Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 9
ГЛАВА 1. Современные методы выделения, и очистки кумаринов из растительного сырья и препараты на их основе. амми большая – перспективный источник получения лекарственных средств 9
1.1 Физико-химические свойства, методы выделения кумаринов из растительного сырья 9
1.2 Номенклатура лекарственных средств на основе природных кумаринов и их стандартизация 20
1.3 Амми большая – источник получения лекарственных средств 22
1.4 Медицинские аспекты применения препаратов «Аммифурин» и «Анмарин» 29
Выводы к главе 1 31
Часть II. Экспериментальная часть 32
Материалы и методы исследования 32
ГЛАВА 2. Подбор оптимальных параметров технологического процесса получения субстанций аммифурина и анмарина 37
2.1 Обоснование получения двух субстанций в едином технологическом процессе 37
2.2. Оптимизация стадии экстракции суммы фурокумаринов из сырья 39
2.3.Оптимизация стадии выделения и очистки аммифурина 45
2.4 Оптимизация стадии выделения и очистки мармезина 49
Выводы к главе 2 53
ГЛАВА 3. Постадийный контроль производства субстанций аммифурин и анмарин из плодов амми большой 54
Выводы к главе 3 61
ГЛАВА 4. Комплексная технология получения субстанций аммифурин и анмарин .62
Выводы к главе 4 76
ГЛАВА 5. Технико-экономическое обоснование и валидация технологического процесса 77
5.1. Технико-экономическое обоснование 77
5.2. Валидация технологического процесса 78
Выводы к главе 5 100
Список литературы 102
- Номенклатура лекарственных средств на основе природных кумаринов и их стандартизация
- Медицинские аспекты применения препаратов «Аммифурин» и «Анмарин»
- Оптимизация стадии экстракции суммы фурокумаринов из сырья
- Валидация технологического процесса
Введение к работе
В настоящее время, несмотря на современные возможности химического
синтеза при разработке лекарственных средств, растения остаются уникальным источником веществ, обладающих разнообразными видами фармакологической активности.
Рациональное использование лекарственного растительного сырья и разработка ресурсосберегающих технологий для повышения экономической эффективности фитохимического производства является актуальной задачей фармацевтической науки. В этом плане к числу перспективных видов лекарственного растительного сырья относятся плоды амми большой, которые являются источником получения лекарственных субстанций аммифурин и анмарин.
Аммифурин представляет собой сумму трех фурокумаринов - изопимпинеллина, бергаптена, ксантотоксина. Данный лекарственный препарат разрешен для медицинского применения в качестве фотосенсибилизирующего средства при витилиго, тотальной и гнездной плешивости.
Анмарин – оригинальный отечественный лекарственный препарат, разрешенный для медицинского применения в качестве антигрибкового средства. Анмарин представляет собой сумму двух изомеров 5I-изопропенил-4I, 5I-дигидропсоралена и 5I-изопропилпсоралена, получаемую путем дегидратации мармезина.
Степень разработанности темы исследования.
В настоящее время существуют технологии получения субстанций аммифурин и анмарин из плодов амми большой. Однако их существенными недостатками являются сравнительно высокие энергоемкость, трудозатраты, расход основного сырья и материалов, реализация данных технологий не позволяет получать одновременно две субстанции в едином технологическом процессе.
Таким образом, актуальным является изучение и оптимизация способов выделения, фракционирования и очистки фурокумаринов плодов амми большой, позволяющих создать экономически эффективную комплексную технологию получения лекарственных субстанций фотосенсибилизирующего и противогрибкового действия со стабильными показателями качества.
Цель исследования
Научное обоснование возможности совместного получения субстанций аммифурин и анмарин из плодов амми большой и разработка комплексной фармацевтической технологии.
Задачи исследования:
-
Определить экспериментально содержание и соотношение фурокумаринов аммифурина и анмарина в плодах амми большой и адаптировать эти аналитические методы для обеспечения стадийного контроля в технологическом процессе;
-
Определить оптимальные условия экстракции суммы фурокумаринов из плодов амми большой;
-
Обосновать, оптимизировать и экспериментально подтвердить параметры способа выделения, фракционирования и очистки фурокумаринов субстанций аммифурин и анмарин;
4. Разработать и оформить нормативно-техническую документацию,
промышленные регламенты на комплексную технологию получения субстанций
аммифурин и анмарин;
5. Подтвердить по результатам технико-экономического расчета эффективность
комплексной технологии получения аммифурина и анмарина из плодов амми
большой.
