Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Достижения и перспективы фармакотерапии нарушений липидного обмена и атеросклероза (обзор литературы) 14
1.1. Гиполипидемические средства 14
1.2. Экспериментальные модели атеросклероза и дислипидемий 17
1.3. Гиполипидемические свойства средств растительного происхождения 23
1.4. Перспективы использования сесквитерпеновых лактонов как гиполипидемических препаратов 26
Глава 2. Материал и методы исследования 30
2.1. Характеристика объектов исследования 30
2.2. Модели, методы исследования и экспериментальные животные 35
2.3. Скрининг гиполипидемической активности (1-й этап исследования) 38
2.3.1. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом 38
2.3.2. Модель острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 40
2.3.3. Экспериментальная модель гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры 42
2.3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией 45
2.3.5. Оценка экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена на клеточной культуре крысинной гепатомы 49
2.3.5.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизма липидов 51
2.3.5.2. Синтез комплементарной ДНК 56
2.3.5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 56
2.4. Исследование механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования) 59
2.4.1. Оценка экспрессии мРНК генов метаболизва липидов в печени крыс 59
2.4.2. Изучение активности ГМГ-КоА-редуктазы и экскреци холестерола 62
2.5. Статистическая обработка данных 64
Глава 3. Скрининг гиполипидемической активности (1-й этап исследования) 66
3.1. Исследование эффектов лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом 66
3.2. Гиполипидемическое действие лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной детергентом WR 1339 79
3.3. Действие сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной диетой, содержащей холестерол и жиры 91
3.4. Изучение гиполипидемического действия на клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) in vitro при экспериментальной модели гиперлипидемии, индуцированной жировой эмульсией 105
3.4.1. Жизнеспособность клеточной культуры гепатомы крыс под воздействием сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила 105
3.4.2. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс 108
3.4.3. Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс на экспериментальной модели гиперлипидемии 114
3.5. Оценка экспрессии геновключевых ферментов липидного обмена в клеточной культуре гепатомы под влиянием сесквитерпеновых лактонов 121
3.5.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) 121
3.5.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) 123
3.5.3. Ген ацил КоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1) 125
3.5.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) 126
3.5.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2) 128
3.5.6. Ген ацетил-КоА карбоксилазы (Acaca) 131
Глава 4. Исследование механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования) 143
4.1. Влияние сесквитерпеновых лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена в печени крыс на модели гиперлипидемии у экспериментальных животных, вызванной атерогенной диетой 143
4.1.1. Ген рецепторов к липопротеинам низкой плотности (Ldlr) 143
4.1.2. Ген 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr) 144
4.1.3. Ген ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) 146
4.1.4. Ген холестерол 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) 148
4.1.5. Гены карнитин-пальмитоилтрансферазы 1и 2 (Cpt1a и Cpt2) 150
4.2. Экскреция холестерола через желудочно-кишечный тракт под влиянием леукомизина 153
4.3. Влияние леукомизина на активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени 155
Заключение 168
Список сокращений и условных обозначений 173
Список литературы 175
- Экспериментальные модели атеросклероза и дислипидемий
- Исследование эффектов лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом
- Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс на экспериментальной модели гиперлипидемии
- Влияние леукомизина на активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В течение последних лет в мире достигнут значительный прогресс в лечении и профилактике сердечнососудистых заболеваний. Несмотря на это, атеросклероз и его осложнения сохраняют лидирующие позиции по смертности, социальному и экономическому ущербу в России и во всех индустриально развитых странах мира [Гуров А. Н., 2015]. По данным Всемирной организации здравоохранения, сердечно-сосудистые заболевания, ассоциированные с атеросклерозом, продолжают оставаться наиболее частой причиной смертности населения в экономически развитых странах и глобальной социально-значимой проблемой.
В России заболеваемость системы кровообращения достигает 18%, а смертность от сосудистых поражений мозга и сердца составляет около 50% от общей смертности. Основными факторами высокого риска развития атеросклероза являются дислипидемии и повышенный уровень холестерола липопротеидов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) в крови. Эпидемиологические исследования показали прямую корреляцию между нарушениями липидного обмена и риском развития сердечно-сосудистых осложнений [Ваулин Н. А., 2004].
Степень разработанности. В связи с высокой медико-социальной значимостью проблема профилактики и терапии атеросклероза вызывает пристальное внимание медиков, биологов и клиницистов во всем мире. Наиболее эффективным фармакологическим подходом к решению проблемы профилактики и лечения атеросклероза является использование лекарственных средств, способных снижать уровень холестерола и общих липидов и нормализовать спектр липидов крови.
Получены убедительные статистические свидетельства существенного снижения риска развития таких осложнений атеросклероза, как ишемический инсульт, инфаркт миокарда и коронарная смерть при гиполипидемической терапии. В основном это стало возможным благодаря внедрению в медицинскую практику нового класса гиполипидемических препаратов, которые по механизму действия являются ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы) [Swirzer J. A., 2006].
Несмотря на широкий арсенал лекарственных средств, используемых для терапии атеросклероза и его проявлений, проблема терапии еще полностью не решена. Не до конца изученными остаются молекулярные механизмы, затрагивающие метаболические и клеточные процессы, лежащие в основе развития патологических явлений. Актуальным является поиск молекулярных мишеней действия биологически активных веществ, включающий оценку активности и экспрессии ключевых ферментов метаболизма липидов.
