Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 19
1.1. Физиологические изменения в организме связанные с беременностью 19
1.2. Нарушение содержания регуляторных гуморальных факторов при осложненной беременности 24
1.3. Современные представления о патогенезе гестоза 26
1.4 Тетрагидробиоптерин – потенциальный эндотелиопротектор 35
1.5 Ингибиторы аргиназы II – класс потенциальных эндотелиопротекторов 37
1.6 Кратковременные эпизоды ишемии-реперфузии – фактор, улучшающий функцию эндотелия в эксперименте 40
1.7. Эритропоэтин – фармакологический агент с прекондиционирующими эффектами 42
1.8. Макролиды - перспективные эндотелиопротективные средства 45
1.9. Коррекция нарушений функции эндотелия ингибиторами фосфодиэстеразы – как перспективное направление 48
1.10. Методические подходы воспроизведения патологии беременности в эксперименте 52
2. Материалы и методы 57
2.1. Моделирование ADMA-подобного гестоза 57
2.2. Моделирование редуцированного кровотока в плаценте (reduced uterine perfusion pressure (RUPP)) 58
2.4. Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 58
2.5. Оценка плацентарной микроциркуляции 59
2.6. Определение протеинурии 60
2.7. Исследование отечности большого сальника 61
2.8. Морфологические методы оценки изменений в плаценте и почках при моделировании ADMA-подобного гестоза
2.9. Исследование плодов 63
2.10. Дизайн эксперимента. Выбор режимов введения для фармакологических агентов и воспроизведения эпизодов ишемии реперфузии 63
2.11. Статистическая обработка результатов исследования 67
3. Сравнительная оценка морфофункциональных нарушений при моделировании ADMA-подобного гестоза и редуцированного кровотока в матке 69
4. Изучение эффективности тетрагидробиоптерина при коррекции adma подобного гестоза 82
5. Исследование эффективности селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 при ADMA-подобном гестозе 92
6. Исследование эффективности 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии при l-name-индуцированном гестозе и роли inos и атф– зависимых к+ каналов в реализации их положительных эффектов 102
6.1. Исследование эффективности 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии для коррекции морфофункциональных нарушений при ADMA-подобном гестозе 102
6.2. Исследование роли iNOS в реализации положительных эффектов 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции ADMA-подобного гестоза 112
6.3. Исследование роли АТФ-зависимых К+ каналов в реализации положительных эффектов 10 минутных эпизодов ишемии реперфузии в коррекции морфофункциональных нарушений при L-NAME-индуцированном гестозе 122
7. Изучение эффективности рекомбинантного эритропоэтина при коррекции ADMA-подобного гестоза 133
8. Изучение эффективности ингибитора фдэ5 -тадалафила при коррекции ADMA-подобного гестоза 143
9. Исследование эффективности эритромицина и азитромицина при adma-подобном гестозе
10. Исследование эффективности витамина b9, сочетанного применения витаминов b9 и в6, витаминно-минеральных комплексов «компливит триместрум 2 триместр» и «компливит триместрум 3 триместр» при adma подобном гестозе
Заключение 173
Выводы 191
Список литературы
- Тетрагидробиоптерин – потенциальный эндотелиопротектор
- Моделирование редуцированного кровотока в плаценте (reduced uterine perfusion pressure (RUPP))
- Исследование роли iNOS в реализации положительных эффектов 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции ADMA-подобного гестоза
- Изучение эффективности ингибитора фдэ5 -тадалафила при коррекции ADMA-подобного гестоза
Введение к работе
Актуальность научного исследования
Гестоз является наиболее часто встречающейся акушерской патологией. В отдельных регионах нашей страны его частота может достигать более 30 % среди всех случаев беременности (ВОЗ, 2012; Резникова Л.Б., 2013; Росстат., 2013, 2014; Шувалова М.П., 2014). В структуре материнской смертности гестоз занимает одно из первых мест. На его долю приходится до 25% случаев (Гребенник Т.К., Павлович С.В., 2011). У детей, родившихся у матерей, перенесших гестоз, перинатальная заболеваемость достигает 30%, а смертность в 3-4 раза превышает популяционную (Иванова Л.Б., 2012). Кроме этого, страдает умственное и физическое развитие ребенка, а у женщин повышается вероятность развития хронической патологии почек и артериальной гипертензии (Иванова О.Ю., 2011; Jain A., 2012).
Патогенез гестоза еще далек от полного понимания, но все больше внимания исследователи уделяют дисангиогенезу в плаценте и нарушению регуляции тонуса мелких артериальных сосудов (Тюренков И.Н., 2012, 2013; Scioscia M., 2015; Adu-Bonsaffoh K., 2015). При морфологическом исследовании плаценты многие авторы описывают специфическую гистологическую картину, которая заключается в диспропорциях развития ее пограничного участка между материнской и плодными частями (Ducray J.F., 2011; Oppenraaij R.H., 2011; Snchez-Aranguren L.C., 2014; Pereira R.D., 2015). Происходит неполная инвазия цитотрофобласта в спиральные артерии матери, что приводит к ишемическим явлениям в плаценте и повышению проницаемости фетоплацентарного барьера (Gilbert J.S., 2008; Ducray J.F., 2011; Oppenraaij R.H., 2011).
