Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литертуры 10
1.1 Органические поражения центральной нервной системы 10
1.2 Современные представления о механизмах развития органических поражений мозга на примере алкогольной энцефалопатии 16
1.3 Методы моделирования этанол–индуцированного поражения ЦНС 20
1.4 Механизм действия лития на патологические пути развития алкогольной энцефалопатии 23
1.5 Фармакокинетика лития 31
Глава 2 Материалы и методы иследования 44
2.1 Экспериментальные животные 44
2.2 Исследуемые вещества 44
2.3 Влияние исследуемых веществ на острую алкогольную интоксикацию 48
2.4 Отработка модели субхронической алкогольной интоксикации 49
2.5 Исследование влияния композиции лития цитрата на поведенческие реакции, биохимические и морфологические изменения в печени и мозге мышей в условиях субхронической алкогольной интоксикации
2.5.1 Оценка высшей нервной деятельности животных 50
2.5.2 Изучение биохимических показателей крови 52
2.5.3 Оценка морфологических изменений в мозге и печени 53
2.6 Изучение фармакокинетических параметров композиции лития цитрата 53
2.6.1 Методика количественного определения лития 53
2.6.2 Тест «Растворение» 56
2.6.3 Определение основных фармакокинетических параметров после однократного введения композиции лития цитрата 56
2.7 Методы статистической обработки результатов 57
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение 58
3.1 Влияние исследуемых веществ на острую алкогольную интоксикацию
3.2 Отработка модели СХАИ 59
3.3 Изучение влияния исследуемых веществ на поведенческие реакции, биохимические и морфологические изменения в печени и мозге мышей в условиях субхронической алкогольной интоксикации 65
3.3.1 Оценка высшей нервной деятельности животных 67
3.3.2 Исследование биохимических показателей крови мышей 72
3.3.3 Оценка морфологических изменений в мозге и печени в условиях субхронической алкогольной интоксикации и введения исследуемых веществ 73
3.4 Оценка фармакокинетических параметров композиции лития цитрата in vitro и in vivo 81
3.4.1 Тест «Растворение» 81
3.4.2 Бескамерный фармакокинетический анализ композиции лития цитрата в эксперименте на животных 82
Заключение 85
Выводы 95
Список сокращений 96
Список литературы 98
- Современные представления о механизмах развития органических поражений мозга на примере алкогольной энцефалопатии
- Исследуемые вещества
- Определение основных фармакокинетических параметров после однократного введения композиции лития цитрата
- Оценка высшей нервной деятельности животных
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Злоупотребление алкоголем является актуальной медико–социальной и экономической проблемой во всем мире (Кошкина Е.А., Павловская Н.И., Ягудина Р.И. и др., 2009; Колик Л.Г., Гудашева Т.А., Мартьянов В.А. и др., 2016). Данные по заболеваемости, опубликованные в отчете Федеральной службы государственной статистики по итогам 2012 года, свидетельствуют, что фактически в стране зарегистрировано 1 807, 9 тыс. больных алкоголизмом. Особую опасность алкоголизма представляет коморбидность – соматоневрологическая и психопатологическая, которая часто маскирует основное заболевание, усложняет его диагностику и лечение (Чернобровкина Т.В., Артемчук А.Ф. Сосин И.К. и др., 2006). Алкогольное поражение центральной нервной системы (ЦНС) занимает одно из ведущих мест в структуре интранозологической коморбидности при алкогольной болезни (Кошкина Е.А., Павловская Н.И., Ягудина Р.И. и др., 2009).
Среди больных алкоголизмом наиболее распространенной психической патологией являются аффективные расстройства (депрессия, тревога) – 33,7 % и расстройства личности (шизофрения) – 7,4 % (Гуревич Г.Л., 2004; Крылов Е.Н., 2004).
В терапии больных с алкогольной зависимостью, осложненным психиатрической
патологией используют различные комбинации антидепрессантов, нормотимиков,
нейролептиков, антиконвульсантов (Гуревич Г.Л., 2005). В базе данных Pubmed последние статьи по теме использования препаратов лития при алкоголизме датируются 90–ми годами прошлого века. Так, в обзоре Lejoyeux M. и Ads J. 1993 г. собран и проанализирован большой массив исследований по использованию препаратов лития для коррекции аффективных расстройств у больных алкоголизмом. Было установлено, что препараты лития не эффективны для лечения таких расстройств у алкоголиков и не снижают алкогольную мотивацию (Lejoyeux M., Ads J.,1993).
