диабета 2-го типа и измерение уровней инсулина и глюкозы
Сахарный диабет 2-го типа – нарушение углеводного обмена, вызванное преимущественной инсулинорезистентностью и относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным нарушением секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без нее [2, 3]. Данную патологию моделировали однократной внутривенной инъекцией свежеприготовленного раствора аллоксана моногидрата в цитратном буфере (pH=4,0) в дозе 80 мг/кг массы.
Животные, которые через месяц после инъекции демонстрировали уровень глюкозы натощак не более 13,89 ммоль/л на фоне сохраненной секреции базального инсулина; концентрацию постпрандиальной глюкозы (120 минута), отличную от базальной; сниженные инсулиногенный индекс и уровень инсулина на 45 минуту (постпрандиальный) после пероральной глюкозной нагрузки, признавались больными СД 2-го типа. Указанное состояние остается стабильным на протяжении как минимум 4 месяцев [7, 26, 200].
Определение концентрации инсулина и глюкозы проводили в сыворотке крови, отобранной из краевой вены уха кролика в объеме 1-2 мл. Уровень инсулина измеряли натощак, на 10 и 45 минуты после пероральной глюкозной нагрузки (3 г/кг). Концентрацию глюкозы определяли натощак, на 10 и 90 минуты, а также на 120 минуту (в сериях с СД 2-го типа) после глюкозной нагрузки. Рассчитывали гликемический (отношение содержания глюкозы в крови натощак к уровню инсулина в крови натощак) и инсулиногенный (отношение прироста уровня инсулина в крови к приросту концентрации глюкозы в крови на 10 минуту после глюкозной нагрузки) индексы [7, 31]. Содержание глюкозы (ммоль/л) определяли глюкозооксидазным методом при помощи наборов «Human» (Германия), инсулин (мкЕД/мл) – радиоиммунным методом с использованием набора «Immunotech» (Чехия) [11] – в центральной научно-исследовательской лаборатории РязГМУ. В качестве экспресс-метода определения уровня глюкозы в цельной крови использовали электрохимический глюкометр OneTouch UltraEasy.
Функциональную активность P-gp определяли in vivo по анализу динамики плазменной концентрации фексофенадина – рекомендованного – EMEA маркерного субстрата белка-транспортера [86]. Фексофенадин является H1-гистаминолитиком III-го поколения, который не подвергается биотрансформации, выводится P-gp на 90% печенью и на 10% почками [87, 105, 201]. Фексофенадин (препарат «Телфаст» 180 мг; производитель: Aventis Pharma, Италия) вводился однократно внутрижелудочно через зонд в дозе 67,5 мг/кг массы тела животного, в форме свежеприготовленной суспензии, до, после 14-дневного введения вилдаглиптина, гликвидона или их комбинации и на 5-й день отмены препаратов, а также на фоне СД 2-го типа до лечения (в сериях с патологией). Пробы крови отбирали в объеме 3-5 мл из краевой вены уха кролика в гепаринизированные пробирки через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после однократного внутрижелудочного введения фексофенадина, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму хранили при -28C до анализа [5]. Используя модельно-независимый метод, при помощи программы «Kinetica 5.0», рассчитывали фармакокинетические параметры фексофенадина: - Сmax – максимальная концентрация (нг/мл); - Тmax – время достижения максимальной концентрации (ч); - AUC0 – площадь под кривой «концентрация - время» от нуля до последнего забора крови (нг/мл)ч; - AUC0- – площадь под кривой «концентрация - время» от нуля до бесконечности (нг/мл)ч; - T – период полувыведения (ч); - MRT – среднее время удерживания препарата в системном кровотоке (ч); - Cl – общий клиренс (л/ч); - Vd – объем распределения (л). Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Стайер» (Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV104 и обращено-фазовой колонкой Ultrasphere фирмы «Вескman Coulter» 4,6 250 мм (зернение 5 мкм). Анализ выполняли при длине волны 220 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин.
