Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы Фармакокинетические исследования при разработке новых пептидных лекарственных препаратов 13
1.1 Фармакокинетика и метаболизм пептидных лекарственных веществ 14
1.1.1 Всасывание и биодоступность пептидных лекарственных веществ 14
1.1.2 Ферменты, участвующие в метаболизме пептидных лекарственных веществ 15
1.1.3 Фармакокинетика коротких пептидов – аналогов природных нейропептидов 17
1.1.3.1 Фармакокинетика ноопепта 17
1.1.3.2 Фармакокинетика дилепта 19
1.2 Межвидовая экстраполяция фармакокинетических параметров лекарственных веществ 21
1.3 Фармакокинетические закономерности в проявлении действия психотропных лекарственных средств 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1 Материалы 38
2.1.1 Объекты исследования 38
2.1.2 Химические реактивы 39
2.1.3 Средства измерений 39
2.1.4 Вспомогательные устройства 39
2.2 Экспериментальные животные 40
2.2.1 Крысы 40
2.2.2 Кролики 41
2.3 Отбор здоровых добровольцев 42
2.4 Методы 45
2.4.1 Способы отбора образцов крови 45
2.4.1.1 Способы отбора образцов крови у крыс 45
2.4.1.2 Способы отбора образцов крови у кроликов 45
2.4.1.3 Способы отбора образцов плазмы крови у добровольцев 45
2.4.2 Извлечение соединения ГБ-115 из плазмы крови 46
2.4.2.1 Извлечение соединения ГБ-115 из плазмы крови крыс 46
2.4.2.2 Извлечение соединения ГБ-115 из плазмы крови кроликов 46
2.4.2.3 Извлечение соединения ГБ-115 из плазмы крови добровольцев 47
2.5 Количественное определение ГБ-115 47
2.5.1 Количественное определение ГБ-115 в плазме крови крыс 47
2.5.2 Количественное определение ГБ-115 в плазме крови кроликов 48
2.5.2.1 Приготовление растворов 48
2.5.2.2 Хромато-масс-спектрометрический анализ ГБ-115 в плазме крови кроликов 50
2.5.2.2.1 Определение градуировочных зависимостей в плазме крови кроликов 52
2.5.2.3 Процент извлечения ГБ-115 из плазмы крови кроликов 53
2.5.2.4 Валидация методики 54
2.5.3 Количественное определение ГБ-115 в плазме крови добровольцев 56
2.5.3.1 Приготовление растворов 56
2.5.3.2 Хромато-масс-спектрометрический анализ ГБ-115 в плазме крови добровольцев 58
2.5.3.2.1 Определение градуировочных зависимостей в плазме крови добровольцев 59
2.5.3.3 Процент извлечения ГБ-115 из плазмы крови человека 61
2.5.3.4 Валидация методики 62
2.6 Расчет основных фармакокинетических параметров ГБ-115 64
2.7 Статистическая обработка полученных результатов 65
Глава 3. Результаты исследования 66
3.1 Доклиническая фармакокинетика соединения ГБ-115 66
3.1.1 Фармакокинетика соединения ГБ-115 у крыс 66
3.1.2 Фармакокинетика соединения ГБ-115 у кроликов 69
3.2 Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических субстанций и композиций соединения ГБ-115 71
3.2.1 Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических субстанций соединения ГБ-115 71
3.2.2 Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических композиций соединения ГБ-115 81
3.3 Сравнительная фармакокинетика и относительная биодоступность таблеток и субстанции ГБ-115 92
3.4 Клиническая фармакокинетика соединения ГБ-115 96
3.5 Межвидовая экстраполяции фармакокинетических параметров соединения ГБ-115 106
3.5.1 Особенности фармакокинетики соединения ГБ-115 у животных и человека 106
3.5.2 Прогнозирование периода полувыведения соединения ГБ-115 у человека по результатам фармакокинетического исследования на крысах и кроликах 109
Итоговое заключение 113
Выводы 115
Практические рекомендации 116
Список сокращений 117
Список литературы 119
- Фармакокинетика дилепта
- Фармакокинетика соединения ГБ-115 у крыс
- Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических композиций соединения ГБ-115
- Прогнозирование периода полувыведения соединения ГБ-115 у человека по результатам фармакокинетического исследования на крысах и кроликах
Фармакокинетика дилепта
Фармакокинетику дилепта изучали на 2-х видов животных: крысах в дозе 200 мг/кг, кроликах в дозе 40 мг и у человека в 3 дозах: 20, 40 и 60 мг. Регламент проведения изучения экспериментальной и клинической фармакокинетики, экстракция и количественное определение дилепта и его метаболитов, использование инструментального оборудования, расчт фармакокинетических параметров, статистическая обработка полученных результатов описаны в работах [31,43,44,45,46].
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс спектрометрическим детектированием определены концентрации нового пептидного препарата дилепта и его основных метаболитов М-1 (N-капроил-L пролил-L-тирозин) и М-2 (N-капроил-L-пролин) в плазме крови крыс, кроликов и добровольцев. Показано, что независимо от видовой принадлежности дилепт превращается в M-1 и М-2. Данный метод позволил реализовать важнейший этап разработки инновационного лекарственного средства изучение его экспериментальной и клинической фармакокинетики [31,43].
На кроликах проведено сравнительное фармакокинетическое исследование таблеток и субстанции дилепта в дозе 40 мг. Относительная биодоступность лекарственной формы составила 93,46±28,91% [46].
Изучена клиническая фармакокинетика дилепта таблетки 20 мг на добровольцах после однократного применения 20, 40 и 60 мг. Установлено, что из-за интенсивного процесса метаболизма исходное соединение определяется в плазме крови добровольцев в нанограммовом диапазоне. Период полувыведения дилепта из плазмы крови колебался в диапазоне 0,4-3,4 ч [44].
Проведен сравнительный анализ результатов изучения клинической фармакокинетики дилепта с экспериментальными данными. При сравнении дозонезависимых фармакокинетических параметров метаболитов дилепта М-1 и М-2 у животных и добровольцев, характеризующих интенсивность очищения организма от препарата, были выявлены существенные межвидовые различия: скорость выведения метаболита дилепта М-1 из ЖКТ замедляется в ряду крыса = кролик человек. Для метаболита М-2 отмечена другая зависимость: человек кролик крыса.
Степень превращения дилепта в М-1 для крыс была в 13 раз выше, чем у кроликов и почти в 4 раза выше, чем у добровольцев. Похожие результаты наблюдаются для показателя степени превращения дилепта в М-2: в 13 и 2,5 раза, соответственно.
Таким образом, интенсивность метаболизма неизмененного соединения у животных и человека различна и уменьшается в ряду крыса человек кролик [43].
Межвидовые различия в активности метаболизирующих систем дилепта у крыс и человека были получены и в опытах in vitro: за 1 час инкубации субстанции с плазмой крови крыс, препарат почти полностью метаболизировался, в то время как в присутствии плазмы крови человека 90% добавленного дилепта сохранялось в неизмененном виде. Полученные в настоящем исследовании результаты о нестабильности метилового эфира N-капроил-L-пролил-L-тирозина в плазме крови крыс как в опытах на животных, так и в модельных опытах с плазмой крови крыс находятся в соответствии с литературными данными о высокой активности эстеразы у грызунов.
Таким образом, в плазме крови крыс после перорального введения дилепта обнаружены и идентифицированы его основные метаболиты – N-капроил-L-пролил-L-тирозин и N-капроил-L-пролин. При сопоставлении результатов метаболической устойчивости дилепта в опытах in vitro и in vivo установлено, что основным метаболитом дилепта в плазме крови крыс является N-капроил-L-пролил-L-тирозин, который образуется в результате деметилирования дилепта эстеразами плазмы крови грызунов. Активность этого фермента у человека значительно ниже по сравнению с ферментативной активностью экспериментальных животных. В опытах после перорального введения дилепта крысам выявлен второй продукт биотрансформации – N-капроил-L-пролин, который образуется в результате гидролиза пептидной связи [32].
В целом, результаты проведенного клинико-экспериментального исследования особенностей фармакокинетики и метаболизма дилепта подтверждают данные о межвидовых различиях в интенсивности биотрансформации лекарственных препаратов в организме крыс, кроликов и человека [43,45].