Ограничивающим фактором поиска гиполипидемических средств является сложность моделирования атеросклероза. На сегодняшний день нет адекватной модели in vivo и (или) in vitro, которая могла бы воспроизвести все стадии атеросклероза [Wang X., 1994]. Генетические дефекты ключевых ферментов липидного обмена, рецепторов к липоротеинам (ЛП) и аполипопротеинам, белковых факторов являются важным фактором развития атеросклероза. Создание модели атеросклероза, идентичной организму человека, позволит точнее исследовать патогенетические факторы развития заболевания, а также механизмы лечения и профилактики [Wang X., 1994; Buzello M., 2003; Lian Z., 2011].
К ряду ценных исходных объектов относятся биологически активные вещества растений в связи с их сравнительно низкой токсичностью, хорошей переносимостью и комплексным воздействием на организм. Перспективным классом природных соединений с высокой фармакологической активностью являются сесквитерпеновые -лактоны [Eliza J., 2009; Merfort I., 2011]. В настоящее время известно более 2000 соединений данного ряда. Установлено, что некоторые лактоны ингибируют активность различных ферментов, таких как фарнезилпротеинтрансфераза, циклооксигеназа и др. [Quintero A., 1999]. Сесквитерпеновые лактоны артишока (Cynara scolymus L.) цинаропикрин, агуерин В и гроссгемин обладают антигиперлипидемическим действием [Kwak Y. S., 2010]. В связи с этим большой интерес представляет поиск ингибиторов синтеза холестерола среди соединений указанного класса.
Гиполипидемические свойства характерны для веществ терпеноидного ряда, содержащих, подобно статинам, 3,5-дигидроксигептановую кислоту. Выраженную активность проявляют сесквитерпеновые лактоны [Тулеуова Г. Х., 2007], однако молекулярные механизмы их гиполипидемического эффекта остаются не изученными. Учеными Акционерного общества «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия» (АО МНПХ «Фитохимия», г. Караганда, Казахстан) из растительного сырья выделена группа сесквитерпеновых лактонов: арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин с потенциальной гиполипидемической активностью, возможно, обусловленной ингибированием ГМГ-КоА-редуктазы.
В этой связи перспективным является изучение сесквитерпеновых лактонов как потенциальных средств гиполипидемического и антиатерогенного действия.
Цель исследования: идентификация механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов, выделяемых из растительного сырья, для разработки на их основе средств профилактики и лечения атеросклероза.
Задачи исследования
-
Оценить гиполипидемическую активность сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) на острых экспериментальных моделях in vivo: гиперлипидемии, вызванные этанолом и детергентом WR1339.
-
Изучить гиполипидемическую активность сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной хронической гиперлипидемии, вызванной у крыс атерогенной диетой.
-
Оценить влияние сесквитерпеновых лактонов на жизнеспособность и обмен липидов культуры клеток гепатомы крыс.
-
Изучить влияние лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов в культуре клеток.
-
Установить механизмы нарушения обмена липидов в условиях воздействия липофундина на культуру клеток гепатомы крыс и изучить влияние сесквитерпеновых лактонов на обмен липидов в культуре клеток.
-
Изучить влияние лактонов на экспрессию генов ключевых ферментов обмена липидов в печени крыс при экспериментальной хронической гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой.
-
Исследовать антиатерогенные, гиполипидемические свойства и механизмы действия леукомизина.
Научная новизна. Впервые проведена фармакологическая оценка гиполипидемического действия шести образцов сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) и установлены молекулярные механизмы этого эффекта.
Впервые предложены и апробированы методы скрининга гиполипидемической активности с использованием культуры клеток. Методы отличаются быстротой, этичностью и низкой себестоимостью, в отличие от традиционно используемых методов исследований на животных.
Изучена эффективность сесквитерпеновых лактонов на острых и хронической моделях гиперлипидемии и атеросклероза: индуцированных этанолом, детергентом WR 1339 и атерогенной диетой у экспериментальных животных, а также жировой эмульсией в культуре клеток.
Проведена оценка экспрессии ключевых генов метаболизма липидов под влиянием сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) в культуре клеток и в печени крыс на модели атеросклероза, вызванного атерогенной диетой.
Теоретическая и практическая значимость работы. Согласно современным представлениям, атеросклероз является гетерогенным многофакторным заболеванием. Исследователями накоплено достаточно данных для утверждения того, что профилактика и лечение этого заболевания должны быть направлены на молекулярные механизмы нарушений обмена липидов.
Проведенное иследование позволило установить молекулярные механизмы гиполипидемической активности ряда соединений группы сесквитерпеновых лактонов, потенциально перспективных для создания лекарственных средств.
Исследование проведено с целью поиска новых перспективных источников гиполипидемических лекарственных средств. Работа выполнена при финансовой поддержке АО МНПХ «Фитохимия», г. Караганда, Казахстан) (договоры на выполнение научно-исследовательских работ №216 от 25.10.2012 и №77/99 от 19.05.2015 между АО МНПХ «Фитохимия» и Федеральным государственным бюджетным образовательным учреждением высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия).
Полученные данные носят фундаментальный характер и представляют высокую научную и практическую ценность. Результаты раскрывают механизмы гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов. Работа выполена в рамках реализации стратегии АО МНПХ «Фитохимия» (Казахстан) по созданию новых лекарственных средств растительного происхождения. Материалы настоящей работы могут быть использованы как результаты доклинического исследования эффективности и безопасности новых средств профиактики и лечения атеросклероза, создаваемых на основе изученных сесквитерпеновых лактонов.
Идентифицированные молекулярные механизмы гиполипидемической активности группы сесквитерпеновых лактонов (арглабин, людартин, гроссгемин, ахиллин, гроссмизин и леукомизин) открывают возможности для создания и внедрения новых препаратов с целью профилактики и лечения дислипидемий и атеросклероза и расширения арсенала подобных препаратов.
Полученные результаты и разработанные методы скрининга гиполипидемической активности могут быть рекомендованы для включения в учебные программы дипломной и последипломной подготовки фармакологов и биохимиков.
Результаты и методы настоящей работы используются в лаборатории биологических моделей ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (г. Томск) для выполнения работ по изучению потенциальных гиполипидемических средств растительного и синтетического происхождения.
Методология и методы исследования. Согласно поставленной цели и задачам выбраны методологически оправданные и информативные методы исследования. За методологическую основу взято Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств и дополненно оригинальными методологическими подходами, направленными на углубленное исследование. Работа выполнена на базе научно-исследовательских лабораторий ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Исследование проведено в два этапа: скрининг механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов, последующее расширенное изучение механизмов влияния лактонов на экспрессию генов обемена липидов в печени экспериментальных животных и исследование фармакологических свойств наиболее активного лактона – леукомизина, определенного на первом этапе.
Исследование является частью доклинического изучения эффективности и безопастности вновь создаваемых лекарственных препаратов, поэтому были использованы соответствующие рекомендованые методы, дополненные изучением молекулярных механизмов действия.
Эксперименты выполнены in vivo и in vitro на беспородных крысах-самцах и в культуре клеток гепатомы крыс. Для моделирования патологии обмена липидов и атеросклероза использовали три модели на животных и одну модель на культуре клеток.
Положения, выносимые на защиту:
-
Сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) снижают уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола на острых моделях гиперлипидемии, индуцированных этанолом и тритоном WR 1339. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны в зависимости от структуры оказывают влияние на разные показатели липидного обмена. Леукомизин проявил более высокую активность в сравнении с другими лактонами.
-
Экспериментальная оценка влияния исследуемых объектов на показатели липидного обмена лабораторных животных при хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой, свидетельствует о способности сесквитерпеновых лактонов снижать уровень триацилглицеролов, свободных жирных кислот и холестерола.
-
Исследуемые сесквитерпеновые лактоны, проявляя гиполипидемическую активность, в различной степени влияют на экспрессию ключевых генов обмена липидов в культуре клеток гепатомы крыс и в печени животных на фоне атерогенной диеты.
-
По результатам скрининга гиполипидемической активности лактонов, максимальный эффект проявляет леукомизин, менее выраженный – два химически близких соединения – ахиллин и гроссмизин (гидроксиахиллин). Арглабин, гроссгемин и людартин характеризуются самой низкой активностью и (или) большей токсичностю в экспериментах на культуре клеток.
-
Механизмы гиполипидемического действия леукомизина включают: способность на фоне атерогенной диеты, подобно розувастатину, повышать экспрессию генов карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2 (Cpt1a и Cpt2) и снижать величину экспрессии ацилКоА-холестерол ацилтрансферазы (Soat1). Гиполипидемический эффект леукомизина связан с его способностью
ингибировать активность ГМГ-КоА-редуктазы в гепатоцитах крыс. Леукомизин увеличивает экскрецию холестерола с фекалиями из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).
Степень достоверности и апробация результатов.
Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала с использованием современных методов и методических подходов, соотвествующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы, точностью статистической обработки.
Основные положения работы доложены на Европейской конференции по биологии и медицинским наукам «Восток-Запад» (Вена, Австрия, 2014), Международной научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития фитохимии» (Караганда, Казахстан, 2015), XIII Международной научно-парктической коференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, Россия, 2015), 9-й Международной научно-практической конференции (Махачкала, Россия, 2015), Международной научно-практической конференции «Наука и образование 2015» (Мурманск, Россия, 2015).
Исследование выполнено в рамках реализации грантов совета при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ:
-
«Идентификация молекулярных мишеней регуляции апоптоза, пролиферации и дифференцировки клеток крови при патологии инфекционного и неинфекционного генеза», соглашение № 16.120.11.614-НШ (2012–2013);
-
«Молекулярные механизмы нарушения апоптоза, пролиферации, дифференцировки и коммуникации клеток крови при социально-значимых заболеваниях инфекционного и неинфекционного генеза», соглашение № НШ-4184.2014.7 (2014–2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 14 полнотекстовых статей в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Личное участие автора. Автор принимал личное участие в проведении научно-исследовательской работы на всех этапах – от планирования до обсуждения результатов и публикации результатов научного исследования.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы исследования и двух глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований), заключения и списка литературы. Работа изложена на 198 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 48 рисунками. Библиографические ссылки включают 205 источников, из которых 169 – публикации зарубежных авторов.
Экспериментальные модели атеросклероза и дислипидемий
Дислипидемия – это нарушенние соотношения в плазме классов липопротеинов (ЛП) [14]. Дислипидемии проявляются гипертриглицеридемией, гиперхолестеринемией или смешанной гиперлипопротеинемией [132, 201, 204].
Дислипидемии являются одним из факторов риска развития атеросклероза [145, 202]. Нарушение постпрандиального метаболизма липидов увеличивает время нахождения ЛП в кровотоке и повышает риск атеросклероза сосудов [196].
Атеросклероз – многофакторное заболевание, проявляющееся инфильтрацией липидами поврежденной интимы сосудов, разрастанием соединительной ткани с образованием фиброзных бляшек, что в итоге приводит к сужению просвета сосудова [26].
Патогенез атеросклероза представляет собой динамичный процесс. В настоящее время нет единой теории, объясняющей и учитывающей все его стороны. Все данные о атогенезе атеросклероза можно объединить в рамки двух концепций: гипотеза «ответ на повреждение» и липидно-инфильтрационная гипотеза. Гипотезы не противоречат друг другу и во многом дополняют одна другую при объяснении различных процессов, возникающих при атеросклерозе [3, 18].
Первая научная липидная теория развития атеросклероза была разработана отечественным патоморфологом Н. Н. Аничковым, который совместно с С. С. Халатовым в 1913 г. показал, что добавление холестерола и жира к обычному корму кроликов вызывает атеросклероз аорты и ее ветвей [3]. Согласно этой теории, пусковым моментом развития атеросклероза является инфильтрация интимы и субэндотелия липидами и ЛП.
В основе гипотезы «ответ на повреждение», предложенной в середине 1970-х гг. американскими исследователями R. Ross и J. A. Glomset, в качестве фактора, инициирующего атеросклеротический процесс, рассматривается нарушение целостности эндотелия. В эндотелиальном слое повреждается цитоскелет, увеличивается расстояние между клетками, ослабляются межклеточные связи с экспозицией субэндотелиальных структур [176].
Повреждению эндотелия способствуют эндогенные и экзогенные химические факторы (метаболиты табачного дыма, катехоламины, продукты гликозилирования и перекисного окисления), повышение артериального давления, дислипидемия, модификация ЛП. В качестве повреждающих агентов также могут выступать бактериальная и вирусная инфекции и сопутствующие им клеточные и гуморальные иммунные и (или) аутоиммунные реакции [18, 96, 154].
При повреждении эндотелия увеличивается экспрессия провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1, фактор некроза опухолей ), хемокинов, факторов роста тромбоцитов и фибробластов. Данные факторы вызывают адгезию и миграцию моноцитов и Т-лимфоцитов в интиму сосуда [65, 92]. В последующем моноциты дифференцируются в макрофаги. Они синтезируют рецептор фагоцитоза, позволяющий поглощать окисленные ЛПНП. Цитоплазма макрофагов обогащается частицами липидов. Макрофаги трансформируются в пенистые клетки, образуют липидные полоски – предшественники зрелых фиброзных бляшек [119].
В развитии атеросклероза, наряду с дисфункцией эндотелия, важными этиологическими факторами являются дислипидемии. Липидный спектр плазмы характеризуются высоким уровнем ХС в ЛПНП (ХС-ЛПНП), триацилглицеролов, хиломикронов и их транспортных белков (аполипопротеина В). Содержание ХС липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) и их транспортного белка апо-А-1 уменьшается [14].
Первичные дислипидемии возникают в результате дефектов генов, регулирующих функции рецепторов, ферментов или транспортных белков, участвующих в липидном обмене [21, 149, 194].
Вторичные дислипидемии развиваются при заболеваниях печени, гормональных нарушениях (сахарный диабет, дисфункция щитовидной железы) или приеме лекарственных средств (мочегонные, -адреноблокаторы, иммунодепрессанты) [15].
Для изучения способности веществ оказывать гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие используют in vivo и in vitro ряд экспериментальных моделей гиперлипидемии с различными механизмами развития.
Идеальная модель для изучения дислипидемии на животных должна отображать развитие различных стадий заболевания, включая накопление пенистых клеток, образование атеросклеротических бляшек, а также соответствующих осложнений, таких как кальцификация, изъязвления, кровоизлияния, тромбоз и стеноз. Разрабатываются модели на животных, которые адекватно отражают патогенез атеросклероза, однако каждая из них имеет некоторые ограничения [114]. Как правило, нарушения обмена веществ у животных вызывают с помощью генетических манипуляций, диетотерапии, хирургии, введения ксенобиотиков (лекарств или токсинов), а также используют комбинации указанных методов [173]. Выделяют острые и хронические модели гиперлипидемии [27].
Модель острой гиперлипидемии, вызванной однократным введением в желудок мышей или крыс 40%-го раствора этанола (5 г/кг), основана на его способности стимулировать секрецию адреналина и активировать липолиз. В результате усиления липолиза повышается уровень жирных кислот (ЖК) в плазме. Они включаются в печени в ТАГ, секретируемые в составе ЛПОНП. [27, 28]. В патогенезе алкогольной гиперлипидемии важную роль играет недостаточное окисление ЖК в митохондриях. Кроме того, при метаболизме этанола образуется большое количество НАДН. Этот кофермент нарушает цикл трикарбоновых кислот и окисление свободных жирных кислот (СЖК) с развитием гиперлипидемии [70, 200].
Гиперлипидемию моделируют однократным введением детергентов (твин 80, тритон WR 1339). Детергенты, ингибируя липопротеинлипазу эндотелия, препятствуют утилизации ЛП, богатых ТАГ, и способствуют накоплению ТАГ в крови экспериментальных животных [16, 27]. Увеличение концентрации общего ХС в крови при воздействии тритона WR 1339 обусловлено также повышенным всасыванием ХС из кишечника, усилением синтеза эндогенного ХС или нарушением его элиминации в составе ЛПНП. Детергент тритон WR 1339 снижает клиренс липопротеинов, усиливает синтез холестерола в печени за счет активации ГМГ-КоА-редуктазы и повышает экспрессию участвующих в метаболизме ЛПНП рецепторов, [16]. Модель гиперлипидемии, вызванной тритоном WR 1339, характеризуется значительным увеличением концентрации различных проатерогенных фракций липопротеинов в крови и оценивается как перспективная для изучения влияния фракционного и субфракционного состава ЛП на патогенез атеросклероза и исследования гиполипидемических средств [23].