Поступление в системный кровоток из ишемизированной плаценты свободных радикалов, гормонов, факторов роста, провоспалительных цитокинов, антигенов плода и других гуморальных факторов вызывает повышение содержания молекул клеточной адгезии и накопление в крови эндогенных ингибиторов eNOS – метилированных аналогов L-аргинина асимметричного диметиларгинина (ADMA) и монометиларгинина (L-NMMA). Конечным финалом сложных патофизиологических механизмов является нарушение реологических и коагуляционных свойств крови и эндотелиальная дисфункция, которые служат причиной полиорганной недостаточности.
Cтепень разработанности темы
Развитие плаценты представляет собой сложное сочетание процессов ангиогенеза и апоптоза регулируемых большим количеством факторов роста (Forbs K., 2010; Knofler M., 2010). Многочисленные исследования показали их дисбаланс у женщин с гестозом, а раннее его появление и повышенное содержание ADMA и его аналогов служат диагностическими критериями этого грозного заболевания на его доклинической стадии (Солоницын А.Н., 2008; Крукиер И.И., 2009; Speer P.D., 2008; Herr F., 2009). С учетом того, что в реализации эффектов многих факторов роста значительную роль играет оксид азота (NO), ишемия плаценты и эндотелиальная дисфункция являются взаимосвязанными и взаимообуславливающими звеньями в патогенезе гестоза.
Обобщив многочисленные литературные данные, можно сказать, что эндотелиальная дисфункция не только фактор определяющий тяжесть клинического протекания заболевания, но и основное звено патогенетических процессов (Айламазян Э.К., 2009; Тюренков И.Н., 2012; Резникова Л.Б., 2013).
Основные принципы современной фармакологической терапии гестоза направлены на коррекцию и компенсацию ишемических явлений в плаценте и борьбу с нарушением функции жизненно важных органов организма женщины. Они включают в себя улучшение микроциркуляции в тканях, снижение артериального давления, нормализацию водно-солевого обмена, коррекцию реологических и коагуляционных свойств крови, увеличение доставки кислорода к тканям, оптимизацию клеточного метаболизма, антиоксидантную терапию и др. («Cтандарт специализированной медицинской …» МЗ РФ, 2013). В свете современных представлений о патогенезе гестоза выявляется, что ее существенным недостатком является отсутствие целенаправленного использования препаратов для коррекции NO-продуцирующей функции эндотелия и активации естественных противоишемических защитных механизмов.
В более ранних исследованиях было показано, что препараты,
повышающие содержание субстрата для синтеза NO – L-аргинина,
увеличивают активность NO-синтазы, усиливают образование NO и
предотвращают развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов при
ADMA-подобном L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота. Кроме
этого, эффективными на данной модели оказались активатор eNOS –
резвератрол, антиоксиданты, эритропоэтин и др. Определенное развитие
получили исследования эндотелиопротективной активности на других «eNOS–
ассоциированных» экспериментальных моделях: гипоэстроген-
индуцированной, гомоцистеин-индуцированной, метаболического Х синдрома, при реактивном поствакцинальном васкулите и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции (Покровский М.В. и соавт., 2005-2014).
Еще одним перспективным направлением лечения и профилактики гестоза может явиться использование фармакологических препаратов, в основе механизма действия которых лежит активация защитных процессов наблюдаемых при ишемическом прекондиционировании. Дистантное ишемическое прекондиционирование, и как его вариант фармакологическое прекондиционирование, оказывает положительное влияние на различные звенья патогенеза гестоза, реализуя свое действие через триггеры «1-го окна» (К+АТФазный механизм) и «2-го окна» (NO-опосредованный механизм) защиты (Карпова Э.С., 2012; Щербакова Е.С., 2014).
Таким образом, в настоящее время накопилось достаточно большое количество сведений о влиянии различных факторов на течение гестоза и их роли в развитии эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического звена этого грозного заболевания и возможности коррекции эндотелиальной дисфункции фармакологическими агентами различных групп. Однако в доступной литературе не обнаружено сведений об изучении эндотелиопротективного действия в условиях ADMA-подобного гестоза
тетрагидробиоптерина, селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010, тадалафила, витамина В6 и фолиевой кислотой, поливитаминно-минеральными комплексами, эритромицина, азитромицина, рекомбинантного эритропоэтина, а также эффективности направления, в основе которого лежит дистантное ишемическое прекондиционирование.
Цель исследования: повышение эффективности фармакологической коррекции морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой системы при гестозе с помощью активации eNOS-детерминированного пути и феномена прекондиционирования.