Научная новизна результатов работы
Впервые научно обоснован, разработан и внедрен способ комплексной переработки плодов амми большой.
Исследовано и экспериментально подтверждено содержание, и соотношение фурокумаринов в сырье, полупродуктах и готовом продукте физико-химическими методами (спектрофотометрии, ВЭЖХ и ЯМР-спектроскопии).
Впервые определены экстрагенты и оптимальные параметры процесса экстракции фурокумаринов субстанций аммифурин и анмарин в едином технологическом процессе.
Впервые обоснованы, оптимизированы и экспериментально подтверждены
параметры способа выделения, фракционирования и очистки фурокумаринов в
технологии совместного получения субстанций аммифурин и анмарин.
Подтверждена по результатам технико-экономического расчета эффективность комплексной технологии переработки плодов амми большой.
Приоритет научных исследований подтвержден заявкой на изобретение № 2014141788 от 16.10.2014 г «Способ комплексной переработки плодов амми большой».
Теоретическая значимость работы
Анализ информационно-аналитического массива обогатит сведения и знания по изучению лекарственных растений, а так же по усовершенствованию технологических методов выделения биологически активных веществ.
Практическая значимость результатов работы.
На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и внедрены:
Промышленный регламент ПР №58171769-53-2015 на производство субстанции аммифурин из плодов амми большой;
Промышленный регламент ПР №58171769-54-2015 на производство субстанции анмарин из плодов амми большой.
Получен экономический эффект 586393 рубля при переработке одной тонны сырья по способу комплексной переработки плодов амми большой.
Методология и методы исследования.
Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных данных, оценке степени разработанности и актуальности темы. Методологическая основа работы при разработке способа выделения и очистки фурокумаринов заключалась в изучении физико-химических свойств фурокумаринов, подборе оптимальных условий. Подбор оптимальных условий экстракции, выделения и очистки фурокумаринов проводились в лабораторных условиях, валидация технологического процесса, проводилась на промышленном оборудовании цеха фитохимии ЗАО «Фармцентр ВИЛАР». Контроль качества сырья, промежуточных и конечных продуктов из плодов амми большой осуществляли в аналитической лаборатории.
Степень достоверности результатов.
Достоверность полученных результатов обусловлена большим объемом проведенных экспериментальных исследований и использованием современных физико-химических, химических, фармакологических методов исследования, что позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты. Проведенные исследования отражены в виде таблиц, графиков и рисунков.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации представлены и доложены на II научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация XXI века» (Москва, 2014), VIII международной научно-практической конференции «Современные концепции научных исследований» (Москва, 2014).
Апробация работы проведена на заседании секции по поиску биологически активных веществ, технологии получения лекарств, фармацевтической химии, фармакогнозии и биотехнологии (в том числе и бионанотехнологии) Ученого совета Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (5 декабря 2014 г., Москва) и на межкафедральной конференции фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (22 декабря 2015г., Москва.)
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования,
постановке цели и задач, выборе объектов исследования, проведении
экспериментальных исследований, обобщению полученных данных и их
статистической обработке.
Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки
Диссертационная работа выполнена в соответствии с «Программой
фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Всероссийского
научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса (АПК) Российской Федерации» № 0576-2014-0013.
Основные положения, выносимые на защиту
результаты изучения содержания и соотношения фурокумаринов в плодах амми большой, полупродуктах и готовом продукте;
результаты подбора экстрагента, оптимальных условий экстракции суммы фурокумаринов плодов амми большой;
- результаты оптимизации параметров выделения, фракционирования и очистки
фурокумаринов субстанций аммифурин и анмарин;
- результаты оптимизации технологии получения субстанций аммифурин и
анмарин;
- результаты технико-экономического расчета эффективности, комплексной фармацевтической технологии получения субстанций аммифурин и анмарин из плодов амми большой.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.04.01 – технология получения лекарств. Результаты проведенных исследований соответствуют пунктам 3 и 8 паспорта специальности.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ из них 3 в журналах входящих в перечень периодических изданий рецензируемых Высшей аттестационной комиссией РФ, оформлена заявка на изобретение.
