Содержание к диссертации
Введение
1. Фармакологическая регуляция глутаматного ионотропного рецептора: достижения современной молекулярной медицины (литературный обзор) 17
1.1 Структурно-функциональная организация NMDA-рецептора и его фармакологическая регуляция 19
1.2 Современные достижения фармакологии блокаторов ионного канала ионотропного глутаматного рецептора (NMDA-рецептора) 30
1.3 Перспективные антагонисты, блокирующие глициновый сайт NMDA-рецетора 31
1.4 Фармакологические подходы к селективной блокаде GluN2B субъединицы ионотропного глутаматного рецептора 33
1.5 Модуляторы NMDA-рецептора с агонистической активностью 34
1.6 Фармакологическая характеристика инновационных модуляторов глутаматных ионотропных рецепторов с не-идентифицированным сайтом связывания 36
1.7 Непрямые модуляторы активности NMDA-рецептора 37
1.8 Фармакология дейтеризованных аналогов 39
1.9 Новые горизонты применения модуляторов ионотропных глутаматных рецепторов 40
1.10 Скавенджеры глутаминовой кислоты – новый класс фармакологических агентов для лечения нарушений мозгового кровообращения 41
2. Материал и методы исследования 47
2.1 Краткая характеристика исследуемого вещества и используемых в работе коммерческих соединений 47
2.2 Лабораторные животные, клеточные культуры, используемые в работе 49
2.3 Метод определения концентрации глутаминовой кислоты при необратимой окклюзии средней мозговой артерии 52
2.4 Метод определения биоэлектрической активности головного мозга на модели острой асфиксии у мышей 54
2.5 Метод изучения влияния соединения аминоэтансульфо-новой кислоты на содержание ИЛ-1 бета и ИЛ-10 в ткани головного мозга крыс 54
2.6 Метод определения нейропротекторного действия ФС-ЛХТ-317 в опытах in vitro 55
2.7 Метод изучения Са2+-ответа NMDA-рецептора нейронов головного мозга 56
2.8 Методы статистической обработки полученных результатов 59
3. Влияние ФС-ЛХТ-317 на плазменную концентрацию глутаминовой кислоты и кионцентрацию цитокинов в головном мозгу животных при его фокальной ишемии 60
3.1 Результаты исследования влияния ФС-ЛХТ-317 на динамику плазменной концентрации глутаминовой кислоты 60
3.2 Влияние ФС-ЛХТ-317 на тканевое содержание про- и противовоспалительных цитокинов в головном мозгу крыс при острой церебральной ишемии 65
4. Влияние соединения аминоэтансульфоновой кислоты ФС-ЛХТ-317 на биоэлектрическую активность и выживаемость клеток головного мозга в условиях ишемии 69
4.1 Влияние магнийсодержащего соединения ФС-ЛХТ-317 на биоэлектрическую активность головного мозга мышей при острой асфиксии 70
4.2 Влияние исследуемого циклического соединения ФС-ЛХТ-317 на выживаемость нейронов при создании условий, подобных мозговой ишемии 72
5. Влияние циклического магнийсодержащего соединения аминоэтансульфоновой кислоты на проводимость кальциевых каналов NMDA рецептора 74
5.1 Выявление ингибиторного эффекта ФФС-ЛХТ-317, направленного на подавление амплитуды Са2+-ответов нейронов при активации NMDA-рецептора 74
5.2 Характеристика анатагониста NMDA-рецептора ФС ЛХТ-317. Определение концентрации полумаксимально го ингибирования (IC50) 78
6. Обсуждение результатов 87
Заключение 97
Перспективы дальнейшего развития темы диссертационного исследования 98
Выводы 99
Практические рекомендации 101
Библиографический список 102
- Структурно-функциональная организация NMDA-рецептора и его фармакологическая регуляция
- Скавенджеры глутаминовой кислоты – новый класс фармакологических агентов для лечения нарушений мозгового кровообращения
- Влияние ФС-ЛХТ-317 на тканевое содержание про- и противовоспалительных цитокинов в головном мозгу крыс при острой церебральной ишемии
- Характеристика анатагониста NMDA-рецептора ФС ЛХТ-317. Определение концентрации полумаксимально го ингибирования (IC50)
Структурно-функциональная организация NMDA-рецептора и его фармакологическая регуляция
NMDA-рецепторы состоят их двух GluN1 и двух GluN2 субъединиц, последние, в свою очередь, подразделяются на GluN2A – GluN2D субъединицы. Хотя до сих пор не совсем понятна роль субъединиц GluN3A, GluN3B, считают, что NMDA-рецепторы, состоящие из субкомпонент GluN1, GluN2, GluN3 представлены в основном в головном мозгу взрослых людей [27]. Кроме того, наличие субъединиц в структуре канала заметно изменяет его физиологические свойства.