Задачи исследования:
1. Провести комплексную оценку функциональных, биохимических и
морфологических нарушений при моделировании различных видов патологии
беременных с использованием результатов функциональных проб, данных
ЛДФ-метрии плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и
морфологического исследования плаценты и почек, с целью выбора
экспериментальной модели наиболее приближенной к гестозу.
2. Провести исследование эффективности коррекции экспериментального
гестоза тетрагидробиоптерином с использованием выбранных критериев:
результатов функциональных проб и данных биохимического и
морфологического исследований.
3. Провести исследование эффективности коррекции
морфофункциональных нарушений при экспериментальном гестозе
селективным ингибитором аргиназы 2 ZB49-0010 с использованием выбранных
критериев.
-
Изучить эффективность применения ингибитора ФДЭ5 – тадалафила, обладающего прекондиционирующим эффектом, при коррекции экспериментального гестоза.
-
Изучить эффективность коротких эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции экспериментального гестоза. Оценить роль АТФ-зависимых К+ каналов и iNOS в реализации эндотелиопротективного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования.
6. Исследовать эффективность фармакологического
прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином при коррекции
экспериментального гестоза.
7. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у
беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии
антибактериальными препаратами из группы макролидов, обладающими
актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
8. Провести исследование эффективности коррекции
морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-
подобной моделью патологии препаратами из группы витаминно-минеральных
комплексов для беременных и витаминами В6 и фолиевой кислотой,
обладающими различными механизмами действия.
Научная новизна исследования
В работе впервые в сравнительном аспекте представлены морфофункциональные нарушения, возникающие при воспроизведении ADMA-подобного гестоза и гипоперфузии беременной матки. Показано, что ADMA-подобная модель патологии у беременных животных в большей степени характеризуется нарушениями, характерными для клинических проявлений гестоза второй половины беременности у женщин.
На основании данных проведенных исследований эффективности тетрагидробиоптерина, селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 и «Тадалафила», относящегося к группе ингибиторов фермента фосфодиэстеразы 5 при коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих на фоне ADMA-подобного гестоза, показана эффективность фамакологических агентов влияющих на путь L-Аргинин – NO - цГМФ.
Использование 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии задних конечностей оказывает выраженное протективное действие при коррекции морфофункциональных изменений при моделировании ADMA-подобной патологии. Значительную роль в реализации положительных эффектов дистантного ишемического прекондиционирования при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью гестоза играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
Введение рекомбинантного эритропоэтина при ADMA-подобной патологии у животных приводит к коррекции морфофункциональных нарушений.
Проведенное исследование показало уменьшение морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии при использовании антибактериальных препаратов из группы макролидов: азитромицина и эритромицина, обладающих актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
Впервые показана эффективность использования поливитаминно-минеральных комплексов: «Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит триместрум 3 триместр» для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе обоснована эффективность применения фармакологических агентов для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии, точками приложения, в механизмах действия которых являются различные eNOS-обусловленные патогенетические звенья. Показано, что использование различных препаратов, улучшающих NO-продуцирующую функцию (тетрагидробиоптерин, селективный ингибитор аргиназы 2, ингибитор фосфодиэстеразы 5), позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное давление, предотвратить альбуминурию, а также изменение соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить снижение показателей
биохимических маркеров (Тоtal NO), добиться положительной динамики морфологических показателей в плацентарной и почечной ткани.
Полученные данные позволяют обосновать новое перспективное направление для поиска и создания эффективных лекарственных препаратов для лечения гестоза, в основе реализации механизма действия которых будет лежать патогенетическое воздействие на различные ADMA-eNOS-детерминированные механизмы развития этой патологии.
На основании результатов проведенной исследовательской работы разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение в развитии перспективных направлений в фармакологии, клинической фармакологии, состоящее в экспериментальном обосновании новых патогенетических подходов к лечению гестоза.
Методология и методы диссертационного исследования
Методология проведенного исследования основана на методических подходах научных исследований отечественных и зарубежных авторов, освещенных в литературе.
Расчет дозирования и режимы введения фармакологических агентов основаны на эффективности в экспериментальных исследованиях, терапевтических дозах для человека c последующим перерасчетом с помощью межвидовых коэффициентов или подобраны в ходе проведения эксперимента.
Дизайн проведенного исследования планировался с учетом рекомендаций по проведению доклинических исследований и одобрен местным этическим комитетом.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано
проведение целенаправленных клинических исследований
тетрагидробиоптерина, тадалафила, коротких эпизодов ишемии-реперфузии, а также их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную фармакологическую терапию эндотелий-ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндоте-лиопротективной активности препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008560/10) и «Компливит триместрум 3 триместр» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008555/10), включены в состав документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.
Полученные результаты используются в учебных программах кафедры фармакологии Орловского государственного университета, кафедры фармакологии Белгородского государственного университета и кафедры фармакологии Воронежской медицинской академии.
Материалы исследования селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 получены в рамках Госконтракта по программе Минпромторга РФ «ФАРМА 2020» №13411.1008799.13.129 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе низкомолекулярных ингибиторов аргиназы 2 для лечения артериальной и легочной гипертензии».