С начала 2000–х гг. активно развивается направление использования лития в качестве нейропротекторного средства (WeiH., QinZ.H., SenatorovV.V. etal., 2001; ChuangD.–M., 2004; Громова О.А., Торшин И.Ю., Никонов А.А. и др., 2009; Торшин И.Ю., Громова О.А., 2012). Механизм нейропротекторного действия лития реализуется за счет: ингибирования гликогенсинтазыкиназы–3 (GSK–3), стимулирования белка теплового шока (hsp70) (Haorah J., RamiresS. H., FloreaniN.etal., 2008), ингибирования входа кальция в клетку через NMDA глютаминовые рецепторы, активации ERK сигнального пути (ChuangD.–M., 2004).
При этанол–индуцированном нейроапоптозе показана эффективность лития в культуре клеток гранулярных нейронов мозжечка (Zhong J., Yang X., Yao W.et al., 2006), на животных в эксперименте при индукции фетального алкогольного синдрома (Sadrian B., Subbanna S., Wilson
D.A.et al., 2012), при остром отравлении этанолом и однократном введении лития (Luo J., 2010). Также следует отметить, что в системе мониторинга безопасности лекарственных средств США (MedWatch) зарегистрированы случаи гепатотоксичности при длительном приеме лития карбоната (McKnight R.F., Adida M., Budge K. et al., 2012). Таким образом, недостаточно изученным остается влияние введения лития на развитие уже сформированной алкогольной нейродегенерации, на фоне продолжающегося введения этанола, и возможное усугубление течения алкогольного поражения печени.
В данной работе используется новая фармацевтическая композиция лития цитрата с оксидом алюминия и полиметилсилоксаном. Такая форма лития цитрата способствует поддержанию стабильной концентрации лития в крови и головном мозге, что важно для осуществления терапевтического эффекта лития, позволяет избежать быстрого нарастания концентрации лития в сыворотке крови, что снижает риск развития дозозависимых побочных эффектов из–за узкого терапевтического коридора.
Степень разработанности темы диссертационного исследования
В доступной нам отечественной и зарубежной литературе исследования нейропротекторного эффекта лития именно при этанол–индуцированном нейроапоптозе встречаются весьма ограниченно. Практически отсутствуют экспериментальные работы, изучающие влияние лития на развитие уже сформированной алкогольной нейродегенерации, на фоне продолжающегося введения этанола. Недостаточно изучено возможное усугубление течения алкогольного поражения печени при приёме препаратов лития. Всё указанное позволило сформулировать цель и задачи настоящей работы.
Цель исследования: изучить нейропротекторный эффект и оценить влияние композиции лития цитрата с оксидом алюминия и полиметилсилоксаном на морфофункциональные изменение в мозге на модели субхронической алкогольной интоксикации.
Задачи исследования:
-
Изучить влияние исследуемой композиции на продолжительность этанолового наркоза.
-
Выбрать и обосновать условия моделирования субхронической алкогольной интоксикации у мышей и оценить последствия интоксикации на ориентировочно–исследовательское поведение и координацию движений.
-
Провести морфофункциональную оценку нейропротекторного и потенциального гепатотоксического действия композиции в условиях субхронической алкогольной интоксикации.
-
Исследовать основные фармакокинетические параметры композиции лития цитрата in vitro и in vivo.
Научная новизна работы. Впервые в работе был показан нейропротекторный эффект новой фармацевтической композиции лития цитрата в отношении структурных этанол– индуцированных нарушений в мозге животных на модели субхронической алкогольной интоксикации. Показано, что композиция лития не потенцирует гепатотоксический эффект этанола при совместном воздействии. Установлено, что композиция лития не усиливает наркотический эффект этанола, а при субхронической алкогольной интоксикации улучшает показатели ориентировочного рефлекса и сохранность условного рефлекса пассивного избегания. Показано пролонгированное высвобождение активного фармацетического ингредиента – лития цитрата в бескамерном фармакокинетическом анализе при однократном введении.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты настоящего исследования могут
быть использованы при разработке методов фармакологической коррекции
нейродегенеративных изменений различного генеза.