Для оценки способности веществ оказывать влияние на скорость постпрандиального метаболизма липидов применяют модель гиперлипидемии, вызванной однократным введением в желудок животных оливкового масла в дозе 5 мл/кг [47].
В развитии гиперлипидемии и атеросклероза важную роль играют как эндогенные нарушения синтеза, транспорта, ферментативного превращения и катаболизма ХС и ТАГ, так и экзогенные влияния в виде различных пищевых нагрузок [22].
Серьезное ограничение на моделирование атеросклероза и дислипидемий накладывают видовые особенности метаболизма. Так, у мышей и крыс, в отличие от людей, регистрируется низкий уровень ХС-ЛПНП и высокий уровень ХС-ЛПВП. У мышей это связано с отсутствием белка-транспортера эфиров ХС (CEPT), который осуществляет перенос эфиров ХС из липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в ЛПОНП и ЛПНП [91]. Таким образом, у мышей 80% ХС плазмы локализован в составе антиатерогенных ЛПВП, что препятствует развитию гиперхолестеринемии и атеросклероза [195].
Для изучения гиполипидемической активности новых веществ широко используется способ моделирования гиперлипидемии с помощью длительного (от 2 нед до 3 мес.) кормления экспериментальных животных высокожировой диетой, богатой ХС [27].
Воспроизведение гиперлипидемии с помощью только атерогенной диеты является достаточно проблематичным у крыс и мышей [162]. Для преодоления ограничений используют ДНК-технологии, чтобы создать генетические модификации. Получены линии мышей с удаленными генами аполипопротеина Е, рецептора ЛПНП, печеночной липазы, а также с увеличенной экспрессией гена апо В-100 [112, 164, 203].
Аполипопротеин Е расположен на поверхности циркулирующих в крови ЛП (хиломикронов, ЛПОНП, ЛПВП) и является лигандом рецепторов в печени. В крови мышей с удаленным геном аполипопротеина Е повышается уровень богатых ТАГ ЛП, что приводит к развитию атеросклероза на фоне стандартной диеты [131]. После удаления у мышей гена, кодирующего рецептор ЛПНП, увеличивается количество циркулирующих в крови атерогенных ЛП, но для развития атеросклероза у таких животных необходимо добавлять в пищу ХС [90].
Исследование эффектов лактонов при острой экспериментальной гиперлипидемии у крыс, индуцированной этиловым спиртом
Гиперлипидемию вызывали однократным внутрижелудочным введением этилового спирта. Механизм гиперлипидемического действия этанола обусловлен стимуляцией выработки адреналина надпочечниками, что приводит к быстрой активации липолиза в жировой ткани, повышению уровня свободных жирных кислот в крови; ускоряется синтез жирных кислот и их этерификация с образованием ТАГ в печени, стимулируется продукция холестерина и его эфиров, тормозится -окисление жирных кислот в митохондриях, увеличивается секреция гепатоцитами ЛПОНП, что приводит к гиперлипидемии [27, 108].
Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень триацилглицеролов в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом
Превентивное курсовое введение леукомизина экспериментальным животнымв дозе 10 мг/кг массы тела в течение 7 дней, как и препарата сравнения никотиновой кислоты в дозе 25 мг/кг массы тела статистичеески значимо (p 0,01) снижало уровень ТАГ в сыворотке крови на 39,3% и 42,8% соответственно (Таблица 7).
Курсовое введение крысам гроссмизина сопровождалось тенденцией к снижению уровня ТАГ в сыворотке крови на 16,7% (р 0,1). Курсовое введение экспериментальным животным в той же дозе арглабина, людартина, гроссгемина и ахиллина не приводило к статистически значимому изменению уровня ТАГ в сыворотке крови.
Таким образом, леукомизин и, в меньшей степени, гроссмизин, при курсовом введении, подобно никотиновой кислоте, снижали уровень ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных.
После курсового введения препаратов у этих же экспериментальных животных индуцировали гиперлипидемию однократным введением этанола (5 г/кг массы тела) в виде 40%-го раствора. Известно, что этанол стимулирует выработку адреналина надпочечниками, что приводит к липолизу, гиперлипидемии и повышенному депонированию ТАГ в печени [27].
Действительно, через 6 ч после введения этанола у животных контрольной группы уровень ТАГ в сыворотке крови статистически значимо повышался в 1,9 раза и составлял (1,55 ± 0,13) ммоль/л (до введения (0,83 ± 0,07) ммоль/л) (Таблица 8). Это свидетельствует о развитии у животных острой гиперлипидемии, вызванной введением этилового спирта.
Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно никотиновой кислоте, существенно снижало уровень ТАГ в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне развития острой гиперлипидемии, вызванной введением этилового спирта. Курсовое введение арглабина снижало повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс, вызванный этанолом, на 51,2% (р 0,01), леукомизина и ахиллина – на 49,5% (р 0,01) и 49,8% (р 0,01) соответственно. Людартин и гроссмизин на модели острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, оказывали менее выраженное действие и снижали повышенный уровень ТАГ в сыворотке крови крыс на 37,5% (р 0,01) и 34,1% (р 0,05) соответственно (Таблица 8).
Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом
Известно, что одним из механизмов развития острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, является активация липолиза, приводящая к значительному повышению уровня СЖК в сыворотке крови, которые в печени участвуют в синтезе триацилглицеролов и способствуют развитию гиперлипидемии.
В результате экспериментов установлено, что через 6 ч после введения этанола (5 г/кг массы тела) в сыворотке крови контрольных животных уровень СЖК повышается в 3,2 раза и составлял (2,73 ± 0,30) ммоль/л (до введения 0,85±0,07 ммоль/л) (Таблица 9).
Курсовое введение сесквитерпеновых лактонов, подобно никотиновой кислоте, существенно снижало уровень СЖК в сыворотке крови экспериментальных животных. Курсовое введение людартина и гроссгемина снижало повышенный уровень СЖК в сыворотке крови крыс, вызванный этанолом, на 63,4% (р 0,01) и 60,7% (р 0,01) соответственно. Курсовое введение ахиллина, леукомизина и арглабина на модели острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, оказывало менее выраженное действие и приводило к снижию повышенного уровня СЖК в сыворотке крови крыс на 42,1% (р 0,01), 41,6% (р 0,05) и 39,6% (р 0,05) соответственно. Введение гроссмизина не оказывало существенного влияния на содержание СЖК в сыворотке крови крыс при экспериментальной острой гиперлипидемии, вызванной этанолом (Таблица 9).
Влияние сесквитерпеновых лактонов и никотиновой кислоты на уровень холестерола в сыворотке крови крыс при острой экспериментальной гиперлипидемии, индуцированной этиловым спиртом
В результате эксперимента было установлено, что курсовое введение сесквитерпеновых лактонов леукомизина, арглабина и гроссмизина, в отличие от никотиновой кислоты, приводило к статистически значимому снижению уровня общего холестерола в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 10). Введение леукомизина снижало уровень общего ХС в сыворотке крови крыс на 20,4% (р 0,05), а арглабина и гроссмизина на 18,3% (р 0,05) и 15,8% (р 0,05) соответственно. Курсовое введение людартина, ахиллина и гроссгемина не сопровождалось статистически значимым изменением уровня общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 10).
После курсового введения препаратов у этих же экспериментальных животных индуцировали гиперлипидемию однократным введением этанола (5 г/кг массы тела) в виде 40%-го раствора. Через 6 ч после введения этанола у животных контрольной группы уровень общего холестерола в сыворотке крови статистически значиимо не изменялся и составлял (1,92 ± 0,06) ммоль/л (до введения - (2,08 ± 0,11 ммоль/л) (Таблица 11).
Курсовое введение никотиновой кислоты, арглабина, леукомизина, людартина, ахиллина и гроссмизина вызывало существенное снижение уровня общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных на фоне острой гиперлипидемии, вызванной этиловым спиртом. Так, арглабин снижал уровень общего ХС в сыворотке крови крыс после введения этанола на 30,4% (р 0,05), леукомизина – на 20,3% (р 0,05), людартина – на 15,8% (р 0,05), ахиллина и гроссмизина – на 14,6% (р 0,05) и 13,0% (р 0,05) соответственно. Курсовое введение гроссгемина не оказывало существенного влияния на уровень общего ХС в сыворотке крови экспериментальных животных (Таблица 11).
Содержание липидов в клеточной культуре гепатомы крыс на экспериментальной модели гиперлипидемии
В работе E. Ilan et al. показано, что культивирование первичных крысиных гепатоцитов с жировой эмульсией (липофундином) в течение 48 ч приводит к накоплению ТАГ и жирных кислот в клетках [105]. Использовали данную модель для оценки влияния сесквитерпеновых лактонов и гемфиброзила на обмен липидов в культуре гепатомы крыс при ее культивировании с жировой эмульсией.
В результате наших экспериментов установлено, что при культивировании с липофундином в концентрации от 0,01% до 0,1% жизнеспособность клеток не уменьшалась по сравнению с соответствующим показателем контрольной культуры (p 0,05) и составляла 97% (методом с трипановым синим) и 95% (методом МТТ-теста) (Таблица 29).
Инкубация клеток НТС в течение 48 ч в присутствии 0,01%-го липофундина приводила к увеличению содержания в них ТАГ в 1,5 раза – с 1,91 (1,72–1,98) до 2,99 (2,87 – 3,05) нмоль/мг белка. При добавлении 0,05%-го липофундина содержание ТАГ увеличивалось в 3 раза до 5,68 (5,54–5,75) нмоль/мг белка по сравнению с контрольными значениями. При добавлении 0,1%-го липофундина исследуемый показатель повышался по сравнению со значениями контроля в 2,4 раза – до 4,57 (4,40–4,68) нмоль/мг белка (Таблица 30).
Таким образом, культивирование клеточной линии НТС в присутствии липофундина приводило к накоплению в клетках ТАГ в зависимости от его концентрации. При этом максимальное увеличение содержания ТАГ в клетках отмечалось при концентрации липофундина в инкубационной среде 0,05 %. Полученный результат также подтверждался при оценке интенсивности флуоресценции Nile Red, которая повышалась в 4 раза по сравнению с контролем и составляла (48534,7 ± 1924,0) ед. флуоресценции (в контроле – (10928,4 ± 967,3) ед. флуоресценции) (p 0,05).
Накопление липидов в культуре НТС подтверждается данными микроскопии клеток после окрашивания нейтральных липидов с красителем Oil Red O. При инкубации клеток с липофундином 0,05 % отмечалось большее количество гранул липидов, окрашенных Oil Red O, чем в контрольной культуре (Рисунок 21).
В экспериментальной модели гиперлипидемии, вызванной жировой эмульсией, ахиллин проявлял способность понижать уровень липидов в культуре НТС и уже в концентрации 0,5 ммоль значительно уменьшал интенсивность флуоресценции Nile Red ((72,5 ± 1,2) %) по сравнению с контролем (p 0,05). Гроссмизин, леукомизин и людартин в концентрации 0,5 ммоль оказывали подобный эффект, ослабляя флуоресценцию на (67,8 ± 0,8) %, (78,3 ± 0,6) % и (84,0 ± 2,4) % соотвественно (p 0,05 во всех случаях). Гемфиброзил снижал содержание липидов до (36,5 ± 3,7) % при концентрации 0,25 мМ (p 0,05) (Таблица 31).
В то же время при гиперлипидемии, индуцированной инкубацией клеток в присутствии липофундина, гиполипидемическое действие сесквитерпеновых лактонов арглабина и гроссгемина проявлялось менее выражено. Арглабин в концентрации 75 мкМ снижал содержание липидов в клетках до (83,8 ± 3,3) %, а гроссгемин при концентрации 100 мкМ - до (74,1 ± 5,2) % (p 0,05 в обоих случаях).
Способность липофундина индуцировать гиперлипидемию показана не только на культуре первичных гепатоцитов in vitro, но и в экспериментах in vivo. Липофундин при введении экспериментальным животным вызывал повышение в крови уровня ТАГ, общего ХС и ХС-ЛПНП. Это обусловлено тем, что высокий уровень экзогенных ТАГ индуцирует синтез аполипопротеина В-100 (АпоВ-100) и ХС в печени, что, в свою очередь, способствует образованию и секреции ЛПОНП [181].
Механизм, с помощью которого сесквитерпеновые лактоны снижают содержание липидов в клетках крысиной гепатомы, не исследован. Вместе с тем известно, что основным механизмом гиполипидемического действия фибратов, в том числе гемфиброзила, являются снижение синтеза ТАГ и увеличение их гидролиза [136, 189]. Гемфиброзил, являясь агонистом рецептора, активирующего пролиферацию пероксисом (PPAR), действует на ядерные рецепторы, увеличивая экспрессию генов, которые регулируют синтез ключевых ферментов липидного обмена и белков метаболизма липопротеинов [136]. Снижение синтеза ТАГ происходит за счет ингибирующего влияния гемфиброзила на активность микросомальной диацилглицерол ацилтрансферазы. Наряду с этим, гемфиброзил активирует деградацию АпоВ, что приводит к снижению секреции ЛПОНП [205]. Флавоноид нарингенин, полученный из цитрусовых, снижает секрецию ЛПОНП также за счет увеличения внутриклеточной деградации АпоВ [58]. Полученные нами данные об уменьшении флуоресценции Nile Red и снижении содержания окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле клеток под влиянием сесквитерпеновых лактонов могут быть обусловлены ингибированием липогенеза или повышенным гидролизом ТАГ, а также снижением синтеза холестерола вследствие ингибирования ГМГ-КоА-редуктазы и образования его эфиров с жирными кислотами. Для установления молекулярных мишеней действия сесквитерпеновых лактонов на метаболизм липидов в культуре НТС необходимо в дальнейшем исследовать экспрессию генов ключевых ферментов липидного обмена.
Влияние леукомизина на активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени
Фермент ГМГ-КоА-редуктаза – ключевой в синтезе холестерола, он катализирует синтез мевалоновой кислоты. Именно эта стадия считается лимитирующей в метаболическом пути биосинтеза ХС и других изопреноидов. Ингибирование ГМГ-КоА-редуктазы является ключевым механизмом гиполипидемического действия статинов – важного класса средств, наиболее часто применяемого при дислипидемиях.
Леукомизин обладает структурным сходством со статинами, имеет в своем составе лактонное кольцо, проявляет гиполипидемическую активность, для выявления механизмов которой изучали влияние лейукомизина на способность ингибировать активность ГМГ-КоА-редуктазы2.
Розувастатин кальция в наших экспериментах in vitro статистически значимо снижал активность ключевого фермента биосинтеза холестерола – ГМГ-КоА-редуктазы на 51% в сравнении со значениями этого показателя в контрольной группе. Леукомизин в несколько меньшей степени ингибировал ГМГ-КоА-редуктазу, уменьшая ее активность на 35% относительно контрольных значений (Таблица 35).
Таким образом, механизм гипохолестеролемического действия сесвитерпеноида леукомизина может быть обусловлен его способностью снижать активность ГМГ-КоА-редуктазы в печени, что сопровождается ингибированием биосинтеза холестерола.
Обсуждение результатов по исследованию механизмов гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов (2-й этап исследования)
На первом этапе исследования было показано, что исследуемые сесквитерпеновые лактоны (арглабин, людартин, гроссгемин, гроссмизин, ахиллин и леукомизин) на моделях острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом и тритоном WR 1339, и на модели хронической гиперлипидемии, вызванной высокожировой диетой, содержащей ХС, способны снижать уровень ТАГ и холестерола в печени и сыворотке крови экспериментальных животных. При этом исследуемые сесквитерпеновые лактоны оказывают влияние на разные показатели липидного обмена.