На основе данных, полученных на крысах и кроликах, впервые проведена межвидовая экстраполяция фармакокинетических параметров дилепта на человека. Аллометрический подход расчета фармакокинетических параметров показал, что период полувыведения дилепта у человека в большей степени соответствует параметру, рассчитанному на основе данных, полученных у крыс [43].
Фармакокинетика соединения ГБ-115 у крыс
Расчеты фармакокинетических параметров соединения ГБ-115 в плазме крови крыс выполнены на основе данных, полученных совместно с Иванниковой Е.В. [19].
На рисунке 4 представлена усредненная фармакокинетическая кривая ГБ-115 в плазме крови крыс после однократного перорального введения ГБ-115 в виде суспензии (доза 100 мг/кг). Поскольку на каждую временную точку использовали по 6 животных, результирующая фармакокинетическая кривая была построена по усредненным концентрациям, поэтому при расчетах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Как видно из рисунка 4, ГБ-115 быстро всасывался из ЖКТ в системный кровоток и определялся в плазме крови уже через 5 мин после введения (величина Сmax/ AUC0Т, составила 3,0794 ч-1).
Фармакокинетические параметры ГБ-115 у крыс после перорального введения субстанции в виде суспензии в дозе 100 мг/кг представлены в таблице 16. Максимальная концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс (146,16 нг/мл) достигалась через 0,17 ч (10 мин) после введения препарата. Соединение ГБ-115 достаточно быстро выводится из организма животных. Об этом свидетельствуют значения следующих фармакокинетических параметров: период полувыведения исследуемого вещества составил 0,24 ч, а среднее время удерживания (MRT) ГБ-115 в организме животных – 0,28 ч. При этом величина плазменного клиренса (Cl/F) исследуемого вещества составила 2,11 л/ч/кг.
Параметром, характеризующим степень проникновения лекарственного вещества в ткани, является кажущийся объем распределения (Vd/F). Его величина составила 0,74 л/кг. Кажущийся объем распределения обычно неэквивалентен анатомическому объему, а отражает распределение препарата и степень его связывания в организме. Так, если препарат связывается преимущественно белками крови, Vd/F будет меньше, чем реальный. С другой стороны, преимущественное связывание препарата во внесосудистом пространстве приводит к превышению значения Vd/F над реальным. В нашем случае расчет величин Vd/F дал значительно большие результаты, указывающие, что ГБ-115 распределяется во всех жидких средах организма животных [63].
Фармакокинетика и фармакодинамика фармацевтических композиций соединения ГБ-115
Фармакотерапия тревожных расстройств требует разработки пероральных лекарственных форм, поскольку длительность и частота применения препаратов исключает парентеральное введение в виду известных ограничений [124]. В рамках разработки концепции создания дипептидных лекарственных препаратов была доказана возможность их перорального применения [21].Соединение ГБ-115 принадлежит к труднорастворимым лекарственным веществам, что определяет отсутствие корреляции дозы и фармакологической активности, обусловленное низкой биодоступностью. Используя физические (получение твердых дисперсных систем) и технологические (получение самоэмульгирующихся систем) методы повышения биологической и фармацевтической доступности лекарственных веществ [3], разработан ряд фармацевтических композиций дипептида ГБ-115, отличающихся по составу и технологии приготовления.
Цель исследования – изучение фармакокинетики и анксиолитической активности фармацевтических композиций соединения ГБ-115, разработанных для создания таблетированной лекарственной формы.
Материалы и методы
В качестве стандартных веществ использовали кристаллическую и микронизированную субстанции ГБ-115, содержание основного вещества в которых было не ниже 99%. В работе использовали 4 лабораторных образца фармацевтических композиций (ФК) ГБ-115, а именно ФК№1 (кристаллическая субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс), ФК№2 (микронизированная субстанция ГБ-115, твердая дисперсная система с поливинилпирролидоном), ФК№3 (микронизированная субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс) и ФК№4 (микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза), разработанных в опытно 82 технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (руководитель – д.фарм.н., профессор Б.М. Пятин).
Исследования фармакокинетики проводили на 180 белых беспородных крысах-самцах (с массой тела 180-220 г), полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая» (Московская область).