Положения, выносимые на защиту
1. Введение фармакологических агентов, влияющих на путь L-Аргинин –
NO – цГМФ (тетрагидробиоптерин, селективный ингибитор аргиназы 2 ZB49-
0010 и ингибитор ФДЭ-5 тадалафила), оказывает протективное действие при
коррекции морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой системы
при ADMA-подобной модели гестоза.
2. Использование коротких эпизодов ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина как препарата, обладающего
прекондиционирующими свойствами, оказывает выраженное протективное
действие на коррекцию морфофункциональных изменений при моделировании
ADMA-подобной патологии. Важную роль в реализации протективных
эффектов играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
3. Введение антибактериальных препаратов из группы макролидов:
азитромицина и эритромицина оказывает выраженный положительный эффект
при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с
ADMA-подобной моделью гестоза.
4. Применение новых поливитаминно-минеральных комплексов
«Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит триместрум 3 триместр»
для коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих у беременных
животных при ADMA-подобной модели патологии, оказывает выраженный
положительный эффект.
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности основана на достаточном количестве наблюдений в эксперименте с использованием методических подходов, отвечающих задачам проводимого эксперимента, и оборудования, имеющего соответствующие сертификаты и прошедшего поверку в метрологической службе.
Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами в зависимости от типа распределения. Статистическую значимость различий между морфологическими изменениями после их ранжирования оценивали с помощью метода анализа непараметрических данных Манна-Уитни. Все расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel 7.0.
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010, 2011, 2012 и 2013 гг., V и ХIV национальных конгрессах «Человек и лекарство», V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции клинических
ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ «БелГУ», конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Франция (Париж, 2012), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Россия (Сочи, 2013), пятой ежегодной научно-практической конференции специалистов по работе с лабораторными животными «Лабораторные животные: наука, фармакология, ветеринария», Россия (Белгород, 2015), X Международном научном конгрессе «Рациональная фармакотерапия», (Санкт-Петербург, 2015).
Апробация диссертации проведена 18.06.2015 г. на заседании кафедры
фармакологии Белгородского государственного национального
исследовательского университета.
Номер госрегистрации: АААА-А16-116041310091-5.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 38 печатных работ, из них 17 в российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание работы. Издана 1 монография. Получено 14 патентов РФ на изобретения и 1 патент РФ на полезную модель.
Личный вклад автора
Автору принадлежит основная роль при определении направления исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Автором проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме выполняемой диссертации. На основании анализа литературных данных выдвинуты рабочие гипотезы о возможных путях фармакологической коррекции экспериментального гестоза с помощью подходов, направленных на ADMA-eNOS-детерминированные механизмы, и методах, в основе реализации которых лежат процессы, протекающие при дистантном ишемическом прекондиционировании. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора осуществлялось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с помощью программного комплекса Asqknowledge 3.8.1, забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 362 источников, из них 87
отечественных и 275 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 239 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, 89 рисунков.
Тетрагидробиоптерин – потенциальный эндотелиопротектор
Этиологические аспекты развития гестоза в научных кругах по-прежнему вызывают жаркие дискуссии. Существует несколько теорий развития гестоза: иммунная, теория дезадаптации, ишемии плаценты, гормональная, токсического воздействия, наследственная и т.д. [250, 264]
В отношении патогенеза гестоза хоть и остается большое количество белых пятен, но определены основные его положения, а все вновь открываемые сведения скорее дополняют полноту патологических событий. Признано, что его ключевым патогенетическим звеном является генерализованная дисфункция эндотелия [7, 22, 68, 142, 156, 157, 242, 253, 268, 275, 290]. Нарушение функционального состояния мелких артериальных сосудов приводит не только к нарушению регуляции артериального давления и микроциркуляции в тканях, что является следствием нарушения баланса между вазоконстрикторами и вазодилататорами, но и вызывает изменения в реологических и коагуляционных свойствах крови [7, 22, 68, 193, 275, 293].
Выделяют несколько возможных причин, приводящих к нарушению функции эндотелия. Нарушение ангиогенеза и апоптоза в плаценте. Плацента - самый молодой в эволюционном аспекте орган. Именно его появление позволило выделиться животным в отдельный класс – млекопитающих. За короткое время он вынужден вырасти, достичь функциональной зрелости и состариться. Высокая интенсивность процессов, протекающих в плаценте, представляет собой не простое накопление массы, а цепь сложных событий ангиогенеза и апоптоза, имеющих многофакторное регулирование и обусловливающих ее динамическую перестройку на протяжении всего периода гестации [94, 177, 188, 226, 263, 284, 332].