Объем и структура диссертации
Номенклатура лекарственных средств на основе природных кумаринов и их стандартизация
Кумарины - природные соединения широко распространенные в растительном мире, чаще встречаются в высших растениях, редко в грибах и лишайниках. Они наиболее типичны для семейств Зонтичных (Apiaceae), Рутовых (Rutaceae), Бобовых (Fabaceae), Конскокаштановых (Hippocastanaceae). Кумарины накапливаются в различных органах растений, чаще всего в корнях, коре, плодах. У сельдерейных кумариновые соединения могут локализоваться в эфирно – масличных канальцах. Содержание данных соединений в растениях колеблется от 0,2 до 10%, причем состав кумаринов меняется в онтогенезе растения и максимально накапливается в многолетних видах. Чаще встречаются простые вещества - производные кумарина и фурокумарина, реже их гликозиды. В растениях южных широт преобладают кумарины, содержащие в качестве заместителей изопреноидные цепи. В растениях умеренного климата и северных широтах наблюдается преимущественное накопление кумаринов, содержащих окси-, метоксигруппы и сложно-эфирные связи. В настоящее время число из растительных объектов выделено порядка 200 соединений [7,12].
Кумарины участвуют в регуляции роста растений, поглощают ультрафиолетовое излучение, защищают растение от избыточного солнечного облучения и неблагоприятных факторов окружающей среды. Биосинтез кумаринов осуществляется по шикиматному пути, их предшественниками служат оксикоричные кислоты. Строение и классификация кумаринов По химической структуре кумарины представляют собой фенольные соединения, в основе которых лежит бензо--пирон (лактон цис-орто-гидрооксикоричной кислоты). В зависимости от химической структуры природные кумарины классифицируются на 6 основных групп [41]: 1.Кумарин и его производные (умбеллиферон, эскулетин, скополетин, метилотозид и др.) 2.Фурокумарины, соединения, в которых ядро фурана сконденсировано с кумариновым (ксантотоскин, бергаптен, псорален и др.) 3. Пиранокумарины, соединения, в которых ядро 2I, 2I-диметилпирана сконденсировано с кумариновым в положениях 5,6, 6,7 и 7, (виснадин, дигидросамидин и др.). 4. Дигидрофурокумарины (производные 4I, 5I– дигидрофурокумаринов), соединения, в которых дигидрофурановый цикл может быть сочленен с кумариновым ядром в положениях 3,4; 5,6; 6,7 и 7,8.(мармезин и др.) 5. Дигидропиранокумарины, соединения, являющиеся производными 3I, 4I – дигидропиранокумаринов (вценадин, самодин и др.). 6. Куместаны, соединения, в которых кумариновое ядро конденсировано с бензофураном в положении 3,4 (куместрол и др.) Физические свойства кумаринов Кумарины обычно представляют собой кристаллические вещества белого или желтоватого цвета, практически нерастворимы в воде, хорошо растворимы в спирте, хлороформе, диэтиловом эфире, мало растворимы в петролейном эфире. Методы выделения из растительного сырья Для экстракции кумаринов обычно используют неполярные растворители (гексан, петролейный эфир, сжиженные газы). Преимуществом этих растворителей перед остальными является то, что кумарины обладают низкой растворимостью в них, в результате чего, при сгущении и охлаждении извлечения происходит непосредственная кристаллизация лактонов. Масло, содержащееся в растениях, извлекается этими растворителями и способствует улучшению растворимости кумаринов [84]. Особенно эффективен этот метод при выделении ацилированных фуро- и пиранокумаринов, выделяемых в значительной степени очищенными от сопутствующих примесей. Чаще всего выделение кумаринов экстракцией углеводородами применяется в лабораторной практике: этим путем были выделены авиценнол, аномалин, кренулатин и многие другие кумарины [53,64,69].
К недостатку рассмотренного метода следует отнести высокую пожароопасность и летучесть применяемых растворителей.
Применение сжиженных газов в качестве экстрагентов позволяет выделять действующие вещества в нативном состоянии с высоким выходом и значительно сокращает время экстракции кумаринов из сырья. После удаления экстрагента получают осадок, состоящий из кристаллов кумаринов, эфирных и жирных масел, который очищают перекристаллизацией. Экспериментально было установлено, что углекислота обладает селективностью в отношении ацилированных фуро- и пиранокумаринов [26,46].
Значительно реже для экстракции сырья и выделения кумаринов указанным методом используют другие растворители такие как спирт, эфир или хлороформ. Спиртовые экстракты обычно содержат, наряду с суммой кумаринов, большее количество сахаров, гликозидов, фенолов и флавоноидов, чем экстракты того же сырья, полученные при использовании неполярных растворителей.
На стадии экстракции кумаринов весьма эффективно использование четыреххористого углерода, так как после сгущения извлечения и кристаллизации кубового остатка кумарины выделяют в довольно чистом состоянии. Однако применение четыреххлористого углерода на этой стадии в условиях производства ограничено ввиду его высокой токсичности и летучести.
Экстракция кумаринов из сырья водой, несмотря на позитивные качества этого растворителя (нетоксичен, доступен, дешев), не получила распространения в производственных условиях. Это объясняется, прежде всего, низким выходом продукта, для увеличения которого экстракцию сырья обычно ведут горячей водой. Кроме того, вода одновременно с кумаринами извлекает много балластных веществ (крахмал, сахара, белки и другие), которые затрудняют проведение технологического процесса. Так, наличие крахмала в сырье вызывает сильное набухание растительного материала, что затрудняет процесс фильтрации экстракта. Наличие же водорастворимых белков вызывает образование эмульсий при обработке водного извлечения органическим растворителем.
Медицинские аспекты применения препаратов «Аммифурин» и «Анмарин»
Полученное на стадии экстракции спиртовое извлечение содержит 90-95% от содержания в сырье фурокумаринов, представленных, бергаптеном, изопимпинеллином и мармезином. Основополагающей операцией данной стадии является разделение суммы фурокумаринов, специфичных для субстанций аммифурина и анмарина. Изучение структуры молекулы и растворимости фурокумаринов показало, что мармезин содержится в сырье в виде гликозида (мармезинин) и в отличие от остальных фурокумаринов растворим в воде. Данное свойство было использовано для отделения мармезинина в виде водного раствора, при этом нерастворимые в воде фурокумарины аммифурина выпадают в осадок, которые отделяются при помощи фильтрования. Экспериментально установлено, что наибольшая полнота осаждения фурокумаринов аммифурина достигается при обработке концентрированного экстракта трех кратным объемом воды. Полноту осаждения контролировали методом спектрофотометрии. Осадок фурокумаринов подвергают дальнейшей очистке, а раствор мармезинина используют для производства лекарственной субстанции анмарин.
В основе стадии очистки суммы фурокумаринов аммифурина лежит реакция раскрытия лактонного кольца под действием 10 % водного раствора натрия гидроксида в гомогенной реакционной среде, при этом балластные вещества удаляются неполярным растворителем. Для превращения солей фурокумариновых кислот в исходные кумарины с учетом технологических и химических свойств выбрана фосфорная кислота (Рисунок 14). В ходе исследований были подобраны соотношение 10% раствора гидроксида натрия и осадка фурокумаринов аммифурина, время гидролиза, тип форэкстрагента.
Из данных таблицы 5 видно, что для очистки суммы фурокумаринов достаточно двукратного объема щелочи.
Кроме того, нами изучено влияние времени гидролиза на соотношение компонентов суммы фурокумаринов. Результаты, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что при увеличении времени гидролиза более одного часа изменения соотношения ксантотоксина, бергаптена и изопимпинеллина практически не происходит (Таблица 7). Таблица 7 – Соотношение компонентов в сумме фурокумаринов в зависимости от времени гидролиза
Из данных таблицы 8 следует, что для форэкстракции балластных веществ целесообразно использовать хлороформ, а для экстракции аммифурина четыреххлористый углерод. Более того применение последнего способствует получению более чистого технического продукта, кристаллизующегося непосредственно при концентрировании извлечения, что упрощает процесс кристаллизации фурокумаринов.
