Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о формил-пептидных рецепторах (FPR) 11
1.2 Терапевтическая эффективность известных FPR лигандов 13
1.3 Природные антагонисты FPR и сигнальных путей, активируемых через FPR 18
1.3.1 Природные пептидные антагонисты FPR 18
1.3.2 Непептидные природные антагонисты FPR и сигнальных путей, активируемых через FPR 21
1.4 Синтетические агонисты FPR 32
1.4.1 Синтетические пептидные агонисты FPR 32
1.4.2 Синтетические непептидные агонисты FPR 34
1.5 Синтетические антагонисты FPR 40
1.6 Молекулярное моделирование FPR лигандов и их рецепторов 47
1.7 Перспективы поиска новых FPR лигандов 50
Глава 2 Материалы и методы исследования 52
2.1 Материалы 52
2.2 Выделение нейтрофилов человека 53
2.3 Выделение нейтрофилов мыши 53
2.4 Культуры клеток 53
2.5 Исследование мобилизации Ca2+ 54
2.6 Исследование рекрутирования -аррестина 55
2.7 Исследование хемотаксиса 56
2.8 Исследование связывания лигандов с FPR1 56
2.9 Исследование адгезии нейтрофилов 57
2.10 Измерение жизнеспособности клеток 57
2.11 Анализ продукции активных форм кислорода (АФК) 58
2.12 Измерение продукции оксида азота (NO) 58
2.13 Измерение продукции цитокинов 59
2.14 Исследование фосфорилирования ERK1/2 59
2.15 Оценка противовоспалительных свойств соединений в культуре микроглиальных клеток крысы 59
2.16 Измерение проницаемости тестируемых соединений через монослой клеток hCMEC/D3 60
2.17 Исследование стабильности соединений в микросомах печени крысы 61
2.18 Молекулярное моделирование 62
2.19 Статистическая обработка и классификационный анализ 63
Глава 3 Результаты собственных исследований .64
3.1 Идентификация FPR агонистов методом высокоэффективного скрининга 64
3.1.1 Результаты первичного скрининга 64
3.1.2 Производные бензимидазола 68
3.1.3 Производные N-фенилмочевины 70
3.1.4 2-(N-пиперазинил)ацетамидные производные 72
3.1.5 Новые агонисты FPR1 среди бензимидазольных производных 74
3.1.6 Молекулярный докинг агонистов FPR с бензимидазольным скаффолдом 77
3.1.7 Новые производные пиридазин3(2H)она 87
3.1.8 Новые хиральные пиридазин3(2H)оны 92
3.1.9 Оптимизация FPR агонистов с пиридазин3(2H)оновым скаффолдом 97
3.1.10 Дальнейшая оптимизация FPR1/2 агонистов с пиридазин3(2H)оновым скаффолдом 104
3.1.11 Молекулярный докинг пиридазин3(2H)оновых FPR1 агонистов 111
3.1.12 Идентификация новых FPR агонистов среди лигандов других GPCR 114
3.1.13 Молекулярное моделирование FPR агонистов с уреидопропанамидным скаффолдом 127
3.1.14 Идентификация индукторов TNF среди агонистов FPR 135
3.1.15 Разработка агентов с противовоспалительными свойствами на основе FPR агонистов 141
3.2 Идентификация новых антагонистов FPR1 159
3.2.1 4H-хромен-4-оны как антагонисты FPR1 159
3.2.2 Молекулярное моделирование хроменовых FPR1 антагонистов 176
3.2.3 1H-пиррол-2(5H)-оны как антагонисты FPR1 180
3.2.4 Молекулярное моделирование 1H-пиррол-2(5H)-оновых FPR1 антагонистов 189
3.2.5 Новые антагонисты FPR1 на основе cаропептата, натурального природного соединения с противовоспалительными свойствами 192
Заключение 196
Выводы 207
Список условных сокращений 208
Список литературы 210
- Непептидные природные антагонисты FPR и сигнальных путей, активируемых через FPR
- Молекулярный докинг агонистов FPR с бензимидазольным скаффолдом
- Разработка агентов с противовоспалительными свойствами на основе FPR агонистов
- Новые антагонисты FPR1 на основе cаропептата, натурального природного соединения с противовоспалительными свойствами
Непептидные природные антагонисты FPR и сигнальных путей, активируемых через FPR
Кумарины представлют собой важную группу соединений с широким спектром биологической активности. Некоторые кумарины имеют антикоагулянтные свойства и используются в клинике [143, 236]. Химические структуры некоторых кумаринов показаны в таблице 1. Такие кумарины, как изогераклеин, императорин, остенол, бергаптен, ксантилетин, аллоксантоксилетин и деметилаурапентол были найдены как ингибиторы продукции O2-. и эластазы нейтрофилов в fMLF-стимулированных нейтрофилах человека [41, 43, 55, 166, 267]. Shen с соавторами обнаружили, что среди 20 исследованных соединений такие кумарины, как изогераклеин, императорин и остенол, были наиболее мощными ингибиторами fMLF-стимулированной продукции O2-. [267]. Тем не менее, недавно было показано, что императорин имеет комплексное действие на ионные каналы, включая ингибиторый эффект на вольтаж-зависимые K+ каналы и АТФ-чувствительные K+ каналы [304], а также