Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные представления о патогенезе сахарного диабета 10
1.2. Этапы разработки средств лечения сахарного диабета 2 типа 15
1.3. Cовременные направления поиска антидиабетических средств 18
1.3.1. Восстановление механизмов секреции инсулина 18
1.3.2. Устранение инсулинорезистентности 20
1.3.3. Снижение продукции глюкозы в печени 22
1.3.4. Прочие механизмы 24
1.4. Концепция сходства физиологической и биохимической регуляции функций нейронов и -клеток поджелудочной железы 25
1.4.1. Гиперактивность GSK-3 27
1.4.2. Окислительный стресс 28
1.4.3. Дефицит нейротрофинов 29
1.5. Обоснование цели исследования и выбранных веществ 31
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1. Препараты и вещества, используемые в экспериментах 40
2.2. Животные 40
2.3. Дизайн эксперимента 41
2.4. Определение уровня глюкозы в крови 41
2.5. Взвешивание животных 41
2.6. Учет потребления корма и воды 42
2.7. Определение толерантности к инсулиновой нагрузке 42
2.8. Количественное определение малонового диальдегида 42
2.9. Иммуногистохимическое исследование поджелудочной железы 42
2.9.1. Подготовка препаратов 42
2.9.2. Иммуногистохимическая реакция 43
2.9.3. Микроскопический анализ 43
2.10. Статистическая обработка результатов 44
Глава 3. Результаты исследований 45
3.1. Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия солей лития – лития карбоната и лития хлорида 45
3.2. Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия афобазола 51
3.3. Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия оригинального низкомолекулярного миметика NGF ГК- 57
3.3.1. Терапевтическое введение 57
3.3.2. Профилактическое введение 63
3.4. Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия метформина 68
Заключение 75
Выводы 86
Практические рекомендации 86
Список сокращений 87
Список литературы 89
- Современные представления о патогенезе сахарного диабета
- Обоснование цели исследования и выбранных веществ
- Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия солей лития – лития карбоната и лития хлорида
- Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия метформина
Современные представления о патогенезе сахарного диабета
Широкая географическая распространенность, исключительно быстрый рост заболеваемости, ранняя инвалидизация больных трудоспособного возраста и высокая смертность от прогрессирующих осложнений обуславливают позицию СД в качестве одного из важнейших социально значимых заболеваний, связанных с высоким уровнем человеческих и экономических затрат. В связи с этим поиск пусковых механизмов его развития и изучение основных звеньев патогенеза, определяющих потенциально новые подходы к фармакотерапии, остаются крайне актуальными и ведутся в лабораториях всего мира.
В соответствии с общепринятой классификацией ВОЗ (1999), выделяют СД 1 типа, характеризующийся деструкцией -клеток поджелудочной железы с последующей абсолютной инсулиновой недостаточностью, и СД 2 типа, обусловленный инсулинорезистентностью и относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без нее; особое место занимает гестационный СД, включающий нарушение толерантности к глюкозе при беременности [9].
Согласно классической теории, предложенной Eisenbarth G. в 1986 г., СД 1 типа развивается у лиц с генетической предрасположенностью, имеющих определенные аллели генов HLA (преимущественно DR и DQ); в дальнейшем было выявлено более ста генов, ассоциированных с развитием СД 1 типа [52]. Этот постулат был основан на открытии Bottazzo G.F. в 1974 г. антител к островковым клеткам поджелудочной железы, что позволило сделать вывод об аутоиммунном характере заболевания [70]. Следующим этапом в понимании патогенеза СД 1 типа было установление потенцирующей роли факторов внешней среды в деструкции инсулин-продуцирующего аппарата [78; 84]. Многие из них, по мнению ряда авторов, имеют определяющую роль в развитии патологии, что стало предпосылкой для выделения идиопатического, не связанного с аутоиммунной агрессией подтипа СД 1 типа [90; 226]. При этом вопрос о механизме гибели -клеток некротическим, апоптотическим путем или их комбинациями остается открытым до сих пор [31].