В последние время многие авторы при морфологическом исследовании плаценты описывают специфическую гистологическую картину, заключающуюся в диспропорциях развития ее пограничного участка между материнской и плодными частями [94, 144, 157, 211, 272]. Происходит неполная инвазия цитотрофобласта в спиральные артерии матери. Уровень зрелости самих спиральных артерий при гестозе не достигает уровня нормальной беременности. В результате спиральные артерии сохраняют эндотелий, эластический слой и средний мышечный слой. Увеличенное пространство между кровотоками в спиральных артериях и ворсинами хориона, а также сохранившаяся способность самих спиральных артерий к вазоконстрикции приводят к ишемии трофобласта и повышению проницаемости фетоплацентарного барьера [144, 157, 178].
Процесс ангиогенеза и апоптоза контролируется сосудисто-эндотелиальным (VEGf) и плацентарным (PlGF) факторами роста эндотелия и рецептор-1 растворимым фактором роста эндотелия (sflt-1) и другими факторами роста. Описанный выше дисбаланс их содержания в плаценте выявлен уже на ранних стадиях гестации, а проведенные многочисленные исследования позволяют предположить, что недостаток этих факторов может привести к развитию гестоза [94, 157, 188, 194, 221, 229, 244, 317].
Образовавшиеся гуморальные факторы в ответ на ишемию, а также, возможно, антигены плода, прошедшие через фетоплацентарный барьер с повышенной проницаемостью, при попадании в организм матери провоцируют накопление в плазме асимметричного диметиларгинина (ADMA), развитие генерализованной эндотелиальной дисфункции, вторичных ишемических явлений и оксидативного стресса [22, 38, 41, 157, 178]. Перечисленные патологические явления ведут к снижению выработки NO, который является не только вазодилататором, но и опосредует действие и образование факторов роста эндотелия и подавляет апоптоз в плаценте. Таким образом, происходит замыкание порочного круга: дисангиогенез провоцирует недостаток NO, недостаток NO усугубляет дисангиогенез.
Накопление в крови беременных женщин метилированных аналогов L-аргинина – асимметричного диметиларгинина (ADMA) и монометиларгинина (MMA), являющихся эндогенными ингибиторами эндотелиальной NO-синтазы (еNOS) [344, 274]. NO является мощным сосудорасширяющим фактором, и его недостаток приводит к нарушению вазодилатации. Современные данные свидетельствуют о повышении в материнской плазме концентрации ADMA у женщин с гестозом. Многие авторы данное явление считают предшественником гестоза [108, 111, 228, 257].
Патогенетические процессы, которые приводят к повышению в плазме женщин ADMA, подлежат еще глубокому изучению. Известно, что ADMA образуется в результате катаболизма белков, содержащих остатки метилированного аргинина. В процессе их метаболизма, происходит высвобождение в материнский кровоток метилированного аргинина. В метаболизме ADMA главная роль принадлежит диметиламиногидролазе диметиларгинина (DDAh). Она сществует в 2х изоформах: DDAh I и DDAh II. На данный момент основной причиной повышения концентрации асимметричного диметиларгинина в плазме крови женщин с гестозом предположительно является снижение активности базисной изоформы DDAh (DDAh II) эндотелиальных клеток и плаценты. Фактором угнетающим активность DDAh II может служить окислительный стресс [109, 144, 214, 337]. Кроме этого, нарушение выделительной функции почек, так же может играть определенную роль в накоплении в плазме метилированных аналогом L-аргенина. При физиологичекой беременности содержание ADMA в крови медленно уменьшается к ее окончанию (в сравнении с небеременными женщинами) [107]. У женщин с развивающейся преэклампсией концентрация ADMA может повышаться вторично из-за нарушения почечной функции [107].
Оксидативный стресс. В патогенезе гестоза нашел свое место и оксидативный стресс [38, 40, 41, 81, 157, 337]. Увеличение свободных радикалов и снижение активности антиоксидантных систем может возникать не только как следствие вышеописанных процессов, но и самостоятельно на фоне воздействия внешних факторов. Химически активное соединение – NO легко вовлекается в патологические реакции с образованием пероксинитритов, что снижает его биодоступность и способствует запуску вышеописанных причин эндотелиальной дисфункции или их усугублению по принципу порочного круга. Свободнорадикальное повреждение клеточных структур и недостаток NO приводит также к усилению апоптоза в плаценте, что, несомненно, усиливает дисангиогенез.
Немаловажным фактором является то, что окислительный стресс снижает активность DDAh [109, 144, 214]. Это приводит, как отмечалось выше, к накоплению в крови ADMA и MMA. Таким образом, мы наблюдаем замыкание следующего порочного круга: окислительный стресс усугубляет эндотелиальную дисфункцию, эндотелиальная дисфункция усиливает ишемию и приводит к большему образованию перекисных радикалов.
Существует целый ряд факторов, которые могут служить параллельными путями реализации патологических процессов или замыкания порочных кругов. При ишемии плаценты определяется повышенное содержание эндотелина-1 (ET-1) и фактора некроза опухоли (TNF-), которые снижают выработку NO [107, 157, 161, 188].