агонистический эффект на ионные каналы TRPV1 [47]. Необходимо отметить, что остенол является известным натуральным соединением с противовоспалительной активностью и широким спектром молекулярных мишений [126, 178]. Кумарин остол имеет слабый ингибиторный эффект на fMLF-индуцированное высвобождение эластазы из нейтрофилов [166]. Хотя родственный кумарин – остенол – имеет мощный ингибиторный эффект на fMLF-индуцированную продукцию O2-. и высвобождение эластазы нейтрофилов [166], для этого соединения ранее были обнаружены свойства ингибитора 5-редуктазы типа I, 5-липоксигеназы и циклооксигеназы [195, 266], что предполагает независимые от FPR эффекты на функциональную активность нейтрофилов. Действительно, ингибиторы циклооксигеназы, такие как целекосиб и индометацин, подавляют fMLF-индуцированный хемотаксис [211]. Кумарины могут также действовать как скавенжеры АФК [100]. Таким образом, необходимо проведение дополнительных исследований для подтверждения прямого действия кумаринов на FPR1.
Хиноны и нафталеноны. Среди всех натуральных соединений группа хиноновых и нафтохиноновых хромофоров является одной из самых больших. Эти соединения имеют широкий спектр биологических эффектов и могут модулировать клеточные сигнальные процессы через регуляцию экспрессии генов и рецепторных тирозин киназ [152]. Имеется ряд публикаций о влиянии этих соединений на fMLF-индуцированный ответ нейтрофилов. Например, берриамон А и нафталеноновые производные берриамон B (таблица 1) и 4-O-метил берриамон С, изолированные из растения Berrya ammonilla, имеют относительно мощное ингибирующее действие на fMLF-индуцированную продукуцию O2-. и высвобождение эластазы из нейтрофилов [54]. Кроме того, родственный этим соединениям метилнафталеновый карбоксилат лавсонафтоат А (таблица 1) также имеет ингибиторную активность на эти процессы [192]. Хотя эмбелин, абрухинон А и ацетилшиконин подавляли fMLF-индуцированный функциональный ответ в нейтрофилах, эти натуральные хиноны также подавляли ионофор A23187-индуцированный биосинтез эйкозаноидов в нейтрофилах [124, 125, 258], а эмбелин непосредственно подавлял ферментативную активность 5-липоксигеназы [258]. Наконец, эхретихинон, изолированный из корней растения Ehretia longiflora, имеет ингибирующий эффект на fMLF-индуцированную продукцию O2-., хотя влияние на fMLF-индуцированное высвобождение эластазы нейтрофилов и другие функциональные ответы нейтрофилов не были обнаружены [51]. Таким образом, могут ли эти соединения действовать как антагонисты FPR1, до сих пор не известно.
Лигнаны. Лигнаны являются растительными фенолами, которые в растениях образуются биосинтетически из фенилпропаноидов. Лигнаны имеют медицинское значение, поскольку обладают разнообразными фармакологическими свойствами, включая противоопухолевые, гепатопротекторные, антигипертензивные, противогрибковые, седативные и антиоксидантные, а также способность подавлять действие фактора активации тромбоцитов [335]. Некоторые лигнаны растительного происхождения были исследованы в отношении подавления fMLF-индуцированного функционоального ответа в нейтрофилах. В частности, (7S ,8R ,7 R ,8 S )-икариол A-9-O--ксилопиранозид и (+)-9 -O-(Z)-ферулоил 5,5 -диметоксиларицирезинол из растений Hygroryza aristata и Zanthoxylum avicennae, соответственно, подавляли продукцию O2-. и высвобождение эластазы в fMLF стимулированных нейтрофилах [42, 57]. Среди пяти лигнанов, изолированных из Zanthoxylum ailanthoides, включая (-)-сирингарезинол, 5,5-дидиметоксипинорезинол, (+) эписезамин, глаберид I и (-)-дигидрокубебин, только (+)-эписесамин (таблица 1) подавлял как продукцию O2-., так и высвобождение эластазы нейтрофилов из fMLF-стимулированных нейтрофилов [55]. Некоторые неолигнаны бифенильного типа, изолированные из Magnolia officinalis, включая 5-аллил-5-(1-гидроксиаллилокси)бифенил-2,2-диол, 4-аллил-2-(2 метилбензофуран-5-ил)фенол, магнолол, магнальдегид D, рандаиол (таблица 1) и рандаинал, в различной степени подавляли продукцию O2-. и высвобождение эластазы из fMLF-индуцированных нейтрофилов [156]. Магнолол также подавлял fMLF индуцированный хемотаксис нейтрофилов человека и слабо подавлял fMLF-стимулированную продукцию O2-. в нейтрофилах крысы [167, 299]. Тем не менее, магнолол и родственные лигнаны также имели прямое стимулирующее действие на мобилизацию Ca2+, продукцию O2-. и высвобождение эластазы из нейтрофилов [156, 301]. Таким образом, ингибирующий эффект магнолола на fMLF-индуцированный