Содержание к диссертации
Введение
I. Перспективные фармакологические подходы к разработке местноанестезирующих лекарственных средств (литературный обзор) 16
1.1 Общие вопросы фармакологии местноанестезирующих лекарственных средств 16
1.2 Фармакологическая характеристика некоторых современных местноанестезирующих лекарственных средств 20
1.3 Современные представления о механизме фармакологического действия местно-обезболивающих лекарственных средств 26
1.4 Системная и локальная токсичность местноанестезирую-щих лекарственных средств 31
1.5 Перспективные лекарственные формы и системы доставки лекарственных средств с местно-обезболивающим действием 34
1.6 Актуальные направления использования местноанестези-рующих лекарственных средств в офтальмологии 46
II. Материал и методы исследования 49
2.1 Дизайн исследования 49
2.2 Этические и нормативные процедуры при проведении исследования 52
2.3 Характеристика объекта исследования. Обоснование выбора доз исследуемых веществ 53
2.4 Основные сведения о лабораторных животных и других биологических объектах, включенных в исследование 61
2.5 Методы компьютерного скрининга активности и токсичности в ряду производных диметилфенилацетамида 65
2.6 Методы исследования острой токсичности некоторых производных диметилфенилацетамида 66
2.7 Методы исследования местноанестезирующей активности 67
2.8 Методы исследования некоторых ключевых механизмов местноанестезирующего действия третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида 72
2.9 Методы обработки результатов исследования и анализа данных 80
III. Скрининг местноанестезирующей активности и токсичности третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида 81
3.1 Прогнозирование токсичности и местноанестезирующей активности в ряду третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида 81
3.2 Исследование острой токсичности производных диме-тилфенилацетамида с наибольшей вероятностью наличия в спектре действия местноанестезирующих свойств 86
IV. Исследование спектра местноанестезирующего действия производных диметилфенилацетамида 91
4.1 Изучение местноанестезирующего и местнораздражаю щего действия производных диметилфенилацетамида на модели инфильтрационной анестезии роговицы глаза кролика 91
4.2 Исследование местноанестезирующего действия произ водных диметилфенилацетамида на модели инфильтраци онной анестезии у морских свинок 99
4.3 Местноанестезирующая активность производных диме тилфенилацетамида на моделях проводниковой анестезии 102
V. Изучение некоторых аспектов механизма мест ноанестезирующег действия производных диметилфенилацетамида 112
5.1 Изучение механизма проницаемости мембран нерва для третичного и четвертичного производных диметилфе-нилацетамида 112
5.2 Исследование антиокислительной активности изучаемых местноанестезирующих веществ в опытах на крысах 117
5.3 Влияние третичного и четвертичного производных диме-тилфенилацетамида на нервное проведение и активность потенциал-зависимых натриевых каналов 121
Заключение 126
Перспективы дальнейшего развития темы 136
Выводы 138
Практические рекомендации 140
Библиографический список 141
- Современные представления о механизме фармакологического действия местно-обезболивающих лекарственных средств
- Прогнозирование токсичности и местноанестезирующей активности в ряду третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида
- Местноанестезирующая активность производных диме тилфенилацетамида на моделях проводниковой анестезии
- Влияние третичного и четвертичного производных диме-тилфенилацетамида на нервное проведение и активность потенциал-зависимых натриевых каналов
Современные представления о механизме фармакологического действия местно-обезболивающих лекарственных средств
Местные анестетики напрямую блокируют передачу болевых импульсов по ноцицептивным афферентным волокнам. Их фармакологическое действие связано с прямым воздействием на нерв и / или нервное волокно, где под действием молекул препарата подавляется входящий натриевый ток по натриевым ионофорам в процессе деполяризации [29].
Следует особо подчеркнуть единство ученых в том, что одним из фундаментальных направлений поиска и создания новых высокоактивных и безопасных МАС, разработки передовых терапевтических стратегий, является повышение селективности натрий-блокирующей активности фармакологических агентов [51]. В этой связи в рамках настоящего обзора хотелось бы подробнее остановиться на фармакологии потенциал-зависимых натриевых каналов.
В настоящее время известны 9 субпопуляций потенциал-зависимых натриевых каналов, экспрессирующихся в нейрональных, сердечных и мышечных клетках [52] (рис. 1.6).
При этом преимущественно нейрональную локализацию имеют NaV 1.1, NaV 1.2, NaV 1.3, NaV 1.4 и NaV 1.6 каналы [54-56], обнаруженные также и в кардиомиоцитах, где основу популяции потенциал-зависимых натриевых каналов составляет популяция NaV 1.5 [51]. Для селективной модуляции определенных популяций каналов с последующим специфическим фармакологическим эффектом необходимы канал-специфичные лиганды, обладающие сродством к той или иной субпопуляции ионофор. С этой целью в настоящее время ведутся исследования структуры каналов на атомном уровне (рис. 1.7) [57-61].
Сейчас хорошо известно, что потенциал-зависимый натриевый канал прокариот состоит из 4 идентичных доменов, формирующих двух- или четырехчленные симметричные структуры [57-61]. Эукариотический канал отличается тем, что при полном подобии доменов с прокариотическими, они формируют еще потенциал-зависимую ионную пору. В каждом домене содержатся трансмембранные S1-S6 сегменты, причем 4 первых сегмента формируют потенциал-зависимый домен, а два последних принимают участие в формировании поры [63]. Петля между S5-S6 сегментами формирует фильтр селективности, который стабилизируется сегментами Р1 и Р2. Каждый S4 сегмент содержит в воротно-заряженном отделе аминокислоту аргинин, играющую ключевую роль в формировании потенциал-зависимости канала. Согласно современным представлениям МАС нарушают проведение натрия через потенциал-зависимые каналы путем формирования взаимодействия молекулы препарата с участком канала, расположенным в полости домена, формирующего ионную пору [64-66]. Однако, поскольку структура данного участка ионного канала широко варьирует в зависимости от субпопуляции, подавляющее большинство известных в настоящее время модуляторов натриевого проведения имеют весьма скромную селективность.
Не только натриевые каналы являются мишенью воздействия МАС. Они также способны подавлять кальциевые и калиевые токи [67-69], ингиби-ровать преходящие рецепторные потенциалы ваниллоидных рецепторов 1 типа [70], а также некоторых других лиганд-зависимых рецепторов. Ряд представителей местноанестезирующих лекарственных средств также нарушают взаимодействие протеинов G и ассоциированных с ними рецепторных систем [71]. Вследствие данного свойства многие препараты способны оказывать собственное противовоспалительное действие, в особенности при воспалительных реакциях с первично нейтрофильным компонентом [72]. Вследствие ингибирование локального воспалительного ответа на альтерирующие факторы МАС способны вносить дополнительный вклад в десенси-тизацию ноцицептивных рецепторов. МАС обладают способностью подавлять высвобождение медиаторов воспаления нейтрофильного происхождения, а также препятствуют абсорбции нейтрофилов к эндотелию, снижают продукцию активных форм кислорода и препятствуют тем самым формирование отеков [73]. Кроме того, помимо натрий-зависимых эффектов мест-ноанестезирующие лекарственные средства способны к нейропротекции и антитромботическому действию [71], не связанным с блокадой натриевых каналов и существенным образом редуцирующих формирование местных болевых реакций, в особенности возникающих на фоне хирургических воздействий [67, 73].
В проведенных исследованиях показано, что некоторые МАС эффективны при так называемой нейропатической боли. Формирование подобного эффекта связывают с происходящим на фоне введения МАС повышением чувствительности антиноцицептивных механизмов, активную роль в котором играют клетки спинальных ганглиев [74].
Важное значение в формировании обезболивающего эффекта лидокаи-на и его аналогов имеет установленный не так давно их эффект на NMDA-рецепторы [75]. Внутривенное введение лидокаина крысам с воспроизводимой острой и нейропатической болью продемонстрировало активацию анти-ноцицептивной системы в обоих случаях [76]. Возможно это связано с нейропротекторными свойствами лидокаина при его введении в антиаритмических или меньших дозах [75]. В рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании у пациентов без сахарного диабета показана нейропротективная активность препарата.
Давно известно, что многие местноанестезирующие агенты обладают антимикробным действием, что активно используется при проведении эпи-дуральных анестезиологических пособий [77]. Причем, наибольшим проти-вомикробным действием из известных МАС обладает бупивакаин [77].
В рандомизированном исследовании пациентов, перенесших операцию на толстом кишечнике, было показано, что курсовое введение лидокаина приводило к достоверному снижению интенсивности болевого синдрома, раннему восстановлению кишечной перистальтики и снижению сроков нахождения в стационаре в послеоперационном периоде [78]. В периопера-ционном периоде МА стимулируют активность натуральных киллеров (NK-клетки) [75].
Введение лидокаина в периоперационном периоде улучшает послеоперационное управление болевым синдромом и редуцирует послеоперационные нарушения местного и общего иммунитета [79].
Исследования антиканцерогенного действия местноанестезирующих лекарственных средств хотя и показало некоторую эффективность, тем не менее нуждается в дальнейшей разработке.
Прогнозирование токсичности и местноанестезирующей активности в ряду третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида
Эмпирический подход к поиску новых фармакологически активных веществ в наше время утратил доминирующие позиции. В своих многочисленных работах В.В. Поройков, Д.А. Филимонов и др. Показали, что большой объем работ по синтезу и дальнейшему лабораторному изучению сотен и тысяч новых субстанций экономически не оправдан и существенно повышает стоимость конечного продукта – лекарственного средства [203].
В этой связи в последние десятилетия ведется поиск методов компьютерного прогнозирования токсичности и спектра фармакологической активности веществ заданной химической структуры. В настоящее время в поиске и создании новых лекарственных препаратов преобладает направленный подход: химические вещества тестируются лишь на небольшое число требуемых видов биологической активности, а свойства выявленных "базовых структур" в последующем оптимизируются путем синтеза и исследования их аналогов. При этом многие виды биологической активности, присущие изучаемому веществу, но являющиеся "побочными" по отношению к избранному направлению исследований, остаются неизученными. В то же время наличие у вещества многих видов биологической активности является типичным. Некоторые из этих видов активности обнаруживаются впоследствии как побочные токсические эффекты, а другие становятся основанием для регистрации препарата по новому назначению [204].
За истекшее двадцатилетие методы, первоначально предложенные для прогноза спектра биологической активности, претерпели существенные изменения [205-205]. Эти изменения базируются как на теоретическом анализе методики прогнозирования, так и на имеющемся опыте ее применения для поиска веществ с требуемыми свойствами с использованием PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances), которая прогнозирует по структурной формуле химического вещества 565 видов биологической активности, включающих основные и побочные фармакологические эффекты, механизмы действия, мутагенность, канцерогенность, тератогенность и эмбриотоксичность.
В рамках настоящей работы нами с помощью системы PASS была проведена оценка вероятности наличия (Pa) и отсутствия (Pi) фармакологической (местноанестезирующей) активности (максимальная вероятность равна 1) в ряду третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида. В результате были получены следующие данные (приводятся значения Ра, в скобках - Pi) (рис. 3.16): ЛХТ 5-01. Благодаря введенному в структуру аргинину гематотоксич-ность соединения снижается с 0,844 до 0,645, появляется иммуномодулиру-ющая активность 0,567; антиаритмические свойства повышаются с 0,474 до 0,729, в то же время из кардиодепрессанта 0,578 соединение превращается в кардиопротектор 0,511. Прогнозируется: блокатор Na каналов 0,711, антиалкогольная активность 0,590, антагонист фибриногеновых рецепторов 0,906. Вероятность наличия местноанестезирующей активности не более 0,089.
ЛХТ 4-01. Замена аргинина на 2-аминопропионовую кислоту приводит к усилению кардиотоксичности с 0,687 до 0,719 и гематотоксичности с 0,645 до 0,840. Прогнозируются: антиалкогольная активность 0,587, иммуномоду-лирующая 0,509, антиаритмическая 0,417, кардиотоническая 0,434, фибрино-генная 0,821. Прогноз местноанестезирующего действия равен 0,345.
ЛХТ 6-01. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: спазмолитик (папаверино-подобный) 0,679, антагонист фиб-риногенвых рецепторов 0,710, антиаритмик 0,520, блокатор Na каналов 0,493, также кардиотоксичность 0,661. Местноанестезирующая активность в спектре действия соединения не превышает по прогнозу 0,276.
ЛХТ12-02. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: антиаритмическая 0,667 (0,029), антагонист К+ каналов 0,509 (0,011), антиастматическая 0,522, кардиопротекторная 0,521, ноотропная 0,557 (0,071), антинейротоксическая 0,581 (0,098), антиастматическая 0,522 (0,040), местноанестезирующая (0,528).
ЛХТ 5-00. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: регулятор метаболизма липидов 0,711 (0,030), фибринолити-ческая 0,676 (0,034), лечение сосудистых (периферических) заболеваний 0,612 (0,059), спазмолитическая 0,550 (0,026), но также гематотоксичность 0,894 (0,019), кардиотоксичность 0,522, тератогенность 0,477. Прогноз мест-ноанестезирующего действия с вероятностью не более 0,263.
ЛХТ 2-01. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: агонист глицинового рецептора 0,855 (0,001), лечение амио-трофического латерального склероза 0,773 (0,014). Введение в структуру аминоэтансульфоновой кислоты приводит к появлению такой активности, как лечение ишемии миокарда 0,722 (0,017), снижение гематотоксичности до 0,694, появление гепатопротекторной 0,620 (0,008) и местноанестезирующей активностей (0,213).
ЛХТ 13-02. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: антигипертензивная 0,666 (0,012), антивирусная 0,649 (0,007), иммуномодулирующая 0,540, нейропротекторная 0,546. Прогнозирование местноанестезирующего действия с вероятностью не более 0,112.
ЛХТ 6-00. Введение в структуру янтарной кислоты снижает канцеро-генность, дополнительно прогнозируются такие эффекты, как антитромботи-ческий 0,627 (0,027), лечение легочной гипертензии 0,910 (0,005), местноане-стезирующее действие со слабой вероятностью (0,301).
ЛХТ-3-00. По прогнозу следует обратить внимание на следующие виды активности: антиаритмическая 0,598 (0,018), ингибитор алкогольдегидро-геназы 0,506 (0,005), кардиопротекторная 0,526 (0,055), лечение ишемии миокарда 0,512 (0,135), ноотропная 0,438 (0,150). Вероятность наличия в спектре действия местноанестезирующей активности оценивается на уровне 0,669.
ЛХТ-4-00. Введение в структуру ацетилглутаминовой кислоты сопровождается появлением высокой вероятности местноанестезирующего действия (0,801). По прогнозу следует также обратить внимание на следующие виды активности: лечение ишемии миокарда 0,731 (0,015), фибринолитиче-ская 0,660 (0,043), регулятор метаболизма липидов 0,642 (0,045), кардиопро-текторная 0,610 (0,018). Кроме того, по сравнению с ЛХТ-13-02 снижается вероятность проявления побочных действий (мутагенность, канцероген-ность).
Таким образом, проведенный компьютерный прогноз вероятности присутствия в спектре фармакологического действия производных диметилфе-нилацетамида местноанестезирующей активности показал, что два вещества из группы третичных аминокислотзамещенных производных с высокой вероятностью обладают местно-обезболивающим действием: вероятность наличия данного эффекта в спектре ЛХТ4-00 с ацетилглутаминовой кислотой в качестве аниона наибольшая и составляет 0,801. Несколько уступает по прогнозной активности третичное соединение ЛХТ-3-00 с остатком глутами-новой кислоты – вероятность равна 0,669.
Среди кватернизированных систем с вероятностью 0,528 местноанесте-зирующий эффект присутствует у соединения ЛХТ-12-02. При этом, по профилю токсичности наиболее безопасным веществом является ЛХТ-4-00.