В течение всей нормально протекающей беременности в крови определяется повышенное содержание ренина, но чувствительность к нему снижена. При преэклампсии наблюдается повышение чувствительности. Хотя механизмы этого явления до конца не ясны, вовлечение в патологический процесс ренин-ангиотензиновой системы привлекает внимание ряда авторов [88, 154, 294,].
Моделирование редуцированного кровотока в плаценте (reduced uterine perfusion pressure (RUPP))
В рамках данной работы проведено исследование эндотелиопротективной активности ряда фармакологических агентов.
Исследование активности тетрагидробиоптерина (ВН4) (Sigma Aldrich, USA) проводилось в дозе 10 мг/кг [36]. Исследование активности селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 проводилось в дозе 5 мг/кг (рекомендации ЗАО «ИИХР»).
Гипотензивный препарат центрального действия – метилдопа (Допегит, «Эгис») вводился в дозе 0,086 (2 x 0,043) г/кг/сут внутрь однократно с 14 по 20 сутки беременности. Данная доза соответствует суточной дозировке для человека (1000 мг/сут).
В эксперименте с воспроизведением 10-минутных эпизодов ишемии-реперфузии использовались 2 режима их воспроизведения. В первом случае эпизод ишемии-реперфузии воспроизводили на 21 день беременности за 90 минут до начала проведения функциональных проб. Второй режим заключался в ежедневном однократном с 10 по 20 сутки беременности воспроизведении эпизода ишемии-реперфузии задней конечности. В ходе проведения второго режима мы производили чередование задних конечностей, подвергавшихся ишемическому воздействию. Выбор двух режимов моделирования эпизодов ишемии-репервузии продиктован наличием у феномена ишемического прекондиционирования двух фаз: ранней и поздней [42, 357].
Рекомбинантный эритропоэтин (Эпокрин, ФГУП ГосНИИ ОЧБ) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг однократно в сутки на 7, 10, 13, 16, 19 сутки беременности. Данная доза для эритропоэтина выбрана на основании выявленных в ранее проведенных экспериментах эндотелеопротективных свойств и отсутствии эритропоэтогенного эффекта [34].
Антибиотики из группы макролидов: эритромицин (ОАО «Биосинтез») и азитромицин (Сумамед, Плива Хрватска д.о.о.) вводились внутрибрюшинно однократно в сутки в дозе 30 мг/кг с 14 по 20 сутки беременности. Соответствующая дозировка выбрана на основании обнаруженного у этих препаратов эндотелеопротективного эффекта в ранее проводимых нами исследованиях [42, 70]. Фолиевую кислоту (ОАО «Валента Фармацевтика») вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки беременности. Витамин В6 (ОАО «Верофарм») вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки беременности.
Препараты «Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит триместрум 3 триместр» (ООО «Фармстандарт-УфаВИТА») вводили в дозе 0,084 таб/кг/сутки однократно внутрь с 14 по 20 сутки беременности. Выбранная доза препарата соответствует его средней терапевтической дозе для человека.
Ингибитор фосфодиэстеразы 5 – тадалафил (Сиалис, ELI LILLY & Company Limited) вводили в дозе 0,9 мг/кг 1 раз в сутки внутрь с 14 по 20 сутки беременности. Выбранная доза препарата соответствует его средней терапевтической дозе для человека (10 мг 1 раз в сутки) [53, 72].
Блокатор АТФ-зависимых К+ каналов – глибенкламид (Манинил, Берлин-Хеми АГ) вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг с 14 по 20 сутки беременности [54, 184].
Селективный ингибитор iNOS – аминогуанидин (Aminoguanidine hemisulfate sate, Sigma-aldrich chemine GmbH) вводили внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг [91, 190].
При комбинированном применении препаратов использовались те же дозы, пути введения, и та же продолжительность применения.
Дизайн эксперимента представлен на схеме (рис. 2.10.2), которая состоит из следующих блоков: 1. Контрольная группа (животные с пероральным введением 0,9% NaCl в эквивалентных дозах с 14 по 20 сутки беременности). 2. Моделирование ADMA–подобного гестоза (животные с внутрибрюшинным введением L-NAME в дозе 25 мг/кг однократно в сутки с 14 по 20 сутки беременности) (рис. 2.5). 3. Моделирование редуцированного кровотока в правом и левом рогах матки. 4. Моделирование редуцированного кровотока в правом роге матки. 5. Коррекция морфофункциональных нарушений при моделировании ADMA-подобного гестоза производилась: 5.1 тетрагидробиоптерином (10 мг/кг); 5.2 селективным ингибитором аргиназы 2 ZB49-0010 (5 мг/кг); 5.3 ингибитором ФДЭ5 – тадалафила (0,9 мг/кг); 5.4 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии; 5.5 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии на фоне введения аминогуанидина (300 мг/кг); 5.6 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии на фоне введения глибенкламида (50 мг/кг); 5.7 рекомбинантным эритропоэтином (50 Ме/кг); 5.8 эритромицином (30 мг/кг) и азитромицином (30 мг/кг); 5.9 фолиевой кислотой (0,2 мг/кг), витамином В6 (2 мг/кг), препаратами «Компливит триместрум 2 триместр» (0,084 таб/кг) и «Компливит триместрум 3 триместр» (0,084 таб/кг). Протокол состоит из следующих разделов (рис. 2.4):
Исследование роли iNOS в реализации положительных эффектов 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции ADMA-подобного гестоза
У крыс с ADMA-подобным гестозом обнаружено увеличение содержания жидкости в тканях большого сальника с 49,89±0,82% до 58,09±1,73% (р 0,05). В почечных клубочках выявлены признаки ишемического повреждения в виде их малокровия, а также дистрофические изменения базальной мембраны капилляров клубочков с её утолщением в виде проволочных петель (рис. 3.8, б). Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 39,20+2,99 (в норме 40,70+3,80). Описанные изменения гломерулярного аппарата могут объяснять имеющуюся у крыс данной группы гиперфильтрацию с выраженной протеинурией. В мелких артериях и артериолах отмечались спазм и выраженная гипертрофия стенок (рис. 3.8, а).