ответ, возможно, обусловлен десенситизацией или кросс-десенситизацией FPR1, так как известно, что магнолол может связываться с рецептором GABAA [1]. Хотя хонокиол подавлял fMLF-индуцированную продукцию O2-., высвобождение катепсина G, мобилизацию Ca2+ и миграцию нейтрофилов [181, 194], последующие исследования показали, что хонокиол не является конкурентным или аллостерическим антагонистом FPR1. Более того, хонокиол может модулировать fMLF-индуцированную активацию нейтрофилов в результате активации протеинкиназы Lyn, что может в дальнейшем интерферировать с активацией PLC2, Akt, p38, протеинкиназы C и мембранной локализацией p47phox, одного из компонентов NADPH-оксидазы [181].
Нордигидрогуаяретовая кислота (NDGA) является лигнаном из растения Larrea tridentata [87]. Хотя NDGA может эффективно подавлять fMLF-индуцированную продукцию АФК и дегрануляцию нейтрофилов [219, 231, 234], этот лигнан является мощным ингибитором 5-, 12-, and 15-липоксигеназ [255]. Другой лигнан, ди-O-метилтетрагидрофурогуайацин B, имел бифазный эффект на fMLF-индуцированную продукцию АФК в нейтрофилах человека [260]. Лигнан MSF-2 (5-гидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-3,7-диметокси-4H-хромен-4-он), выделенный из плодов Melicope semecarpifolia, подавлял fMLF-индуцированную продукцию O2-., высвобождение катепсина G и хемотаксис, тогда как мобилизация внутриклеточного Ca2+ была только частично снижена в нейтрофилах человека [180]. Поскольку MSF-2 не подавял связывание fMLF с FPR1, то авторы предположили, что действие этого лигнана обусловлено ингибирующим влиянием на нижележащие от этого рецептора пути, возможно на PI3K.
Среди других лигнанов, которые подавляли fMLF-индуцированные ответы в нейтрофилах, только лигнан PP-6 [(2R, 3R)-2-(3,4-дигидроксибензил)-3-(3,4 диметоксибензил)бутиролактон] (таблица 1), изолированный из Piper philippinum, блокировал связывание fMLF с FPR1 (IC50 1.5 мкM) [132]. Лигнан PP-6 также подавлял fMLF-индуцированную мобилизацию Ca2+, продукцию O2-. и фосфорилирование ERK1/2, Akt и p38 [132], предполагая прямое антагонистическое действие на этот рецептор.
Лигнаны фурфуранового типа, такие как матарезинол, ларицирезинол и пинорезинол, широко распространены среди съедобных растений. Эти лигнаны могут быть метаболизированы кишечной микрофлорой до энтеролактона и энтеродиола, имеющих, как предполагается, противоопухолевое действие [273]. Энтеролактон является изомером PP-6 и также может подавлять продукцию АФК в fMLF-стимулированных нейтрофилах [219].
Тритерпены, стероиды и сапонины. Тритерпены являюся одной из наиболее разнородных групп натуральных растительных соединений. Эти соединения содержат 4-х или 5-ти кольцевые скелеты и гидроксильные, карбоксильные или оксо- группы и образуются в растениях через скваленовую циклизацию. Некоторые тритерпены, изолированные из Microtropis fokienensis, подавляли fMLF-индуцированную продукцию O2-. и высвобождение эластазы из нейтрофилов, с наиболее мощным среди них соединением 30-гидрокси-2,3-seco-люп-20(29)-эн-2,3-диоикная кислота («тритерпен 17»; таблица 1), имеющим в своем составе две карбоксильные группы [36]. Олеанольная, урсолиновая и бетулиновая кислоты являются известными тритерпенами с противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами [284]. Олеанольная кислота подавляет fMLF-индуцированные ответы, включая продукцию O2-. и высвобождение эластазы из нейтрофилов [27, 52, 171, 200]. Активность этого тритерпена на продукцию O2-. была в 8 раз выше в нейтрофилах, стимулированных fMLF, по сравнению с нейтрофилами, стимулированными форбол-12 миристат-13 ацетатом (PMA) [171]. Эпибетулиновая кислота (таблица 1), изолированная из Pachycentria formosana, показала сходную ингибирующую активность, как и олеанольная кислота [52], а также ее аналог, бетулиновая кислота. Эти соединения подавляли fMLF-индуцированную продукцию O2-. нейтрофилами. Тем не менее, бетулиновая кислота не влияла на fMLF-индуцированное высвобождение эластазы [54], что предполагает ее действие через FPR1-независимый механизм. Хотя -амирин, уваол, урсолиновая кислота, 19-гидрокси урсолиновая кислота, а также 19,24-дигидрокси урсолиновая кислота подавляют fMLF-индуцированную продукцию O2-., все эти тритерпены также подавляют генерацию O2-., стимулированную арахидоновой кислотой [39], что предполагает неспецифический эффект этих соединений и (или) взаимодействие на молекулярные пути, расположенные ниже этого рецептора.
