Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1. Ишемия мозга 13
1.1 Ишемический каскад реакций 15
1.2 Реперфузионный синдром 21
1.3 Модели ишемии мозга 22
2. Современные подходы в терапии ишемического инсульта 24
2.1 Используемая терапия 24
2.1.1 Урокиназа 25
2.1.2 Алтеплаза 25
2.1.3 Стрептокиназа 26
2.1.4 Антикоагулянты 26
2.1.5 Антиагреганты 28
2.1.6 Блокаторы кальциевых каналов 29
2.1.7 Блокаторы глутаматных NMDA рецепторов 30
2.1.8 Блокаторы натриевых каналов 31
2.1.9 Агонисты ГАМК 32
2.1.10 Стабилизаторы мембран 33
2.1.11 Антитела к молекулам адгезии 33
2.2 Антиоксиданты 34
2.2.1 Ловушки свободных радикалов 34
2.2.2 Альфа-липоевая кислота 35
2.2.3 NXY-059 37
2.2.4 Эбселен 38
2.2.5 Мексидол 39
2.2.6 Карнозин 40
2.2.7 Семакс
2.3 Нейротрофические факторы 42
2.4 Стволовые клетки 44
3. Коэнзим Q10 48
3.1 Структура и биосинтез 48
3.2 Функции коэнзима Q10 50
3.3 Применения коэнзима Q10 при заболеваниях центральной нервной системы 59
3.3.1 Коэнзим Q10 при нейродегенеративных заболеваниях з
3.3.2 Коэнзим Q10 при ишемическом повреждении мозга 65
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 71
1. Исследуемые препараты 71
2. In vitro эксперименты
2.1 Получение нейрональной культуры клеток 72
2.2 Моделирование нормобарической гипоксии 72
2.3 Изучение цитотоксичности субстанции коэнзима Q10 и выживаемости нейронов после нормобарической гипоксии 72
2.4 Изучение спонтанной биоэлектрической активности клеток 73
3. In vivo эксперименты 74
3.1 Экспериментальные животные 74
3.2 Наркоз 74
3.3 Внутривенное введение веществ 74
3.4 Расчет смертности животных 75
3.5 Измерение неврологического статуса животных 75
3.6 Моделирование фокальной ишемии головного мозга 77
3.7 Декапитация 79
3.8 Морфологическая оценка очага поражения головного мозга 79
3.9 Планиметрическая обработка фотографий срезов головного мозга крыс, расчет объема очага поражения 80
3.10 Определение тканевого содержания коэнзима Q10 и -токоферола в головном мозге крыс 81
4. Обработка, анализ и представление результатов исследования 83
5. Протоколы экспериментов
5.1 Исследование возможности накопления CoQ10 и -токоферола в интактном головном мозге крыс после однократного внутривенного введения препарата CoQ10 84
5.2 Изучение цитотоксичности субстанции коэнзима Q10 и выживаемости нейронов в условиях нормоксии и гипоксии на модели нейрональной культуры клеток гиппокампа 85
5.3 Изучение нейротропных и нейропротекторных свойств субстанции CoQ10 на модели нормобарической гипоксии нейрональной культуры клеток гиппокампа 86
5.4 Изучение нейропротекторного эффекта однократного внутривенного введения препарата CoQ10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 87
5.5 Изучение нейропротекторного эффекта однократного внутривенного введения препарата CoQ10 на модели необратимой ишемии головного мозга крыс 89
5.6 Сравнение нейропротекторной эффективности однократного внутривенного введения мексидола и препарата коэнзима Q10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 91 5.7 Изучение нейропротекторной эффективности двукратного внутривенного введение препарата CoQ10
на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 93
ГЛАВА III. Результаты исследования и их обсуждение 95
1. Исследование возможности накопления CoQ10 и -токоферола в интактном головном мозге крыс после однократного внутривенного введения препарата CoQ10 95
2. Изучение цитотоксичности субстанции коэнзима Q10 и выживаемости нейронов после воздействия нормобарической гипоксии 99
3. Изучение нейротропных и нейропротекторных свойств субстанции CoQ10 на модели нормобарической гипоксии на нейрональной культуре клеток гиппокампа 101
4. Изучение нейропротекторного эффекта однократного внутривенного введения препарата CoQ10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 106
5. Изучение нейропротекторного эффекта однократного внутривенного введения препарата CoQ10 на модели необратимой ишемии головного мозга крыс 114
6. Сравнение нейропротекторной эффективности однократного внутривенного введения мексидола и препарата коэнзима Q10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 121
7. Изучение нейропротекторной эффективности двукратного внутривенного введения препарата CoQ10 на
модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс 129
ГЛАВА IV. Заключение 137
Итоги 137
Выводы 139
Практические рекомендации 140
Список сокращений и терминов 141
Приложения 142
Список литературы 146
- Реперфузионный синдром
- Стволовые клетки
- Моделирование нормобарической гипоксии
- Измерение неврологического статуса животных
- Сравнение нейропротекторной эффективности однократного внутривенного введения мексидола и препарата коэнзима Q10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс
Введение к работе