Рецепторы, кроме того, могут содержать две разные GluN2-субъединицы, что придает в итоге рецептору с подобной тригетеромерной структурой уникальные свойства [25, 28].
Как большой класс рецепторов все глутаматные ионотропные рецепторы (iGluRs) имею подобную гомологичную структуру, обусловливающую схожесть пространственной архитектуры всех трех подклассов данных рецепторов.
Так, структура всех глутаматных ионотропных рецепторов включает 4 полуавтономных домена: аминотерминальный домен (ATD), лиганд-связывающий домен (LBD), трансмембранный домен (TMD) и карбоксильный терминальный домен (CTD) (рисунок 1.1).
Каждая из многочисленных субъединиц рецептора детально изучалась. Кристаллические структуры амино-терминального домена, включающего GluN1 и GluN2 субъединицы, в связи с ионами цинка [29] и ифенпродилом [30], обнаружили подобие с раскладушкой, состоящей из 2 частей – R1 и R2 (рисунки 1.2, 1.3).
Каждая из многочисленных субъединиц рецептора детально изучалась. Кристаллические структуры амино-терминального домена, включающего GluN1 и GluN2 субъединицы, в связи с ионами цинка [29] и ифенпродилом [30], обнаружили подобие с раскладушкой, состоящей из 2 частей – R1 и R2 (рисунки 1.2, 1.3).
Хотя между различными типами глутаматных рецепторов существует высокая степень гомологичного соответствия (или подобия), оно, как правило ограничивается структурой лиганд-связываемого домента [31], тогда как амино-терминальный домен рецептора обусловливает его высокую видоспе-цифичность. В отличие от неионотропных глутаматных рецепторов, для NMDA-рецепторов идентифицированы многочисленные сайты взаимодействия с модуляторами, существенным образом изменяющими функциональную активность рецептора [32]. Например, ионы цинка связываются с GluN2A, GluN2B субъедицинами рецептора [33, 34] в специальном кармане, образованном расщелиной в амино-терминальном домене GluN2B субъединицы [29], в то время как GluN2B-селективный ингибитор ифенпродил связывается с пространством между GluN1 и GluN2B гетеродимерами (рисунок 3), отличным от места связывания ионов цинка [30].
Амино-терминальный домен рецептора контролирует способность к открытию и глубину инактивации вслед за освобождением от связи с глута-миновой кислотой [35]. Кристаллическая структура [24, 36, 37] лиганд-связывающего домена NMDA-рецептора также напоминает по форме раскладушку и состоит из двух долей – D1, D2. Здесь, в расщелине между долями располагается участок для взаимодействия рецептора с агонистами.
Сразу же после воздействия агониста происходят конформационные изменения, доля D2 перемещается и приоткрывает междолевую расщелину [24]. Между NMDA- и не-NMDA-рецепторами установлена высокая степень гомологичного сходства по LBD-домену, однако конформационные изменения, ведущие к открытию канала являются уникальными для NMDA-рецептора и не находят подтверждения у АМРА- и каинатных-рецепторов [36, 37]. Модуляторы сродства рецептора к глицину также связываются с ли-ганд-связывающим доменом (рисунок 1) [38].
Трансмембранный домен рецептора формирует пору ионного канала и включает три трансмембранные спиральные структуры и возвратную петлю, напоминающую инвертированный калиевый канал [19].
Трансмембранная часть рецептора связана с лиганд-связываемым доменом тремя мостиками, каждый из которых (М1, М3 и М4) перекинут к соответствующей спирали. Мостик М2 связывает лиганд-связываемый домен с возвратной петлей, выстилающей внутреннюю поверхность ионной поры и контролирующей ионную проницаемость и блокаду канала [39]. В районе ионной поры происходит и потенциал-зависимая блокада канала ионами магния подобно неконкурентным антагонистам, более известным как блока-торы канала [39, 40].
Большой внутриклеточный фрагмент рецептора представлен карбоксил-терминальным доменом, с которым связывают посттрансляционную модификацию рецептора, а также рецепторный трафикинг [11].
Совсем недавно две кристаллические гетеротетрамерные конструкции NMDA-рецептора, состоящие из ATD – LBD – TMD, были идентифицированы. Они позволили более детально определить отличия рассматриваемого рецептора от АМРА-рецепторов (рисунок 1). Данные кристаллические структуры вскрыли закономерности межсубъединичных и внутридоменных взаимоотношений в конструкции рецептора, что, в конечном счете, позволило мировой науке продвинуться вперед в понимании механизмов взаимодействия рецептора со своими модуляторами [35].
Ген GluN2-субъединицы кодирует синтез 4 структур: GluN2А, GluN2В, GluN2С и GluN2D-субъединиц, каждая из которых привносит свои уникальные свойства в общую систему функционирования рецептора, включающую время инактивации, способность к открыванию ионного канала, продолжительность нахождения канала в открытом состоянии и, наконец, чувствительность к агонистам [24, 25, 41, 42]. Так, GluN2А-содержащие рецепторы имеют более быструю скорость инактивации, чем иные GluN2-содержащие рецепторы [43], и также менее чувствительны к глицину и глутаминовой кислоте по сравнению с другими подтипами рецепторов.
С точки зрения способности к открыванию, рекомбинантные GluN2А-содержащие рецепторы обладают почти в 10 раз большим потенциалом, чем GluN2С- и GluN2D-содержащие рецепторы [44]. Функциональные свойства трансмембранного ионного канала, такие как магний-зависимая блокада, кальциевая проницаемость, проводимость одного канала, широко варьирует между GluN2А/В и GluN2С/D-рецепторами и определяется единственным участком GluN2-субъединицы в М3 трансмембранном регионе [45].
Фармакологические свойства канала определяются не только его субъединичной и доменной композицией, но также уровнем экспрессии его структурных элементов в разные периоды онтогенеза, а также расположением в головном мозгу. В период эмбрионального развития в головном мозгу крыс обнаруживается низкий уровень представительства GluN1, GluN2В и GluN2D-рецепторов, тогда как высока концентрация GluN2А и GluN2С-содержащих рецепторов. К моменту рождения GluN2В-рецепторы экспрессируются преимущественно в коре и гипоталамусе, а GluN2D – обнаруживаются с высокой плотностью локализации в таламусе, гипоталамусе и стволе мозга. GluN2А-рецепторы экспрессируются в гиппокампе и коре мозга, а GluN2С – в мозжечке [46-48]. В головном мозгу взрослых крыс все субъединицы представлены более или менее равномерно с преобладанием GluN2А-содержащих изоформ.
Разнообразие функций, определяющееся комбинацией многочисленных и разнообразных субъединиц, делает NMDA-рецептор важнейшим объектом для терапевтического воздействия. Фармакологическая значимость рецептора определяется также множеством участков связывания для агонистов и антагонистов, модуляторов активности с различной степенью субъединичной и доменной селективности. Неконкурентные антагонисты, известные также как блокаторы канала, связываются глубоко в ионной поре (рисунок 1.1) и требуют активации рецептора перед связыванием (рисунки 1.2, 1.3) [40].
Скавенджеры глутаминовой кислоты – новый класс фармакологических агентов для лечения нарушений мозгового кровообращения
Сосудистые катастрофы головного мозга сохраняют лидирующие позиции по уровню заболеваемости и прогностической значимости в популяции молодых людей и лиц пожилого и старческого возраста [167, 168]. До настоящего времени не разработано эффективных консервативных методов лечения и профилактики указанных серьезных заболеваний.
Вместе с тем, установлена прямая зависимость между уровнем глута-миновой кислоты в экстрацеллюлярной жидкости тканей головного мозга и инсультом, менингитом, травматическим поражением головного мозга [169-172], а также хроническими патологическими процессами ЦНС, такими как ВИЧ-ассоциированная деменция, боковой амиотрофический склероз и др. [173-175]. При всех указанных патологиях предотвращение роста концентрации глутаминовой кислоты в мозгу позволяет улучшать последствия указанных патологий как у людей, так и в экспериментах на животных [170, 176, 177].
В недавно проведенных исследованиях установлена зависимость между мозговыми и плазматическими концентрациями глутаминовой кислоты [174, 175]. Снижение плазменных уровней маркера экстайтотоксичности ведет к формированию благоприятного градиента вещества, при котором происходит перераспределение содержания кислоты в циркуляцию и снижение ее уровня в головном мозгу, предотвращая формирование вторичной глута-мат-опосредованной нейротоксичности [176, 177]. В свою очередь, снижение уровня глутаминовой кислоты в крови сопровождается улучшением неврологических последствий заболеваний ЦНС [178-181], следовательно, попытки редукции уровня мозгового и плазменного глутамата представляются чрезвычайно важными с точки зрения выработки перспективной терапевтической стратегии [182-187].
Метаболизм глутаминовой кислоты, содержащейся в плазме крови, осуществляется путем ферментативного превращения е в альфа-кетоглутарат при участии фермента глутаматоксалоацетаттрансаминаза (ГОТ, другое название аспартатаминотрансферазы (АсАТ)). Ферментативная активность и, как следствие, метаболические последствия, находятся в прямой зависимости от уровня в крови субстрата рГОТ, оксалоацетата (ОА) [188, 189].
Патофизиологические исследования хронических нейродегенератив-ных заболеваний: БАС [190-193], глиомы [194-201], острого нарушения мозгового кровообращения [202-208], травматического поражения головного мозга [209, 210] продемонстрировали наличие единого маркера и посредника прогрессирования патологии – повышение уровня глутаминовой кислоты в спинномозговой жидкости и ликворе.
Роль эксайтотоксичности глутаминовой кислоты при упомянутых патологических состояниях широко документирована в различных исследованиях и является превалирующей гипотезой патогенеза нейродегенеративных заболеваний. Полагают, что основной мозговой возбуждающий медиатор глутаминовая кислота в чрезмерно высоких длительно сохраняющихся концентрациях приводит к перевозбуждению мотонейронов головного и спинного мозга и их последующей гибели.
В частности, при изучении патогенетической роли глутаминовой кислоты при ишемическом инсульте были проведены 4 основных клинических и экспериментальных исследования, в которых было доказано эксайтотоксиче-ское действие глутамата при данной патологии. Так, была исследована концентрация глутаминовой кислоты в спинномозговой жидкости пациентов при сравнении с контрольной группой лиц того же возраста. Было установлено, что в среднем концентрация кислоты превышает в опытной группе показатели контроля в 40% случаев. В исследовании была показана корреляционная зависимость между высокими концентрациями глутаминовой кислоты в спинномозговой жидкости и дебютом заболевания, а также степенью снижения двигательной функции и объемом поражения мотонейронов. Помимо повышения концентрации глутаминовой кислоты в ликворе, в исследовании [171] установлена эскалация е содержания и в крови у пациентов с инсультом.
Помимо указанных феноменов, было установлено, что у пациентов с дегенеративно-дистрофическими процессами головного и спинного мозга нарушается транспорт глутаминовой кислоты, в частности, снижается активность транспортных систем, направленных на снижение концентрации эндогенного медиатора [193]. Определенную роль в повреждении транспортной функции в настоящее время связывают с селективным снижением количества астроцитов GLT-1 (EAAT2) субпопуляции глутаматного транспортера [178]. Эти же авторы показали, что у 60-70% пациентов с дегенеративно-дистрофическими процессами ЦНС наблюдается потеря от 30 до 95% гли-альных клеток – транспортеров глутаминовой кислоты. В то же время до настоящего времени остается неясным, является ли гибель астроцитов пусковым фактором развития заболевания, или же это одно из звеньев в патогенетической цепи формирования поражения головного мозга [182].
Описанные выше исследования привели к созданию препарата рилузо-ла, ингибирующего высвобождение глутаминовой кислоты [191, 192]. Несмотря на довольно скромную терапевтическую активность (повышение продолжительности жизни пациентов в среднем на 2 мес.), было установлено, что наибольшая активность препарата отмечается у пациентов с высоким содержанием глутаминовой кислоты в крови и ликворе. А при оптимально подобранном режиме введения препарата наблюдалось снижение уровня медиатора как в плазме крови, так и спинномозговой жидкости, и ликворе [207].
Однако к настоящему времени очевидно, что многочисленные попытки создать эффективный препарат на основе ингибирования рецепторов или продукции глутаминовой кислоты, оказались абсолютно безуспешными [206, 209, 210].
Современная научная дискуссия развивается в направлении формирования альтернативной стратегии, согласно которой избыточная глутаминовая кислота перераспределяется из головного и / или спинного мозга в системный кровоток под действием естественного плазменного скавенджера глута-миновой кислоты – оксалоацетата (ОА) [173, 175]. Увеличение концентрации ОА приводит к ускорению энзиматической реакции с участием ГОТ, субстратом которого он является, что ведет, соответственно, к деградации глу-таминовой кислоты, снижению е уровня в крови. В свою очередь, падение плазменной концентрации медиатора приводит к ускорению эффлюкса активного глутамата из ликвора. Как результат эксайтотоксическое действие медиатора ослабевает.
В исследовании с использованием меченной радиоизотопом глутами-новой кислоты [173], было доказано наличие подобного градиента под действием вводимого внутривенно ОА. Помимо указанного исследования, также нашло подтверждение предположение о снижении уровня глутаминовой кислоты в крови и ткани и жидкости головного мозга на модели парааксо-нальной нейротоксичности на фоне профилактических и лечебных режимов введения ОА.
Описанный научный подход показал высокую патогенетическую эффективность в экспериментальных исследованиях на моделях формирования нарушения мозгового кровообращения, травматического повреждения головного мозга, парааксональной интоксикации. Нейропротекция была доказана на основе оценки поведенческих и двигательных реакций животных в динамическом наблюдении, а также при проведении гистологических исследований ткани головного и спинного мозга.
Широкое представительство глутаматных ионотропных рецепторов в головном мозгу, уникальность структурной организации рецепторов, их полиморфизм, делают NMDA-рецеторы перспективной биологической мишенью для создания эффективных лекарственных препаратов для профилактики и лечения таких важнейших и социально-значимых заболеваний, как ишемические нарушения мозгового кровообращения, травматическое поражение головного мозга, нейродегенеративные заболевания, а также ряд психических расстройств.
Влияние ФС-ЛХТ-317 на тканевое содержание про- и противовоспалительных цитокинов в головном мозгу крыс при острой церебральной ишемии
ИЛ-10 – один из самых эффективных противовоспалительных цитоки-нов, который эндогенно производится иммунными клетками и ограничивает воспалительную реакцию. Существуют экспериментальные данные, которые показывают ведущую роль ИЛ-10 в механизмах подавления воспаления при рассеянном склерозе и артрите, также, как и при моделировании ишемии мозга in vivo [222]. Инъекции IL-10 через яремную вену значительно уменьшали площадь инсульта в мозге грызунов при окклюзии средней мозговой артерии [223].
Но несмотря на достаточное количество экспериментальных доказательств связи воспаления и клеточной гибели при ишемии мозга, понимание механизмов выживания нейронов после инсульта пока еще очень ограничено. Ранее на гиппокампальных нейронах крысы была разработана клеточная модель для регистрации эффекта прекондиционирования и постгипоксиче-ской гипервозбудимости [224].
В этой модели противовоспалительный цитокин ИЛ-10 предотвращал развитие постгипоксической гипервозбудимости, подавляя спонтанную синхронную Cа2+ пульсацию. В то же время ИЛ-10 защищал ГАМКергические нейроны от гибели, восстанавливая в них эффект гипоксического преконди-ционирования. Показано, что активация одного из сигнальных путей, инициируемых ИЛ-10, необходима для развития гипоксического прекондиционирования в ГАМКергических нейронах [225]. Гипоксическое воспаление оказывает скорее всего более широкое воздействие на перестройку центральной нервной системы при повреждении головного мозга. При этом, вероятно, будут включаться механизмы регуляции активности рецепторов нейромедиаторов, таких как NMDA и AMPA, или других специфических глутаматных рецепторов (GluRs); тормозных ГАМК рецепторов (ГАМКR); активность в ГАМКерги-ческих и глутаматергических сетях, изменение синаптической плотности, повреждение аксонов, вызывающее нейрогенез. Таким образом, все еще неясно, как все эти механизмы могут быть использованы при лечении инсульта, что свидетельствует в пользу высокой актуальности изучения роли ИЛ-10 в реализации фармакологических эффектов потенциальных церебропротекто-ров.
В этой связи изучили влияние профилактического внутривенного введения исследуемого соединения ФС-ЛХТ-317 на тканевую концентрацию ИЛ-1 бета и ИЛ-10 в поврежденных и неповрежденных областях головного мозга крыс с острой фокальной ишемией. Соединение и препарат сравнения нимодипин вводили в вену хвоста за 5-10 мин до воспроизведения острой патологии в дозах 25,0 мг/кг и 1,5 мг/кг, что соответствовало высшим терапевтическим дозам лекарственных веществ.
В контрольной серии опытов, проведенных на 6 крысах-самцах, установили, что в неповрежденных областях головного мозга животных с фокальной ишемией головного мозга наблюдается тенденция к росту провоспа-лительного ИЛ-1 бета и статистически значимое при сравнении с контролем повышение содержания противовоспалительного ИЛ-10 (рис. 3.1).
Внутривенное введение нимодипина в профилактическом режиме в дозе 1,5 мг/кг не сопровождалось динамикой изучаемых цитокинов в неповрежденных областях головного мозга крыс, однако, приводило к снижению уровня ИЛ-1 бета в зоне ишемии. Следовательно, препарат сравнения обладает заметным протекторным действием, направленным на ограничение повреждающего действия острой ишемии на мозговые структуры.
При исследовании влияния ФС-ЛХТ-317 на тканевую концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов мы установили, что введение вещества в дозе 25,0 мг/кг воспроизводит эффект нимодипина в отношении ИЛ-1 бета, но, в то же время, повышает тканевую концентрацию противовоспалительного ИЛ-10 в зоне ишемии головного мозга и восстанавливает содержание цитокина до уровня интактных животных в удаленной от острой ишемии зоне.
Таким образом, реализация фармакологического действия магнийсо-держащего соединения аминоэтансульфоновой кислоты может быть реализована за счет подавления продукции провоспалительного цитокина ИЛ-1 бета в мозгу животных на фоне активации синтеза защитного ИЛ-10 преимущественно в области острой ишемии.