Большинство исследователей склоняется к апоптотической теории разрушения -клеток, согласно которой наблюдается чрезмерная активация рецепторов системы Fas-FasL Т-лимфоцитов широкой гаммой лигандов, ведущее место среди которых занимает ФНО- [104]. Кроме того, отмечается усиление экспрессии рецепторов семейства ФНО. Образующиеся сигнальные комплексы через ядерные и митохондриальные механизмы запускают каскад каспазных реакций, конечным результатом которых является фрагментация цитоскелета клетки, расщепление ингибитора ДНК-азы и инактивация антиапоптотических белков семейства bcl-2, что неминуемо ведет к гибели клетки [31; 90].
Первостепенное значение в развитии аутоиммунного воспаления при СД 1 типа играют Т-лимфоциты - Тх 1 типа, продуцирующие ИЛ-2, ИФН-, ФНО- и опосредующие клеточный иммунный ответ, и Тх 2 типа, определяющие через систему ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-17А, ИЛ-23 гуморальный ответ. Однако большинство авторов сходятся во мнении о цитотоксичности продуцируемых цитокинов субпопуляциями CD4+ и CD8+ Тх 1 типа; некоторые же сообщают о весомом вкладе Тх 17 типа и Т-регуляторных клеток в инициацию некротических изменений островкового аппарата [34; 37; 157].
Таким образом, СД 1 типа рассматривается как полигенное многофакторное заболевание, развивающееся в ходе аутоиммунной агрессии -клеток поджелудочной железы, вызванной наследственными изменениями генетического аппарата во взаимодействии с факторами внешней среды.
Патогенез СД 2 типа базируется на совокупности компонентов инсулинорезистентности, нарушения инкретинового ответа, наследственной предрасположенности и образа жизни и питания, ведущих к ожирению [202]. Низкая физическая активность, высококалорийная пища, стрессы являются первостепенными факторами риска, усугубляя инсулинорезистентность и способствуя реализации генетических изменений, непосредственно обуславливающих развитие СД 2 типа.
Инсулинорезистентность - состояние, характеризующееся недостаточностью биологического ответа клеток на инсулин при его нормальной концентрации в крови. Она реализуется посредством следующих факторов [9]:
сокращение количества рецепторов инсулина и снижения их аффинности;
повреждение пострецепторных механизмов, опосредующих эффекты инсулина;
недостаточность концентрации инсулина для стимуляции постоянно растущего количества рецепторов;
нарушение процесса транслокации транспортеров глюкозы ГЛЮТ-4 к мембранам клеток;
избыточность концентрации свободных жирных кислот.
На первом этапе инсулинорезистентность приводит к компенсаторному усилению секреции инсулина с характерным искажением описывающей ее кривой: первая фаза секреторного ответа на нагрузку глюкозой снижена, повышена концентрация проинсулина и метаболитов гормона, нарушен суточный ритм секреции. На следующем этапе ввиду ограниченных компенсаторных возможностей наблюдается истощение -клеток, ведущее к абсолютной недостаточности инсулина и требующее его экзогенное введение [154]. Одним из ведущих симптомов развивающегося СД 2 типа является гипергликемия натощак, вызванная усилением глюконеогенеза и гликогенолиза вследствие утраты способности -клеток реагировать на повышение гликемии. Развивающаяся глюкозотоксичность в еще большей мере снижает чувствительность органов и тканей к инсулину, замыкая порочный круг патогенеза СД 2 типа [9].
К важнейшим факторам формирования инсулинорезистентности относят ожирение и связанную с ним гиперлипидемию. Она обусловлена интенсификацией процессов липолиза в висцеральных адипоцитах ввиду их гиперреактивности к липолитическим факторам, преимущественно катехоламинам, и пониженной чувствительности к антилиполитическим эффектам инсулина. Свободные жирные кислоты ослабляют захват и утилизацию инсулина гепатоцитами, приводя к усилению их инсулинорезистентности, что в конечном итоге стимулирует глюконеогенез и гликогенолиз в печени. Кроме того, гиперлипидемия замедляет утилизацию глюкозы скелетной мускулатурой, усугубляя инсулинорезистентность миоцитов на фоне нарастающей гиперинсулинемии [73].