Полученные данные положены в основу разработки нового нормотимического лекарственного средства, и являются основанием для расширения показаний к применению.
Используемый подход к конструированию новой лекарственной формы – совместное
использование лития цитрата и вспомогательного компонента – оксида алюминия,
модифицированного кремнийорганическим полимером, пролонгирует высвобождения
активного фармацевтического ингредиента – лития, способствуя поддержанию стабильных концентраций иона лития в сыворотке крови и головном мозге, что важно для осуществления терапевтического эффекта лития.
Методология и методы исследования. В соответствии с поставленными задачами были выбраны современные высокоинформативные методические подходы. Диссертационная работа представляет собой экспериментальное исследование, выполненное на 370 животных. Основные эксперименты выполнены согласно методическим рекомендациям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., 2012), «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005). В ходе работы на этапе отработки модели субхронической алкогольной интоксикации (СХАИ) для оценки ориентировочно– исследовательского поведения животных проводили тест «Open field» («Открытое поле»), моторного дефицита и степени нарушения координации движений – «вращающийся стержень». На этапе комплексной оценки композиции лития цитрата при СХАИ, для изучения влияния на процессы обучения и запоминания вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ), для оценки уровня депрессивности животных использовали тест Порсолта («принудительного плавания»). Количественное определение лития осуществляли методом
атомно–эмиссионной спектрометрии с индуктивно–связанной плазмой (АЭС – ИСП). Тест «Растворение» проводили для композиции лития цитрата и таблеток карбоната лития («Седалит», Россия) в соответствии с методиками ГФ XIII ОФС. 1.4.2.0014.15 (Том II, стр. 225). Фармакокинетику композиции лития цитрата изучали после однократного перорального введения у мышей в дозе 1120 мг/кг (5,6 мг/кг в пересчете на литий). Расчет фармакокинетических параметров проведены для однокамерной модели с использованием PKSolver – надстройки программы Microsoft Office Excel 2007 (Zhang Y. etal., 2010). Для изучения нейропротекторного и потенциального гепатотоксического эффекта композиции лития цитрата проводили морфологическое исследование соответствующих органов. Все полученные результаты подвергались статистической обработке.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Введение композиции лития цитрата в дозе 1120 мг/кг не потенцирует наркотический эффект этанола, а при субхронической алкогольной интоксикации улучшает показатели ориентировочного рефлекса и сохранность условного рефлекса пассивного избегания на 7–е и 14–е сутки после начала введения.
-
Композиции лития цитрата коррегирует нейротоксический эффект при субхронической алкогольной интоксикации и не усугубляет течение гепатотоксического эффекта этанола.
-
Определены основные фармакокинетические параметры для исследуемой композиции, доказывающие пролонгированное высвобождение активного фармацевтического ингредиента – лития.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала с использованием современных методов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы, точностью статистической обработки полученных результатов.
Материалы диссертации были представлены на VI, VII Российской (итоговой) научно– практической конкурс - конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2015, 2016), на заочной XVII международной научно–практической конференции «Современные концепции научных исследований» (Москва, 2015), на XII международной конференции «Лимфология: от фундаментальных исследований к медицинским технологиям» (Новосибирск, 2016), на 54–й Международной научной студенческой конференции «МНСК – 2016» (Новосибирск, 2016), на Международной научно–практической конференции «Перспективные научные исследования – 2016» (София, 2016), на симпозиуме «Когнитивные науки, геномика и биоинформатика – 2016» (Новосибирск, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ. Получен патент на изобретение № 2620118.
Работа выполнена в ходе проведения ПНИЭР, выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». Основанием для проведения ПНИЭР является Государственный контракт от «28» августа 2015 г. №14.N08.12.1041.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает 132 источника, из них 53 отечественных, 79 иностранных.
Работа выполнена в лаборатории фармакологических исследований Отдела медицинской химии ФГБУН Новосибирского института органической химии им Н.Н. Ворожцова СО РАН (зав. лаб. д.б.н., проф. Т.Г. Толстикова), совместно с лабораторией лимфорегуляции ФГБНУ Научно–исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии (зав. лаб. к.х.н., Л.Н. Рачковская), лабораторией ультраструктурных исследований (зав. лаб. д.б.н., проф. Н.П. Бгатова).