В экспериментах in vitro сесквитерпеновые лактоны также снижали содержание липидов в культуре гепатомы крыс НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле.
Результаты оценки эффективности лактонов на экспериментальных моделях in vitro и in vivo позволили предполагать, что механизмы гиполипидемической активности исследуемых веществ различаются.
Для установления молекулярных механизмов гиполипидемического действия сесквитерпеновых лактонов было изучено их влияние на экспрессию ключевых генов, регулирующих метаболизм липидов в печени при атерогенной диете.
Несмотря на существование множества различных генов, вовлеченных в соответствующие молекулярные каскады метаболизма жирных кислот, жиров и холестерола, полиморфизмы лишь немногих из таких генов достоверно ассоциированы с развитием атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний [33]. Поэтому в настоящей работе было проанализировано влияние изучаемых сесквитерпеновых лактонов (арглабина, ахиллина, гроссгемина, гроссмизина, леукомизина и людартина) на величину экспрессии мРНК ключевых генов липидного обмена в печени животных при атерогенной диете:
- рецептора к ЛПНП (Ldlr);
- ключевого фермента синтеза холестерола, 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА-редуктазы (Hmgcr);
- фермента, катализирующего образование эфиров холестерола, ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soatl);
- фермента, регулирующего скорость синтеза желчных кислот, 7-альфа-гидроксилазы (Сур7а1);
- фермента, регулирующего скорость окисления митохондриями длинноцепочечных жирных кислот, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cptla);
- фермента, катализирущего перенос ацила на внутримитохондриальный КоА карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2).
В результате экспериментов было установлено, что высокожировая атерогенная диета приводит к снижению в печени экспериментальных животных величины экспрессии мРНК генов рецептора к ЛПНП (Ldlr), 7-альфа-гидроксилазы (Сур7а1), карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 (Cptla) и карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2) (Рисунок 42,а). Это способствует снижению поглощения печенью циркулирующих в крови ЛПНП (Ldlr), интенсивности окисления жирных кислот митохондриями (Cptla и Cpt2) и выведению холестерола в виде желчных кислот (Сур7а1). Снижение величины экспрессии в печени гена ГМГ-КоА-редуктазы при атерогенной диете обусловлено избыточным поступлением ХС с пищей, который по принципу отрицательной обратной связи уменьшает экспрессию данного гена при участии фактора транскрипции - стеролсвязывающего регуляторного белка SREBP-2 [93].
При атерогенной диете происходит увеличение величины экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soatl) (Рисунок 42). Известно, что этерификация холестерола, обусловленная АцилКоА холестерол ацилтрансферазой, играет важную роль в упаковке, продукции и секреции ЛПОНП печенью [59].
АцилКоА холестерол ацилтрансфераза модулирует катаболизм ХС в гепатоцитах и концентрацию его в плазме, уменьшая уровень свободного ХС в клетках печени, что способствует снижению экспрессии и активности 7-альфа гидроксилазы. При атерогенной диете повышение активности АцилКоА холестерол ацилтрансферазы способствует увеличению секреции гепатоцитами ЛПОНП. Показано, что ингибиторы этого фермента увеличивают синтез желчных кислот через повышение экспрессии холестерин 7-альфа гидроксилазы. Повышение экспрессии Soat1 может способствовать снижению 160 экспрессии холестерин 7-альфа-гидроксилазы и развитию гиперхолестеринемии при атерогенной диете [157].
Фенофибрат относится к дериватам фиброевой кислоты – группе гиполипидемических препаратов, влияющих преимущественно на обмен липопротеиновых частиц, богатых триацилглицеролами (хиломикроны, липопротеины очень низкой и промежуточной плотности). Фибраты являются агонистами ядерных -рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом (PPAR) [182], и их гиполипидемическое действие обусловлено несколькими механизмами [174].
Фенофибрат в печени крыс на фоне атерогенной диеты индуцирует -окисление жирных кислот, о чем свидетельствует увеличение экспрессии мРНК генов Cpt1a и Cpt2 с сопутствующим уменьшением синтеза жирных кислот и ТАГ (см. Рисунок 42,б).
Ингибирование фенофибратом экспресии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы (Soat1) приводит к уменьшению образования эфиров ХС. Увеличение экспрессии мРНК гена рецепторов к ЛПНП (Ldlr) способствует извлечению из циркуляции в крови атерогенных ЛПНП. В то же время снижение экспрессии мРНК гена 7-альфа-гидроксилазы (Cyp7a1) способствует уменьшению синтеза и секреции желчных кислот, что может спровоцировать развитие желчнокаменной болезни и ограничивает применение фибратов [158].
Статины являются структурными аналогами и конкурентными ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы – ключевого фермента биосинтеза холестерола в гепатоцитах. Основной механизм их действия основан на снижении внутриклеточного содержания ХС в клетках печени, в результате чего происходит увеличение количества мембранных рецепторов к ЛПНП. Это приводит к связыванию и выведению из кровотока атерогенных ЛПНП и, таким образом, уменьшению концентрации ХС в крови.
Розувастатин на фоне атерогенной диеты уменьшает величину экспрессии мРНК гена ацилКоА холестерол ацилтрансферазы, повышая при этом в печени экспрессию генов, кодирующих синтез рецепторов ЛПНП (Ldlr), синтез желчных кислот (Cyp7a1) и окисление жирных кислот в митохондриях (Cpt1a и Cpt2), что обуславливает его гиполипидемическое действие (см. Рисунок 42,б).