Отдельного внимания заслуживает феномен липотоксичности, заключающийся в отложении комплексов неэтерифицированных жирных кислот с альбумином в цитозоле инсулинзависимых клеток, а также липопротеинов очень низкой и низкой плотности (ЛПОНП и ЛПНП) в интиме сосудов. В процессе -окисления липидов образуется избыточное количество ацетил-КоА, которое стимулирует глюконеогенез. Кроме того, ацетил-КоА снижает активность пируватдегидрогеназы, что ведет к избыточному образованию лактата в цикле Кори – одного из главных субстратов для глюконеогенеза. Свободные жирные кислоты подавляют активность гликогенсинтазы [46].
Следующим фактором, формирующим инсулинорезистентность, является активация процессов воспаления, реализуемых посредством индукции синтеза первичных и вторичных медиаторов – ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, СРБ, МХБ-1 и других в ответ на провоспалительный эффект модифицированных липопротеинов и гликозилированнных структур [73]. В результате каскада реакций, опосредуемых цитокинами, на поверхности эндотелиоцитов имеет место гиперэкспрессия молекул адгезии с последующим развитием инфильтрации сосудистой стенки, снижением ее эластичности и активацией липопероксидации клеточных мембран, приводящая к нарушениям микроциркуляции, усугублению энергодефицита тканей и развитию сосудистых осложнений [18]. Кроме того, доказано триггерное действие ФНО- и ИЛ-6 в отношении инсулинорезистентности и дислипидемий. Ряд исследований рассматривают провоспалительные цитокины как факторы, дезорганизующие трансдукцию сигнала инсулина и индуцирующие апоптоз -клеток поджелудочной железы [56; 97]. Одним из основных элементов, вовлеченных в патогенез СД любого типа, а также формирование его осложнений и интегрированный во все биохимические пути реализации глюко- и липотоксичности, является окислительный стресс [2; 195]. Отмечено, что при СД присутствуют оба компонента, являющиеся его причинами – усиленная генерация активных форм кислорода в условиях окисления глюкозы и жирных кислот и недостаточность антиоксидантных систем, важнейшими из которых являются системы глутатиона, супероксиддисмутазы, каталазы [215]. В условиях гипергликемии наблюдается активация полиолового пути окисления глюкозы, вовлекающего в каскад реакции НАДФ, что ведет к дефициту восстановленных форм глутатиона [2; 33]. Продукты аутоокисления глюкозы и гликозилированные белки, воздействуя на специфические рецепторы, активируют иммунный ответ; в процессе окисления жирных кислот образуется значительное количество эйкозаноидов, опосредующих воспалительные реакции [33]. По данным большинства исследований, важнейшую роль в формировании окислительного стресса играет транскрипционный фактор NF-B, активируемый накоплением избытка свободных радикалов в клетке и запускающий, в свою очередь, экспрессию молекул адгезии, воспаления и сосудистых факторов [49]. Немаловажным элементом, обуславливающим окислительный стресс, является дисфункция NO-синтазы, приводящая к избыточному синтезу токсичных свободных радикалов NO и его производных [195]. Извращение вазодилатирующего действия оксида азота считается отправной точкой в развитии атеросклероза, микроциркуляции и сосудистых нарушений при СД, в т.ч. диабетической нефро- и офтальмопатии [89]. Особо чувствительным к повреждающему действию активных форм кислорода является островковый аппарат поджелудочной железы, который характеризуется слабым антиоксидантным потенциалом. Активность супероксиддисмутазы в панкреатических -клетках на 50% ниже таковой в гепатоцитах; активность каталазы и глутатионпероксидазы в поджелудочной железе составляет около 1% активности данных ферментов в печени [186].
Обоснование цели исследования и выбранных веществ
В литературе приведены определенные данные об эффективности инкретиномиметиков на экспериментальной модели болезни Альцгеймера [93; 199]. В исследовании на культуре гиппокампальных нейронов показано, что агонист рецепторов ГПП-1 повышает жизнеспособность клеток, подвергнутых действию индуктора синтеза -амилоида; этот эффект подавляется блокатором рецепторов ГПП-1 [119].