Экстракцию фексофенадина из плазмы крови осуществляли с помощью метода жидкостной экстракции в органическую фазу. Для этого к 2 мл плазмы добавляли 375 мкл 2 н кислоты хлористоводородной, встряхивали на приборе «Vortex», после чего добавляли по 2 мл дихлорметана (ACROS ORGANICS), этилацетата (ACROS ORGANICS) и диэтилового эфира (ХИММЕД) марок «для ВЭЖХ» или «ХЧ», помещали на встряхиватель для пробирок на 10 минут. После чего пробы центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин, отделившийся органический слой переносили в колбу для выпаривания и удаляли органический растворитель при помощи роторно-вакуумного испарителя. Затем сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы, 100 мкл полученного раствора вкалывали в хроматографическую колонку. Коэффициент экстракции фексофенадина из плазмы крови составил 64%.
Элюирование выполняли подвижной фазой следующего состава (на 200 мл): 64 мл ацетонитрила, 133,7 мл бидистиллированной воды, 2,33 мл ледяной уксусной кислоты (ХИММЕД) и 0,936 мл триэтиламина (ACROS ORGANICS), доведенной триэтиламином до pH=4,3. Все реактивы имели марку «для ВЭЖХ» или «ХЧ». Время удерживания пика фексофенадина составило 12,31±0,01 мин.
Определение концентрации фексофенадина в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Калибровочные растворы готовили добавлением в плазму интактных кроликов рассчитанного количества стандарта фексофенадина гидрохлорида с концентрацией 10 мкг/мл.
Калибровочную зависимость высот хроматографических пиков от концентраций фексофенадина определяли для диапазона 25 – 1000 нг/мл. Калибровочный график строили по 8 точкам, для каждой точки выполняли по 8 измерений.
Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне нормы
При введении гликвидона в дозе 10 мг/кг массы курсом 14 дней не выявлены достоверные изменения фармакокинетических параметров маркерного субстрата P-gp – фексофенадина, между исходными значениями, показателями после 14-й день введения гликвидона и на 5-й день его отмены (таблица 13). Однако, наблюдалась тенденция к изменениям фармакокинетики фексофенадина, характерным для индукции функциональной активности P-gp, заметная как после 14-дневного введения изучаемого производного сульфонилмочевины, так и на 5-й день его отмены. Установлено снижение показателей Сmax, AUC0, AUC0-, увеличение Cl и Vd (р 0,05%) фексофенадина после введения гликвидона по отношению к исходным параметрам.
Достоверных отличий в тканях тощей кишки, печени и почек, а также гематоэнцефалическом барьере между экспрессией P-gp в контрольной группе, после 14-дневного введения гликвидона на фоне нормы и на 5-й день его отмены не обнаружено (рисунок 24; таблица 14). Таблица 15. Изменения уровней инсулина и глюкозы после введения гликвидона (10 мг/кг) на фоне нормы (Mean±SD или Media (lq; uq))
При введении гликвидона в дозе 10 мг/кг массы курсом 14 суток выявлено только статистически достоверное снижение средних значений глюкозы натощак после 14 дней введения на 17,4% (p 0,05) и на 20,74% (p 0,05) на 5-е сутки отмены препарата (таблица 15). В условиях снижения уровня эндогенного ингибитора P-gp – глюкозы, предполагалось, что будет наблюдаться индукция P-gp. Однако указанного явления не происходило.
Таким образом, внутрижелудочное введение интактным кроликам гликвидона в дозе 10 мг/кг массы тела в течение 14 дней не вызывает достоверных изменений функциональной активности P-gp, несмотря на снижение уровня тощаковой глюкозы крови и наметившуюся тенденцию к изменениям фармакокинетических параметров, характерным для индукции белка-транспортера. Экспрессия Р-gp в тканях тощей кишки, печени, почек и гематоэнцефалическом барьере головного мозга после 14-дневного введения гликвидона не менялась. Транспортная функция, экспрессия ABCB1 белка и концентрация базальной глюкозы крови сохранялись на исходном уровне и на 5-е сутки отмены препарата. Полученные результаты опубликованы в статье: Титов Д.С., Правкин С.К. Эффективность и безопасность фармакотерапии на фоне применения гликвидона. Российский медицинский журнал. 2016. №4. С.203-206 [10].
Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность P-gp у кроликов оценивали по фармакокинетическим параметрам фексофенадина после его однократного введения (таблицы 16, 17 и 18). Таблица 16. Динамика индивидуальных значений концентрации фексофенадина (67,5 мг/кг) в плазме крови у интактных кроликов на фоне 14-дневного введения комбинации вилдаглиптина (5 мг/кг) и гликвидона (10 мг/кг) и на 5-й день отмены препаратов № К1 К2 К3 К4 К5 К6 К7 К8 К1 К2 К3 К4 К5 К6 К7 К8 К1 К2 К3 К4 К5 К6 К7 К8 Концентрация фексофенадина, нг/мл
При введении комбинации вилдаглиптина в дозе 5 мг/кг и гликвидона в дозе 10 мг/кг массы курсом 14 дней фармакокинетические параметры фексофенадина достоверно не изменялись по сравнению с исходными данными. В периоде отмены выявлены следующие изменения фармакокинетики маркерного субстрата P-gp – фексофенадина (таблица 21): достоверное увеличение медианы T на 5-й день отмены на 237,2% (p 0,05) / ( среднего геометрического T на 249,85% (p 0,05) (90% ДИ 123,76%; 446,98%) по сравнению с исходными значениями и достоверное среднего геометрического T на 182,98% (p 0,05) (90% ДИ 55,33%; 414,55%) по сравнению со значениями после введении комбинации вилдаглиптина и гликвидона курсом 14 дней; достоверное увеличение средних значений AUC0 на 5-й день отмены комбинации препаратов на 46,11% (p 0,05) / ( среднего геометрического AUC0 на 50,21% (p 0,05) (90% ДИ 22,88%; 83,63%) по сравнению с исходными значениями и достоверное увеличение средних значений AUC0 на 5-й день отмены на 37,21% (p 0,05) / ( среднего геометрического AUC0 на 40,71% (p 0,05) (90% ДИ 5,39%; 87,88%) по сравнению со значениями после введении комбинации вилдаглиптина и гликвидона курсом 14 дней; достоверное увеличение медианы AUC0- на 5-й день отмены на 197,75% (p 0,05) / ( среднего геометрического AUC0- на 257,25% (p 0,05) (90% ДИ 109%; 510,67%) по сравнению с исходными значениями и достоверное увеличение медианы AUC0- на 5-й день отмены на 140,93% (p 0,05) / ( среднего геометрического AUC0- на 214,01% (p 0,05) (90% ДИ 59,21%; 519,33%) по сравнению со значениями после введении комбинации вилдаглиптина и гликвидона курсом 14 дней; достоверное увеличение медианы MRT на 5-й день отмены на 229,42% (p 0,05) / ( среднего геометрического MRT на 240% (p 0,05) (90% ДИ 119,34%; 427,06%) по сравнению с исходными значениями и достоверное увеличение медианы MRT на 5-й день отмены на 204,42% (p 0,05) / ( среднего геометрического MRT на 190,29% (p 0,05) (90% ДИ 62,8%; 417,63%) по сравнению со значениями после введении комбинации вилдаглиптина и гликвидона курсом 14 дней, а также достоверное снижение средних значений Cl на 68,66% (p 0,05) / ( среднего геометрического Cl на 72,01% (p 0,05) (90% ДИ 52,15%; 83,63%) по сравнению с исходными значениями и достоверное снижение средних значений Cl на 65,01% (p 0,05) / ( среднего геометрического Cl на 68,16% (p 0,05) (90% ДИ 37,19%; 83,86%) по сравнению со значениями после введении комбинации вилдаглиптина и гликвидона курсом 14 дней.