Стероиды являются производными тритерпенов в растениях и животных организмах. Желчные кислоты являются стероидными кислотами, найденными преимущественно в желчи позвоночных животных. Эти эндогенные анионные детергенты производятся печенью и содержат жесткие стероидные гидрофобные химические скаффолды. Хотя жирные кислоты ранее рассматривались как катаболические продукты холестерола, вовлеченные в солюбилизацию различных липидов и жирорастворимых соединений в кишечнике, недавно они были открыты как сигнальные молекулы, участвующие во многих физиологических функциях. По крайней мере две из этих кислот, а именно дезоксихолиевая кислота (DCA) и хенодезоксихолевая кисоота (CDCA) были найдены как прямые антагонисты FPR1, способные подавлять при высоких концентрациях (100 мкM) связывание с FPR1 меченого 3H-fMLF [46, 48]. Chen с соавторами сообщили, что CDCA подавляет fMLF-индуцированную мобилизацию Ca2+ в моноцитах человека при IC50 40 мкM [46]. Другая жирная кислота – тауроурсодеоксихоливая кислота – также подавляляла fMLF-индуцированную мобилизацию Ca2+ при относительно высоких концентрациях (IC50 500 мкM) [15].
Молекулярный докинг агонистов FPR с бензимидазольным скаффолдом
В ряде предыдущих работ для построения гомологичных моделей FPR1 была успешно использована кристаллическая структура бычьего родопсина [86, 90, 222]. Положение сайта связывания в этих моделях было определено на основе эксприментов по кросс-сшиванию и мутагенезу. Этот сайт локализован в верхней области рецептора, в ее трансмембранных (ТМ) фрагментах TM2, 5, 6 и 7 [212, 214]. Предыдущие докинговые вычислительные эксперименты были проведены с использованием пептида Ac-QAWF, являющегося активным фрагментом аннексин AI-производного пептида Ac9–25 [142]. Наши предварительные модельные эксперименты подтвердили, что область для докинга совпадает с участком связывания, определенным в этой ранней работе (рисунок 4). Таким образом, мы считаем, что данная гомологичная модель может быть использована для изучения новых агонистов FPR1.
Movitz с соавторами ранее показали, что карбонильный углерод аминокислотного остатка Ala пептида Ac-QAWF расположен примерно в геометрическом центре этого пептида [222]. В наших исследованиях этот углеродный атом был выбран в качестве центра для сферической области поиска при докинге с радиусом сферы 11 (рисунок 4А). Такая область поиска для докинга полностью включает в себя молекулу пептида, а также 36 остатков FPR1. Среди этих остатков, 6 остатков (Asp106, Arg201, Arg205, Trp254, Tyr257 и Phe291) были ранее идентифицированы путем мутагенеза как наиболее важные остатки сайта связывания агонистов FPR1 [214].
Визуальная инспекция сайта связывания FPR1 позволила выявить ключевые характеристики его поверхности. Они включают канал A; полость B, канал С, дно D и большую полость E (рисунок 4Б). Канал А расположен в зоне остатков Asn192, Thr199, Thr265, Ile268 и Leu271. Канал C ограничен остатками Leu101, Val105, Tyr257, Ser287 и Phe291. Полость B сформирована изобутильной группой остатка Leu198 и ограничена Val160, Leu198, Arg201, Gly202 и Arg205. Большая полость E расположена около Trp91, Trp95, Cys98, и Lys99. Наконец, дно D окружено каналами A и C и ограничено остатками Ala261, Ala264 и Val283. Необходимо отметить, что методология, использованная ранее Movitz с соавторами [222] отличается от алгоритма, используемого в программе MVD. Тем не менее, мы нашли, что поза Ac-QAWF была аналогична приведенной ранее в этой работе Movitz с соавторами. Наложение докинговых поз fMLF и Ac-QAWF показало, что скелеты этих пептидов хорошо перекрываются между собой (рисунок 4Б).