Автор выражает благодарность научному руководителю д.м.н., проф. А.Ю. Летягину и
научному консультанту д.б.н., проф. Т.Г. Толстиковой за неоценимую помощь в интерпретации
полученных данных и написании диссертационной работы. Автор выражает благодарность
к.х.н. Л.Н. Рачковской за поддержку и помощь в ходе выполняемой работы. Автор искренне
признателен всему коллективу лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН
за помощь в проведении экспериментальных работ. Также автор благодарит д.м.н. Н.А. Жукову
и д.б.н., проф. Н.П. Бгатову за помощь в выполнении гистологических исследований и
интерпретации полученных результатов. Автор благодарит сотрудников кафедры
фармацевтической технологии и биотехнологии НГМУ за возможность проведения фармацевтических исследований.
Современные представления о механизмах развития органических поражений мозга на примере алкогольной энцефалопатии
Мозг является одним из основных органов – мишеней негативного воздействия алкоголя. Злоупотребление алкоголем приводит к изменениям в структуре и функциях мозга. У больных с хроническим алкоголизмом отмечают выраженные нарушения когнитивных и двигательных способностей, в том числе нарушение мышления, заторможенность реакции, проблемы с концентрацией внимания, нестабильность настроения, снижается поведенческий контроль. Считается, что алкоголь оказывает негативное влияние на всю нервную систему в целом, однако некоторые области мозга или клеточные популяции являются более чувствительными. Префронтальная кора, гиппокамп, мозжечок, белое вещество и глиальные клетки особенно восприимчивы к воздействию этанола (Alfonso– Loeches S., Guerri C., 2011).
Патогенез алкогольного поражения мозга включает в себя комплекс взаимосвязанных процессов, которые взаимодействуя между собой, реализуют нейротоксические эффекты этанола через общие патогенетические пути: повышение активности глутаматной системы (эксайтотоксичность), оксидативный стресс как следствие усиления образования свободных радикалов и оксида азота, прогрессирующее нейровоспаление, активация механизмов апоптоза (Bates M.E., Bowden S.C., Barry D., 2002; Haorah J, Ramirez S.H., Floreani N. et al., 2008; Obernier J.A., Bouldin T.W., Crews F.T., 2002; Yang J.–Y., Xue X., Tian H. et al., 2014).
В настоящее время исследователи придерживаются двух направлений относительно патогенеза этанол–индуцированной нейродегенерации: 1) Изменение транскрипционных факторов в мозге, вызывающее оксидативный стресс; 2) Ингибирование этанолом нейрогенеза. Далее рассмотрены подробнее оба этих направления. Многочисленные экспериментальные данные подтверждают тот факт, что этанол–индуцированная нейродегенерация развивается из–за оксидативного стресса, вызванного провоспалительными ферментами. Так, в исследовании in vitro было установлено, что введение в культуру клеток гиппокампа этанола приводит к изменению транскрипции белка в частности, повышению связывания с ДНК транскрипционного фактора каппа–би (NF–kB) и соответственно снижению связывания – транскрипционного фактора CREB.
Семейство транскрипционных факторов CREB активируется фосфорилированием и активация CREB в нервной системе отмечается в ответ на обучение, физическую нагрузку, боль, гипоксию, разнообразные стрессы и др (Баранова К.А., Рыбникова Е.А., Чурилова А.В. и др., 2014). CREB играет важную роль в процессах обучения, памяти, связывая синаптическую активность с долгосрочными изменениями в нейрональной пластичности (Lonze B.E., Ginty D.D., 2002).
Транскрипционный фактор NF–kB участвует в воспалительных и иммунных реакциях, пролиферации и апоптозе клеток. В ЦНС активация NF–kB может опосредовать как реализацию непатологического эндогенного сигнала, т.е. участвовать в нормальном функционировании мозга, так и патологического состояния мозга при различных неврологических заболеваниях (Chen L.–F., Greene W.C., 2004). Баланс экспрессии и активации этих двух факторов транскрипции является одним из механизмов нейротоксического действия этанола. В культуре клеток гиппокампа было установлено, что этанол снижает уровень CREB – регулируемого гена – нейротрофического фактора мозга (BDNF), что способствует развитию этанол–индуцированной нейродегенерации (Zou J., Crews F., 2006).