Субстанции и фармацевтические композиции вводили перорально крысам в дозе 100 мг/кг (в виде водной суспензии с твином-80). Образцы крови отбирали до введения соединения ГБ-115 и через 10, 15, 20, 30, 45 и 60 мин после введения вещества (см. гл. 2 разделы 2.2.1, 2.4.2.1, 2.5.1).
Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно независимым методом (программа M-IND) (см. гл. 2 раздел 2.6).
f (%) – относительная биодоступность (AUC0Т(T)/AUC0Т(R)100%), где T (AUC0Т фармацевтической композиции), R (AUC0Т кристаллической или микронизированной субстанции).
Статистическая обработка полученных результатов представлена в гл. 2 разделе 2.7.
Исследования фармакодинамики проводили на 165 белых беспородных крысах-самцах (с массой тела 180-220 г), полученных из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства», филиал «Столбовая» (Московская область) (см. гл. 3 раздел 3.2.1).
Поскольку ранее было показано смещение диапазона анксиолитических доз ГБ-115 до 0,1-5,0 мг/кг при пероральном использовании [26], для эксперимента были выбраны эффективные дозы ГБ-115 0,3-0,9 мг/кг. В качестве плацебо использовали соответствующие каждой композиции наполнители и вспомогательные вещества без соединения ГБ-115. ФК№1-4 вводили в виде водной суспензии с твином-80 перорально из расчета 0,1 мл/100 г массы тела животных за 45 мин до тестирования.
Результаты и их обсуждение
Фармакокинетические исследования
На рисунке 9 представлены фармакокинетические кривые ГБ-115 в плазме крови крыс после его однократного перорального введения в виде кристаллической и микронизированной субстанций, а также четырех фармацевтических композиций в дозе 100 мг/кг. Как видно из рисунка 9А-Г, ГБ-115 быстро всасывается в ЖКТ, поступает в системный кровоток и определяется в плазме крови крыс уже через 5 мин после введения как субстанций, так и 4-х фармацевтических композиций (ФК№1-4).
Однако на стадии всасывания соединения ГБ-115 отмечаются значительные различия в его количественном содержании после введения анализируемых фармацевтических композиций. Для ФК№1 характерно постепенное увеличение концентрации вещества с достижением максимальной концентрации через 20 мин после введения, которая составляет 126,25 нг/мл, затем отмечается быстрое (в течение 30 мин) падение концентрации. ФК№2 отличается резким подъемом концентрации фармакологически активного соединения: уже через 5 мин после введения она составляет 103,41 нг/мл и достигает максимума через 15 мин – 185,10 нг/мл.
В последующие интервалы времени концентрация ГБ-115 постепенно снижалась на протяжении 1,5 ч и в конечный период времени составила - 35,61 нг/мл. Максимальная концентрация ГБ-115 после введения ФК№3 была самой низкой и составила 97,36 нг/мл через 20 мин после введения. Для данной фармацевтической композиции характерно наличие достаточно высоких концентраций в последующие интервалы времени. Концентрация ГБ-115 после введения ФК№4 достигает своего максимального значения через 15 мин и составляет 121,50 нг/мл.
Значительные различия в кинетике ГБ-115 наблюдались и на стадии его элиминации из плазмы крови крыс. Так, для ФК№1 отмечалось быстрое снижение концентрации ГБ-115 в период 20-30 мин и через 45 мин активное вещество в плазме крови крыс не обнаруживалось. Для ФК№2 и ФК№4 концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс снижалось более медленно и через 90 мин соединение регистрировалось в достаточно высоком количестве. Характер элиминации ГБ-115 после перорального введения ФК№3 более медленный, причем, высокая его концентрация сохранялась в течение 60 мин и составила в этот интервал времени 66,35 нг/мл.
На основании полученных экспериментальных данных рассчитаны основные фармакокинетические параметры ГБ-115 модельно-независимым методом, которые представлены в таблице 21.