Из рисунка 5А видно, что водородная связь между fMLF и Arg205 формируется с участием терминальной карбоксильной группы пептида и гуанидиновой группы Arg205. Можно также отметить значительное ионное взаимодействие между этими областями с энергией 3.0 ккал/моль. Это наблюдение подтверждается работами Mills с соавторами [214], которые сообщили об аналогичном взаимодействии fMLF и Arg205 этого рецептора. Они также отметили, что формильная группа fMLF образует водородную связь с Arg201. Тем не менее, в результате расчетов мы не обнаружили соответствующую водородную связь, хотя эти области расположены близко друг к другу (расстояние между атомом азота гуанидина в Arg201 и кислородом формильной группы fMLF составляет 4.05 ).
Докинг FPR1 агонистов и их неактивных аналогов в гомологичную модель FPR1 может помочь в определении ключевых характеристик взаимодействия «лиганд-рецептор». Такие систематические исследования для FPR1 агонистов ранее не проводились. Мы выполнили такой анализ с использованием набора из 50 бензимидазолов, включая 33 активных FPR1 агониста и 17 неактивных аналогов (таблицы 13, 14, 19 и 20).
В результате молекулярного моделирования было показано, что наиболее активные бензимидазольные производные AG-11/03 и AG-11/05 ощутимо не взаимодействуют с Arg205. Хотя AG-11/05 образует водородную связь (1.5 ккал/моль) с Arg205 (рисунок 5Б), это взаимодействие было слабее, чем водородная связь, образуемая между Arg205 и пептидом fMLF. С другой стороны, метокси-группы AG-11/03 и AG-11/05 имеют очень сходную ориентацию, благодаря образованию водородной связи между их метокси-группами и Thr199.
Для некоторых лиганд-рецепторных комплексов была изучена стабильность докинговых поз путем выполнения симуляции методом MD (молекулярная динамика). Для агонистов FPR1 при 310 K строилась MD-траектория, начиная от их лучших докинговых поз внутри сайта связывания FPR1. Расстояния от карбонильных углеродов в остатках FPR1 до гетероатомов в различных регионах молекул агонистов указаны в таблице 21. Из этой таблицы видно, что расстояния изменяются незначительно, то есть молекулы агонистов осциллируют около своих равновесных положений.
Для увеличения разнообразия исследованных агонистов FPR1 мы также выполняли докинг девяти петидов, известных как агонисты FPR1. Среди них были fMLF и три его производных: N-formyl-Met-Leu-Phe-OMe [fMLF-OMe], boc-cis-4-mer-captomethyl-Pro-Leu-Phe-OMe [boc-cis-4-mercapto-methyl-PLF-OMe] [215] и N-formyl-Met-Leu-(COO) Phe-NHBzl [fML(COO)F-NHBzl] [23]. Неактивные пептидные аналоги включали N-formyl-Met-(COO)Aib-Phe-OMe [fM(COO) Aib-F-OMe] [23], N-formyl-Met-(NMe)Leu-Phe-OMe [fM-(NMe)LF-OMe] [24], N-formyl-Met-azaPro-Phe-OMe [fM-azaPF-OMe] [232], [Pheol]3 и N-formyl-Cys-Leu-Phe-Cys-OMe [fCLFC-OMe] [233].
Поскольку по результатам анализа «структура-активность» одной из наиболее значимых характеристик, необходимых для проявления FPR1 агонистической активности 2 (бензимидазол-2-илтио)-N-фенилацетамидами является присутствие алкокси-группы в бензимидазольном фрагменте, мы проанализировали положение алкокси-заместителей в докинговых позах в FPR1 сайте связывания. Были определены все аминокислотные остатки FPR1, расположенные внутри 3.5 от атома кислорода в алкокси-группах всех алкокси-содержащих бензимидазолов. Мы нашли, что у 37 из 43 алкокси-замещенных бензимидазолов атомы кислорода метокси- или этокси-групп были размещены в канале А или полости В. Среди этих бензимидазолов 34 соединения были активными агонистами FPR1, что показывает значимость лиганд-рецепторного взаимодействия в областях А и В (рисунок 6). У оставшихся активных производных (AG-09/17, AG-09/20 и AG-11/10) алкокси-группы занимали полость Е.
Разработка агентов с противовоспалительными свойствами на основе FPR агонистов
В настоящем разделе представлены данные по биологической активности новых FPR2 агонистов, полученных путем модификации описанных выше уреидопропанамидов (см. раздел 3.1.12). Целью этого исследования было получение FPR2 агонистов с противовоспалительными свойствами. Соединения были синтезированы в Dipartimento di Farmacia, Scienze del Farmaco, Universit degli Studi di Bari Aldo Moro (Бари, Италия) под руководством профессора Marcello Leopoldo.
