Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структура, метаболизм и фармакологическая активность полиненасыщенных жирных кислот 11
1.1 Химическая структура, номенклатура и классификация жирных кислот 11
1.2 Роль длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот в работе центральной нервной системы у млекопитающих 12
1.3 Метаболизм длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот у млекопитающих
1.3.1 Поступление полиненасыщенных жирных кислот в плазму крови и их транспортировка 13
1.3.2 Транспорт полиненасыщенных жирных кислот в головной мозг 18
1.3.3 Содержание жирных кислот в головном мозге 20
1.4 Влияние полиненасыщенных жирных кислот на процессы нейровоспаления 22
1.4.1 Противовоспалительные производные ю-З полиненасыщенных жирных кислот 22
1.4.2 Исследование влияния ю-З полиненасыщенных жирных кислот на центральную нервную систему на in vitro и in vivo моделях 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1 Характеристика экспериментальной модели 35
2.2 Физиологические и поведенческие исследования
2.2.1 Мониторинг изменений массы тела экспериментальных животных 37
2.2.2 Оценка неврологического статуса экспериментальных животных 37
2.2.3 Оценка рабочей памяти и локомоторной активности в Y-лабиринте 38
2.2.4 Оценка функции долговременной памяти з
2.2.5 Оценка спонтанной локомоторной активности 40
2.3 Иммуногистохимические методы 40
2.3.1 Оценка экспрессии маркеров нейровоспаления при нейровоспалении in vivo.. 40
2.3.2 Оценка экспрессии ИЛ-ір при нейровоспалении in vitro 43
2.4 Физико-химические методы 43
2.4.1 Измерение внеклеточного уровня рН микроэлектродным методом 43
2.4.2 Измерение внутриклеточного уровня рН ратиометрическим методом 47
2.5 Биохимические методы 50
2.5.1 Определение концентрации малонового диальдегида в гомогенатах тканей.. 50
2.5.2 Определение жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга 52
2.6 Статистическая обработка результатов 53
Собственные исследования
ГЛАВА 3. Оценка изменений кислотно-основного равновесия в центральной нервной системе при нейровоспалении 54
3.1 Динамика экспрессии ИЛ-ір при периферически индуцированном нейровоспалении 56
3.2 Внутриклеточный уровень рН гиппокампа при остром нейровоспалении 60
3.3 Внутриклеточный уровень рН гиппокампа при подостром нейровоспаления 69
3.4 Уровень рН нейронов гиппокампа при in vzYro-индуцированном нейровоспалении 78
3.5 Внеклеточный уровень рН нейронов гиппокампа при хроническом
нейровоспалении на мышиной модели Ts65Dn 81
ГЛАВА 4. Оценка эффективности введения ю-З полиненасыщенных жирных кислот при нейровоспалении 84
4.1 Влияние полиненасыщенных жирных кислот на массу тела животных при нейровоспалении
4.2 Анализ жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга мышей после введения полиненасыщенных жирных кислот 88
4.3 Влияние полиненасыщенных жирных кислот на поведенческие характеристики мышей при нейровоспалении 91
4.4 Неврологический статус мышей при нейровоспалении на фоне введения ю-3 полиненасыщенных жирных кислот 95
4.5 Экспрессия маркеров нейровоспаления в гиппокампе на фоне введения ю-3 полиненасыщенных жирных кислот 96
4.6 Накопление пептида Ар 1-42 в гиппокампе при нейровоспалении на фоне введения ю-3 полиненасыщенных жирных кислот 102
4.7 Содержание малонового диальдегида в гиппокампе мышей при нейровоспалении на фоне введения полиненасыщенных жирных кислот 105
4.8 Уровень рН нервной ткани при нейровоспалении на фоне введения ю-З
полиненасыщенных жирных кислот 107
Обсуждение результатов 111
Заключение 124
Выводы 126
Список сокращений и условных обозначений 127
Список литературы
- Метаболизм длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот у млекопитающих
- Оценка неврологического статуса экспериментальных животных
- Внутриклеточный уровень рН гиппокампа при остром нейровоспалении
- Влияние полиненасыщенных жирных кислот на поведенческие характеристики мышей при нейровоспалении
Введение к работе
Актуальность темы. Психоневрологические расстройства, в том числе когнитивные и эмоциональные нарушения, являются частыми проявлениями органических поражений центральной нервной системы (ЦНС) (Fleminger et al, 2013). Состояние, характеризующееся крайней степенью нарушения когнитивных функций, называют деменцией (Преображенская, 2013). Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, во всем мире насчитывается 47,5 миллиона человек с деменцией. Ежегодно происходит 7,7 миллиона новых случаев заболевания (Информационный бюллетень ВОЗ №362, 2015). В России в возрасте после 70 лет деменцией страдают 4,6% людей, после 80 лет — 16-18% (Чухловина, 2010). Наиболее частой причиной деменции является болезнь Альцгеймера (БА), составляющая 60-70% случаев прогрессирующего ухудшения когнитивных функций при старении (Дамулин, 2013). Сосудистые поражения головного мозга считаются второй по частоте после БА причиной деменции у лиц пожилого и старческого возраста (Wimo et al., 2013). Учитывая большую распространенность заболеваний центральной нервной системы, сопровождаемых когнитивным дефицитом, содержание больных и симптоматические методы их лечения требуют значительных затрат (Зырянов, Белоусов, 2011). Общемировые затраты на лечение деменции составляют 1% от общемирового ВВП (World Alzheimer Report, 2010).
Методы фармакотерапии деменции ограничены применением пероральных форм ингибиторов ацетилхолинэстеразы (донепезил, ривастигмин, галантамин) и антагониста NMDA-рецепторов - мемантина (Васенина и др., 2013). Данные препараты воздействуют на отдельные звенья патогенеза деменции: снижение холинергической и усиление глутаматергической передачи в синапсах. В связи с этим, их применение позволяет лишь приостановить развитие психоневрологических симптомов нейроде-генеративной патологии на ранних этапах болезни, но на развитие заболевания, в целом, они не влияют (Noetzli, Еар, 2013).
В связи с необходимостью поиска новых препаратов для лечения и профилактики деменции, исследования, позволяющие детально изучить механизмы развития когнитивных расстройств и определить перспективные терапевтические мишени, чрезвычайно актуальны. Процесс нейровоспаления, сопровождающий основную долю заболеваний ЦНС и признанный ключевым компонентом развития когнитивных нарушений, представляет собой перспективную мишень терапевтического воздействия при лечении данных патологий (Салмина и др., 2015).
Длинноцепочечные ю-З полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в нормальном функционировании ЦНС (Schuchardt et al, 2010). Существуют данные о том, что потребление ю-З ПНЖК, в частности докозагексаеновой (ДГК) и эйкозапентаеновой (ЭПК), снижает риск развития деменций (Devore et al., 2009, Okubo et al., 2012) и способствует улучшению когнитивных функций (Swanson, 2012). В то же время, снижение содержания ю-З ПНЖК в головном мозге, сопровождающее процессы старения, часто связано с когнитивным дефицитом и развитием нейродегенеративных заболеваний (Salem, Eggersdorfer, 2015). В связи с тем, что ю-З ПНЖК и их метаболиты обладают противовоспалительными свойствами, их рассматривают в качестве потенциальных средств профилактики и лечения неврологических заболеваний, сопровождающихся реакцией нейровоспаления (Farooqui, 2012). Несмотря на активное исследование фармакологических свойств ю-З ПНЖК, механизмы их положительного влияния на когнитивные функции при патологиях, ассоциированных с нейровоспалением, малоизучены. Установление механизмов влияния ю-З ПНЖК на функции высшей нервной деятельности является важным этапом поиска фармакологических средств для коррекции когнитивных нарушений, сопровождающих заболевания ЦНС.
Целью работы является оценка роли ю-З полиненасыщенных жирных кислот в сохранении кислотно-основного равновесия нервной ткани при нейровоспалении.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить изменения рН нервной ткани на моделях острого, подострого и хронического нейровоспаления;
-
Исследовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на когнитивные функции и неврологический статус экспериментальных животных при нейровоспалении;
-
Охарактеризовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на экспрессию провоспалительных маркеров и морфологические характеристики микро-глии и астроглии в гиппокампе экспериментальных животных с нейровоспалением;
-
Исследовать влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на накопление Р-амилоида в гиппокампе животных с экспериментальным нейровоспалением;
-
Установить влияние докозагексаеновой и эйкозапентаеновой кислот на внутри-и внеклеточный уровень рН гиппокампа при нейровоспалении.
Научная новизна. Экспериментально установлено снижение уровня рН в пирамидальных нейронах гиппокампа и внеклеточной среде при in vivo-индуцированном остром, подостром и хроническом нейровоспалении и при in vitro-
индуцированном нейровоспалении. Показано, что снижение уровня рН сопровождается нарушением когнитивных функций при нейровоспалении. Установлено, что ю-З ПНЖК при пероральном введении способствуют сохранению нормальных значений рН нейронов и интерстициальной жидкости гиппокампа у животных с экспериментальным нейровоспалением. Результаты работы свидетельствуют о протективном влиянии ю-З ПНЖК в отношении когнитивных функций через стабилизацию уровня рН нервной ткани.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данное исследование расширяет представление о фундаментальных механизмах развития процесса нейро-воспаления. Полученные данные позволяют рассматривать изменения уровня рН головного мозга в качестве основного механизма когнитивных нарушений, сопровождающих неврологические заболевания, ассоциированные с нейровоспалением. В процессе исследования получены новые данные о механизмах влияния ю-З полиненасыщенных жирных кислот на течение процесса нейровоспаления. Выявлены новые механизмы влияния ю-З ПНЖК на память, неврологический статус и локомоторную активность животных с экспериментальным нейровоспалением. Работа позволяет экспериментально обосновать возможность использования ю-З ПНЖК для создания средств профилактики и терапии когнитивных расстройств при неврологических заболеваниях. Полученные экспериментальные данные являются основой для более глубоких доклинических исследований и клинических испытаний ю-З ПНЖК, обладающих нейропротективной активностью.
Разработан оригинальный метод калибровки показаний рН-чувствительного красителя BCECF-am, представляющий собой комбинацию микроэлектродного и ни-герицинового методов.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Острое и подострое нейровоспаление сопровождается снижением внутриклеточного уровня рН нервной ткани, что приводит к изменению функционирования белковых молекул клеток головного мозга, и, как следствие, к нарушению когнитивных функций;
-
Докозагексаеновая и эйкозапентаеновая кислоты при пероральном введении способствуют стабилизации внутри- и внеклеточного уровня рН в гиппокампаль-ном отделе головного мозга при нейровоспалении, что препятствует снижению когнитивных функций.
Степень достоверности. Все научные положения и выводы диссертации аргументированы, обоснованы и достоверны. Фактические материалы, представленные в
диссертации, полностью соответствуют первичной документации - протоколам исследований. Достоверность полученных результатов и выводов основывается на достаточном объеме выборки, использовании современных методов исследования, корректном анализе полученных данных, адекватной статистической обработке.
Апробация работы. Материалы работы доложены на Международной конференции «Neuroscience 2013» (США, Калифорния, Сан-Диего, 9-13 ноября, 2013 г.), XXII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2015 г.), X Тихоокеанском медицинском конгрессе с международным участием «Человек и лекарство» (Владивосток, 19-20 сентября 2013 г.), X Международной (XIX Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 19 марта 2015 г.), III Научно-практической конференции молодых ученых и студентов Школы биомедицины ДВФУ (Владивосток, 24 апреля 2015 г.), ежегодных научных конференциях ИБМ ДВО РАН (Владивосток, 2013 г., 2014 г. и 2015 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК, и 1 - в международном издании, реферируемом базой Web of Science. Остальные работы представлены в форме тезисов на научно-практических конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», двух глав, отражающих результаты собственных исследований, главы «Обсуждение», заключения и выводов. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 262 источника.
Роль автора в работе. Вся теоретическая и экспериментальная работа выполнена непосредственно диссертантом.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской федерации (проект № 14-50-00034 и проект № 14-575-21-0038) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в рамках программы «УМНИК».
Метаболизм длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот у млекопитающих
Источником основной части свободных жирных кислот в плазме крови являются триглицериды жировой ткани. Жирные кислоты высвобождаются при липолизе и транспортируются, образуя комплекс с альбумином (Mitchell et al, 2011). Несмотря на то, что концентрация свободных жирных в плазме мала и составляет 0,25-0,5 ммоль/л (Welch et al., 2006), они являются основным источником жирных кислот для тканей. Исследования на моделях экспериментальных животных показывают, что жирные кислоты, в том числе АК и ДГК, достаточно быстро проникают в головной мозг после введения в плазму в неэтерифицированной форме (Rapoport et al, 2001). Кроме того, эндотелиоциты капилляров головного мозга, астроциты и нейроны быстро захватывают ПНЖК при внесении их в культуральную среду в форме свободных кислот (Kaduce et al., 2008). Эти данные позволяют предположить, что свободные жирные кислоты, содержащиеся в плазме, являются основным источником ПНЖК для мозга.
Открытие липидных рецепторов CD36 и GPR120 на вкусовых рецепторных клетках доказывает наличие вкусового восприятия пищевых липидов (Degrace-Passilly, Besnard, 2012). Вкусовые сигналы, поступающие от ротовой полости, модулируют дальнейшие процессы преобразования липидов (Mattes et al., 2005).
Переваривание липидов катализируется язычной и желудочной липазой (Armand, 2007). Длинноцепочечные свободные жирные кислоты, высвобождаемые желудочной липазой, стимулируют секрецию холецистокинина, который, в свою очередь, стимулирует секрецию панкреатической липазы (Little et al., 2007). Гидролиз триглицеридов в моноацилглицерол и свободные жирные кислоты осуществляется преимущественно панкреатической липазой (Bauer et al., 2005), которая расщепляет триглицериды в sn-І и sn-З позициях. В двенадцатиперстной кишке эмульгирование пищевых жиров увеличивает площадь поверхности гидрофобных липидных капель для пищеварительных ферментов (Bauer et al., 2005). Процесс эмульгирования происходит за счет механического перемешивания с помощью перистальтики в присутствии солей желчных кислот, амфипатических производных холестерина. Несмотря на то, что всасывание липидов происходит эффективнее в присутствии желчи, для менее гидрофобных ПНЖК присутствие желчи не является обязательным, в отличие от их насыщенных аналогов (Black, 2007). Всасывание свободных жирных кислот и 2-моноацилглицерола, первичных продуктов окисления липидов, в тонком кишечнике способствует образованию амфипатических смешанных мицелл, которые переносят гидрофобную часть через щеточную каемку мембран энтероцитов путем простой диффузии (Ramirez et al, 2001). Для ПНЖК с малой и средней длиной цепи включение в смешанные мицеллы для всасывания не требуется. Структура триглицеридов также может влиять на кишечную абсорбцию: жирные кислоты, находящиеся в sn-положении, существенно повышают всасывание (Chen et al., 2001).
Среди механизмов, посредством которых ПНЖК проходят через апикальную мембрану энтероцитов, присутствует как облегченная, так и пассивная диффузия (Masson et al., 2010). Поглощение ПНЖК облегченной диффузией осуществляется за счет транслоказы жирных кислот (FAT) CD36, белков-переносчиков жирных кислот (FATP) (Jia et al., 2007), и мембраносвязанных белков, связывающих жирные кислоты (FABP, БСЖК) (Masson et al., 2010).
Оказавшись внутри энтероцитов, цитозольные FABP (FABPc) облегчают транспортировку жирных кислот к гладкой эндоплазматической сети, где вновь синтезируются сложные липиды (Storch, Corsico, 2008). Ацил-КоА-синтазы преобразуют жирные кислоты в активированные производные ацил-КоА, которые соединяются с 2-моноацилглицеролами в триацилглицеролы с помощью ферментов ацил-КоА-моноацилглицеролацилтрансферазы и ацил-КоА-1,2 диацилглицеролацилтрансферазы в пределах ферментного комплекса триацилглицерол синтазы. Гидрофобные триглицериды, повторно образуя хиломикроны, транспортируются к остальным частям тела через лимфатическую систему (Banks et al., 2008).
Липиды транспортируются в плазме в составе липопротеинов, состоящих из нейтрального липидного ядра (триглицеридов и эфиров холестерина), окруженного оболочкой из амфипатических аполипопротеинов, фосфолипидов и неэтерифицированного (свободного) холестерина (Putnam, 2012, Ehehalt et al., 2006). В нормальной человеческой сыворотке об ПНЖК составляют 60% сложных эфиров холестерина, 22% триацилглицеринов и 38% фосфолипидов (Spector, 2001). Содержание линолевой кислоты в фосфолипидах ЛПОНП, ЛИНИ, ЛПВП варьирует от 21 до 25%, в то время как содержание арахидоновой кислоты намного ниже - от 4,8% в ЛПОНП до 9,6 % в ЛПВП фракциях (Moloney et al, 2004). Напротив, со-3 ПНЖК составляют 1,7% сложных эфиров холестерина, 1,8% триацилглицеринов и 3,5% фосфолипидов, где содержание ДГК превосходит содержание других ю-3 ПНЖК и составляет 2,2% (Putnam, 2012).
Хиломикроны представляют собой наиболее крупные липопротеины с наиболее высокой плотностью и высоким содержанием липидов, из которых 90% приходится на триацилглицерины (Phillips et al., 2001). Поскольку хиломикроны циркулируют, большая часть триацилглицеринов в их составе гидролизуется липопротеинлипазами, при этом частицы уменьшаются в размерах и увеличивается их плотность. Впоследствии они подвергаются эндоцитозу в печени и расщеплению в лизосомах печеночной липазой. Свободные жирные кислоты, полученные при деградации триглицеридов, могут поступать в мышечные клетки или адипоциты, подвергаться Р-окислению с выделением энергии или транспортироваться в крови в виде комплекса с альбумином с последующим захватом клетками (Nayak, 2011). Хиломикроны и неэтерифицированные циркулирующие альфа-линоленовая и линолевая кислоты поступают в гепатоциты из кровяного русла, где выступают в качестве предшественников для синтеза более длинноцепочечных ПНЖК (DeMar et al., 2005, Igarashi et al, 2007a, Igarashi et al, 2008, Rapoport et al, 2010). Секреция печенью ЛПОНП, богатых триглицеридами, зависит от синтеза, активации и этерификации в фосфолипиды, триацилглицерины или сложные эфиры холестерина промежуточных соединений ацил-КоА и ПНЖК. Кроме того, свободные жирные кислоты могут повторно этерифицироваться в триглицериды и храниться в адипоцитах и гепатоцитах. Этот процесс, однако, может привести к развитию патологической гипертриглицеридемии. Таким образом, липидный баланс в печени определяет концентрации триацилглицеридов и липопротеинов в составе плазмы крови и головного мозга (Caspi et al., 2007).
Оценка неврологического статуса экспериментальных животных
Измерение концентрации малонового диальдегида (МДА) в гиппокампе и коре головного мозга проводилось согласно методике Wasowicz et al. (1993). Метод основан на реакции МДА с тиобарбируровой кислотой (ТБК) при температуре 95С. После проведения поведенческих экспериментов, когорту из 40 животных использовали для определения жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга и концентрации малонового диальдегида в тканях мозга. Животных выводили из эксперимента методом декапитации с предварительным внутрибрюшинным введением тиопентала натрия (3%, 60 мг/кг). Извлечение головного мозга и выделение гиппокампального отдела и коры производилось быстро при температуре 4С. После выделения производили заморозку материала в жидком азоте, далее образцы хранились при температуре -70С. Для анализа было взято по 10 образцов гиппокампа из каждой группы животных (всего 40 образцов). Предварительно проводилось определение общего содержания белка в образцах методом реакции с бицинхониновой кислотой. Подготовка образцов для анализа включала следующие этапы:
К 20 мл гомогенизирующего буфера добавляли 200 мкл ингибитора фосфатаз (Р0044, Sigma) и 2 таблетки ингибитора протеаз (cOmplete, Roche), тщательно перемешивали.
Анализируемые фрагменты ткани переносили в пробирки, взвешивали и добавляли к ним гомогенизирующий буфер в концентрации 5 мл/г. 3. Гомогенизацию проводили в 2 этапа: вручную при помощи пробирок-гомогенизаторов и методом ультразвуковой гомогенизации, используя ультразвуковой соникатор Sonicator Q125 (Qsonica).
Полученные гомогенаты центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость, которую впоследствии использовали для определения содержания белка и концентрации МДА.
Для определения общего содержания белка использовали набор Pierce ВСА Protein Assay Kit. Экспериментальные процедуры и расчет концентрации белка производили в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией. Для измерения оптической плотности полученных разведений использовали планшетный спектрофотометр BioMark xMark (BioRad). Согласно рассчитанным концентрациям, все образцы были приведены к концентрации белка 1 мг/мл. 0,5 мл гомогената переносили в центрифужную пробирку на 10 мл, приливая туда 3 мл 1% фосфорной кислоты и 1 мл 0,6% раствора тиобарбируровой кислоты. Смесь помещали в кипящую водяную баню на 45 минут. Пробы охлаждали, добавляли 4 мл бутанола и встряхивали в течение 1 мин до образования суспензии. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре UV-3600 (Shimadzu) при длине волны 532 нм. В качестве контроля служила пробирка, в которую добавляли аналогичные растворы, но вместо гомогената добавляли дистиллированную воду. Для расчета содержания МДА использовали молярный коэффициент экстинкции комплекса МДА-ТБК (Memsogullari et al, 2003). Концентрацию МДА рассчитывали по формуле:
Где, Смда - концентрация малонового альдегида, нмоль/1 мг белка Di - оптическая плотность образца; D2 - оптическая плотность контрольного раствора; Vi - объем гомогената взятого для определения, мл; V2 - конечный объем смеси, мл; 1 - длина кюветы, см; є - коэффициент экстинкции 156 мМ -см"1.
Определение жирнокислотного состава фосфолипидов головного мозга Сразу после проведения поведенческих тестов мышей выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения тиопентала натрия (3%, 60 мг/кг) с последующей декапитацией и быстрым извлечением головного мозга. Извлеченный мозг помещали на лед, быстро выделяя гиппокамп и кору больших полушарий, которые затем замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70С.
Экстракцию липидов из ткани производили по методу Folch et al. (1957). Полученные образцы гомогенизировали с помощью ступки и пестика в течение 1 минуты, добавляя метанол в соотношении 10 мл/1 г ткани. Затем приливали хлороформ в соотношении 20 мл/1 г ткани и гомогенизировали еще в течение 2 минут. Полученный гомогенат фильтровали, а с оставшейся после фильтрации тканью проделывали повторную процедуру экстракции. Полученные экстракты переносили в мерный цилиндр, приливая 0,9% раствор NaCl, в объеме, равном 1А объема полученного экстракта, перенося в центрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали 5 минут при 2000RPM. Верхнюю фазу отбирали при помощи пипетки, дважды промывая небольшими объемами хлороформа, который затем добавляли к нижней фазе. Нижнюю фазу переносили в кругло донную колбу и выпаривали с помощью вакуумного испарителя. Полученный липидный осадок растворяли в 5 мл хлороформа и хранили при температуре минус 20С. Следующим этапом стало получение метиловых эфиров липидов для последующего отделения фракции фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии. Полученные хлороформные извлечения упаривали с помощью вакуумного испарителя. К образцам добавляли 1 мл бензола, количественно перенося их в пробирки. В пробирки приливали по 50 мкл 0,7 М раствора NaOH в 70% метаноле и выдерживали на водяной бане 30 минут при 50С. Смесь нейтрализовали внесением 250 мкл раствора НСІк в метаноле. Полученную смесь упаривали и приливали к осадку 1 мл гексана. Раствор наносили на пластинку силикагеля G60 plates (Merck) 10x10 см для анализа методом тонкослойной хроматографии. Визуализацию хроматограммы производили путем опрыскивания тонкой полоски пластинки 50% серной кислотой и последующего нагревания до 135С. Фракцию метиловых эфиров жирных кислот удаляли с пластинки, экстрагируя хлороформом, и анализировали методом газовой хроматографии (ГХ). Для анализа использовали газовый хроматограф Shimadzu GC-17А (Shimadzu, Япония) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Supelcowax 10, 30м х 0,25 мм (Sigma, США). При анализе температура колонки составляла 190С, температура инжектора и детектора составляла 240С. В качестве газа-носителя использовали гелий. Пики метиловых эфиров жирных кислот идентифицировали по времени удерживания путем сравнения их со временем удерживания стандартов (47015-U SUPELCO, Sigma, США).
Внутриклеточный уровень рН гиппокампа при остром нейровоспалении
На данном этапе работы проводилось определении изменений рН нервной ткани при хроническом нейровоспалении на модели мышиной линии Ts65Dn. Мышиная линия Ts65Dn представляет собой генетическую модель синдрома Дауна. Кариотип мышей данной линии несет хромосому, содержащую дистальный сегмент мышиной хромосомы 16 и проксимальный конец 17 хромосомы. Наличие лишней хромосомы создает тройную копию практически всех генов 16 мышиной хромосомы и формирует фенотипические признаки синдрома Дауна. Для данной модели характерны нарушения когнитивных функций (Lysenko et al., 2014) и наличие хронического нейровоспаления (Lockrow et al, 2012).
Эксперимент проводился на 10 мышах мужского пола линии Ts65Dn в возрасте 12 - 14 месяцев. В качестве контроля использовались однопометные мыши с нормальным набором хромосом (2N). Производилось однократное внутрибрюшинное введение ЛПС (5 мг/кг) или 0,9% раствора NaCl в объеме 200 мкл. Через 3 часа после инъекции животных подвергали поведенческим тестам: определяли локомоторную активность и рабочую память в Y-лабиринте. Поведенческие эксперименты проводились с целью подтверждения наличия нейровоспаления. Сразу после поведенческих экспериментов животных выводили из эксперимента методом декапитации под изофлурановым наркозом, производили извлечение гиппокампа и изготовление переживающих срезов. Далее производилось измерение внеклеточного рН срезов микроэлектродным методом.
По результатам тестирования рабочей памяти животных в Y-лабиринте, коэффициент спонтанных альтернаций у мышей линии Ts65Dn оказался на 7% ниже, чем у животных с нормальным кариотипом (р = 0,03). Введение ЛПС не оказывало статистически значимого влияния на коэффициент спонтанных альтернаций как у диплоидных мышей, так и у мышей с трисомией. Полученные данные подтверждают наличие нарушений рабочей памяти у мышей линии Ts65Dn при их сравнении с 2N животными (Рисунок 21).
Локомоторная активность до введения ЛПС у мышей линии Ts65Dn была на 31% выше, чем у 2N-Mbiinefi (р 0,0001). После индукции нейровоспаления количество входов в рукава лабиринта у диплоидных мышей снизилось на 33% (р = 0,01), у трисомических - на 60% (р 0,0001). Локомоторная активность у мышей Ts65Dn до введения ЛПС была повышена, а после введения ЛПС снизилась до уровня группы «2N ЛПС».
Измерение внеклеточного рН в СА1 области гиппокампа показало, что у трисомических мышей рНо, в среднем, на 0,15 рН-единицы ниже, чем у диплоидных животных. При введении ЛПС рНо снизился, в среднем, на 0,11 как у 2N, так и у Ts65Dn мышей. В итоге, после введения ЛПС уровень рН у трисомических мышей был на 0,15 рН-единицы ниже, чем у мышей с нормальным кариотипом.
В данном эксперименте мы показали, что у животных с хроническим нейровоспалением и нарушенными когнитивными функциями, интерстициальный уровень рН гиппокампальной области головного мозга снижен. Дополнительная стимуляция иммунной системы бактериальными липополисахаридами приводит к еще более выраженному сдвигу уровня рН в кислую сторону.
Несмотря на наличие исследований, доказывающих положительное влияние ю-3 ПНЖК на когнитивные функции (Rest et al, 2007; Jiao et al, 2014), данных, детально раскрывающих механизмы их влияния на функции памяти и способность к обучению, до сих пор не получены. Мы предположили, что одним из возможных механизмов влияния ю-3 ПНЖК на когнитивные функции при нейровоспалении является стабилизация уровня рН в клетках и внеклеточной среде. Наше предположение основано на установленных фармакологических свойствах ю-3 ПНЖК. Известно, что ю-3 жирные кислоты способны ускорять синтез эндогенных антиоксидантных ферментов, тем самым снижая интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), повышение которой приводит к снижению уровня рН (Lee et al., 2013). Другим возможным механизмом влияния ю-3 ПНЖК на уровень рН при нейровоспалении является их способность снижать активацию микроглии, которая, как известно, в активированном состоянии является источником избытка ионов Н+ (Magistretti, Allaman, 2013).
Для проверки вышеизложенной гипотезы нами осуществлялось измерение внутри- и внеклеточного уровня рН гиппокампа мышей после введения смеси ю-3 ПНЖК в течение 48 дней и последующей индукции нейровоспаления. Помимо измерения рН, как и в предыдущих этапах работы, нами проводилось определение поведенческих и морфологических изменений, вызванных введением препарата ПНЖК и индукцией нейровоспаления. В качестве модели нейровоспаления для изучения влияния ПНЖК нами была выбрана модель подострого ЛПС-индуцированного нейровоспаления, рассмотренная в предыдущей главе. Выбор данной модели был основан на наличии статистически достоверных изменений рабочей памяти, при их отсутствии во второй рассмотренной выше модели - остром нейровоспалении. Кроме того, для выбранной нами модели подострого нейровоспаления характерно более выраженное увеличение количества астроцитов и снижение внутриклеточного уровня рН в гиппокампе, что позволяет более достоверно отследить влияние ПНЖК на эти параметры. Немаловажным критерием выбора модели стало менее выраженное снижение локомоторной активности по сравнению с моделью острого нейровоспаления. Выраженное снижение локомоторной активности происходит вследствие периферического воспаления и затрудняет исследования памяти и поведения лабораторных животных.
Эксперимент проводился на 120 мышах мужского пола линии CD1. Препарат на основе ДГК (38%) и ЭПК (46%) в виде эмульсии с молоком вводили внутрижелудочно половине животных в дозировке 300 мг/кг/день (114 мг/кг ДГК и 138 мг/кг ЭПК) в течение 48 дней. Контрольная группа получала молоко в таком же объеме (200 мкл). В течение последней недели введения смеси ПНЖК животным внутрибрюшинно вводили раствор ЛПС в дозировке 200 мкг/кг/день. Контрольная группа получала 0,9% раствор NaCl. Введение ПНЖК, так же, как и инъекции ЛПС производили раз в день между 9 и 11 утра. Таким образом, в данном эксперименте присутствовало 4 группы мышей:
Влияние полиненасыщенных жирных кислот на поведенческие характеристики мышей при нейровоспалении
Известно, что тщательное регулирование рН как во внеклеточной среде, так и в нейронах и глиальных клетках, является важнейшим параметром нормального функционирования центральной нервной системы (Chesler, 2003). Наравне с такими параметрами как температура и осмолярность, рН оказывает влияние на конформацию белковых молекул и, тем самым, на функциональную активность ферментов рецепторов и ионных каналов (Chesler, 2003). Существуют данные о влиянии уровня рН на ГАМК-ергическую передачу, в частности, W. Mozrzymas с коллегами (2004) показал, что в гиппокампальных нейронах крысы при высокой концентрации протонов ГАМК-ергическая передача усиливалась (Mozrzymas, 2004). При регистрации токов в режиме «whole-cell» было обнаружено, что аппликация эндогенной ГАМК на культивируемые нейроны мозжечка при низких значениях рН приводила к усилению токов, при высоких - к ослаблению (Robello, Balduzzi, 2000). Кроме того, при снижении рН наблюдается уменьшение чувствительности ГАМКа-рецепторов, что ведет увеличению выработки ГАМК (Mozrzymas, 2004). В экспериментах in vivo показано, что протоны, выделяемые NHE, преодолевают буферную емкость синаптического пространства, и возникающая в результате ацидификация изменяет скорость и амплитуду ГАМК-ергических ингибиторных постсинаптических токов, тем самым удваивая импульс при каждом событии (Dietrich, Morad, 2010).
Изменение рН отражаются и на глутаматергической передаче. Снижение рН существенно тормозит работу NMDA-зависимых ионных каналов (Dravid et al., 2007). Повышение внеклеточной концентрации протонов снижает активность нейрональных NMDA-рецепторов (Banke et al, 2005). рН-зависимая модуляция NMDA-зависимых токов осуществляется, в основном, за счет изменения количества открытых каналов и, в меньшей степень, за счет изменения проводимости отдельных каналов. Помимо этого, внеклеточные протоны ингибируют каинатные (КА) и АМРА рецепторы (Du et al., 2014). Beppu К. предположил, что изменение рН глии является важнейшим регулятором высвобождения глутамата в мозжечке при ишемии (Beppu et al., 2014). Поскольку состояние ГАМК- и NMDA рецепторов играет существенную роль в реализации синаптической пластичности, когнитивные функции в высокой степени зависят от изменения ГАМК- и глутаматергической передачи (Paoletti et al., 2013, Kleschevnikov et al., 2012). В данном исследовании мы сопоставили снижение рН нервной ткани и нарушение когнитивных функций, наблюдаемое при нейровоспалении. Введение ЛПС способствовало как ацидификации нейронов и внеклеточной среды, так и нарушению долговременной и рабочей памяти экспериментальных животных. При этом, предварительное введение ю-З ПНЖК наряду со стабилизацией рН способствовало нормализации памяти животных и их неврологического статуса, являющегося индикатором нормального функционирования ЦНС, в целом.
Полученные данные позволяют объяснить поведенческие изменения, наблюдаемые при нейровоспалении и обосновать эффекты, наблюдаемые при введении ю-З ПНЖК. Мы обнаружили, что введение ДГК (114 мг/кг) и ЭПК (138 мг/кг) в течение 7 недель способствовало повышению содержания ДГК в фосфолипидах клеточных мембран гиппокампа в 2 раза, в фосфолипидах коры - на 13%. Важнейшим показателем, определяющем степень накопления ю-З или ю-6 ПНЖК в головном мозге является отношение концентрации ДГК к концентрации АК. Исследователями доказана положительная корреляция между величиной соотношения ДГК/АК и когнитивными функциями, а также отрицательная корреляция между данным соотношением и образованием продуктов апоптоза при введении Ар (Hashimoto et al., 2005). По результатам наших экспериментов, соотношение ДГК/АК в коре больших полушарий у контрольной группы составило 2,03, в группе, получавшей ПНЖК, 2,29, в гиппокампе: 1.25 и 1.63, соответственно.
Увеличение соотношения ДГК/АК свидетельствует о частичном замещении арахидоновои кислоты докозагексаеновой кислотой в фосфолипидах головного мозга. При этом, ДГК и ЭПК служат в качестве субстратов для ферментов циклооксигеназ и липооксигеназ, снижая интенсивность окисления арахидоновои кислоты и образования провоспалительных медиаторов - простагландинов и тромбоксанов (Wall et al. 2010). В то же время, повышается интенсивность образования противовоспалительных медиаторов, окисленных производных ДГК и ЭПК, протектинов и резольвинов. Окисленные производные ДГК способны снижать экспрессию CD 14 и TLR4 на поверхности клеток, подавляя, тем самым, иммунный ответ. Согласно литературным данным, исследования in vitro подтверждают, что ю-3 ПНЖК и их производные обладают противовоспалительным действием на ЦНС, вовлекая рецепторы TLR4 и PPAR, а также фактор NFKB (Zhao et al. 2011, Kawashima etal.,2008).
Еще один возможный механизм действия ю-3 ПНЖК на когнитивные способности заключается в их влиянии на накопление пептида бета-амилоида (АР). Согласно литературным данным, при снижении рН повышается активность у-секретазы - ключевого фермента синтеза Ар из белка-предшественника (АРР). у-секретаза является протеазным комплексом, состоящим из 4 белковых субъединиц: пресинилина, никастрина, Aph-І и Реп-2. Пресинилин, являясь каталитической протеазой, проявляет максимальную активность при низких значениях рН (Campbell et al., 2003). При этом, у-секретаза наиболее интенсивно продуцирует Ар40 и Ар42 при значениях рН, близких к 6,8 (Mclendon et al, 2000). Таким образом, смещение рН в кислую сторону подобное тому, что мы наблюдаем в нашем исследовании при введении ЛПС может являться причиной накопления Ар и, как следствие, нарушения когнитивных функций. В нашем исследовании максимальное снижение рН во внутриклеточном пространстве наблюдается при подостром нейровоспалении и достигает значения 6,9, при этом, количество Ар42-позитивных элементов в гиппокампе мышей увеличилось в 2 раза. Введение ДГК и ЭПК позволило не только предотвратить ЛПС-индуцированное накопление Ар, но и снизить базовый уровень данного маркера в гиппокампе мышей в 2,3 раза. Полученные нами данные об уменьшении накопления нейротоксического пептида соотносятся с данными о стабилизации рН, объясняя положительное действие вводимых ю-З ПНЖК на когнитивные функции.
Полученные данные позволяют объяснить наблюдаемое положительное влияние ДГК и ЭПК на поведенческие и когнитивные показатели. Уровень рН - критический параметр функционирования головного мозга. Протоны, являясь чрезвычайно маленькими молекулами, участвуют в регуляции множества физиологических функций. В нервной системе они модулируют процессы синаптической передачи (Dietrich, Morad, 2010) и нейрональной возбудимости (Wang, Xu, 2011), влияя на активность протон-чувствительных ионных каналов, рН-чувствительных потенциалзависимых Са2+-каналов (Carlin, 2005) и лиганд-зависимых NMDA- и ГАМК-рецепторов (Robello, Balduzzi, 2001, Dravid et al, 2007). ю-З ПНЖК, являясь соединениями с высокой противовоспалительной и антиоксидантной активностью, способны эффективно стабилизировать ионный гомеостаз клетки, сохраняя физиологичные значения рН при нейровоспалении и нормализуя когнитивные функции.