Прогнозирование периода полувыведения соединения ГБ-115 у человека по результатам фармакокинетического исследования на крысах и кроликах
Прогностическая ценность экспериментального изучения фармакокинетики лекарственных средств во многом определяется возможностями межвидовой экстраполяции полученных данных. Для этой цели помимо физиологических моделей [37] используют аллометрический подход Дедрика [64]. В соответствии с данным подходом фармакокинетические профили ЛС, различающиеся у животных разных видов, могут быть сведены к одному, если для каждого вида используется не хронологическое, а «фармакокинетическое» время, которое определяется скоростными особенностями протекания фармакокинетических процессов у данного вида [42]. Одним из информативных фармакокинетических параметров является период полувыведения препарата из плазмы/сыворотки крови (t1/2el). Знание этого параметра обеспечивает надлежащее проведение как клинических исследований новых препаратов, так и практическое применение конкретного препарата в медицине. Еще одним преимуществом использования данной характеристики для межвидовой экстраполяции является то, что этот фармакокинетический параметр не зависит от дозы.
Цель исследования – оценка периода полувыведения соединения ГБ-115 у человека по результатам фармакокинетического исследования на крысах и кроликах с использованием аллометрического подхода.
Межвидовые соотношения для фармакокинетических параметров ЛВ формируются на основе концепции биологического подобия, согласно которой у мелких и крупных животных скорости протекания основных физиологических процессов одинаковы, если в качестве параметра «время» использовать не астрономическое (хронологическое), а «биологическое» или «физиологическое» время [34].
Для отображения полученных данных на основе аллометрического подхода использовали метод Дедрика, где хронологические времена отбора проб крови животных пересчитывали в соответствующие «фармакокинетические» времена по уравнению: tpk = t/m0,25, где tpk – «фармакокинетическое» время; m – масса тела кролика или крысы, кг; t – хронологическое время [64].
По профилям изменения концентраций ГБ-115 в плазме крови крыс и кроликов в хронологическом времени и координатах Дедрика модельно-независимым методом рассчитывали периоды полуэлиминации препаратов, выраженных в реальном (t1/2 el) и «фармакокинетическом» времени (t1/2 el pk). Прогнозируемую величину t1/2 el ГБ-115 у человека (t1/2 el h) рассчитывали по уравнению:
На рисунке 13 представлены усредненные фармакокинетические профили ГБ-115 в плазме крови крыс и кроликов после однократного перорального введения исследуемых лекарственных веществ. На рисунке 13А представлены кривые изменения концентраций ГБ-115 от времени в реальном -хронологическом времени и на рисунке 13Б - в «фармакокинетическом» времени, т.е. с поправкой Дедрика. Из рисунка 13Б видно, что происходит «сближение» скорректированных фармакокинетических кривых по сравнению с исходными профилями. Такое «сближение» нашло отражение в величине периода полувыведения исследуемого вещества из плазмы крови животных.
Полученные результаты представлены в таблице 24. Из таблицы 24 видно, что значение t1/2el ГБ-115 у крыс, полученное на основании усредненного фармакокинетического профиля, составило 0,2 ч, в то время как после преобразований величина t1/2 el pk увеличилась до 0,6 ч.
Для кроликов отмечена обратная зависимость, те. среднее значение ti/2ei, рассчитанное для реального времени составило 1,3±0,3 ч и после коррекции на «фармакокинетическое» время - 0,9±0,2 ч. Другими словами, аллометрический подход обеспечивает межвидовое «сближение» определяемого параметра.
В рамках I фазы клинических исследований на добровольцах была изучена фармакокинетика таблетированной формы ГБ-115. На основании индивидуальных фармакокинетических профилей рассчитаны основные фармакокинетические параметры, в частности, период полувыведения. Среднее значение t1/2 el ГБ-115 составило 1,0±0,2 ч [17].
Прогностическая величина t1/2 el у человека на основе данных, полученных на крысах, составила 1,73 ч и данных, полученных на кроликах – 2,60 ч, соответственно.
Таким образом, прогностическая ценность крыс, как модели оценки периода полувыведения ГБ-115 человека, оказалась более достоверной по сравнению с кроликами. С другой стороны, применение аллометрического подхода в межвидовой экстраполяции фармакокинетических данных и прогнозировании периода полувыведения лекарственных веществ у человека может стать основой для оптимизации дизайна фармакокинетического исследования препаратов в клинике. Проведенные исследования экспериментальной и клинической фармакокинетики ГБ-115 подтвердили актуальность применения аллометрического подхода для межвидовой экстраполяции фармакокинетических параметров при переносе на человека.