Первая группа соединений состояла из производных агонистов (R)LK-4 и (S) LK-4 (таблица 52). Результаты исследования показали, что ни одно из новых соединений не обладает свойствами антагониста FPR2. Таким образом, можно предположить, что модификация структуры агониста путем введения гидроксильной группировки в ароматические кольца уреидопропанамидных производных не приводит к конверсии функциональной активности лиганда от агонизма к антагонизму. Тем не менее, введение гидроксильной группы приводило к изменению биологической активности производных. В частности, введение гидроксильной группы в положение 4 фенилмочевинной группировки приводило к неактивным соединениям (R)LK-24 и (S)LK-24. Этот результат был неожиданным, так как предыдущие наши исследования показали, что введение в это положение полярных группировок – таких, как NO2 и CN, толерантно сказывалось на активности. Таким образом, возможно, что введение заместителя, играющего роль донора водородной связи, не является толерантным для этой части молекулы. С другой стороны, замещение группы CN в соединениях (R)LK4 и (S)-LK-4 на гидроксильную группу было толерантным. Действительно, (R)LK-4 и (S)-LK25 имеют величины EC50, сходные с таковыми для этих соединений на FPR1 и FPR2.
Введение гидроксильной группы в фенильное кольцо приводило к разным эффектам в зависимости от хиральности молекулы. Было обнаружено, что R-энантиомеры менее активны, чем S-энантиомеры. Кроме того, если гидроксильная группа была введена в положение 3, то полученное соединение (S)LK-26 имело величину EC50, сходную с таковой для соединения (S)LK-4, тогда как агонистическая активность (S)LK-27 была ниже, чем у (S)LK-4. Наконец, R-энантиомеры LK-26 и LK-27 были неактивны в отношении FPR1, тогда как S-энантиомеры имели величину EC50, сходную с таковой для (S)LK-4.
Вторая группа соединений состояла из производных агонистов (R)LK-2 и (S)LK-2 (таблица 53). Анализ биологической активности этих аналогов показал, что введение гидроксильной группы в фенильное кольцо приводит к полной потере агонистической активности на FPR2 и к значительному снижению агонистической активности на FPR1. Этот эффект проявлялся сильнее, если гидроксильная группа была введена в положение 4. Данный факт подтверждает, что введение заместителя, образующего водородные связи в этой части молекулы препятствует взаимодействию лиганда с FPR2. Замещение фенилаланинового остатка в молекуле LK-2 на остаток тирозина приводит к снижению активности FPR2 агониста (соединения (2R)LK-46 и (2S)LK-47). Тем не менее, эта структурная модификация не влияет на взаимодействие с FPR1.
Поскольку ни одно из исследованных в данном разделе производных не обладало антагонистической активностью, мы решили оценить их способность вызывать десенситизацию FPR1/2 рецепторов. Для этого была изучена способность соединений подавлять мобилизацию Ca2+ в ответ на последующую обработку клеток FPR2 агонистом WKYMVM. Среди производных (R)LK-4 и (S)LK-4 только (S)LK-26, (R)LK-27 и (S)LK-27 были способны вызывать десенситизацию FPR2 с величинами IC50, сходными со значениями EC50 для этих же уреидопропанамидов. Среди производных соединения (S)LK-2, только у (2R)LK-46 и (2S)LK-47 обнаружена способность вызывать десенситизацию.
В следующей серии экспериментов мы изучали вопрос о том, могут ли соединения, которые вызывают десенситизацию FPR рецепторов оказывать защитный эффект на модели нейровоспаления (in vitro). Для этого мы оценили влияние исследуемых соединений на клетки N9 микроглии мыши, которые часто используются в качестве репрезентативной модели первичных клеток микроглии [91]. Следует отметить, что клетки N9 экспрессируют небольшие уровни Fpr2 mRNA в нестимулированных условиях, тогда как экспрессия Fpr2 mRNA значительно увеличивается при активации клеток бактериальным эндотоксином (ЛПС) и другими воспалительными медиаторами, такими как амилоид [64, 287].
В первой серии экспериментов было изучено влияние новых синтезированных соединений на метаболическую и цитотоксическую активность клеток N9 в нестимулированных условиях с использованием MTT (3[4,5диметилтиазол-2ил]2,5 дифенилтетразолий бромид). Этот метод позволяет количественно оценить митохондриальную активность живых клеток и тем самым определить цитотоксичность соединений. Результаты исследования показали, что ни одно из соединений, за исключением (R)LK-26 и (S)LK-27, не были цитотоксичными после 24 часов инкубации в интервале концентрций от 0.1 до 100 мкМ (IC50 100 мкM).