Морфологическая картина плаценты при ADMA-подобном гестозе проявлялась в виде ишемии ворсин и интервиллезных пространств и слущиванием эндотелия в сосудах плаценты (рис. 3.9). В отдельных случаях это приводило к появлению очагов некроза децидуальных клеток в ткани плаценты. На внешней поверхности плаценты наблюдали массивные отложения фибрина.
Патологические изменения в плаценте при моделировании ADMA-подобного гестоза: А - неравномерное кровенаполнение спонгиозного слоя; Б - вакуольная дистрофия гигантоклеточного трофобласта; очаги некроза на границе гигантоклеточного трофобласта и децидуальной ткани; дистрофические изменения, малокровие децидуального слоя. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 200 Наложение серебряных клипс выше бифуркации аорты и на 2 яичниковые артерии приводило к подъему артериального давления до 155,4±3,6 и 109,3±5,7 мм рт. ст. (рис. 3.10). Коэффициент эндотелиальной дисфункции повышался до 2,02±0,23 (р 0,05) (рис. 3.11). Кроме этого, происходило снижение микроциркуляции в плаценте обоих рогов матки до 229,7±9,9 при 446,3±27,5 ПЕд у интактых беременных самок (рис. 3.12). Моделирование снижения кровотока в обоих рогах матки приводило к статистически значимому по сравнению с интактными беременными животными повышению протеинурии до 1,34±0,11 г/л (р 0,05) (рис. 3.13).
Исследование NO-продуцирующей функции эндотелия у животных с редуцированным кровотоком в обоих рогах матки показало отсутствие статистически значимой разницы экспрессии eNOS в эндотелии и концентрации конечных метаболитов N0 в плазме крови по сравнению с беременными интактными животными (табл. 3.1). 160
Примечание: Здесь и везде далее: РК2р – редуцированный кровоток в 2-х рогах матки; – при р 0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; y – при р 0,05 по сравнению с беременными крысами с редуцированным кровотоком в 2-х рогах матки.
Примечание: – при р 0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; y – при р 0,05 по сравнению с беременными крысами с редуцированным кровотоком в 2х рогах матки.
Примечание: – при р 0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; y – при р 0,05 по сравнению с беременными крысами с редуцированным кровотоком в 2-х рогах матки. Рисунок 3.12 - Уровень микроциркуляции при моделировании редуцированного кровотока в 2-х рогах матки г/1л,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Интактные РК2р Примечание: – при р 0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; y – при р 0,05 по сравнению с беременными крысами с редуцированным кровотоком в 2-х рогах матки.
При моделировании редуцированного кровотока в обоих рогах матки в плаценте наблюдались ярко выраженные изменения ишемического генезы (рис. 3.14). У крыс этой группы не обнаружено увеличение содержания жидкости в тканях большого сальника. В почечных клубочках принаков патологических изменений не выявлено. Заметной реакции мезангия не отмечено (табл. 3.1).
Патоморфологические изменения плаценты при ишемии: А – общий вид с обширными некрозами и кровоизлияниями в лабиринтной зоне (ЛЗ); Б – некрозы и геморрагические озера в ЛЗ, В – крупный очаг гнойного децидуита, расслоение тканей на границе плаценты и стенки матки. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х50 (А), Х200 (Б, В). Наложение клипс на правую подвздошную артерию и правую яичниковую артерию не приводило к статистически выраженному изменению артериального давления и коэффициента эндотелиальной дисфункции. У животных данной группы происходило снижение микроциркуляции в плаценте правого рога до 204,4±14,3 и до 309,0±15,8 ПЕд в левом роге матке (р 0,05) (рис. 3.15). Статистически значимого изменения диуреза, протеинурии, реакции мезангия, микроциркуляции и NO-синтезирующей функции эндотелия у этих животных не выявлено (табл. 3.1).