Активация NF–kB связана с увеличением провоспалительных цитокинов, например, фактора некроза опухоли – альфа (tumor necrosis factor–) (TNF). TNF стимулирует продукцию ИЛ –1, ИЛ – 6, ИЛ – 8, интерферона – (Banks W.A., 2005). Взаимосвязь между цитокинами и развитием алкогольной энцефалопатии подробно описана в обзоре Crews et al. 2006 (Crews F.T., Bechara R., Brown L.A. et al., 2006a). TNF также может потенцировать глутаматную эксайтотоксичность за счет ингибирования обратного захвата глутамата через NF–B.
Также доказательством того, что этанол–индуцированная нейродегенерация развивается в результате оксидативного стресса, является то, что введение антиоксидантов восстанавливает нейрогенез в зубчатой извилине гиппокампа, которая избирательно нарушается на фоне хронического алкоголизма у крыс (Herrera D.G., Yague A.G., Johnsen–Soriano S. et al., 2003).
Другим механизмом нейротоксичности этанола является ингибирование генеза нейронов и глии (Nixon K., 2006). Морфологические исследования, проведенные при различных нейродегенеративных заболеваниях, показали прямую корреляцию между торможением нейрогенеза в зубчатой извилине и потерей клеточного объёма, причем это часто происходит без явного увеличения гибели клеток (Eisch A.J., 2002). Таким образом, этанол, активируя каскад провоспалительные цитокины – оксидативный стресс ингибирует пролиферацию нервных стволовых клеток, что в свою очередь приводит к уменьшению нейрогенеза (Crews F.T., Mdzinarishvili A., Kim D. et al., 2006b).
Исследуемые вещества
Оценку процессов обучения и запоминания проводили в тесте условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) (Passive Avoidance) (Coulbourn, США) (Хабриев Р.У., 2005). Экспериментальная установка УРПИ представляет собой прямоугольную камеру с металлическим полом, разделенную на два отсека (темный и ярко освещенный) с помощью темного бокса с входным отверстием размерами 4х4 см посредине у основания. Животное помещали в освещенный отсек камеры хвостом к входному отверстию. С целью обучения животное при переходе из светлой камеры в темную получает однократное болевое раздражение электротоком (2 мА). Продолжительность раздражения определяется выбеганием животного из темного отсека.
О качестве выработки рефлекса судили по времени захода в темный отсек камеры при воспроизведении УРПИ (латентный период рефлекса), доле животных, не зашедших в темный отсек при повторном тестировании и времени пребывания в нем. Проверку наличия рефлекса осуществляли через 24 часа после обучения
Тест Порсолта или тест «принудительного плавания» использовали для оценки уровня депрессивности у животных (Хабриев Р.У., 2005; Porsolt R.D., Bertin A., Jalfre M, 1977). Мышь помещали в цилиндр с водой (Т=25±1C) и в течение 5 мин фиксировали общее время (с) пассивного плавания, состоящего из периодов полной иммобильности и дрейфа, а также латентное время до первой иммобильности животного. За дрейф принимали слабые движения одной или двумя лапами, совершаемые животным для поддержания головы над поверхностью воды. Воду в стакане меняли после каждого животного.
Для определения биохимических показателей крови животных выводили из эксперимента методом декапитации. Кровь забирали в пробирки типа эппендорф объемом 2 мл. Кровь в пробирках отстаивали в течение 20–30 минут при комнатной температуре, после завершения процесса свертывания крови, центрифугировали (центрифуга Sigma 6K15, Германия) пробирку со свернувшейся кровью в течение 15 минут при 3000 об/мин для максимального выдавливания сыворотки из сгустка. После центрифугирования и полной ретракции сгустка отбирали сыворотку, расположенную над ним.
В сыворотке с помощью стандартных наборов реактивов (Biocon) определяли содержание аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), общего белка, общего билирубина. Применяли следующие методы: активность АЛТ и АСТ – оптимизированным энзиматическим кинетическим методом, общий белок – определение с бромфеноловым синим, билирубин общий – прямой метод Вальтерса и Герарда. Измерения выполняли на биохимическом анализаторе Stat Fax 3300 (США).