Характеристика анатагониста NMDA-рецептора ФС ЛХТ-317. Определение концентрации полумаксимально го ингибирования (IC50)
Как можно видеть на предыдущем рисунке, ФС-ЛХТ-317 способен до-зозависимо подавлять Са2+-ответы нейронов гиппокампа на аппликацию NMDA. Для определения концентрации полумаксимального ингибирования, добавляли 10мкМ NMDA в безмагниевой среде на фоне различных концентраций ФС-ЛХТ-317. На рисунке 5.2 (А, Б) и 5.3А представлены 3 отдельных эксперимента (нейроны, полученные из трех различных особей крыс), которые показывают, что увеличение концентрации ФС-ЛХТ-317 с 10 мкМ до 20 мМ (отмечено красными стрелками) приводит к последовательному подавлению амплитуды Са2+-сигналов на аппликацию NMDA. При этом концентрации порядка 10-20 мМ полностью подавляют Са2+-сигналы нейронов на NMDA, но не влияют на аппликацию активатора АМРА-рецепторов – альфа-аминометилизоксазолпропионовой кислоты (Рис. 5.2А, АМРА, 3 мкМ).
На рисунке 5.4А показаны результаты усреднения амплитуд кальциевых ответов с оценкой достоверности отличия полученных данных от контрольных значений.
На рисунке 5.4Б показаны усредненные по нескольким десяткам нейронов Са2+-ответы на 10 мкМ NMDA в безмагниевой среде на фоне возрастающих концентраций ФС-ЛХТ-317 (отмечено красными стрелками). Видно, что в среднем, разброс в амплитудах Са2+-ответов между культурами, полученными из разных особей не значителен, а эффект подавления сигналов при аппликации ФС-ЛХТ-317 определяется его концентрацией.
Аппроксимация сигмовидной функцией зависимости процента подавления амплитуды Са2+-ответов нейронов на NMDA от концентрации ФС-ЛХТ-317 (LHT) показала, что величина IC50 для данного антагониста составляет 0,45±0,20 мМ.
Свойства антагониста ФС-ЛХТ-317 заключается в том, что его связывание происходит, вероятно, с сайтом для магния внутри катионного канала рецептора, и поэтому, для эффективного связывания необходимо, чтобы канал находился в открытом состоянии.
Известно, что при длительной (более 3 мин) активации NMDA-рецептора Са2+-ответ клеток становиться необратимым. В качестве механизмов рассматривается ингибирование кальций-транспортирующих систем и нарушение функционирования митохондрий, что приводит к опустошению пула АТФ в клетках [221].
На рисунке 5.5А показано, что аппликация 10 мкМ NMDA в полной среде вызывает необратимое увеличение Са2+ в цитозоле и выход Са2+ на новый стационарно повышенный уровень, отражающий открытие канала NMDA-рецепторов и отсутствие их инактивации.
Однако добавление 10 мМ ФС-ЛХТ-317 (LHT) (рис. 5.5Б) приводит к быстрому закрытию канала и уменьшению Са2+ в цитозоле практически до уровня покоя.
При этом, измеряя скорость уменьшения уровня [Ca2+]i после добавления антагониста (ФС-ЛХТ-317) в разных концентрациях, можно получить зависимость скорости проникновения и связывания ингибитора от концентрации антагониста в индивидуальных нейронах (рис. 5.6Б). Аппроксимация усредненных экспериментальных скоростей уменьшения амплитуд Са2+-ответов с помощью сигмовидной кривой дозовой зависимости показало, что ФС-ЛХТ-317 вызывает полумаксимальный эффект, направленный на инактивацию канала NMDA-рецептора, при 0,13 мМ (рис. 5.7). Таким образом, особый тип ингибирования NMDA-рецептора с помощью ФС-ЛХТ-317 обусловлен быстрым проникновением его в канал рецептора и вероятно, его аллостерическим характером взаимодействия.