При моделировании редуцированного кровотока в правом роге в плацентах правого рога матки возникали изменения ишемического генеза, морфологическая картина принципиально не отличалась от состояния плацент у группы животных с моделированием редуцированного кровотока в обоих рогах матки. В левом роге матки морфологическая картина плацент соответствовала состоянию плацент группы интактных животных.
Интегральная характеристика бальной оценки изменения морфологических показателей при моделировании ADMA-подобного гестоза и моделирования редуцированного кровотока в матке представлена в табл. 3.1.
Сравнительная оценка состояния плодов выявила уменьшение массы плодов при всех моделируемых патологических состояниях по сравнению с группой интактных беременных животных. В группах животных с редуцированным маточным кровотоком гипотрофия плодов была более выраженной по сравнению с группой с ADMA-подобным гестозом. Кроме этого, у животных с редуцированным маточным кровотоком наблюдалась постимплантационная гибель плодов (табл. 3.1).
Изучение эффективности ингибитора фдэ5 -тадалафила при коррекции ADMA-подобного гестоза
При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен протективный эффект 10-кратного воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии. Морфологическое исследование у животных с однократным воспроизведением кратковременного эпизода ишемии-реперфузии за 90 минут до проведения функциональных проб не проводилось.
При морфологическом исследовании сосудов почек у животных с 10 -кратным воспроизведением кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии картина резко отличалась от контрольной группы беременных крыс.
Мелкие артерии коркового вещества почки со слабовыраженными признаками гипертрофии и спазма мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 36,8+3,16 (в норме 40,70+3,80).
Морфологическое исследование плаценты при коррекции ADMA-подобного гестоза 10-кратным воспроизведением кратковременного эпизода ишемии-реперфузии выявило устранение ишемических повреждений в плацентарной ткани (рис. 6.7). Наблюдалось относительно равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя, отсутствие повреждения слоя гигантского трофобласта и децидуальной оболочки На внешней поверхности плаценты наблюдались слабые отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических показателей представлена в таблице 6.3 из которой следует, что 10-кратное воспроизведение кратковременного эпизода ишемии-реперфузии достоверно снижало интегральную оценку в баллах (2-3) по сравнению с ADMA-подобным гестозом.
Гистологическая картина плаценты у животных с 10-кратным воспроизведением кратковременных 10-минутных ишемических эпизодов на фоне ADMA-подобного гестоза: а – децидуальный слой: мономорфная структура, отсутствие дистрофических изменений; б -равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя; в - отсутствие дистрофических изменений трофобласта; Окр. гематоксилином и эозином.
Таким образом, при морфологическом исследовании сосудов почек и плаценты обнаружено выраженное протективное действие 10-кратного воспроизведения кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии, заключающееся в приближении морфологической картины к интактным беременным животным без признаков ишемических повреждений, как это отмечалось у контрольной группы с ADMA-подобным гестозом, но целевого уровня не достигалось.
При иммуногистохимическом исследовании, было выявлено усиление экспрессии eNOS под влиянием коротких эпизодов ишемии-реперфузии до уровня интактных животных (табл. 6.3, рис. 6.8).
Однократное и десятикратное воспроизведение коротких 10 минутных ишемических эпизодов проявило выраженное эндотелиопротективное действие на модели ADMA-подобного гестоза, что проявилось в усилении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в уменьшении нарушений микроциркуляции в плаценте. Кроме этого, десятикратное воспроизведение коротких ишемических эпизодов приводило к снижению артериального давления, нормализации протеинурии, восстановлению NO-продуцирующей системы. Морфологическое исследование выявило предотвращение деструктивных явлений ишемического генеза, вызванных введением L-NAME при воспроизведении 10-кратных ишемических эпизодов. Однако полной нормализации морфологической картины в почках и плаценте не наступало.
Следует отметить, что эффекты однократного воспроизведения и десятикратного воспроизведения коротких ишемических эпизодов на NO-синтезирующую функцию разнонаправленные. Данный факт говорит о различных механизмах реализации их эндотелиопротективного действия.
Введение аминогуанидина, являющегося селективным ингибитором iNOS, здоровым беременным животным не приводило к статистически значимому изменению артериального давления. Введение аминогуанидина беременным животным с экспериментальным гестозом, леченным кратковременными 10 минутными эпизодами ишемии-реперфузии, приводило к полному устранению их гипотензивного эффекта (рис. 6.9).
Введение аминогуанидина здоровым беременным животным не приводило к статистически значимому изменению КЭД, но, при введении его на фоне коррекции ADMA-подобного гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии, значительно снижало их эндотелиопротективный эффект и приводило КЭД к уровню, статистически отличимому от группы интактных животных (рис 6.10 и табл. 6.4).
Обращает на себя внимание то, что отрицательное влияние аминогуанидина на артериальное давление и функцию эндотелия проявляется только при попытке коррекции моделируемой патологии, что указывает на важную роль iNOS в реализации эндотелиопротективного эффета короткими эпизодами ишемии-реперфузии.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о важной роли iNOS в реализации эндотелиопротективного эффета при коррекции ADMA-подобного гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии.