Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 17
1.1. Характеристика нестероидных противовоспалительных средств 17
1.2. Обоснование возможности применения прокаина и таурина с целью предотвращения или ослабления ульцерогенного действия кеторолака трометамина 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Методы исследования анальгетической активности 49
2.1.1. Исследование болевой реакции, вызываемой химическими агента-та- 49 ми
2.1.2. Метод исследования болевой реакции, вызываемой раздражением 50 электрическим током
2.1.3. Метод исследования болевой реакции при термическом воздей- 51 ствии .
2.2. Методы изучения ульцерогенного действия нестероидных противо- 51 воспалительных средств 52
2.3. Метод исследования свртывающей системы крови 53
2.4. Метод регистрации осмотических и кислотных эритрограмм .
2.5. Метод исследования структурных свойств белков с помощью кис- 56 лотно-основного титрования 59
2.6. Метод исследования оптических свойств белков. 60
2.7. Методы морфологических исследований 62
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Сравнительное изучение анальгетической активности диклофенака 62 натрия и кеторолака трометамина
3.2. Изучение ульцерогенного действия кетороака трометамина на фоне применения прокаина и таурина 67
3.3. Патоморфологические исследования 70
3.4. Исследование влияния кеторолака трометамина и его комбинированного применения с прокаином и таурином на свртывающую систему крови 89
3.5. Изучение структурно- функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных диклофенаком натрия, кеторолака тромета-мином, прокаином, таурином, и комбинациями кеторолака трометамина
с прокаином и таурином 91
3.5.1. Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных диклофенаком натрия 91
3.5.1.1. Изучение влияния диклофенака натрия на кислотную резистентность мембран эритроцитов 92
3.5.1.2. Изучение влияния диклофенака натрия на гипоосмотическую резистентность мембран эритроцитов 98
3.5.2. Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных кеторолака трометамином 101
3.5.2.1. Изучение влияния кеторолака трометамина на кислотную резистентность мембран эритроцитов 101
3.5.2.2.Изучение влияния кеторолака трометамина на гипоосмотиче скую резистентность мембран эритроцитов 105
3.5.3. Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных прокаином 109
3.5.3.1. Изучение влияния прокаина на кислотную резистентность мембран эритроцитов 111
3.5.3.2. Изучение влияния прокаина на гипоосмотическую резистентность мембран эритроцитов 115
3.5.4. Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных таурином 118
3.5.4.1. Изучение влияния таурина на кислотную резистентность мембран эритроцитов 119
3.5.4.2. Изучение влияния таурина на гипоосмотическую резистент ность мембран эритроцитов 124
3.5.5. Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритро цитов, модифицированных кеторолака трометамином в комбинациях спрокаином и таурином 127
3.5.5.1. Изучение влияния кеторолака трометамином в комбинациях с прокаином и таурином на кислотную резистентность мембран эритроцитов 128
3.5.5.2. Изучение влияния кеторолака трометамином в комбинациях с прокаином и таурином на гипоосмотическую резистентность мембран эритроцитов 133
3.5.5.3. Изучение влияния кеторолака трометамина в комбинациях с прокаином и таурином на кислотную и гипоосмотическую резистентность мембран эритроцитов в опытах invivo 1 3.6. Изучение влияния диклофенака натрия, кеторолака трометамина, прокаина, таурина и их комбинаций на оптические свойства белков 140
3.7. Изучение влияния диклофенака натрия, кеторолака трометамина, прокаина, таурина и их комбинаций на буферные свойства белков 145
Резюме 152
ГЛАВА 4. Заключение 153
Выводы 171
Список литературы
- Обоснование возможности применения прокаина и таурина с целью предотвращения или ослабления ульцерогенного действия кеторолака трометамина
- Метод исследования болевой реакции, вызываемой раздражением 50 электрическим током
- Изучение ульцерогенного действия кетороака трометамина на фоне применения прокаина и таурина
- Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных прокаином
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) широко применяются в лечебной практике (А.Е. Каратеев, 2015; Р.М. Балабанова, 2010; Е.Л. Насонов 2006;). Однако проблема переносимости и безопасности НПВС стоит особенно остро (А.Е. Карате-ев, 2015; E.J. Frech, M.F. Go, 2009). Нестероидная гастропатия (НПВП-гастропатия) представляет собой специфический синдром, преимущественно проявляется поражением слизистой оболочки желудка (СОЖ), с появлением эритемы, эрозий и/или язв и признана одним из самых распространённых серьёзных осложнений терапии НПВС. В настоящее время ведутся исследования, направленные на выявление неизвестных механизмов формирования НПВП-гастропатии и разработка новых лекарственных препаратов для лечения и профилактики осложнений (В.Т. Ивашкин, 2016; А. Е. Каратеев, 2008).
Для предотвращения и лечения НПВС–зависимых гастропатий используют ингибиторы протонной помпы, блокаторы Н2 рецепторов гистамина, антациды, средства механически защищающие эрозивно-язвенное поражение, а так же новые препараты, например гастропротектор ребамипид– синтетический аналог простагландина E2 (Государственный реестр лекарственных средств, 2017; А.С. Сухих, 2016; Е.Л. Насонов, 2008). Однако установлено, что ингибиторы Н2-гистаминовых рецепторов, местно действующие препараты висмута, антациды недостаточно эффективны в лечении и профилактике язв желудка у лиц, длительно принимающих нестероидные противовоспалительные препараты (О.А. Сторонова, 2015; R.Micklewright, 2003).
Из всех перечисленных препаратов наиболее эффективными считаются ингибиторы протонной помпы. Однако их эффективность уменьшается при локализации поражения в слизистой желудка, длительном применении НПВС и отсутствии Н.pylori (Е.Л. Насонов, 2006). Кроме этого препараты, снижающие кислотность желудочного сока (блокаторы Н2-гистаминовых рецепторов, ингибиторы протонный помпы, антациды), при их длительном применении повышают внутрижелудочное pН и способны вызвать нарушение процессов пищеварения, что проявляется клинической картиной диспепсического синдрома. Длительное повышение рН, с одной стороны, значительно ослабляет барьер для патогенной и условно-патогенной флоры, попадающей в желудочно-кишечный тракт. Стойкое подавление желудочной секреции, с другой стороны, вызывает гиперга-стринемию, что чревато возникновением дис- и метапластических процессов в желудочном эпителии (на фоне хронического воспаления) (Т.Е. Морозова 2015, В.Т. Ивашкин, 2015). Поэтому разработка новых способов профилактики НПВС-гастропатии и уточнение механизмов повреждающего действия НПВС на клеточном уровне является актуальным.
Степень разработанности темы исследования.
Используемые в настоящее время зарегистрированные препараты, снижающие кислотность желудочного сока (блокаторы Н2-гистаминовых рецепторов, ингибиторы протонный помпы, антациды), при их длительном применении повышают внутрижелудочное pН и способны вызвать нарушение процессов пищеварения, что проявляется клинической картиной диспепсического синдрома. Длительное повышение рН, с одной стороны, значительно ослабляет ба-3
рьер для патогенной и условно-патогенной флоры, попадающей в желудочно-кишечный тракт. Стойкое подавление желудочной секреции, с другой стороны, вызывает гипергастринемию, что чревато возникновением дис- и метопласти-ческих процессов в желудочном эпителии (на фоне хронического воспаления) (Т.Е. Морозова, 2015).
Известно, что энтеральное применение прокаина при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки в дозах, соответствующих терапевтическому диапазону (0,25–0,5% раствор до 30–50 мл 2–3 раза в день) хорошо переносится и характеризуется отсутствием побочных эффектов, в частности в связи с тем, что плохо проникает через слизистые оболочки [Машковский М.Д., 2012]. Кроме этого прокаин обладает местным анестезирующим действием, обеспечивая снижение выраженности болей в эпигастрии. Следует подчеркнуть, что прокаин блокирует ионные каналы мембраны клеток и при этом не влияет на кислотность желудочного сока.
Таурин характеризуется практически полным отсутствием побочных эффектов. Таурин обладает мембранопротекторным свойствами, нормализует соотношение фосфолипидов мембран клеток, регулирует окислительные процессы и проявляет антиоксидантные свойства, снижает степень апоптоза эндотели-альных клеток, предупреждает чрезмерный выход кальция из клеток, обладает рядом положительных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы, обладает кардио- радио- и гепатопротекторными свойствами, участвует в конъюгации желчных кислот и предотвращает холестаз, участвует в регуляции секреции ГАМК, обладает гипогликемическим и гиполипидемическим свойствами [В.К. Поздеев, 2015; Е.В. Ших, 2015].
Тем не менее, несмотря на ряд свойств, позволяющих предположить наличие гастропротекторного эффекта, для профилактики НПВС индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка прокаин и таурин в клинической практике в настоящее время не используются.
Цель исследования: разработка новых способов профилактики НПВС-гастропатии при помощи перорального курсового применения таурина и прокаина, а также изучение клеточных механизмов повреждающего действия диклофенака натрия и кеторолака трометамина.
Задачи исследования:
-
В опытах in vitro и in vivo изучить дополнительные механизмы повреждающего действия диклофенака натрия и кеторолака трометамина в эффективных анальгетических дозах на мембраны клеток и белковые молекулы крови белых беспородных крыс.
-
На модели гемолиза эритроцитов, при изучении оптических и буферных свойств гемоглобина крови белых беспородных крыс изучить влияние на мембраны клеток и белковые молекулы: а) прокаина; б) таурина; в) комбинации прокаин + кеторолака тро-метамин; г) таурин + кеторолака трометамин.
-
Изучить эффективность перорального профилактического применения прокаина и таурина при НПВС-гастропатии, индуцированной кеторолака трометамином в дозе УД50 по критерию количество язв и данным патоморфологических исследований слизистой оболочки желудка белых беспородных крыс.
4. Подтвердить отсутствие гепатотоксического и нефротоксического действия прокаина и таурина при профилактике НПВС-гастропатии в эксперименте по данным патоморфологических исследований.
Научная новизна исследования.
Впервые выявлены новые компоненты механизма повреждающего действия
НПВС на примере диклофенака натрия и кеторолака трометамина в определенных экс
периментальным путем эффективных анальгетических дозах (диклофенак натрия
2,25мг/кг-9мг/кг, кеторолака трометамин 0,1875мг/кг 0,75мг/кг) на мембрану клеток и
слизистую оболочку желудка, заключающиеся в изменении структурно-
функциональных свойств белковых молекул, что приводит к уменьшению кислотной и гипоосмотической резистентности клеток.
Установлено, что прокаин и таурин проявляют мембранопротекторный эффект, так как увеличивают в опытах in vitro и in vivo кислотную и гипоосмотическую резистентность клеток к действию повреждающих факторов, как при использовании в отдельности, так и в случае их комбинированного применения с кеторолака трометамином.
Предложены новые эффективные способы защиты слизистой оболочки желудка от повреждающего действия НПВС, которые заключаются в 7 дневном профилактическом приёме таурина (в дозе 7,14 мг/кг) или прокаина (в дозе 1,07 мг/кг). (Методические рекомендации «Способ профилактики НПВС-гастропатии». Патент №2449784, Патент №2455984).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Впервые проведены экспериментальные исследования in vitro и in vivo, позволившие уточнить и дополнить сведения о повреждающем действии НПВС на слизистую оболочку ЖКТ и мембраны клеток. Выдвинуто предположение, что помимо основного известного механизма повреждающего действия кеторолака тро-метамина и диклофенака натрия, обусловленного фармакологическими свойствами, имеет место быть взаимодействие их с белково-липидными комплексами мембран клеток, проявляющееся в изменении структурно-функциональных свойств белковых молекул, что приводит к уменьшению кислотной и гипоосмотической резистентности клеток. Установлено, что известные лекарственные средства – таурин и прокаин, эффективно предупреждают повреждения слизистой оболочки желудка, индуцированные применением кеторолака трометамина, и определены их оптимальные профилактические дозы.
Практическая значимость работы заключается в том, что предложено использование таурина и прокаина по новому показанию к применению – для плановой профилактики НПВС-гастропатии, что имеет потенциально высокую практическую значимость ввиду высокой эффективности, низкого риска побочных эффектов и низкой стоимости фармакотерапии данными известными лекарственными препаратами.
Методология и методы диссертационного исследования.
При проведении экспериментальных исследований соблюдали методические рекомендации «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств», части первой (Миронов А.Н., 2012). Исследования проведено на базе фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Воронежский госу-
дарственный университет», отдела патоморфологии ГНУ ВНИВИПФиТ РАСХН на белых беспородных конвенциональных половозрелых мышах, крысах. Методологический подход был основан на выполнении комплекса теоретических, биофизических, фармакологических, гистологических, статистических методов, что обеспечило возможность выполнения задач исследования. Исследования проведены с соблюдением этических принципов экспериментов над животными с учетом требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях.
Положения, выносимые на защиту:
-
Изучены новые компоненты механизма повреждающего действия диклофенака натрия и кеторолака трометамина на клеточные мембраны, заключающиеся в способности вызывать ослабление или разрыв внутримолекулярных связей, стабилизирующих молекулу белка, что связано с диссоциацией NН+-групп имидазольного кольца гистиди-на, концевых -аминогрупп, сульфгидрильных групп цистеина, фенольных групп тирозина, -аминогрупп лизина и проявляется в увеличении глубины денатурации.
-
Прокаин и таурин увеличивают кислотную и гипоосмотическую резистентность клеток на модели гемолиза эритроцитов.
-
В опытах in vitro и in vivo показано, что прокаин и таурин ослабляют повреждение мембран клеток, индуцированное кеторолака трометамином
-
Профилактическое применение прокаина и таурина снижает количество эрозив-но-язвенных дефектов и препятствует изменению морфологической структуры слизистой оболочки желудка, индуцированного кеторолака трометамином.
-
Морфологическая структура печени и почек при применении прокаина и таури-на в комбинации с кеторолака трометамином не изменяется и остаётся в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об отсутствии гепатотоксического и нефроток-сического действия.
Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность полученных результатов базируется на использовании современных методов, приборов и устройств, достаточном объеме проведенных экспериментов, репрезентативности выборки (728 особей лабораторных животных, не менее чем по 6 особей в группе) и адекватной статистической обработке полученной информации с использованием параметрических критериев (t-критерий Стъюдента) и непараметрических критериев (критерий Вилкоксона и U критерий Манна-Уитни).
Результаты диссертационного исследования доложены и представлены на региональных, всероссийских и международных научных конференциях, ежегодных научных сессиях ФГБОУ ВО «Воронежского государственного университета» с 2007 г. по 2011 г.; IX и X международных конгрессах «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва 2008-2009 г.), XLVII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс. Медицина» (Новосибирск 2009 г.), XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье (Санкт-Петербург 2011 г.), Всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Проблемы здоровьесбе-режения дошкольников, учащихся и студентов. Новые здоровьесберегающие тенденции
в фармации и медицине» (Воронеж 2011), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск 2011). Апробация диссертации проведена на межкафедральном заседании фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ВГУ (протокол № 1503-08б от 22.03.2017).
Личный вклад в проведённое исследование. Автор принимал непосредственное участие в разработке идеи, состоящей в получении дополнительных знаний о непосредственном повреждающем действии НПВС на соматические клетки организма. На основе результатов проведенных исследований было предложено провести поиск среди известных лекарственных препаратов, средств, предупреждающих ульцерогенное действие НПВС. Им определена цель и задачи исследования, проведён анализ литературы. Самостоятельно спланированы и проведены все экспериментальные исследования in vitro и in vivo, результаты полученных исследований подвергнуты математической статистике, на основании этого сделаны объективные и достоверные выводы, разработаны способы профилактики НПВС-гастропатии для практического здравоохранения. Автором лично проведено описание полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации и основных публикаций по теме выполненной диссертационной работы (17 печатных работ, из них 5 в изданиях ВАК, 2 патента РФ на изобретение).
Публикация результатов. Опубликовано 17 работ, из них 5 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационной работы и 2 патента на изобретение.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 201 странице текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы с результатами проведённых исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 288 литературных источников, из которых 158 отечественных и 130 иностранных авторов. Работа проиллюстрирована 27 таблицами и 13 рисунками.
Обоснование возможности применения прокаина и таурина с целью предотвращения или ослабления ульцерогенного действия кеторолака трометамина
Следующий этап в раскрытии механизма действия НПВС был достигнут в начале 90-х годов ХХ века. Появились новые данные, касающиеся фундаментального значения ПГ как центральных паракринно/ аутокринных медиаторов важнейших процессов, протекающих в организме человека: эмбриогенез, овуляция и беременность, костный метаболизм, рост и развитие клеток нервной системы, репарация тканей, функция почек и ЖКТ, тонус сосудов и свртывания крови иммунный ответ и воспаление, клеточный апоптоз и некоторые другие. Установлено, что эти эффекты опосредуются связыванием ПГ с G-цитоплазматическими (ЕР1 для ПГ2) и ядерными (PPAR,PPA и PPA) рецепторами, действующими напрямую в качестве факторов транскрипции [94, 142].
ЦОГ-1 находится в эндоплазматическом ретикулуме, а ЦОГ-2 – как в эндо-плазматическом ретикулуме, так и в ядерной мембране, причм ЦОГ-1 и ЦОГ-2 используют разные пулы арахидоновой кислоты, которые метаболизируются под влиянием различных стимулов. Полагают, что ядерная локализация ЦОГ-2 позволяет ей взаимодействовать с перечисленными выше ядерными ПГ-рецепторами и регулировать экспрессию некоторых клеточных генов [94, 142, 175]. ЦОГ–1 экспрессируется во всех тканях и способствует образованию ПГ, которые оказывают защитное влияние на слизистую оболочку желудка (ПГЕ2), способствуют агрегации тромбоцитов (ТКА2), нормализуют функции почек (ПГI2).
Напротив ЦОГ–2, в норме практически не выявляется в большинстве тканей [191, 230], хотя установлено, что она экспрессируется в головном мозге [217], почках и структурах сердечно–сосудистой системы (ССС) [196]. Однако, на фоне воспаления экспрессия ЦОГ–2 быстро нарастает на короткое время и регулируется цитокинами, факторами роста и факторами, вызывающими рост опухолей [22]. ЦОГ-2, участвуя в синтезе провоспалительных простагландинов, которые модулируют действие гистамина, серотонина, брадикинина, обеспечивают болевую импульсацию из очага воспаления, оказывает регулирующее влияние на центр тепловой регуляции [44, 173, 282]. Высокая активность ЦОГ-2 наблюдается так же в раковых клетках и атеросклеротических бляшках, где фермент соответственно тормозит естественные процессы апоптоза и способствует атерогенезу [108].
В настоящее время особое внимание привлечено к изучению роли ЦОГ-2 в регуляции эмбриогенеза, репродукции [94] и патогенезе патологических состояний, выходящих за рамки воспаления. К последним относят воспалительная гипе-ральгезия, эпилепсия и инсульт, атеротромбоз, злокачественные новообразования (аденоматоз, рак толстой кишки и др.), остеопороз, бронхиальная астма, воспалительные заболевания миокарда [75, 91,]. В последнее время появились новые сведения, позволяющие обсуждать роль ЦОГ-2 в патогенезе миокардитов [94, 142]. Другой аспект данной проблемы связан с изучением болезни Альцгеймера. Было показано, что клетки микроглии, выполняющие роль фагоцитирующих клеток ЦНС, при их патологической активации экспрессируют ЦОГ-2. При этом ингиби-ция ЦОГ-2 отменяет апоптоз нейрональных клеток. Это позволяет частично объяснить данные клинических исследований о том, что НПВС замедляют развитие симптомов болезни Альцгеймера [94].
В настоящее время достаточно полно раскрыт механизм основного действия кислоты ацетилсалициловой [1, 246]. Последняя, являясь сильным ацетилирую-щим агентом, при взаимодействии с любыми белками ацетилирует концевые группы аминогруппы лизина и серина, входящие в состав активного центра ЦОГ-1 и -2. Однако, при этом остатся неясным механизм противовоспалительного действия на субклеточном уровне неацетилированных салицилатов (салицилат натрия). Различия в механизме действия салицилатов и кислоты ацетилсалициловой проявляются в том, что применение кислоты ацетилсалициловой вызывает ульцерогенез, а неацетилированные салицилаты не действуют на слизистую оболочку желудка [1, 94, 96, 142].
В исследованиях Kullich W., Fagerer N., Schwann H. показано, что нимесу-лид, являясь препаратом первой линии при ревматических заболеваниях [40, 224, 225, 242, 243, 254, 272]. В отличие от кислоты ацетилсалициловой он является акцептором свободных радикалов глутатион S–трансферазы. Реактивные формы кислорода (РФК), играют роль в патогенезе ревматоидных заболеваний [227]. Zheng и соавторы [219] показали, что нимесулид и его активный метаболит 4–ОН нимесулид оказывают не только акцепторное действие на РФК, но могут также ингибировать свободные радикалы, сформированные хондроцитами во время течения ревматических процессов. Антиоксидантные свойства нимесулида могут положительно влиять на подавление воспалительныого процесса при ревматических заболеваниях [172, 193, 227, 249].
Ибупрофен, напроксен и пироксикам,наиболее часто используемые в клинической практике, оказывают противовоспалительное и обезболивающее действие, однако вследствие низкой селективной активности в отношении изоформ ЦОГ, вызывают побочные эффекты: желудочно-кишечные кровотечения и изъязвление слизистой оболочки желудка[213, 238].
Напротив, в отличие от напроксена, диклофенак натрия в первую очередь обратимо тормозящий функционирование ЦОГ–2 в меньшей степени вызывает повреждение слизистой оболочки ЖКТ [213].
НПВП последнего поколения – эторикоксиб, лумиракоксиб и вальдекок-сиб/парекоксиб, ингибирующие только ЦОГ – 2, обладают наименьшей гастро-токсичностью, что подтвержено многочисленными широкомасштабными контролируемыми испытаниями [86, 94,170, 211, 218, 285]. Однако, в отличие предыду 22 щих поколений они оказывают токсическое действие на сердечно-сосудистую систему [75, 181, 267]. Фармакологические и токсические свойства НПВС в значительной степени-зависят от их фармакокинетики [188]. Противовоспалительное действие НПВП обусловлено высокой концентрацией веществ в ткани при воспалении, однако их повышенное содержание в ЖКТ, почках, печени, крови и стенках сосудов к сожалению определяет частоту встречаемости и выраженность побочных эффектов [173,188]. В связи с этим в настоящее время разработаны современные стандарты терапии, как для селективных, так и для неселективных НПВП [76, 83, 88, 95, 241]. Даже кратковременный прим НПВС может приводить к развитию серьз-ных побочных эффектов[12]. Поэтому существует проблема безопасности применения НПВП.
Метод исследования болевой реакции, вызываемой раздражением 50 электрическим током
Для исследования свертывающей системы крови проводили запись коагуло-грамм на коагулографе [32] (коагулограф самопишущий Н 334, АО «Краснодарский ЗИП», Россия).
Регистрация параметров осуществлялась прибором коагулограф самопишущий переносной типа Н-334, который широко используется в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждениях. В коагулографе, являющимся электроизмерительным прибором, используется механическое перекатывание пробы крови по ячейке. Показателями служили следующие параметры: 1) Начало свртывания Т1,с; 2) Конец свртывания Т2,с; 3) Продолжительность процесса свртывания Т,с; 4) Скорость свртывания за первую минуту Vс1, отн.ед.; 5) Начало ретракции и фибринолиза Т3,с; 6) Время существования плотного сгустка Т4,с; 7) Степень коагуляции СК,%; 8) Коагулирующая активность КА, отн. ед.; 9) Степень фибринолиза СФ,%; 10) Фибринолитический потенциал ФП, отн.ед.; 11) Гемостатический потенциал ГП, отн. ед.;
Анализ периферической крови контрольной группы проводили после 16 часового голодания животных (крысы самцы m=180-250 г).
В экспериментальных группах анализ периферической крови проводился спустя 3 часа после перорального введения кеторолака трометамина в дозе соответствующей УД50 (0,94 мг/кг) и 16 часового предварительного голодания животных. В группах исследования свртывающей системы крови на фоне комбинированного прима кеторолака трометамина и прокаина, кеторолака трометамина и таурина животные в течение 7 дней получали внутрижелудочно с помощью зонда прокаин и таурин в дозах 1,07 и 7,14 мг/кг, затем после 16-часового голодания внутрижелудочно вводился кеторолака трометамин и спустя 3 часа снимали коа-гулограммы.
Кровь бралась из хвостовой вены, путм отсекания кончика хвоста. При этом предотвращался контакт крови с внешней поверхностью хвоста, следили чтобы края углубления в основании кюветы были чистыми от крови и не образовывался миниск. Перед взятием крови хвост крысы помещали в стакан с тплой водой (45 оС) на несколько минут. Первую каплю крови удаляли, остальными заполняли кювету.
Механическая устойчивость эритроцитов к гипоосмотической среде 0,55 % раствора хлорида натрия оценивали с помощью методики регистрации интегральных эритрограмм, разработанной на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета [126]. Для исследования кислотной резистентности эритроцитов использовали модифицированный метод регистрации кислотных эритрограмм, предложенный И.И. Гительзоном и Н.А.. Терсковым [19, 20, 126, 140].
Принцип метода регистрации осмотическойи кислотной резистентности эритроцитов заключается в фотометрической регистрациикинетики распада клеток, помещнных в гипоосмотический раствор хлориданатрия или путм добавления к суспензии 0,1 Н раствора соляной кислоты. Мерой стойкости для каждого эритроцита является время, в течение которого происходит его разрушение. Полученные данные позволяют построить эритрограмму. Эритрограмма – это кривая, отражающая последовательное во времени вступление эритроцитов разной стойкости вфазу гемолиза [5, 59, 261]. Аналитически этот процесс можно представить уравнением вида: G (%) = f(t).
Забор крови для проведения исследования структурно-функциональных свойств эритроцитов производился путм отсекания кончика хвоста у белых беспородных крыс самцов массой 180-250 г. в одно и тоже время – между 730 и 830 часами. Кровь самотком набирали в пробирку со стабилизатором (5% цитрат натрия или гепарин). Цельную кровь разводили физиологическим раствором и трижды центрифугировали при 3000об/мин в течение 10-15 минут с промежуточным отмыванием от стабилизатора и плазмы 0,9% раствором хлорида натрия.
Регистрацию эритрограмм проводили с помощью прибора ПЭ 5400 ВИ (спектрофотометр ПЭ 5400 ВИ, ООО «Экохим», Россия). Определение концентрации эритроцитов и регистрацию эритрограмм осуществляли спектрофотомет-рически.
Исследования осмотической резистентности эритроцитов крови белых беспородных крыс были проведены с помощью метода регистрации во времени кинетики осмотического гемолиза эритроцитов, помещнных в 0,55 % раствор NaCl. Выбор данной концентрации хлорида натрия в качестве «рабочего» раствора обусловлен созданием режима предгемолитического состояния эритроцитов, при котором они находятся в течение 15-30 минут встабильном положении. Такой подход обеспечил чувствительность метода. Кинетику гемолиза эритроцитов в 0,55% растворе NaCl (или растворе НСl) фиксировали непосредственно после добавления гипоосмотическогго раствора NaCl или 0,1 М НС1 к эритроцитарной взвеси (0,9% NaCl).
При проведении кислотного гемолиза эритроцитов регистрировали S-образную интегральную кривую (рис. 1), форма которой отражает суммарное изменение величины светорассеяния () в исследуемом растворе во времени,то есть =f(t). В процессе гемолиза скорость распада эритроцитов достигает максимального значения (Vmax) примерно в середине кривой.
Смещение S- образной кривой в первые минуты ниже нулевой линии связано со сферуляцией эритроцитов (участок 0 - 1 на рис. 1). Дальнейшая восходящая часть кривой гемолиза отражает разрушение наименее устойчивых эритроцитов (участок 1 - 2 на рис. 1), а при вступлении в процесс гемолиза основной массы эритроцитов регистрируется фаза собственного гемолиза (участок 2 - 3 на рис. 1). Период выхода на плато отражает разрушение наиболее стойких эритроцитов (участок 4 на рис.1).
Изучение ульцерогенного действия кетороака трометамина на фоне применения прокаина и таурина
При исследовании гистологических препаратов печени животных, получавших кеторолака трометамин в дозе 0,94 мг/кг, установлено наличие незначительных лимфоидных инфильтратов в области триады (Рис. 6). Однако, структурная организация паренхимы печени была сохранена в пределах нормы. Балочная система и дольки печени имели нормальное строение. Признаков деструктивных и некробиотических процессов не обнаружено.
Анализ гистологических препаратов почек показал, что введение кеторолака трометамина в указанной дозе сопровождалось некоторым изменением морфологической структуры (Рис. 7). При этом былиустановлены слабовыраженные дистрофические процессы в корковом слое. Архитектоника мозгового слоя оставалась в пределах нормы. Зарегистрирована серозная отчность в клубочковом аппарате и периклубочковой зоне, проявляющаяся увеличением зон просветления между эпителиальной капсулой и клубочковой капиллярной сети нефрона, а также дистрофией клеток извитых канальцев.
В случае предварительного применения таурина (внутрижелудочнов дозе 7,14 мг/кг в течение 7 суток) перед введением кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) слизистая оболочка желудка была лучше сохранена относительно применения кеторолака трометамина в отдельности (Рис. 8). В данном случае дефекты слизистой оболочки носили гораздо менее выраженный характер. Однако, в ходе анализа структурной организации слизистой оболочки желудка при применении кеторолака трометамина в комбинации с таурином было установлено наличие отдельных очажков десквамации апикальной части желз и дистрофии покровного слоя слизистой оболочки. Наряду с этим, плотность слизистого слоя (желз), относительно применения кеторолака трометамина в отдельности, была повышена и приближалась к контролю. Возможно, указанная положительная динамика связана с наличием у таурина доказанного антиоксидантного и мембранопротекторнного и других положительных эффектов со стороны ряда органов и систем. Кроме того, таурин способен предотвращать изменения внутриклеточного объма за счт регулирования уровня Cа2+ в клетке. Предполагается, что таурин способен взаимодействовать с некоторыми мембранными белками, изменяя их конформацию и, как следствие этого, структурно-функциональные свойства мембран клеток. Таурин нормализует соотношение фосфолипидов мембран клеток и, в первую очередь, отношение фосфатидилэтаноламина к фосфатидилхолину, а также отношение холестерина к фосфолипидам. Поэтому конечным результатом указанных механизмов может являться увеличение кислоной резистентности клеток слизистой оболочки желудка.
При анализе структурной организации печени крыс, которым перед применением кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) внутрижелудочно вводили таурин (7,14 мг/кг) установлено, что междольковая соединительная ткань в области триады умеренно развита, архитектоника паренхимы печени в прилежащей к триаде зоне равномерная (Рис. 9). Печночные дольки развиты равномерно и сохранялась балочная структура в дольке с нормальными гепатоцитами. Таким образом, признаков деструктивных, некротических и воспалительных процессов при профилактическом использовании таурина перед введением кеторолака трометамина не обнаружено. Исследование структурной организации почек у крыс, которым до введения кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) назначали профилактическое введение таурина (внутрижелудочно в дозе 7,14 мг/кг), показало увеличение плотности почечных клубочков в корковом слое, а также архитектоника мозгового слоя имела мозаичный характер. Кроме того в ходе изучения гистологических препаратов установлено незначительное расширение периклубочковой полости, просвета проксимальных нефронов и дистрофия клеток извитых канальцев (Рис. 10).
Структурная организация слизистой оболочки желудка при комбинированном применении прокаина (внутрижелудочно в дозе 1,07 мг/кг) и кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) характеризовалась нормальным строением без дистрофических процессов (Рис. 11). Аналогично комбинации с таурином плотность слизистого слоя (желз), относительно применения кеторолака трометамина в отдельности, была повышена и приближалась к контролю. Слизистый и подслизистый слои были без видимых патологических изменений. Таким образом, профилактическое применение прокаина вызывает уменьшение эрозивно-язвенных поражений желудка, индуцированных НПВС и кеторолака трометамином в частности. Возможно, это связано со способностью прокаина взаимодействовать с белково-липидными комплексами мембран клеток, вызывая изменения их конформации, что приводит к увеличению порога проницаемости для Н+.
Исследование гистологических препаратов печени крыс, которым перед введением кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) профилактически вводили прокаин (внутрижелудочно в дозе 1,07 мг/кг), показало, что дольковая структура выражена в пределах нормы (Рис. 12). В ряде случаев дольковая структура несколько сглажена. Также зарегистрировано набухание цитоплазмы вблизи центральной вены. Однако, в общем структурная организация паренхима печени при данном комбинированном применении кеторолака трометамина и прокаина оставалась в пределах нормы.
Структурная организация почек у группы животных, которым до введения кеторолака трометамина (внутрижелудочно в дозе 0,94 мг/кг) назначали прокаин (внутрижелудочно в дозе 1,07 мг/кг), отличалась наличием единичных клубочков в корковом слое, но в пределах нормы (Рис. 13). Кроме того, отмечено уплотнение структуры на границе коркового и мозгового слов, а также зернистая дистрофия клеток извитых канальцев. Отсутствовали признаки воспаления и деструктивных процессов. Следовательно, структурная организация почек у данной группы животных после окончания эксперимента также оставалась в пределах нормы.
Таким образом, профилактическое 7 дневное применение таурина (7,14 мг/кг) и прокаина (1,07 мг/кг) перед введением кеторолака трометамина (0,94 мг/кг) приводило к увеличению резистентности слизистой желудка к повреждающим факторам, что проявлялось нормализацией структурной организации слизистой оболочки желудка относительно применения кеторолака трометамина в отдельности. Структурная организация печени у крыс как контрольной, так и всех опытных групп оставалась в пределах нормы. Однако, при использовании кеторолака трометамина в отдельности зарегистрировано наличие незначительных лимфоидных инфильтратов в области триады печени. Структурная организация почек у крыс во всех случаях в общем оставалась в пределах нормы. Тем не менее, у всех групп животных, установлено незначительное накопление серозной жидкости в полости клубочков почек и слабовыраженные дистрофические процессы в случае применения кеторолака трометамина, а также его комбинации с таурином и прокаином.
Изучение структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов, модифицированных прокаином
Анализ результатов кислотного гемолиза эритроцитов показал, что спустя три часа после введения кеторолака, в дозе УД50, Kmax составила 7,115 отн.ед, что на 64,3% больше контрольного значения. Это свидетельствует об увеличении доли эритроцитов среднестойкой популяции, одновременно вступающих в стадию собственно гемолиза. В данном случае происходит возрастание относительно контроля доли среднестойких эритроцитов со сходными структурными изменениями, по причине модификации, которая сопровождается накоплением дфектов в мембране и преобладанием процессов деструктивного характера.
При профилактическом назначении животным таурина в дозе 7,14мг/кг по истечении трх часов от момента введения кеторолака в дозе УД50, Kmax была выше контроля на 30,9%. Однако, если сравнить значения Kmax в данном случае и при применении кеторолака трометамина в отдельности, отчтливо заметно снижение доли эритроцитов среднестойкой (основной) популяции, одновременно вступающих в стадию собственно гемолиза, при профилактическом назначении таурина. Предварительное введение таурина в указанной дозе приводит к снижению Kmax относительно кеторолака трометамина на 20,3%, а повреждающее действие последнего на фоне профилактического назначения таурина снижается более чем в два раза.
В случае предварительного профилактического назначения животным прокаина в дозе 1,07 мг/кг изменения значений показателя Kmax были аналогичными относительно применения таурина.
О влиянии исследуемых комбинаций лекарственных средств на популяцию низкостойких к кислотному гемолитику эритроцитов позволяет судить показатель Gсф. При профилактическом введении таурина и прокаина после введения кеторолака трометамина значения Gсф были относительно близкие и составили -2,43% и -2,17% соответственно. Значение данного показателя при введение одного кеторолака находятся ближе к контрольному. Таким образом, профилактическое применение таурина в дозе 7,14 мг/кг и прокаина в дозе 1,07 мг/кг вызвыло увеличение доли эритроцитов, одномоментно находящихся в стадии сфероцитоза в условиях кислотного гемолиза на 115,99% и 93,2% относительно применения кеторолака трометамина в отдельности и на 183,2%; 153,2% относительно контроля соответственно. Эти изменения указывают на чувствительность и распространение модифицирующего действия данных комбинаций в отношении низкостойкой популяции эритроцитов и могут свидетельствовать о замедлении перехода эритроцитов из стадии сферуляции к стадии собственно гемолиза или о модификации большего количества эритроцитов. Оба варианта объясняются взаимодействием с мембранными структурами. Возможно, чувствительность определнной доли низкостойких эритроцитов к комбинированному действию таурина (прокаина) и кеторолака трометамина повышена, о чм свидетельствует некоторое смещение S-образной кривой влево и одновременно с этим снижение угла е наклона относительно S-образной кривой кеторолака трометамина.
Также следует отметить, что при профилактическом использовании таурина и прокаина снижается общая доля гемолизированных эритроцитов, что нашло сво отражение в смещении участка перегиба и плато S-образной кривой кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных таурином (прокаином) и кеторолака трометамином вниз относительно таковой кеторолака трометамина в отдельности.
Анализ гипоосмотического гемолиза эритроцитов, который отражает наличие скрытых дефектов мембран, показал, что при введении таурина в дозе 7,14 мг/кг перед применением кеторолака в дозе УД50, уменьшается относительная скорость гипоосмотического гемолиза эритроцитов относительно кеторолака трометамина в отдельности на 77,3% и контроля на 23,6%. Данные изменения свидетельствуют о том, что профилактическое применение таурина приводит к модификации, которая связана с взаимодействием данного вещества с мембранными структурами эритроцитов и проявляется в увеличении порога проницаемости мембран для ионов и воды.
Профилактическое введение прокаина в дозе 1,07 гм/кг перед введением кеторолака трометамина в дозу УД50 также привело к уменьшению доли эритроцитов, одновременно вступающих в стадию собственно гипоосмотического гемолиза на 70,3% относительно опыта с кеторолака трометамином в отдельности. Это также показывает, что прокаин предотвращает повреждающее действие кеторолака трометамина на мембраны эритроцитов. Значения изучаемого показателя в данном эксперименте были равны значению контрольного опыта, на основании чего можно сделать заключение о том что прокаин несколько в меньшей мере предотвращает повреждение мембран клеток или в меньшей степени поступает в системный кровоток после перорального введения.
При анализе показателя G120 (который отражает действие на более стойкие к гипоосмотической среде эритроциты) было установлено, что предварительное применение таурина в дозе 7,14 мг/кг и прокаина в дозе 1,07 мг/кг перед введением кеторолака трометамина также увеличивает гипоосмотическую резистентность эритроцитов. Об этом свидетельствует снижение доли гемолизированных эритроцитов за 120 секунд эксперимента в случае предварительного введения таурина и прокаина перед назначением кеторолака трометамина на 58,58% и 50,9% соответственно относительно значения данного показателя при введении кеторолака трометамина в отдельности. Кроме этого, следует отметить, что в обоих случаях комбинированного применения таурина (прокаина) и кеторолака трометамина значения G120 были менее контроля на 39,9% и 28,7% при комбинации с таурином и прокаином соответственно. При введении кеторолака трометамина в отдельности, значениеG120 превышало контрольное более чем на 45%.