Что касается клинических данных, убедительные доказательства наличия положительного когнитивного эффекта у пациентов с болезнью Альцгеймера получены только для инсулина, введнного для преодоления ГЭБ интраназально [163]. Также были предприняты попытки применения других антидиабетических средств с целью замедления прогрессирования патологии при болезни Альцгеймера. Эти исследования, проводимые в 2010-2018 гг. (протокол NCT01255163) не предоставили результатов об эффективности агониста рецепторов ГПП-1 эксенатида (Баетта, AstraZeneca, UK) у пациентов с болезнью Альцгеймера в связи с недостаточной репрезентативностью выборки.
Обратный вопрос о возможности применения нейропротекторных веществ в качестве антидиабетических препаратов до недавнего времени не ставился. Учитывая тот факт, что повреждения как нейрональных систем, так и инсулин-продуцирующего аппарата поджелудочной железы в значительной степени связаны с окислительным стрессом и дефицитом нейротрофических факторов, в ФГБНУ «НИИ фармакологи имени В.В. Закусова» было высказано предположение о целесообразности изучения антидиабетической активности нейропротекторных веществ, усиливающих выраженность нейротрофических процессов и ослабляющих проявления окислительного стресса.
Для проверки этого предположения в исследованиях, начатых в 2012 году, в качестве потенциальных антидиабетических соединений были изучены оригинальные нейротропные вещества, созданные в Институте: дипептидный ноотропный и нейропротекторный препарат ноопепт [28], димерный дипептидный миметик NGF соединение ГК-2 [21; 32; 53], анксиолитик афобазол [43].
Данные исследования проводились только с оценкой функциональных показателей СД, в частности, гипергликемии и массы тела, и обычно не содержали морфологических исследований, которые могли бы дать прямые доказательства цитопротекторного действия препаратов в отношении инсулин-продуцирующих -клеток поджелудочной железы. Исключение составил препарат ноопепт, эффект которого был частично изучен и на морфологическом уровне, однако применнная в этих исследованиях методика окрашивания по Гомори не давала возможность в полной мере дифференцировать -эндокриноциты от клеток других типов [26]. Достичь максимальной точности исследований на морфологическом уровне можно с использованием иммунохимического метода диагностики, основанном на применении специфических антител к определяемому антигену. По сравнению с классическими гистологическими методиками, ИГА имеет неоспоримые преимущества, наиболее важными из которых являются высокая специфичность в отношении детектируемого объекта, чувствительность, позволяющая открывать вещество (антиген) при его низкой концентрации в ткани, а также интенсивность полученного сигнала [69].
Основное достоинство ИГА состоит в том, что он селективно выявляет клетки, содержащие определяемый антиген, тогда как другие методы, например, окраска гематоксилин-эозином, дифференцируют клетки и клеточные органеллы лишь на группы по физико-химическим свойствам. Если при окраске гематоксилин-эозином по Гомори у животных активного контроля нами было выявлено 23,0% -клеток [26], то в случае применения ИГА данный показатель у диабетических животных, не получавших лечения, в среднем был на уровне 9,5% [25]. Это сопоставление свидетельствует о более точной идентификации и дифференциации панкреатических -клеток методом ИГА. Таким образом, представляется целесообразным дальнейшее изучение афобазола и миметика 4-й петли NGF, соединения ГК-2 с использованием метода ИГА для оценки их возможного цитопротекторного действия в отношении инсулин-продуцирующих -клеток.
Кроме того, в планируемое исследование были также включены соли лития, ингибирующие GSK-3, поскольку данный фермент является негативным регулятором синтеза и экспрессии нейротрофинов и функционирования антиоксидантных систем, а его угнетение может обеспечить повышение выживаемости и активацию процессов регенерации -клеток [134; 229].