Для следующей серии экспериментов были выбраны соединения, которые вызывали десенситизацию ((R)LK-25, (R)LK-26, (S)LK-26, (R)LK-27, (S)LK-27, (2R)LK-46 и (2S) LK-47). Эти соединения были изучены в отношении их способности модулировать окислительный стресс в клетках N9, обработанных воспалительным стимулом, а именно ЛПС. В частности, мы измеряли эффекты на продукцию АФК и для сравнения использовали известный FPR агонист Quin-C1, который также был способен вызывать десенситизацию FPR (IC50 = 40 нМ) и проявлять противовоспалительные свойства in vivo [117, 118].
Известно, что при физиологических условиях АФК вовлекаются в иммунные ответы и воспаление, а также в нормальные процессы в нервной ткани [150, 296]. Например, недавно сообщалось, что Fpr2 вызывают нейрональную дифференцировку в нейрональных стволовых клетках мыши через продукцию АФК [336]. Тем не менее, если продукция АФК превышает пороговый уровень, то это может вызывать окислительный стресс, повреждение белков и ДНК и индуцировать перекисное окисление липидов. Окислительный стресс может триггировать клеточную смерть и вовлекаться в патогенез многих нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера [172].
Исследование влияния соединений (R)LK-25, (R)LK-26, (S)-LK-26, (R) LK-27, (S) LK-27, (2R)LK-46 и (2S)LK-47, а также Quin-C1 в N9 клетках после их 24-часовой стимуляции с ЛПС показало, что при концентрации соединения 100 нМ только Quin-C1, (R) LK-25 и (2R)LK-46 индуцировали статистически значимое снижение продукции АФК (p 0.05) (рисунок 27). При тестировании соединений в концентрации 1 мкМ статистически значимое снижение продукции АФК наблюдалось для всех протестированных соединений (p 0.05), за исключением (S)LK-26. Более того, за исключением соединения (S)LK-26, снижение в продукции АФК коррелировало с уровнями десенситизации рецепторов.
Мы также оценили прямой антирадикальный эффект соединений (R)LK-25, (R)LK-26, (S)LK-26, (R)LK-27, (S)LK-27, (2R)LK-46 и (2S)LK-47 путем измерения их влияния на неферментативную продукции аниона супероксида (O2.-) в системе феназин метасульфат/NADH). Важно отметить, что ни одно из тестируемых соединений не показало антирадикального эффекта при концентрациях до 20 мкМ, подтверждая, что эти уреидопропанамиды ведут себя как функциональные антагонисты, а не как скавенжеры АФК, и что эти соединения имеют защитный эффект в модели нейровоспаления путем десенситизации рецепторов и, возможно, кросс-десенситизации.
В разделе 3.1.10 были описаны агонисты FPR2 c 3-(1H-индол-3-ил)-2-[3-(4 замещенный-фенил)уреидо]пропанамидным скаффолдом. Структура соединения ST-12, как пример такого агониста, показана в таблице 54. Этот агонист характеризуется способностью индуцировать высвобождение внутриклеточного Ca2+ в нейтрофилах человека. Для некоторых агонистов FPR2 показана способость осуществлять противовоспалительные свойства на разных моделях [117, 141]. В то же время, ранее не изучались эффекты агонистов FPR2 на in vitro или in vivo моделях нейровоспаления. Поэтому мы решили проверить, будут ли новые агонисты FPR2 с уреидопропанамидным скаффолдом проявлять противовоспалительные свойства на модели нейровоспаления (in vitro). Все соединения были синтезированы в Dipartimento di Farmacia, Scienze del Farmaco, Universit degli Studi di Bari Aldo Moro (Бари, Италия) под руководством профессора Marcello Leopoldo. Структура и биологическая активность соединений показана в таблице 54.
Новые антагонисты FPR1 на основе cаропептата, натурального природного соединения с противовоспалительными свойствами
Аурантиамид ацетат (саропептат) является природным соединением, выделенным из различных источников, включая растение Polygonum chinensin и бактерий Aspergillus penicilloides [292]. Аурантиамид ацетат является дипептидом, который может быть получен синтетически, путем конденсации бензоилфенилаланина с фенилаланинолом. В ЛПС-стимулированных человеческих микроглиальных клетках BV-2, аурантиамид ацетат снижает активность индуцибельной NO синтазы (iNOS), циклооксигеназы-2 (COX-2) и продукцию провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1 и TNF, что может свидетельствовать о нейропротекторном действии этого соединения [326]. Hwang с соавторами [133] сообщили о серии противовоспалительных дипептидов, структурно родственных аурантиамид ацетату, включая соединения (2R,2 S)-AA-6 и (2R,2 S)-AA-7. Оба соединения ингибировали продукцию O2– и высвобождение эластазы из нейтрофилов человека, стимулированных fMLF. Молекулярный скаффолд аурантиамид ацетата может быть оптимизирован путем модификации его аминоксилотных остатков. В настоящем разделе представлены результаты исследования аналогов аурантиамид ацетата с целью разработки новых FPR1 антагонистов.