Наряду с этим, для повышения выхода целевого продукта, предложено проводить дополнительную обработку четыреххлористым углеродом водного маточного раствора мармезинина и маточных растворов, полученных после фильтрации технической суммы фурокумаринов в процессе очистки. Объединенную четыреххлористоводородную фракцию подвергают очистке на оксиде алюминия 1 степени и полученный продукт присоединяют к основной субстанции аммифурина. В этой связи, были проведены исследования по выделению аммифурина с использованием различных марок оксида алюминия и силикагеля. В результате установлено, что все марки оксида алюминия могут быть использованы для этих целей (Таблица 9). В свою очередь, силикагель 5-40 мкм в вышеописанных условиях проведения эксперимента не был пригоден для выделения аммифурина.
Силикагель КСК 5-40 (Силослав, Россия). - Для подтверждения рациональности подобранных условий и получения качественной субстанции аммифурина, нами проанализировано соотношение компонентов суммы фурокумаринов в исходном сырье, промежуточных и готовом продукте. Данные таблицы 10 свидетельствует о том, что качественный состав аммифурина зависит от соотношения фурокумаринов в сырье. Следует также отметить целесообразность присоединения суммы фурокумаринов полученных из маточных растворов к основному продукту, что способствует обогащению конечной субстанции ксантотоксином. В результате отработки технологии на 3 партиях сырья установлено, что выход аммифурина составляет не менее 65 % от содержания в сырье.
Реакция гидролиза мармезинина В ходе исследований были подобраны время гидролиза, тип экстрагента, изучена стадия очистки мармезина. Из данных таблицы 11 видно, что реакцию гидролиза достаточно проводить в течение 30 минут. Однако в условиях промышленного производства при увеличении объема загрузок для полноты проведения реакции предложено увеличить время гидролиза до 60 минут. Таблица 11 – Влияние времени гидролиза на выход мармезина
Оптимизация стадии экстракции мармезина В ходе исследования нами было установлено, что смола выделившаяся в водном маточном растворе после гидролиза содержит значительное количество мармезина. Так же было замечено, что при температуре ниже 40С смола превращается в твердую карамелеобразную массу и осложняет проведение процесса. С учетом этого, а так же того, что повышение температуры улучшает растворимость мармезина, нами предложено вести экстракцию мармезина при 60-65С.
Учитывая растворимость мармезина в гидрофобных растворителях, для извлечения продукта реакции гидролиза апробированы такие растворители как хлороформ, дихлорэтан и четыреххлористый углерод. Данные таблицы 12 свидетельствуют о рациональности использования дихлорэтана на этой стадии, кроме того, данный растворитель менее летуч и экономически выгоден.
Оптимизация стадии экстракции суммы фурокумаринов из сырья
Одним из условий получения качественной фармацевтической субстанции является использование достоверных и воспроизводимых методик аналитического контроля, позволяющих оценить содержание основных БАВ в сырье, промежуточных и готовом продуктах.
В этой связи для обеспечения сквозной стандартизации при получении аммифурина нами использован метод спектрофотометрии, основанный на способности кумаринов к поглощению в УФ-свете в диапазоне 220-350 нм (Рисунок 4).
Определение оптической плотности проводили при длине волны 352 нм и расчет содержания суммы фурокумаринов проводили в пересчете на ксантотоксин.
Контроль содержания суммы фурокумаринов проводят в следующих контрольных точках: сырье (плоды амми большой), спиртовые экстракты, шрот, четырёххлористоуглеродные извлечения, маточные растворы, техническая сумма фурокумаринов и готовый продукт (аммифурин) с использованием адаптированных методик подготовки пробы.
При анализе сырья: Около 2 г (точная навеска) измельчённых плодов, отобранных из аналитической пробы, просеивают через сито №1, помещают в колбу вместимостью 100 мл (с притёртой пробкой), добавляют 50 мл 95% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают (с точностью до 0,01 г), затем присоединяют к обратному холодильнику с водяным охлаждением и нагревают на кипящей водяной бане в течение двух часов. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, взвешивают (с точностью до 0,01 г) и доводят массу колбы до первоначального 95% этанолом, перемешивают. В круглодонную колбу вместимостью 50 мл помещают 25 мл полученного экстракта и отгоняют до объёма 1-2 мл. Затем приливают 5 мл хлороформа, смывая со стенок колбы осадок, добавляют 2 мл 95% этанола, перемешивают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл. Круглодонную колбу ещё раз промывают 95% этанолом, присоединяя содержимое к основному раствору и доводят объем раствора в мерной колбе до 25 мл этанолом 95 %, перемешивают и измеряют оптическую плотность.
При анализе спиртового экстракта: 1 мл экстракта помещают мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95 %, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 220-350 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
При анализе шрота: около 30,0 г (точная навеска) измельчённого воздушно-сухого шрота экстрагируют в аппарате Сокслета 95% этанолом в течение двух часов. Спиртовой экстракт упаривают в вакууме в круглодонной колбе вместимостью 250 мл почти досуха (примерно до объёма 2 мл). Затем приливают 5 мл хлороформа, тщательно смывая со стенок колбы осадок, добавляют 3 мл 95% этанола, перемешивают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, объём раствора доводят до метки этанолом 95 %, перемешивают и измеряют оптическую плотность. При анализе технической суммы фурокумаринов: около 1,0 г (точная навеска) технической суммы фурокумаринов растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в 15 мл хлороформа, затем приливают 25 мл 95% спирта этилового, тщательно перемешивают и доводят объём раствора спиртом до метки, перемешивают, измеряют оптическую плотность.
При анализе четырёххлористоуглеродных извлечений: в мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл четырёххлористоуглеродного извлечения и объём раствора доводят до метки этанолом 95 %, перемешивают и измеряют оптическую плотность.
При анализе водно-спиртового маточника: 25 мл водно-спиртового маточника обрабатывают хлороформом (5 раз по 20 мл). Хлороформное извлечение отфильтровывают и упаривают до объёма 1-2 мл. К остатку приливают 5 мл хлороформа, затем 10 мл 95% этанола, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объём колбы 95% этанолом до метки и измеряют оптическую плотность
При анализе аммифурина: около 0,04 г препарата (точная навеска) растворяют в 75 мл этанола 96 % в мерной колбе вместимостью 100 мл доводят объем этанолом 96 % до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем этанолом 96 % до метки, перемешивают и снимают спектр на спектрофотометре.
Оптическую плотность всех подготовленных растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 352 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют этанол 95 %.
Фармацевтическую субстанцию анмарина, представляющую собой смесь двух изомеров ангидромармезина, в ходе технологического процесса получают непосредственно по реакции дегидратации из мармезина, выделенного из плодов амми большой [32]. Таким образом, именно мармезин является основным соединением, содержание которого необходимо контролировать в исходном сырье и промежуточных продуктах. Однако ФС 42-1996-83 «Амми большой плоды» регламентирует только содержание суммы фурокумаринов в пересчете на ксантотоксин. Данное обстоятельство диктует необходимость внесения изменений в ФС и введением показателя, нормирующего содержание мармезина.
Для этих целей при оптимизации технологического процесса нами использован метод ВЭЖХ с УФ-дектированием при длине волны 336 нм.
Методика проведения анализа: Около 2 г (точная навеска) неизмельчённых плодов, отобранных из аналитической пробы, помещают в колбу вместимостью 100 мл (с притёртой пробкой), добавляют 50 мл 95% этанола. Колбу закрывают пробкой и взвешивают (с точностью до 0,01 г.), затем присоединяют к обратному холодильнику с водяным охлаждением и нагревают на кипящей водяной бане в течение двух часов. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, взвешивают с точностью до 0,01 г. и доводят массу колбы до первоначального 95% этанолом. Полученный экстракт перемешивают, фильтруют через вату и переносят пипеткой 45 мл в кругло донную колбу вместимостью 100 мл и отгоняют до объёма 5 мл. К полученному спиртовому остатку приливают 10 мл очищенной воды, нагретой до 60-70 С, перемешивают и охлаждают. Затем обрабатывают смесь в делительной воронке 15 мл эфира три раза, каждый раз встряхивая в течение 3 минут. Раствор упаривают на роторном испарителе до удаления этанола, добавляют 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Полученный раствор обрабатывают 10 мл хлороформа три раза, каждый раз встряхивая в течение 3 минут. Хлороформные извлечения фильтруют через безводный сульфат натрия и отгоняют на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл этанола 95 % (раствор А). 20 мкл раствора А вводят в хроматограф. Параллельно анализируют раствор РСО мармезина.