Соли лития довольно широко применяются для лечения различных форм депрессий [67; 221]. Известно, что депрессии связаны с нарушением нейрогенеза и нейрональной пластичности, особенно в префронтальной коре и гиппокампе. В связи с этим данные препараты применяются в качестве нейропротекторов при различных нейродегенеративных заболеваниях, ишемии и травмах мозга. Это может служить основанием для проведения экспериментов по изучению возможных антидиабетических эффектов солей лития. Хотя в литературе встречаются отдельные данные о гипогликемических свойствах лития хлорида [138; 141], лития карбонат, единственная зарегистрированная в России соль лития, на предмет антидиабетического действия ранее не исследовалась.
Соли лития оказывают избирательное угнетающее действие на экспрессию GSK-3, гиперактивность которой в нейронах и -клетках играет важнейшую роль в патогенезе как нейродегенеративных заболеваний, так и СД (рисунок 4) [173; 229]. Они также ослабляют проявления окислительного стресса [120; 125] и усиливают экспрессию BDNF не только за счт ослабления генерации свободных радикалов, но также путм активации транскрипции специфического экзона IV; этот эффект сочетается с угнетением проапоптотических генов и каспазы-3 [95].
Как отмечалось ранее, характерный для СД окислительный стресс, обусловленный дефицитом антиоксидантных систем в сочетании с гиперактивностью GSK-3, ведет к сдвигу соотношения предшественников нейротрофинов и их зрелых форм в сторону преобладания первых. Этому соответствует факт снижения уровня нейротрофинов у пациентов с СД [58]. Однако, фармакокинетические ограничения полноразмерных молекул нейротрофинов, низкая биологическая устойчивость, неспособность в условиях системного введения проникать через биологические барьеры, наличие побочных эффектов определили невозможность их использования с целью заместительной терапии [168]. Фактически, во всех проведенных к настоящему времени исследованиях эффективность NGF в терапии перечисленных заболеваний доказана только при интрацеребральном (интрацеребровентрикулярном) введении, поскольку данная молекула не способна проникать через гематоэнцефалический барьер [203], а при системном введении вызывает значительные нежелательные реакции, такие как кровотечения, боли, потеря веса, повреждение кожных покровов в месте инъекций и другие.
В отделе химии лекарственных средств НИИ фармакологии имени В.В. Закусова сформулирована рабочая гипотеза, согласно которой отдельные структуры нейротрофинов при взаимодействии с одним и тем же рецептором могут активировать разные сигнальные пути, обуславливая различные эффекты нейротрофинов [8]. Эта гипотеза послужила основой нового направления фармакологических исследований по созданию системно-активных низкомолекулярных миметиков нейротрофинов, лишенных побочных действий полноразмерной молекулы. В рамках предложенной гипотезы был сконструирован дипептидный миметик, получивший рабочий шифр «ГК-2» [40]. В соединении сохранен центральный дипептидный фрагмент Glu94-Lys95, который, согласно стереохимическим принципам, может наиболее глубоко проникать в зону связывания рецептора и наиболее полно распознаваться им. Периферийный Asp93 был заменен его биоизостером, остатком янтарной кислоты, а аминокислотный остаток Gln96 замещен амидной группой. Целью указанных замен явилась стабилизация конформации -изгиба, увеличение устойчивости соединения к действию пептидаз.
Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия солей лития – лития карбоната и лития хлорида
Как следует из представленных данных (рисунок 8), уровень глюкозы у крыс с СД на 7 день после введения СТЗ статистически значимо превосходил таковой у здоровых животных. В течение последующих дней (14, 21, 28) уровень гликемии у крыс группы активного контроля нарастал, достигая значений 26 ммоль/л. Под действием солей лития не наблюдалось прогрессирование гипергликемии, характерное для диабетических животных: напротив, ее уровень имел тенденцию к снижению на протяжении всего периода эксперимента. Таким образом, показана достоверная и стабильная гипогликемическая эффективность исследуемых солей лития.
Экспериментальные данные подтверждаются расчетами показателя относительной антигипергликемической активности Аг (таблица 1), которые свидетельствуют о более раннем проявлении лечебного эффекта лития карбоната (7-й день) по сравнению с лития хлоридом. Антидиабетическая активность обеих солей лития достигает максимума через две недели и в дальнейшем сохраняется на том же уровне до конца эксперимента.