При сопоставлении полученных результатов с проведенными ранее исследованиями антиаритмической активности указанных веществ, следует заметить, что наибольшая антиаритмическая активность на моделях аконити-новой аритмии, а также нарушений ритма сердца ишемического и реперфу-зионного происхождения у крыс, кошек и собак была зарегистрирована именно у данных представителей химической группы.
Местноанестезирующая активность производных диме тилфенилацетамида на моделях проводниковой анестезии
Для исследования активности веществ на предмет эффективности блокады чувствительных нервов мы воспользовались двумя приемами: во-первых, тестом «tail-flick» на мышах по Bianch, а, во-вторых, моделью блокады седалищного нерва у крыс по Camougic и Takman. Тест анестезии хвоста мыши является наиболее простым в воспроизведении и, вместе с тем, достаточно информативным методом, позволяющим судить о наличии фармакологической активности вещества на модели проводниковой анестезии.
В тесте проводниковой анестезии хвоста мыши референтное мест-ноанестезирующее средство лидокаина гидрохлорид, а также третичные его производные продемонстрировали дозозависимый местно-обезболивающий эффект. При этом, по силе продолжительности блокады нерва хвоста аминокислот-содержащие производные превосходили структурный предшественник во всех концентрациях.
Полученные результаты отразились и на значениях вычисляемых интегральных показателей активности на данной модели: если показатель ЭК50 лидокаина был равен 1,63, то у соединения ЛХТ-3-00 и соединения ЛХТ-4-00 его значения были ощутимо ниже – 0,47 и 0,52. Хотелось бы также обратить внимание на то, что максимальная продолжительность эффекта среди третичных соединений была наибольшей у производного с ацетилглутаминовой кислотой в качестве аниона и составила в среднем 181 мин. Возможно, увеличение продолжительности блокады проведения связано с замедлением тканевого клиренса молекул третичных производных, поскольку латентный период наступления эффекта и у соединений и референтного препарата одинаковый.
При исследовании кватернизированного производного диметилфе-нилацетамида ЛХТ-12-02 нами получены результаты, качественно и количественно отличающиеся от третичных соединений. Как нами было уже показано на моделях инфильтрационной и терминальной анестезии латентный период наступления эффекта соединения был велик: в наименьшей концентрации раствора он составлял 25 мин в среднем, а при введении вещества в наиболее концентрированном виде был равен 17 мин. Однако, в данном случае формировался блок проведения, длительность которого простиралась на весь период наблюдения при введении растворов в концентрации 1,0 и 2,0%, и более 164 мин наблюдения в среднем при введении слабо концентрированного раствора соединения. 50%-ная эффективная концентрация, вычисленная на основании полученных данных, составила 0,31, а индекс относительной активности был равен 5,26 – наибольший среди изученных веществ.
Модель проводниковой анестезии седалищного нерва крыс методически более сложна, поскольку требует хорошего технического навыка введения анестетика к месту воздействия на нервный проводник, и, кроме того, она позволяет оценивать глубину анестезии по определению доли давления поршня алгезиметра, вызывающего ответную реакцию животного, от уровня максимально давления, не вызывающего болевой реакции.
На данной модели помимо лидокаина гидрохлорида в качестве референтного местноанестезирующего средства выбрали бупивакаина гидрохлорид. За 100%-ную глубину анестезии мы приняли силу давления поршня ал-гезиметра на конечность животного, которая не вызывает ответной болевой реакции при введении 2%-ного раствора бупивакаина гидрохлорида. Необходимо отметить, что снижение концентрации раствора анестетика в два раза практически не отражалось на силе, длительности и глубине местноанестези-рующего эффекта препарата. Отмечали некоторое снижение силы и длительности фармакологического эффекта лишь при подведении к нерву животного 0,5% раствора анестетика.
Лидокаина гидрохлорид уступал первому референтному лекарственному препарату как по силе (в концентрациях 1,0 и 0,5%), так и по длительности местноанестезирующего эффекта (во всех концентрациях).