Объектами для светооптического исследования служили печень и мозг (области Fr1–Fr3 префронтальной коры головного мозга). Для светооптического исследования биологические образцы фиксировали в 4 % растворе параформальдегида, приготовленном на среде Хенкса, дофиксировали в течение 1 ч в 1 % растворе ОsO4 (осмий тетроксид) (Sigma, США) на фосфатном буфере (pH 7.4), обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и заключали в эпон (Serva, Германия). Полутонкие срезы толщиной 1 мкм получали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Германия/Швейцария), окрашивали толуидиновым синим и изучали с помощью светового микроскопа LEICA DME (Германия).
Полученные микрофотографии морфометрировали с помощью компьютерной программы Image J 1.46 (National Institutes of Health, США). Для определения объемных плотностей и численных характеристик гистологических структур печени и мозга использовали закрытую тестовую систему из 154 точек и шагом 100 нм при увеличении 2000 (Автандилов Г.Г., 1990).
Для количественного определения массовой доли лития в биологических объектах (сыворотка крови, мозг) и в водном фильтрате после высвобождения лития с поверхности композиции лития цитрата в водный раствор в тесте «Растворение» использовали метод атомно–эмиссионной спектрометрии с индуктивно–связанной плазмой (АЭС–ИСП). Измерения проводили на спектрометре OPTIMA 4300DV (PerkinElmer, США) с рабочим диапазоном длин волн от 170 до 800 нм. Методика основана на измерении интенсивности спектральных линий определяемого элемента – лития, при изменении его концентрации. Связь интенсивности излучения с массовой концентрацией элемента в растворе устанавливают с помощью градуировочной зависимости, построенной по известным концентрациям рабочих стандартных растворов и по сигналам интенсивности излучения, соответствующим этим концентрациям.
В основе метода АЭС–ИСП лежат следующие процессы: атомизация молекул анализируемого вещества в высокотемпературной плазме; возбуждение образовавшихся атомов; излучение света возбужденными атомами; разложение света на спектр и выделение из него аналитических линий.
Подготовка к выполнению измерений состоит из следующих этапов: 1. Приготовление стандартных растворов; 2. Приготовление исследуемых растворов; 3. Подготовка спектрометра и выполнение измерений концентраций. 1. Приготовление 1 л стандартного раствора с концентрацией 0,1 мг/мл лития проводили по общим рекомендациям для химико–аналитических работ: навеску высушенного при 105С до постоянного веса лития хлористого (LiCl) массой 0,6108 г, быстро взвешивали (соль сильно гигроскопична) с погрешностью не более ±0,0003 г, растворяли в дистиллированной воде. Полученный раствор количественно переносили в мерную колбу вместимостью 1 л и объём доводили до метки дистиллированной водой. Хранят раствор в полиэтиленовой посуде. Срок хранения основного раствора один месяц. Из этого раствора готовили рабочий стандартный раствор с концентрацией лития 10 мкг/мл путём разбавления основного раствора в 10 раз.
Определение основных фармакокинетических параметров после однократного введения композиции лития цитрата
Целью настоящего раздела явилось изучение кинетики высвобождения лития из таблетированной формы лития карбоната («Седалит») с обычным высвобождением и фармацевтической композиции лития цитрата с модифицированным высвобождением и сопоставление полученных данных с результатами фармакокинетических исследований in vivo.
В данном случае лития карбонат и лития цитрат являются фармацевтическими альтернативами, т.е. эти субстанции содержат одно и то же действующее вещество, но в виде различных солей (Dressman J.B., Lennernas H., 2000).
Из таблеток «Седалит» литий высвобождался в течение первых 30 минут почти на 80%. Через 2 часа таблетка карбоната лития полностью растворяется в воде, поэтому дальнейшее измерение не проводилось и точки на графике отсутствуют (Рисунок 13). Совсем иную картину демонстрирует композиция цитрата лития с модифицированным высвобождением. Литий из композиции высвобождается не более 50%. Это связано с химическими связями (водородными), возникающими между лития цитратом, оксидом алюминия и полиметилсилоксаном, также литий задерживается и в самом поровом пространстве носителя. 3.4.2 Бескамерный фармакокинетический анализ композиции на основе лития цитрата, оксида алюминия и полиметилсилоксана в эксперименте на животных
В результате проведенного эксперимента были получены фармакокинетические кривые зависимости концентрации ионов лития от времени для сыворотки (Рисунок 14А) и мозга (Рисунок 14Б). Фармакокинетические кривые содержания лития в сыворотке крови (А) и в гомогенатах мозга (Б) после однократного ведения лития цитрата (ЛЦ) 75 мг/кг и композиции лития цитрата (КЛЦ) 1120 мг/кг (5,6 мг/кг в расчете на элементный литий) Примечание: по оси абсцисс – время, ч; по оси ординат – концентрация лития в сыворотке крови мышей, мкг/мл (А), гомогенатах мозга мышей, мкг/г (Б).