Валидация технологического процесса
Основополагающим документом, регламентирующим производство лекарственных средств в мировой фармацевтической практике, является стандарт надлежащей производственной практике (Good Manufacturing Practice – GMP) – система норм, правил и указаний, отражающий целостный подход к контролю технологического процесса и производства качественных препаратов. Впервые такой принципиально новый подход к обеспечению качества лекарственных средств был разработан в США в 60-х годах двадцатого века.
В России стандарт GMP был подготовлен Ассоциацией инженеров по контролю микрозагрязнений (АСИНКОМ) и в 2004 г. постановлением Госстандарта РФ утвержден ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». Данный стандарт был разработан на основе правил GMP Европейского союза 2003 г.
В 2009 г. с учетом внесенных изменений взамен ГОСТ 52249-2004 приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии № 159-ст утвержден и введен в действие ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств».
Действующий стандарт представляет собой идентичный перевод Good Manufacturing Practice for Medical Product for Human and Veterinary Use (GMP EC) по состоянию на 31 января 2009 г. и состоит из основных требований и 19 приложений. В частности, Приложение 7 «Производство лекарственных средств из растительного сырья» содержит описание требований к хранению, отбору проб и контролю качества исходного и промежуточных продуктов из лекарственного растительного сырья.
Наряду с этим, приказом Министерства промышленности и торговли РФ № 916 от 14.07.2013г. утверждены «Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств», включающие требования к производственным помещениям, оборудованию, персоналу, исходному сырью, а также непосредственно к технологическому процессу и качеству готовой продукции.
Правила надлежащего производства являются частью системы управления качеством, которая гарантирует, что продукцию постоянно производят и контролируют по стандартам качества, соответствующим ее предназначению, а также в соответствии с требованиями регистрационного досье, протокола клинических испытаний и спецификации на эту продукцию.
Одним из основных требований GMP проведение валидации. Наряду с валидацией аналитических методик, процедур очистки и контроля в процессе производства, компьютеризированных систем и в отношении лиц, ответственных на документальное оформление, валидирован должен быть и технологический процесс.
Валидация процесса проводится в целях доказательства того, что процесс, функционирующий в пределах установленных параметров, обеспечивает эффективное и с воспроизводимыми результатами производство промежуточной продукции или фармацевтической субстанции, соответствующих предварительно заданным спецификациям и показателям качества. Результаты валидации процесса подлежат документальному оформлению.
Существует три подхода к валидации: перспективная валидация, сопутствующая валидация и ретроспективная валидация. Перспективная валидация является предпочтительной, её рекомендуется выполнять для всех процессов, связанных с производством фармацевтических субстанций до начала реализации готового лекарственного препарата. Сопутствующая валидация может быть проведена при отсутствии данных для повторяющихся технологических циклов, если выпущено ограниченное число серий субстанции, если серии субстанций выпускались редко или были произведены посредством валидированного процесса, который был модифицирован. Ретроспективная валидация проводится как исключение для хорошо организованных процессов, в которые не было внесено значительных изменений для получения фармацевтической субстанции.
Количество производственных циклов, необходимых для валидации, зависит от сложности процесса или от значимости изменений процесса, подлежащих рассмотрению. Для перспективной и сопутствующей валидации должны быть использованы данные, полученные для трех последовательных производственных серий продукции надлежащего качества. Для оценки постоянства процесса при ретроспективной валидации, как правило, необходимо исследовать данные для 10 – 30 последовательных серий, но при соответствующем обосновании это число может быть уменьшено.