Эффективность солей лития проявляется в более выраженном увеличении массы тела животными экспериментальных групп по сравнению с группой активного контроля (рисунок 9). Так, разница в массе тела между последним днем эксперимента и исходной величиной у здоровых животных достигала 52,0 г (прибавка +16,2%). В группе активного контроля эта величина составляла 17,0 г (+5,8%), в то время как у животных, получавших терапию карбонатом лития – 39,0 г (+12,5%), хлоридом – 27,7 г (+8,9 %).
Кроме того, антидиабетическая активность исследуемых соединений подтверждается более низкими значениями полидипсии, являющейся важнейшим индикатором СД (таблица 2). В то время как у животных активного контроля отмечалось значительное увеличение потребления воды, у животных обеих опытных групп регистрировалось статистически значимое снижение данного показателя. Этот эффект был наиболее выражен к концу эксперимента: животные группы активного контроля ежесуточно потребляли объем жидкости, более чем на 120% превышающий таковой у здоровых животных; у диабетических животных, получавших терапию лития хлоридом эта разница составляла только 62%, а лития карбонатом – 51%.
Менее выраженная, но также достоверная разница отмечена и в отношении полифагии (таблица 2).
Влияние терапии лития хлоридом и лития карбонатом на уровень МДА как показателя окислительного стресса оценивалось в последний день эксперимента (рисунок 10).
В то время как у животных активного контроля уровень МДА в 2 раза превышал таковой у здоровых крыс, на фоне терапии солями лития он снижался и был сопоставим с показателем здоровых животных.
С целью получения доказательств цитопротекторного действия исследуемых соединений было проведено морфологическое исследование поджелудочных желез животных с использование моноклональных антител к инсулину. Эксперименты были начаты с дифференцированной оценки островков -клеток по площади (рисунок 11). Отмечено, что если в группе здоровых животных преобладали островки крупных размеров (площадью 2501-10000 мкм2 – 36% и более 10001 мкм2 – 38%), то у нелеченых диабетических животных их число снижено до 26% и 10% соответственно, в данной группе преобладали мелкие островки (площадью 501-2500 мкм2 – 49%).
Терапия солями лития способствует увеличению доли крупных островков (площадью 2501-10000 мкм2 – 35% в группе лития карбоната и 28% в группе лития хлорида; площадью более 10001 мкм2 – 17% и 18% соответственно).
Как следует из данных, представленных в таблице 3, в группе нелеченых диабетических животных отмечено уменьшение абсолютной и относительной площади -клеток по сравнению с группой здоровых животных. Их островки характеризуются минимальным количеством инсулиноцитов, вакуолизацией и склерозированием, наличием дистрофических изменений в структуре ткани (рисунок 12В). Средняя площадь панкреатических островков у таких животных почти в 4 раза меньше площади островков здоровых животных (рисунок 12А). Доля -клеток в поперечном срезе поджелудочной железы нелечных диабетических крыс составляет около 9,5%, в то время как у здоровых этот показатель достигал 28,1%.
Введение диабетическим крысам в течение 28 дней препаратов лития приводит к заметному восстановлению морфологических характеристик -клеток (рисунок 12С, 12D). Суммарная площадь -клеток у леченых диабетических животных в 2 раза выше таковой у нелеченых крыс в случае терапии лития карбонатом и в 2,5 раза – лития хлоридом. Выраженность показателей морфометрии коррелирует с показателями уровня глюкозы в крови: коэффициент корреляции уровня глюкозы с процентным содержанием -клеток в срезе составляет 0,6942, а с их суммарной площадью – 0,6538. (рисунок 13).
Таким образом, в данных экспериментах показана стабильная гипогликемическая активность лития карбоната и лития хлорида при их введении в эквинормальных дозах ежедневно в течение 28 дней. Препараты положительно влияли на динамику массы тела крыс, уменьшали выраженность полифагии и полидипсии, а также ослабляли накопление МДА как одного из показателей окислительного стресса.
Морфологический анализ поджелудочных желез позволил выявить цитопротекторную активность солей лития, проявившуюся в восстановлении абсолютного и относительного количества -клеток. Установлено наличие значительных корреляционных связей показателей морфометрии с уровнем глюкозы в крови.