При сравнении экспериментальных данных по кинетике субстанции ЛЦ и новой лекарственной формы ЛЦ различия установлены на фазе всасывания и элиминации: при введении ЛЦ совместно с пористым вспомогательным компонентом уменьшается Сmax и Tmax, увеличивается период полувыведения. После введения субстанции ЛЦ уровень лития в сыворотке повышается уже через 15 минут, максимальная концентрация определяется через 2 часа и составляет 12,1 мкг/мл. КЛЦ повышает уровень лития в сыворотке в течение первого часа, максимальная концентрация определяется через 1 час и составляет 2,80 мкг/мл, что в 4,3 раза ниже, чем у ЛЦ (Рисунок 14А). Период полувыведения у композиции лития цитрата в 2,4 раза больше, чем у референтного лития цитрата.
После введения субстанции ЛЦ уровень лития в мозге повышается уже через полчаса после введения, через 6 часов достигается максимальная концентрация и составляет 1,03 мкг/г. КЛЦ повышает уровень лития в мозге примерно через час после введения, максимальная концентрация определяется через 2 часа и составляет 0,29 мкг/г, что в 3,5 раза ниже, чем у ЛЦ (Рисунок 14Б).
На основании полученных экспериментальных данных с помощью надстройки программы Microsoft Office Excel 2007 – PKSolver были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для ЛЦ и КЛЦ в сыворотке крови мышей (Таблица 23).
Относительную биодоступность КЛЦ рассчитывали по формуле: Fотн. (%) = AUC(КЛЦ) /AUC(ЛЦ). 100 %.
Сопоставление фармакокинетических параметров КЛЦ относительно ЛЦ показывает, что величина AUC уменьшается в 2,25 раза, клиренс увеличивается в 1,3 раза, увеличивается MRT – среднее время удержания препарата в организме, которое составило для ЛЦ – 12,36 ч, для КЛЦ – 60,60 ч. При этом величина AUC0– t КЛЦ в 2,25 раза ниже AUC0–t ЛЦ соответственно 74,04 мкг ч/мл и 166,7 мкг ч/мл. Рассчитанная величина относительной биодоступности КЛЦ в сравнении с ЛЦ составила 44,41%.
После введения пористой компоненты в субстанцию ЛЦ снижается величина Cmax и AUC, что связано с ухудшением его абсорбции с поверхности пор в ЖКТ. КЛЦ при введении внутрь поступает в системный кровоток в меньшей концентрации, что обусловливает уменьшение его биодоступности. Но в тоже время пористая компонента способствует поддержанию более длительного и равномерного уровня лития в сыворотке крови, увеличивая период полувыведения.
Оценка высшей нервной деятельности животных
Современные экспериментальные исследования, посвященные изучению механизмов развития органических поражений ЦНС, подтверждают факт формирования поведенческих отклонений у модельных животных, подвергшихся воздействию экзогенных или эндогенных факторов, вызвавших поражение ЦНС (Лисицкий Д.С., 2014; Сазонова Е.Н., Симанкова А.А., Лебедько О.А. и др., 2011). Для многих заболеваний из этой группы установлена связь между субстратом повреждения и клинической симптоматикой.
Несмотря на разнообразие причин, способных вызвать поражение ЦНС, патогенез этих заболеваний определяется типовыми процессами, среди которых большое значение придается структурным изменениям нейрональных белков, повышению активности глутаматной системы (эксайтотоксичности), оксидативному стрессу и апоптозу (Лысогорская Е.В., Клюшников С.А., 2015; Haorah J, Ramirez S.H., Floreani N. et al., 2008; Obernier J. A., Bouldin T.W., Crews F.T., 2002; Yang J.–Y., Xue X., Tian H. et al., 2014). Каждый из этих процессов является потенциальной мишенью для терапевтического воздействия.