Полученные изменения свидетельствуют об увеличении концентрации фексофенадина в крови за счет увеличения абсорбции и замедления выведения маркерного субстрата, что указывает на ингибирование функциональной активности белка-транспортера P-gp в кишечнике и печени на 5-й день отмены комбинации изучаемых препаратов.
Влияние комбинации вилдаглиптина и гликвидона на функциональную активность и уровень экспрессии гликопротеина-Р на фоне сахарного диабета 2-го типа
При введении гликвидона в дозе 10 мг/кг массы курсом 14 дней на фоне СД 2-го типа наблюдались достоверные изменения следующих фармакокинетических параметров маркерного субстрата P-gp – фексофенадина (таблица 33): - увеличение медианы значений Сmax на фоне СД 2-го типа на 90,93% (p 0,05) / ( среднего геометрического Сmax на 104,98% (p 0,05) (90% ДИ 34,59%; 212,2%)) по сравнению с исходными значениями; - снижение медианы значений Сmax на фоне 14 дней введения гликвидона на 38,77% (p 0,05) / ( среднего геометрического Сmax на 51,2% (p 0,05) (90% ДИ 34,48%; 63,66%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа; - увеличение медианы значений Сmax на 5-й день отмены на 54,47% (p 0,05) и на 32,14% (p 0,05) / ( среднего геометрического Сmax на 42,51% (p 0,05) (90% ДИ 21,19%; 67,59%) и на 42,47% (p 0,05) (90% ДИ 14,64%; 77,06%)) по сравнению с исходными значениями и по сравнению со значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона, соответственно, а также снижение среднего геометрического Сmax на 30,48% (p 0,05) (90% ДИ 1,23%; 51,06%) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа; - увеличение среднего геометрического T на фоне СД 2-го типа на 118,7% (p 0,05) (90% ДИ 53,74%; 211,1%) по сравнению с исходными значениями; 122 - увеличение среднего геометрического Т/4 на фоне 14-дневного введения гликвидона на 80,38% (р 0,05) (90% ДИ 29,76%; 150,75%) по сравнению с исходными значениями; - увеличение медианы значений Т/4 на 5-й день отмены на 96,92% (р 0,05) / ( среднего геометрического Т/4 на 160,54% (р 0,05) (90% ДИ 92,71%; 252,25%) по сравнению с исходными значениями; - увеличение среднего значения AUC0 на фоне СД 2-го типа на 115,36% (р 0,05) / ( среднего геометрического AUC0 на 112,95% (р 0,05) (90% ДИ 86,45%; 143,21%)) по сравнению с исходными значениями; - снижение среднего значения AUCo на фоне 14 дней введения гликвидона на 45,71% (р 0,05) / среднего геометрического AUCo на 47,16% (р 0,05) (90% ДИ 36,48%; 56,05%) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа; - снижение среднего значения AUCo на 5-й день отмены на 29,68% (р 0,05) / ( среднего геометрического AUCo на 28,31% (р 0,05) (90% ДИ 16,82%; 38,21%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа; - увеличение среднего значения AUCo на 5-й день отмены на 51,43% (р 0,05) и на 29,53% (р 0,05) / ( среднего геометрического AUCo на 52,67% (р 0,05) (90% ДИ 35,87%; 71,54%) и на 35,67% (р 0,05) (90% ДИ 8,03%; 70,39%)) по сравнению с исходными значениями и значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона, соответственно; - увеличение медианы значений AUCo- на фоне СД 2-го типа на 262,02% (р 0,05) / ( среднего геометрического AUCo- на 248,49% (р 0,05) (90% ДИ 201,2%; 303,22%)) по сравнению с исходными значениями; - снижение медианы значений AUCo- на фоне 14-дневного введения гликвидона на 54,05% (р 0,05) / среднего геометрического AUCo- на 53,67% (р 0,05) (90% ДИ 29,45%; 69,58%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа и увеличение среднего геометрического AUCo- на 61,45% (р 0,05) (90% ДИ 8,12%; 141,01%) по сравнению с исходными значениями; - увеличение медианы значений AUCo- x на 5-й день отмены гликвидона на 138,49% (р 0,05) / ( среднего геометрического AUCo-oo на 188,08% (р 0,05) (90% ДИ 113,22%; 289,24%)) по сравнению с исходными значениями и увеличение среднего геометрического AUCo-oo на 78,43% (р 0,05) (90% ДИ 15,82%; 174,9%) по сравнению со значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона; - снижение среднего значения С1 на фоне СД 2-го типа на 71,61% (р 0,05) / Ц среднего геометрического С1 на 71,31% (р 0,05) (90% ДИ 66,8%; 75,2%)) по сравнению с исходными значениями; - увеличение среднего значения С1 на фоне 14-дневного введения гликвидона на 136,5% (р 0,05) / ( среднего геометрического С1 на 115,87% (р 0,05) (90% ДИ 41,76%; 228,7%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа и снижение среднего значения С1 на 32,87% (р 0,05) / Ц среднего геометрического С1 на 38,06% (р 0,05) (90% ДИ I 7,51%; I 58,52%)) по сравнению с исходными значениями; - снижение среднего значений С1 на 5-й день отмены гликвидона на 62,25% (р 0,05) и 43,77% (р 0,05) / Ц среднего геометрического С1 на 65,31% (р 0,05) (90% ДИ I 53,12%; I 74,33%) и на 44% (р 0,05) (90% ДИ I 13,68%; I 63,66%)) по сравнению с исходными значениями и значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона, соответственно; - снижение среднего значения Vd на фоне СД 2-го типа на 36,02% (р 0,05) / Ц среднего геометрического Vd на 38,7% (р 0,05) (90% ДИ I 23,76%; I 50,71%) по сравнению с исходными значениями; - увеличение среднего значения Vd на фоне 14-дневного введения гликвидона на 79,05% (р 0,05) / ( среднего геометрического Vd на 79,26% (р 0,05) (90% ДИ 49,87%; 114,41%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа; - увеличение среднего значения Vd на 5-й день отмены гликвидона на 36,45% (р 0,05) / ( среднего геометрического Vd на 42,35% (р 0,05) (90% ДИ 14,32%; 77,25%)) по сравнению со значениями на фоне СД 2-го типа и 124 снижение среднего значения Vd на 23,79% (p 0,05) по сравнению со значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона; - увеличение среднего геометрического MRT на фоне СД 2-го типа на 113,55% (p 0,05) (90% ДИ 54,82%; 194,55%) по сравнению с исходными значениями; - увеличение среднего геометрического MRT на фоне 14-дневного введения гликвидона на 77,35% (p 0,05) (90% ДИ 30,43%; 141,14%) по сравнению с исходными значениями и увеличение медианы значений MRT на 5-й день отмены гликвидона на 185,23% (p 0,05) / ( среднего геометрического MRT на 151,4% (p 0,05) (90% ДИ 89,03%; 234,36%)) по сравнению с исходными значениями.
Полученные достоверные изменения ( Сmax, AUC0, AUC0-, T, MRT, Cl, Vd) свидетельствуют об увеличении концентрации фексофенадина в крови за счет увеличения абсорбции и замедления выведения маркерного субстрата, что указывает на ингибирование функциональной активности P-gp на фоне СД 2-го типа по сравнению с исходными значениями. Возвращение до исходных значений на фоне 14-дневного введения гликвидона животным с СД 2-го типа ряда фармакокинетических параметров (Сmax, AUC0, и Vd), а также тенденция к нормализации AUC0- и Cl свидетельствуют о, как минимум, частичном восстановлении функциональной активности P-gp. При этом, на 5-й день отмены гликвидона фармакокинетические показатели ( Сmax, AUC0, AUC0- и Cl) достоверно демонстрировали ингибирование функциональной активности P-gp по сравнению с исходными значениями и значениями на фоне 14-дневного введения гликвидона.