Актуальность исследования. Острые нарушения мозгового кровообращения являются ведущей причиной смертности и инвалидизации трудоспособного населения в большинстве стран мира. В США ежегодно около 700 тысяч человек переносят ишемический инсульт, в России по данным Росстата - более 450 тысяч человек. Около 15% пациентов умирают в течение первой недели заболевания, большинство выживших после инсульта пациентов утрачивает трудоспособность и нуждается в постоянном уходе (Barquera, S.// Archives of medical research. - 2015. -V. 46, № 5 - Р. 328-338). Это делает ишемический инсульт актуальной проблемой не только медицинской, но и социально-экономической значимости. Возможности патогенетической терапии инсульта остаются крайне ограниченными. Несомненную терапевтическую эффективность в острой фазе инсульта доказали только тромболитические препараты, однако, по данным NINDS (национального института неврологических болезней и инсульта), меньше 5% пациентов с инсультом получают данную терапию и актуальным является поиск новых лекарственных средств с нейропротекторным механизмом действия (Ly, J.// Expert opinion on pharmacotherapy. - 2006. - V. 7, № 12. - P. 1571-1581). Ишемический инсульт чаще всего возникает в результате перекрытия просвета мозговой артерии тромбом. Своевременное восстановление церебрального кровотока ограничивает размер некроза, но, с другой стороны, реперфузия вносит дополнительный вклад в повреждение головного мозга (Lapi, D.// Journal of vascular research. - 2015. - V. 51, № 1. - P. 22-31). Возобновление кровотока приводит к активации оксидативного стресса: инициирует образование свободных радикалов и активных форм кислорода, активирует перекисное окисление липидов, повреждает ДНК и вызывает гибель нейронов (Lavie., L.// Sleep medicine reviews. - 2015. - V. 20. - P. 27-45). При этом активируются эндогенные защитные антиоксидантные системы (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза), однако в условиях оксидативного стресса их оказывается недостаточно для нейтрализации всех свободных радикалов, что приводит к гибели нейронов. Препараты с антиоксидантным нейропротекторным механизмом действия, способные остановить ишемический каскад, являются перспективными для использования как в качестве монотерапии при инсульте, так и в сочетании с тромболитическими препаратами (Ord., E.// Journal of cerebral blood flow and metabolism. - 2013. - V. 33, № 8. - P. 1215-1224). Коэнзим Q10 (CoQ10, убихинон, убидекаренон) – это вещество из класса бензохинонов, который присутствует во всех клетках организма, участвует в переносе электронов в дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий и является мощным эндогенным антиоксидантом. Он предотвращает открытие митохондриальных пор, препятствует деструкции митохондрий, улучшает эндотелиальную функцию и обладает комплексным противовоспалительным действием (Bentinger, M.// Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - V. 396, № 1.- Р. 74-79). Нейропротекторные эффекты CoQ10 были показаны в многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона, болезнь Альцгеймера, при гипертензии и атеросклерозе, а так же при ишемических повреждениях мозга (Salama, M.// CNS & neurological
disorders drug targets. - 2013. - V. 5, № 12. - P. 641-664). Из-за гидрофобности и крупных размеров молекулы биодоступность коэнзима Q10 крайне низка – около 2%. После приема per os уровень CoQ10 в плазме повышается медленно и достигает максимума спустя 6-8 часов, при этом его проникновение в органы-мишени, особенно в головной мозг, окруженный гематоэнцефалическим барьером, крайне ограничено (Bhagavan, H.// Free radical research. -2006. - V.5, № 40. - Р. 445-453). В ургентных ситуациях, таких как ишемический инсульт, для реализации нейропротекторного эффекта необходимо обеспечить быстрое проникновение коэнзима Q10 в головной мозг, что может быть достигнуто с помощью его внутривенного введения.
Степень разработанности проблемы: исследования убихинона в качестве
цитопротектора начались практически сразу после открытия его антиоксидантной роли. В последние годы интерес мирового научного сообщества к изучению коэнзима Q10 в качестве нейропротекторного агента сильно возрос – появляется все больше новых научных работ, описывающих его изучение как in vitro, так и in vivo на различных моделях ишемии мозга и нейродегенеративных заболеваний. Однако, в настоящее время, на фармацевтическом рынке отсутствуют лекарственные формы убихинона для внутривенного введения. Такие экстренные клинические ситуации, как ишемический инсульт, требуют быстрой доставки лекарственных веществ в головной мозг, и оптимальным является их внутривенное введение. Нейропротекторная эффективность коэнзима Q10 при его внутривенном введении на модели ишемии мозга ранее не изучалась и представляет несомненный научный интерес.
Цель исследования - комплексная оценка нейропротекторного эффекта коэнзима Q10 на модели фокальной ишемии головного мозга у крыс.
Задачи исследования
-
Оценить возможность накопления и динамику распределения CoQ10 в головном мозге интактных крыс после однократного внутривенного введения CoQ10.
-
На нейрональной культуре клеток гиппокампа in vitro оценить влияние CoQ10 на жизнеспособность и функциональную активность нейронов в условиях острой нормобарической гипоксии.
-
На моделях ишемии/реперфузии и хронической ишемии головного мозга оценить влияние однократного внутривенного введения CoQ10 на первые сутки на смертность, неврологический статус, размер очага поражения головного мозга и тканевое содержание CoQ10 в головном мозге животных.
-
На модели ишемии/реперфузии головного мозга оценить и сравнить эффекты однократного внутривенного введения коэнзима Q10 и мексидолa на 7 сутки на смертность, неврологический статус, размер очага поражения головного мозга и тканевое содержание CoQ10 в головном мозге животных.
-
На модели ишемии/реперфузии головного мозга оценить влияние двукратного внутривенного введения CoQ10 на 7 сутки на смертность, неврологический статус, размер очага поражения головного мозга и тканевое содержание CoQ10 в головном мозге животных.
Научная новизна исследования. Впервые показана возможность быстрого пополнения уровня коэнзима Q10 в головном мозге крыс и изучена динамика его уровня на протяжении 12 часов после внутривенного введения коэнзима Q10 в дозе 30 мг/кг у интактных животных и в условиях ишемического повреждения мозга.
На нейрональной культуре клеток гиппокампа в условиях гипоксии впервые показана нейропротекторная эффективность CoQ10 в концентрации 10 М, выражающаяся в поддержании жизнеспособности нейронов и улучшении их функционального состояния на протяжении 7 суток.
Впервые выявлена способность CoQ10 уменьшать неврологический дефицит и ограничивать размер очага поражения головного мозга после внутривенного введения коэнзима Q10 в дозе 30 мг/кг на моделях ишемии/реперфузии и необратимой ишемии головного мозга.
Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования.
Полученные в результате настоящей работы данные об эффектах коэнзима Q10 дополняют и расширяют имеющиеся сведения об этом веществе. Полученные результаты могут служить основанием для расширения показаний для клинического применения препаратов на основе коэнзима Q10 и обосновывают необходимость разработки лекарственных форм CoQ10 для парентерального введения. Экспериментальные подходы, использованные в данной работе, могут быть использованы для оценки эффективности различных нейропротекторных лекарственных средств.
Методология исследования. Дизайн исследования согласуется с принципами проведения экспериментов на лабораторных животных и проведения аналитических исследований. Работа проводилась с соблюдением правил проведения научных исследований и основывалась на принципах биоэтики. Теоретической и методологической основой исследования послужили фундаментальные и прикладные исследования отечественных и зарубежных ученых по данной проблеме, публикации в периодических изданиях, методические рекомендации. Теоретический анализ обзора литературы подкреплялся экспериментальными лабораторными данными. Изучение нейропротекторной активности коэнзима Q10 проводили с использованием современных актуальных методик. Исследования in vitro проводили на культурах нейронов гиппокампа в условиях нормоксии и нормобарической гипоксии. Определяли влияние коэнзима Q10 в концентрации 10 М на жизнеспособность нейронов и их функциональную активность. Ишемию головного мозга in vivo моделировали путем постоянной и временной окклюзии средней мозговой артерии. Коэнзим Q10 вводили внутривенно в различные временные сроки. Неврологический дефицит у животных оценивали по шкале mNSS (modified neurological stroke score). Размер поражения головного мозга определяли морфологически с помощью окраски мозга метаболическим красителем. Тканевое содержание коэнзима Q10 определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии по стандартной методике.
Положения, выносимые на защиту
-
Возможность быстрого повышения уровня CoQ10 в головном мозге крыс после его однократного внутривенного введения в дозе 30 мг/кг у интактных животных и в условиях ишемического повреждения.
-
Способность CoQ10 в концентрации 10 М повышать выживаемость и улучшать функциональную активность нейронов in vitro в условиях острой нормобарической гипоксии.
-
Нейропротекторная эффективность CoQ10, выражающаяся в улучшении неврологического статуса и уменьшении размера очага некроза мозга на моделях хронической ишемии и ишемии/реперфузии головного мозга у крыс.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных
результатов обусловлена однородностью выборки объектов эксперимента, использованием
валидизированных методов количественного анализа, согласованностью с результатами
опубликованных ранее исследований, теоретическим обоснованием полученных
экспериментальных данных. Основные результаты работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях: X Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для Медицины и Психологии» (Судак, 02-12 июня 2014 года); Международном конгрессе по нейронаукам (Красноярск, 19 -21 июня 2014 года); 27-ом Международном конгрессе по нейропсихофармакологии (ECNP) (Берлин, 18-21 октября 2014 года); XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 7-11 апреля 2014 года); 25-ом Международном съезде Европейского общества по изучению гипертензии и сердечнососудистых заболеваний (Милан, 12-15 июня 2015 года); 8-ом Международном конгрессе общества по изучению коэнзима Q10 (Болонья, 8-11 октября 2015 года). Результаты исследований отмечены Дипломом I степени на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» в 2014 году. По результатам работы выдан патент № 2554500 «Способ лечения ишемического инсульта» от 10 апреля 2015.
Личный вклад автора. Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе, получены автором самостоятельно. Автору принадлежит ведущая роль в анализе данных литературы по теме диссертационной работы, проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично сформулированы основные положения, выводы и рекомендации. В работах, выполненных научным коллективом, автором проведен анализ полученных данных. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от экспериментально-теоретической реализации поставленных задач до обсуждения результатов в научных публикациях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 6 тезисов докладов в материалах российских и международных конференций, 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, результаты исследований и их обсуждение и
приложения, а так же выводов и списка литературы. Диссертация включает 14 таблиц и 23 рисунка. Библиографический список содержит 221 источников, из них 193 на иностранном языке.
Реперфузионный синдром
Стволовые клетки
В норме с током крови к нейронам и клеткам нейроглии доставляется кислород, который участвует в реакциях аэробного гликолиза и образовании энергии. Это происходит на дыхательной цепи митохондрий, которая локализуется на их внутренней мембране. На первой компенсаторной стадии гипоксии происходит активация NADH - зависимого пути окисления как наиболее ранний ответ на недостаток кислорода. Однако нарастание гипоксии приводит к инактивации комплекса I. Неспособность клеток окислять энергетические субстраты приводит к их энергетическому голоданию. Было показано, что в этом периоде вещества, шунтирующие перенос электронов с комплекса I (CoQ10) способны восстанавливать клеточное дыхание и редокс статус переносчиков. Нарастание кислородного голодания приводит к дальнейшей инактивации комплексов переноса электронов – цитохромов b и c (комплекса II и III) (Stadtman E. R., 2000). При прекращении переноса электронов наступает резкая нехватка АТФ и избыточное накопление АМФ, что приводит к активации протеинкиназных систем и усугубляет кислородное голодание клеток. Полная инактивация цитохромоксидазы приводит к прекращению дыхания и остановке окислительного фосфорелирования. Наступает гибель клетки. Стадии энергетических изменений в ткани мозга зависят от удаленности нейрона от ядерной зоны ишемии. В «ядре» нейроны при недостатке АТФ не могут поддерживать работу Na/K-АТФазы, нарушается ее работа и развивается аноксическая деполяризация мембраны нейрона. В зоне пенумбры нейроны находятся в стадии потенциально обратимого нарушения энергетического метаболизма (Чернобаева Г.Н., 1984). Изменения клеточных реакций в ответ на ишемию мозга
Острая фокальная ишемия мозга запускает каскад патологических реакций, затрагивающих все клеточные структуры головного мозга. В ядерной зоне ишемии все клетки страдают одинаково, подвергаются некрозу и апоптозу. Уже через 30 мин от начала ишемии нейроны начинают сморщиваться, наступает кариопикноз, вакуолизация цитоплазмы и набухание ЭПР. Эти явления являются потенциально обратимыми в течение 6 часов, затем нейроны подвергаются некрозу. Через 2 часа от начала ишемии начинают появляться первые нейроны, повергшиеся запрограммированной гибели – апоптозу. Их число максимально через 48 часов. В области пенумбры нейроны оказываются более устойчивыми и первыми страдают клетки нейроглии (Флеров М.А., 1996). Астроциты в головном мозге выполняют множество функции: обеспечивают трофику нейронов, секретируют факторы роста, регулируют активность нейронов, захватывают избыточное количество возбуждающих нейромедиаторов. В области пенумбры уже в первые минуты ишемии происходит снижение активности астроцитов, однако через 4-6 часов клетки гиперактивируются и начинают секретировать кислый глиальный фибриллярный белок, который к 7 суткам от начала ишемии приводит к формированию глиального рубца на месте инфаркта мозга (Barreto G., 2011). В зоне пенумбры так же активируются клетки микроглии, что приводит к избыточному выделению токсических веществ и запускает механизмы отсроченной гибели нейронов (Lai A. Y., 2006). Кроме изменений в клетках головного мозга ишемия так же запускает изменение активности нейтрофилов и макрофагов из периферической крови: развивается нейтрофильная и макрофагальная инфильтрация ишемизированной ткани мозга, которая достигает максимума к 5-7 суткам от начала ишемии (Ашмарин И.П., 1996). Глутамат-кальциевая эксайтотоксичность
Наиболее быстрой реакцией на ишемию мозга является активация глутамат-кальциевого каскада, который вносит основной вклад в формирование зоны некроза мозга. В его развитии выделяют три основных этапа: этап индукции, этап амплификации и этап экспрессии, непосредственно приводящий к гибели клеток (Гусев Е.И., 2001).
Этап индукции. Снижение уровня АТФ в результате нарушения работы дыхательной цепи митохондрий приводит к инактивации Na/K-АТФазы, компенсаторной активации анаэробного гликолиза, накоплению лактата и ионов водорода. Нарушается ионный градиент, что приводит к оттоку ионов калия из клетки, притоку ионов Са+2 в клетку и деполяризации мембраны. Внутриклеточное накопление кальция является одним из ключевых механизмов, лежащих в основе некроза нейронов. Нарушение ионных градиентов приводит к избыточному высвобождению возбуждающих нейромедиаторов – глутамата и аспартата. Кроме того, поврежденная астроглия оказывается неспособной к захвату избытка глутамата, что приводит к перевозбуждению глутаматных рецепторов и развитию феномена эксайтотоксичности (см. рис. 2). Этот процесс начинается уже спустя 10-20 мин от начала острой фокальной ишемии (Kritis A. A., 2015).
Этап амплификации. Усиление повреждающего сигнала связано, прежде всего, с продолжающимся накоплением внутриклеточного кальция. Дополнительные ионы Са+2 поступают в клетку через потенциал - зависимые кальциевые каналы. Это приводит к повышению содержания диацилглицерола, к еще большему увеличению чувствительности нейронов к возбуждающим сигналам и образуется замкнутый «порочный» круг. При этом экспериментально было показано, что глутамат-кальциевая эксайтотоксичность играет наибольшую роль в формировании ядерной зоны ишемии и пограничной зоны между некрозом и зоной пенумбры. Повышенное количество глутамата переходит из зоны некроза в область пенумбры, приводя к увеличению зоны поражения. Этот самораспространяющийся процесс увеличения очага поражения мозга от центра к периферии был назван «эффектом домино» (Mark L. P., 2001).
Моделирование нормобарической гипоксии
Изучение эффективности Семакса при лечении острого ишемического инсульта проводилось на кафедре неврологии Московского Государственного Медицинского Университета под руководством академика РАН Е.И. Гусева и профессора В.И. Скворцовой. Препарат был использован при лечении 30 больных. Получены убедительные свидетельства позитивного действия Семакса в процессе терапии инсультов и постинсультных состояний по широкому комплексу показателей, в том числе по динамике и полноте восстановительных процессов. Испытания терапевтического действия препарата при лечении цереброваскулярных заболеваний (в т.ч. начальных проявлений недостаточности мозгового кровообращения, дисциркуляторной энцефалопатии) также показали положительное действие Семакса, наиболее отчетливо выражавшееся в повышении работоспособности, улучшении познавательных способностей и слухоречевой памяти, коррекции нарушений сна, уменьшении времени реакции на простые и сложные стимулы (Ашмарин И.П., 1997).
Антиоксидантные свойства коэнзима Q10 и его нейропротекторная эффективность при ишемии мозга обсуждаются в разделе «3.2» (см. стр. 48).
Огромное значение в развитии процессов ишемического повреждения мозга имеет недостаточность трофического обеспечения нейронов. Наибольшее трофическое влияние на активность нейронов оказывают нейротрофины – регуляторные пептиды, которые синтезируются в самих нейронах или клетках нейроглии. Эти вещества действуют локально в месте высвобождения, стимулируют рост и ветвление аксонов и дендритов, что способствует образованию новых синаптических контактов и связей и поддержанию пластичности нервной ткани. В результате поиска нейротрофических факторов был выделен фактор роста нервов (NGF). Большие размеры белка препятствуют его прохождению через ГЭБ и ограничивают возможности его терапевтического использования. На основании NGF было изучено и выделено множество других представителей нейротрофинов – BDNF (фактор роста, выделенный из мозговой ткани), нейротрофин-3, FGF (фактор роста фибробластов),GDNF (глиальный нейротрофический фактор роста) и другие. Наибольшее изучение среди факторов роста получил BDNF. Существует много исследований, показывающих эффективность введения BDNF на различных моделях ишемии в различных протоколах введения. Наилучшие результаты показаны на модели фокальной ишемии мозга при введении непосредственно в зону ишемической полутени. Введение препарата приводило к значительному ограничению зоны некроза и улучшению неврологического статуса животных. В другом исследовании было показано, что внутривенное введение BDNF крысам с фокальной ишемией мозга в различные сроки до и через 30 мин после начала ишемии приводило к уменьшению размера очага поражения в мозге, снижению неврологического дефицита животных. Кроме того, была показана способность препарата влиять на экспрессию белков апоптоза – Bax и Bcl2 (Schabitz W. R., 2000). Эти данные были опровергнуты в другом исследовании, где было показано, что препарат BDNF плохо проникает через ГЭБ и его введение не приводит к уменьшению повреждения мозга ни в коре, ни в подкорковых структурах. При этом исследователями был создан препарат PEG-BDNF (BDNF, конъюгированный с полиэтиленгликолем), который лучше проникал через ГЭБ, накапливался в мозге и приводил к ограничению зоны поражения преимущественно в коре мозга. На подкорковый очаг повреждения препарат не влиял (Zhang Y., 2001). Были проведены клинические исследования BDNF более чем на 1000 больных болезнью Альцгеймера, которым вводили препарат подкожно и внутривенно. При этом не было зафиксировано никаких когнитивных улучшений (Wu D., 2005). Другим перспективным нейротрофином является FGF – фактор роста фибробластов. Он широко представлен в различных тканях, в том числе в головном мозге и стимулирует рост клеток и ангиогенез. На животных был показан его хороший нейропротекторный эффект даже при отсроченном внутривенном введении через 3 часа после начала ишемии мозга (Deguchi Y., 2000). III фаза клинических исследований FGF на пациентах с острым ишемическим инсультом была досрочно прекращена из-за того, что в группе пациентов, получавших препарат, уровень летальности был повышен. Во II фазе другого клинического исследования было показано, что у пациентов с инсультом, получавших FGF внутривенно, не было зафиксировано никаких улучшение, более того, они чаще страдали гипотензией и уровень смертности был выше (Bogousslavsky J., 2002).
Еще одним представителем семейства нейротрофинов является белок нейротрофин-3, который является фактором роста нервов, стимулирует ангиогенез и нейрогенез, оказывает нейропротекторный эффект. Животным за 3 суток до моделирования фокальной ишемии непосредственно в головной мозг вводили препарат нейротрофина-3. Был показан нейропротекторный эффект препарата, выражающийся в улучшении ангиогенеза, улучшении выживаемости и восстановлению неврологических функций у животных (Zhang J., 2012). В настоящее время изучение нейротрофических факторов активно продолжается как на стадии доклинических исследований, так и в клинике. Ведется активный поиск методов улучшения прохождения нейротрофинов через ГЭБ и снижению их побочных эффектов. Так же проводятся исследования совместного применения нейротрофинов и других нейропротекторных препаратов (Bradberry J. C., 2004).
Моделирование нормобарической гипоксии
Фокальную ишемию головного мозга моделировали с помощью интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии по методике, описанной Longa et al.,1989 (Longa E. Z., 1989). В стерильных условиях наркотизированного животного (хлоралгидрат, в/бр, 400 мг/кг) фиксировали на спине на операционном столе. Вся операция проходила на подогреваемом столе, для предотвращения гипотермии. Подкожно вводили раствор атропина (0,05 мг/кг) для предупреждения брадикардии и гиперсаливации. Область шеи выбривали, обрабатывали 5% спиртовым раствором йода и кожным антисептиком «Эко бриз». Затем проводили разрез кожи по срединной линии шеи, рассекали подкожную фасцию, щитовидную железу отодвигали с помощью ретрактора.
Затем под микроскопом (OLYMPUS, SZ-40, Japan) выделяли сонный треугольник, образованный сверху двубюшной мышцей, латерально - крудино-ключично сосцевидной мышцей и медиально – грудино-подъязычной мышцей. В сонном треугольнике выделяли сонный сосудисто-нервный пучок, образованный общей сонной артерией и блуждающим нервом. Осторожно отделяли блуждающий нерв и накладывали микрохирургическую сосудистую титановую клипсу на общую сонную артерию на 1 см ниже ее бифуркации. Затем осторожно выделяли из спаек наружную и внутреннюю сонные артерии и с помощью биполярного коагулятора коагулировали две ветви наружной сонной артерии – верхнюю щитовидную артерию и затылочную артерию. На дистальный конец наружной сонной артерии накладывали лигатуру и затягивали ее наглухо, на проксимальный конец накладывали вторую лигатуру и не затягивали ее. На внутреннюю сонную артерию накладывали микрохирургическую сосудистую клипсу. Между двумя лигатурами на наружной сонной артерии с помощью микрохирургических ножниц производили артериотомию и через надрез в просвет наружной сонной артерии вставляли филамент, вокруг него фиксировали лигатуру и продвигали филамент в общую сонную артерию до упора в клипсу. В экспериментах были использованы филаменты фирмы DOCCOL, производство США, которые представляли собой нейлоновую нить размером 4-0, диаметр 0,19 мм, длина 30 мм, с покрытым силиконом кончиком - длина покрытие 2-3 мм, диаметр филамента с покрытием 0,39 мм±0,02 мм (номер в каталоге DOCCOL 403923РК10). Затем наружную сонную артерию перерезали до конца, филамент разворачивали и осторожно продвигали во внутреннюю сонную артерию до упора в клипсу. Клипсу снимали и продвигали филамент глубже во внутреннюю сонную артерию. В области отхождение крыло-небной артерии филамент продвигали медиально до ощущения сопротивления. В зависимости от веса животного снаружи оставалось 10±2 мм филамента. Таким образом, с помощью силиконового наконечника филамента перекрывали устье отхождения средней мозговой артерии (см. рис. 9). В экспериментах с ишемией/реперфузией (модель временной окклюзией средней мозговой артерии) филамент оставляли на 60 минут, затем его осторожно вынимали, до упора силиконового наконечника в лигатуру. На внутреннюю сонную артерию накладывали микрохирургическую сосудистую клипсу, филамент осторожно вынимали, лигатуру затягивали наглухо и коагулировали культю наружной сонной артерии. В экспериментах с постоянной ишемией мозга (модель необратимой окклюзии средней мозговой артерии) филамент оставляли в сосуде на все время эксперимента, лигатуру вокруг филамента затягивали и коагулировали культю наружной сонной артерии. Оставшуюся снаружи часть филамента осторожно отрезали. Затем снимали микрохирургические сосудистые клипсы, рану послойно ушивали, рану местно обрабатывали раствором антибиотика (гентамицина). Подкожно в область шва вводили 2% раствор лидокаина для послеоперационного обезболивания. Внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора для предупреждения обезвоживания. Затем животное помещали на подогреваемую подстилку до выхода из наркоза, затем перемещали в индивидуальную клетку до окончания эксперимента. Ложнооперированным животным проводили все вышеописанные манипуляции, кроме установки филамента. Среднее время операции составляло 30 минут + 60 минут окклюзии. Рис. 9 - Схема интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии (собственный рисунок)
Для извлечения головного мозга проводили эвтаназию животных с помощью передозировка наркоза (хлоралгидрат, внутрибрюшинно 1 гр/кг) и внутрисердечного введения 0,5 мл 3М раствора KCl. Затем снимали скальп с черепа крысы и ножницами перерезали позвоночник в области атлатно-затылочного сочленения. С помощью костных кусачек Люэра осторожно разрушали черепную коробку, обнажая головной мозг. Затем отсекали мозжечок, головной мозг извлекали в стерильную чашку Петри и замораживали при -20оС в течение 15 минут. Затем мозг нарезали на 5 фронтальных срезов по 2 мм толщиной.
Сравнение нейропротекторной эффективности однократного внутривенного введения мексидола и препарата коэнзима Q10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга крыс
Необходимо отметить, что суммарный балл у животных в обеих экспериментальных группах в данном эксперименте был ниже, по сравнению с предыдущим экспериментом, где использовали модель ишемии/реперфузии. В группе «ОСМА хр/и + физ.р-р» средний балл составил 7,1 и был достоверно ниже, чем в группе «ОСМА хр/и + CoQ10» (10,3), р 0,01. При этом достоверные различия были обнаружены по всем двигательным тестам (1-4 тесты) и не были обнаружены в тестах на чувствительность - прикосновение к вибриссам и туловищу (тесты 5-6). Это может свидетельствовать о том, что более тяжелое поражение головного мозга приводит к невосполнимой утрате чувствительности на стороне туловища, противоположной области пораженного полушария, однако двигательные функции возможно улучшить. Размер очага поражения головного мозга животных В результате постоянной окклюзии средней мозговой артерии в течение 24 часов происходило образование достоверно большей зоны некроза головного мозга, по сравнению с зоной некроза, образующейся при ишемии/реперфузии.
Зона некроза у животных из группы «ОСМА хр/и + физ.р-р» затрагивала больше половины ипсилатерального полушария и составила 57,2±2,8%. По сравнению с предыдущим экспериментом (ишемия/реперфузия) зона поражения у животных в группе, получавшей физиологический раствор увеличилась в 2 раза (на 54%), р 0,05.
В группе животных «ОСМА хр/и + CoQ10» зона поражения затрагивала чуть больше четверти пораженного полушария и составила 28,4±2,9%. По сравнению с животными, получавшими препарат CoQ10 в эксперименте с ишемией/реперфузией зона некроза мозга увеличилась на 69%, р 0,05.
Вероятнее всего, в патогенезе развития постоянной ишемии свободнорадикальное повреждение мозга играет меньшую роль, чем в реперфузионном поражении. Этим можно объяснить менее выраженный нейропротекторный эффект препарата CoQ10 при данной модели ишемии мозга. Однако, различия в зоне повреждения головного мозга в группах «ОСМА хр/и + физ.р-р» и «ОСМА хр/и + CoQ10» являются достоверными и зона поражения у животных получавших препарат CoQ10 на 50% меньше, по сравнению с животными, получавшими физ.р-р, р 0,05. Соотношения зон некроза головного мозга в экспериментальных группах представлено на рисунке 19.
Зона поражения головного мозга (в % к объему ипсилатерального полушария). Данные представлены в виде ср.знач±станд.ош, - р 0,05 относительно группы «ОCМА хр/и + физ.р-р».
Абсолютное содержание CoQ10 в ткани мозга во всех экспериментальных группах представлено в таблице 8. Уровни CoQ10 в головном мозге интактных и ложнооперированных животных достоверно не различались, р 0,05.
Постоянная ишемиия головного мозга в течение 24 часов приводила к достоверному снижению тканевого содержания CoQ10 в обоих полушариях в группе «ОСМА хр/и + физ.р-р», р 0,05. Уровень CoQ10 в ипсилатеральном полушарии был на 25% меньше, чем у интактных животных (р 0,05) и достоверно не отличался от контралатерального полушария.
Данные представлены в виде ср.знач±станд.отклон, -р 0,05 относительно интактных и ложнооперированных животных, #-р 0,05 относительно «ОСМА хр/и + CoQ10» (оба полушария).
В группе животных, получавших коэнзим Q10 уровень тканевого CoQ10 был достоверно выше, чем у животных, получавших физиологический раствор, р 0,05. При этом в контралатеральном полушарии происходило накопление препарата, его уровень был достоверно выше, чем у интактных животных, р 0,05. В ипсилатеральном полушарии происходило восстановление уровня CoQ10 до уровня интактных животных. Однако, различия в уровне CoQ10 в ипсилатеральном и контралатеральном полушариях в группе «ОСМА хр/и + CoQ10» не были статистически значимыми, р 0,05.
Абсолютное содержание -токоферола в головном мозга животных представлено в таблице 9. Среди всех экспериментальных групп только в группе «ОСМА хр/и + физ.р-р» в ипсилатеральном полушарии были зафиксированы достоверные различия в уровне -токоферола, р 0,05. Введение препарата CoQ10 не приводило к изменению уровня -токоферола в головном мозге крыс.
В настоящее время нейропротекторный эффект коэнзима Q10 на модели необратимой ишемии мозга плохо изучен. В работе Li et al. эффекты коэнзима Q10 изучали на моделях глобальной и фокальной ишемии мозга. Раствор CoQ10 вводили животным внутрибрюшинно в дозе 3 мг/кг. При этом исследователями не было выявлено различий в размерах очага поражения мозга ни на модели фокальной ишемии (размер повреждения составлял 23% и 25%), ни глобальной ишемии (86% и 83%) в контрольной группе и группе, получавшей CoQ10 соответственно. Отсутствие эффекта от введения коэнзима Q10 возможно связано с крайне низкой дозой вещества (около 1 мг на животное) и внутрибрюшинным введением CoQ10 (Li H., 2000).
В исследовании Ostrowski R. была использована модель инсульта с помощью аппликации эндотелина-1 на среднюю мозговую артерию. CoQ10 вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг однократно перед операцией. Гистологические исследования показали, что введение CoQ10 приводило к значительному снижению нейрональной гибели, особенно в области гиппокампа. Так же авторами были измерены уровни АТФ, лактата, СОД и глутатиона в головном мозге крыс. Было показано, что введение CoQ10 приводило к снижению уровня оксидативного стресса, преимущественно за счет его антиоксидантного действия (Ostrowski R. P., 1999).
В нашем эксперименте впервые было показано, что внутривенное введение раствора солюбилизированного коэнзима Q10 на модели хронической ишемии мозга приводит к его накоплению в головном мозге и реализации нейропротекторного эффекта, который выражался в уменьшению очага некроза мозга на 50% и улучшению двигательных функций.
Постоянная ишемия мозга без реперфузии приводила к формированию большой зоны некроза и к выраженному неврологическому дефициту. Смертность животных в экспериментальных группах также была высока, поэтому, с учетом механизма действия коэнзима Q10, для дальнейших экспериментов решено было исследовать нейропротекторный механизм CoQ10 на модели ишемии/реперфузии головного мозга.