Перспективным направлением в терапии нейродегенеративных заболеваний является применение БАС, обладающих комплексным действием в отношении ряда ключевых звеньев нейродегенерации, общих для разных форм патологии. В этом плане перспективными являются препараты лития, механизм нейропротекторного действия которых реализуется через: ингибирование гликоген синтаз киназы (GSK–3), стимулирование белка теплового шока (hsp70) (Chiu С.–Т., Chuang D.–M., 2010), ингибирование входа кальция в клетку через NMDA глютаминовые рецепторы и активацию EPK сигнального пути (Einat H., Yuan P., Gould T.D. et al., 2003).
Литий – один из самых старых препаратов, применяемых в психиатрии, и не теряющий своей актуальности в настоящее время. Это связано с тем, что литий обладает широким спектром биологической активности, которая не имеет аналогов. Литий является золотым стандартом лечения аффективных расстройств (Geddes J.R., Burgess S., Hawton K. et al., 2004; Mller–Oerlinghausen B., Felber W., Berghfer A. et al., 2005), есть работы, подтверждающие нейропротекторный и нейрорегенеративный эффекты лития, как при острых повреждениях мозга, так и при хронических нейродегенеративных заболеваниях (Chiu, Chuang D.–M., 2010; Noble W., Planel E., Zehr C. et al., 2005; Wada A., Yokoo H., Yanagita T. et al., 2005).
Несмотря на все положительные эффекты, препараты лития достаточно ограниченно используются в клинической практике из–за трудности подбора терапевтической дозы, необходимости мониторирования его концентрации в крови, развития дозозависимых побочных эффектов, многократный (3–4 раза в сутки) приём, снижающий комплаентность пациента к лечению.
В связи с перечисленными недостатками в клинической практике предпочтение отдается пролонгированным ЛФ лития, кратность приёма которых составляет 1 раз в сутки, нарастание концентрации происходит более плавно, без резких пиков. В Государственном реестре ЛС РФ зарегистрирован единственный препарат лития – «Седалит» (ОАО «Фармстандарт – Лексредства», Россия; № рег. ЛСР– 001453/07). Пролонгированных форм лития в РФ не зарегистрировано. Создание ЛФ лития с замедленным высвобождением является актуальной технологической задачей, т.к. она позволяет избежать быстрого нарастания концентрации лития в сыворотке крови, что влечет за собой деление терапевтической дозы и многократый приём препарата, развитие дозозависимых побочных эффектов из– за узкого терапевтического коридора.
Настоящая работа выполнена в ходе проведения ПНИЭР «Доклинические исследования нормотимического лекарственного средства на основе комплекса лития цитрата, полиметилсилоксана и оксида алюминия», выполняемой в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». И содержит разделы, включающие исследования дополнительной фармакологической активности композиции лития цитрата и части фармакокинетического анализа. Таким образом, целью данной работы была оценка нейропротекторного действия композиции лития цитрата на фоне субхронической алкогольной интоксикации. Что в перспективе дает расширение показаний для данной нормотимической композиции в клинической практике.
Работа состояла из четырех этапов: выявление способности композиции ослаблять острую алкогольную интоксикацию; выбор и отработка патологической модели (нейродегенерации), оценка нейропротекторного эффекта композиции на выбранной модели и изучение фармакокинетики.
В настоящем исследовании для моделирования нейродегенерации была использована субхроническая алкогольная интоксикация потому что алкоголизм является актуальной медико–социальной и экономической проблемой во всем мире.
На первом этапе было установлено, что сам оксид алюминия с полиметилсилоксаном в дозе 1120 мг/кг и композиция лития цитрата в дозе 1120 мг/кг достоверно уменьшают продолжительность этанолового наркоза в 1,6 и 1,45 раз соответственно. В то время как лития карбонат в дозе 30 мг/кг и лития цитрат в дозе 70 мг/кг не оказывали статистически значимого эффекта на длительность этанолового наркоза, что позволяет сделать вывод об отсутствии у данных соединений лития угнетающего или стимулирующего эффекта на действие этанола. Полученные данные об отсутствии этанол–потенцирующих свойств у композиции подтвердили целесообразность использования данного соединения с целью ослабления нейротоксических эффектов этанола.