Результаты по влиянию новых соединений на мобилизацию Ca2+ в клетках FPR1-HL60 и FPR2-HL60 показаны в таблицах 63-65. Оказалось, что замещение (S)-триптофана на (R)-триптофан приводило к 36-кратному снижению FPR1 антагонистической активности ((2R,2 S)-AA-6: IC50 = 0.45 мкM против (2R,2 R)-AA-6: IC50 = 16.5 мкM), тогда как замещение (R)-фенилаланина на (S)-фенилаланин приводило к менее драматическим изменениям в активности ((2R,2 S)-AA-6: IC50 = 0.45 мкM против (2S,2 S)-AA-6 IC50 = 5.8 мкM). Кроме того, (2S,2 S)-AA-6 был способен блокировать FPR2.
В следующей серии экспериментов мы изучали влияние на FPR1 антагонистическую активность структурных модификаций на концах молекулы (2R,2 S)-AA-6.
В ходе структурных модификаций фенильное кольцо TV-бензоильной области было заменено на бутильные заместители, так как ранее сообщалось, что введение разветвленных алкильных заместителей, в частности, /so-бутилоксикарбонил, /-бутилоксикарбонил и бутилоксикарбонил в TV-концевую часть трипептида Met-Leu-Phe (MLF) приводило к возникновению FPR1 антагонистической активности, тогда как введение линейных алкильных заместителей (метоксикарбонил, этоксикарбонил) приводило к FPR1 агонистической активности [214].
Исследование активности этих аналогов показало, что некоторые структурные модификации не влияли на способность соединений блокировать FPR1. В частности, соединение AA-10, несущее циклогексильную группу, имело величину IC50, сходную с таковой для соединения (2R,2 S)-AA-6. Напротив, введение изобутильной или t-бутокси групп приводило к значительному снижению антагонистической активности молекулы. Этот эффект был более сильным для соединения AA-12, для которого наблюдалось 46-кратное снижение активности. Таким образом, объем разветвленных алкильных заместителей имел влияние на взаимодействие с FPR1. Более того, введение t-бутокси заместителя негативно влияло на селективность соединений, так как (2R,2 S)-AA-8 было также способно активировать FPR2. Наконец, учитывая тот факт, что соединение (2R,2 S)-AA-7, в котором фенилаланиновая группа была замещена на циклогексилаланин, имеющий величину IC50, сравнимую с таковой для (2R,2 S)-AA-6, мы заменили фенилаланиновый скаффолд в молекуле (2R,2 S)-AA-6 на разветвленные аминокислоты, такие как лейцин и валин (соединения AA-12 и AA-13, соответственно). Эти структурные модификации привели к значительному снижению активности соединений AA-12 и AA-13 по сравнению с (2R,2 S)-AA-6 и (2R,2 S)-AA-7. Полученные результаты дают основание полагать, что форма и размер заместителя в этой части молекулы также играет важную роль во взаимодействии с FPR1. Кроме того, соединение AA-12 было способно активировать FPR2.
Все соединения, изученные в данном разделе, были также исследованы на нейтрофилах человека. С использованием этих клеток было подтверждено, что все соединения являются антагонистами FPR1. Хотя они не активировали мобилизацию Ca2+ в нейтрофилах, но вызывали концентрационно-зависимое блокирование ответа клеток на добавление fMLF, имея величины IC50, сравнимые с найденными для клеток FPR1-HL60. Исключением было соединение AA-10, которое имело относительно низкую антагонистическую активность в нейтрофилах человека по сравнению с клетками FPR1-HL60.
Поскольку активация нейтрофилов пептидом fMLF может индуцировать различные функциональные ответы в нейтрофилах, включая хемотаксис, в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние наиболее активных антагонистов FPR1, а именно (2R,2 S)-AA-6, (2R,2 S)-AA-7, (2S,2 S)-AA-6 и AA-10 на хемотаксис нейтрофилов человека (таблица 65). Мы обнаружили, что все соединения концентрационно-зависимо подавляют fMLF-индуцированную миграцию нейтрофилов. Величины наблюдаемых в этом исследовании IC50 хорошо коррелируют с антагонистической активностью соединений (2R,2 S)-AA-6 и (2R,2 S)-AA-7.
Таким образом, исследование аналогов аурантиамид ацетата показало, что абсолютная конфигурация 2R,2 S является наилучшей для проявления FPR1 антагонистической активности. Структурные модификации, выполненные на терминальных участках аналогов аурантиамид ацетата, показали, что размер заместителя имеет сильное влияние на взаимодействие с FPR1.