Исследование антидиабетического и цитопротекторного действия метформина
С целью возможности сопоставления эффектов изучаемых соединений и референтного образца было проведено изучение антидиабетического действия препарата первой линии в лечении СД 2 типа метформина на функциональном и морфологическом уровнях перорально в дозе 300 мг/кг [201].
Результаты измерения основных физиологических показателей (базального уровня глюкозы в плазме крови, динамики массы тела) экспериментальных групп животных представлены на рисунках 34 и 35 соответственно.
Представленные данные свидетельствуют, что уровень глюкозы в крови животных пассивного контроля с 1 по 28 день наблюдений соответствовал нормальным значениям (рисунок 34). Уровень гликемии у крыс с СД на 7 день после введения СТЗ статистически значимо превосходил таковой в 3 раза у интактных животных. В течение последующих дней (14, 21, 28) у животных активного контроля он имел планомерную тенденцию к росту, достигнув максимума 29,3 ммоль/л, что в 5 раз выше уровня интактных крыс.
Высокую степень декомпенсации СД также характеризует нарушенная динамика массы тела (рисунок 35) наряду с выраженной полифагией (рисунок 36) и полидипсией (таблица 14).
В условиях воспроизведенной модели была подтверждена гипогликемическая активность метформина. К концу первой недели эксперимента эффект метформина не отмечался (рост гликемии до 21,3 ммоль/л), однако на 14-й день исследования зафиксировано снижение уровня глюкозы на 29,7% по сравнению с активным контролем. На 21-й день разница по сравнению с животными, не получавшими лечения, составляла уже 65,6%, 28-й день – 62,4%. Под действием препарата не наблюдалось прогрессирование гипергликемии: напротив, ее уровень имел тенденцию к снижению.
Исходно животные всех групп имели примерно равную массу 263,3±1,5 г, индукция СД вызвала ее резкое снижение в первые дни. Разница средней массы животного активного контроля между последним днем эксперимента и исходной величиной до введения СТЗ была отрицательной и составила -5,6 г (-2,2%). Терапия метформином не способствовала приросту массы тела, разница исходной и конечной масс составила -3,4 г (-1,3%), тогда как у здоровых животных она была положительной и составила 64,9 г (+24,4%).
Наличие антидиабетической активности метформина подтверждается выраженным снижением полифагии и полидипсии – важнейших индикаторов СД. Начиная со второй недели эксперимента, под действием препарата отмечалось статистически значимое уменьшение массы потребляемого корма (рисунок 36). Если животные группы активного контроля к концу эксперимента потребляли корма на 44,9% больше здоровых, то в группе метформина эта разница составляет 17,6%.
Более выраженный эффект был зарегистрирован в отношении полидипсии (таблица 14): в то время как у животных активного контроля отмечалась выраженная жажда (суточное потребление воды в 4,5 раз больше, чем у здоровых), у животных, получавших метформин, имело место статистически значимое уменьшение потребление воды к 21 дню в 1,3 раз, к 28 дню – в 1,5 раз по сравнению с активным контролем.
Морфометрический анализ включал определение площади -клеток и дифференцированную оценку островков у животных разных групп. Если в группе здоровых животных преобладали островки крупных размеров (площадью более 10001 мкм2), то у нелеченых диабетических животных островки в основном мелкие (площадью 501-2500 мкм2 и 2501-10000 мкм2) (рисунок 38). В группе диабетических крыс, получавших терапию метформином, отмечено увеличение доли островков крупных размеров.
Полученные данные свидетельствуют об уменьшении площади -клеток в группе нелеченых диабетических животных (таблица 15). Островки крыс группы активного контроля характеризуются сниженным количеством -клеток, нарушением формы и размеров (рисунок 39В). Средняя площадь панкреатических островков у таких животных составляла около 7646 мкм2, что в 2,4 раза меньше площади островков здоровых животных (рисунок 39А). Процентное содержание суммарной площади -клеток в поперечном срезе поджелудочной железы нелечных диабетических крыс составило 5,8%, в то время как у здоровых этот показатель достигал 20,0%.