Третичные дериваты лидокаина – соединения ЛХТ-3-00 и ЛХТ-4-00, как и структурный предшественник обладали высокой активностью, в максимально концентрированных растворах вызывали блокаду проведения по нерву по глубине сопоставимую с эталонным препаратом бупивакаина гидрохлоридом. Длительность эффекта аминокислот-содержащих производных при сравнении с лидокаином была значимо выше.
Четвертичный дериват диметилфенилацетамида ЛХТ-12-02 на данной модели воспроизводил закономерность, установленную на модели анестезии хвоста мыши: по истечении продолжительного латентного периода (от 18 до 26 мин) формировалась сопоставимо с бупивакаином глубокая и длительная блокада седалищного нерва животных. Причем, длительность фармакологи ческого эффекта составила 180 минут наблюдения. Дальнейшее наблюдение за животными мы посчитали нецелесообразным.
На рис. 4.20 представлены соотношения показателей ЭК50, рассчитанные для третичных и четвертичных производных диметилфенилацетамида на моделях проводниковой анестезии у мышей и крыс.
Из представленных данных хорошо видно, что наибольшее значение интегрального показателя как в тесте «tail-flick», так и на модели блокады седалищного нерва крысы, вычислено для лидокаина гидрохлорида. Причем, имеется существенная разница между этими значениями в опытах на лабораторных грызунах разного вида. Возможно, это связано с тем, что в опытах на крысах местный анестетик подводится к нерву непосредственно и не происходит потерь препарата до формирования фармакологического эффекта.
В случае с третичными производными ЛХТ-3-00 и ЛХТ-4-00, а также у четвертичного деривата ЛХТ-12-02 значения исследуемого коэффициента, полученные на разных моделях проводниковой анестезии располагаются очень близко друг к другу. При этом, наиболее активным соединением на данных моделях является производное ЛХТ-12-02, несмотря на длительный латентный период формирования анестезии, что, безусловно, является недостатком с практической точки зрения.
Влияние третичного и четвертичного производных диме-тилфенилацетамида на нервное проведение и активность потенциал-зависимых натриевых каналов
В опытах на изолированных препаратах седалищного нерва озерной лягушки изучили влияние третичного и четвертичного производных диме-тилфенилацетамида на амплитуду потенциала действия и проводимость по А-волокнам. Результаты экспериментальных исследований представлены в таблице 5.15.
Все исследуемые вещества и референое местноанестезирующее лекарственное средство подавляют как тоническую составляющую процесса проведения, так и ритмическую составляющую изучаемого процесса. При этом, однако, характеристика подавления для каждого соединения носила уникальный характер.
Так, третичное производное диметилфенилацетамида практически полностью повторяло эффекты лидокаина, лишь при выдерживании препарата нерва в более концентрированных растворах соединения отмечали более значимое снижение максимальной амплитуды потенциала действия нерва, возникающего в ответ на одиночный раздражающий стимул высокой интенсивности.
Напротив, применение четвертичного производного диметилфенилаце-тамида во всех концентрациях сопровождалось отличным от препарата сравнения и третичного деривата ЛХТ-4-00 подавлением как максимальной амплитуды ПД, так и проводимости по А-волокну уже при воздействии сравнительно низких концентраций анестетика. Очевидно, подобный эффект можно объяснить достаточным временем воздействия вещества на препарат нерва, позволившим ему проникнуть внутрь проводника и воздействовать на натриевые каналы.
Косвенно об этом может свидетельствовать и то, что время релаксации вольт-амперных измененных характеристик препарата нерва на фоне воздействия соединением ЛХТ-12-02 происходило гораздо медленнее и измерялось в отличие от лидокаина и его третичного производного ЛХТ-4-00 несколькими часами (рис. 5.22).
В опытах на изолированных недифференцированных нейронах брюхо-ногого моллюска были получены следующие результаты: соединения ЛХТ-4-00 и ЛХТ-12-02 при добавлении с внутренней стороны цитоплазматической мембраны в концентрации 10-4 М/л подавляли трансмембранны натриевый ток на уровне потенциала 50-60 мВ в среднем на 33-35 и 48-50% соответственно (рис. 5.23). Данное изменение не является временной характеристикой и не может объясняться изменением внутриклеточного или внеклеточного состояния.