Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Роль эстрогенов и ароматазы в канцерогенезе рака эндометрия 15
1.2. Фармакологические характеристики ингибиторов ароматазы (классификация и свойства) 21
1.3. Место ингибиторов ароматазы в лечении злокачественных новообразований 27
1.4. Применение ингибиторов ароматазы в лечении рака эндометрия 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Дизайн и объем экспериментальных исследований 41
2.1.1. Экспериментальная модель рака эндометрия на животных 41
2.1.1.1. Опухолевые клетки 41
2.1.1.2. Животные и условия их содержания 41
2.1.1.3. Модель рака эндометрия 43
2.1.1.4. Постановка опытов 44
2.1.1.5. Оценка результатов 45
2.1.1.6. Статистическая обработка данных 46
2.2. Методы иммуногистохимических исследований 46
2.2.1. Выявление комплекса антиген-антитело на гистологических препаратах 46
2.2.2. Окраска авидин-биотиновым методом 46
2.2.3. Фиксация 47
2.2.4. Депарафинирование и обезвоживание 48
2.2.5. Дополнительная обработка срезов перед окрашиванием 48
2.2.6. Определение уровней экспрессии 51
2.2.7. Статистическая обработка результатов иммуногистохимического исследования 52
2.3. Методы клинических исследований з
2.3.1. Клиническая характеристика обследуемых пациенток 52
2.3.1.1. Клиническая характеристика пациенток, получавших лечение ингибиторами ароматазы и тамоксифеном по поводу РМЖ 63
2.3.1.2. Клиническая характеристика пациенток, получавших анастрозол в неоадъювантном режиме по поводу РЭ 66
2.3.2. Эхографические методы исследования 67
2.3.2.1. Аппарат для выполнения эхографического исследования 67
2.3.2.2. Трансабдоминальное сканирование 68
2.3.2.3. Трансвагинальное сканирование 68
2.3.2.4. Цветное допплеровское картирование 70
2.3.2.5. Допплерометрия параметров кровотока в сосудах
2.3.3. Эндоскопические методы исследования 73
2.3.4. Статистические методы клинического исследования 74
Глава 3. Результаты собственных исследований 76
3.1. Результаты изучения влияния сравниваемых препаратов на рост опухолевых клеток рака эндометрия у мышей 76
3.2. Оценка состояния эндометрия у пациенток, получавших лечение по поводу рака молочной железы 78
3.2.1. Гистологическая структура эндометрия у пациенток, получавших лечение по поводу ЗНО молочной железы 79
3.2.2 Экспрессия маркеров клеточной пролиферации и факторов апоптоза в эндометрии у пациенток, получавших лечение по поводу рака молочной железы 80
3.2.3. Экспрессия рецепторов к эстрогену и прогестерону в ткани неизмененного эндометрия у пациенток, получавших гормональную терапию по поводу РМЖ 81
3.2.4. Экспрессия Her2/neu в ткани опухоли молочной железы у пациенток, получавших лечение по поводу РМЖ 82
3.3. Оценка состояния эндометрия у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки 82
3.3.1. Динамика М-эхо сигнала у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки 83
3.3.2. Динамика скоростей кровотока в артериях матки у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки 85
3.3.3. Динамика гистологической структуры опухоли у пациенток, получавших анастрозол в неоадъювантном режиме по поводу ЗНО тела матки 85
3.3.4. Экспрессия маркера пролиферации Ki-в эндометрии у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки 87
3.3.5. Экспрессия рецепторов к эстрогену и рецепторов к прогестерону в ткани эндометрия у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии ЗНО тела матки 88
3.3.6. Экспрессия фермента ароматаза в эндометрии у пациенток, получавших ИА анастрозол в качестве неоадъювантной терапии ЗНО тела матки 89
3.3.7. Экспрессия циклина D1 в эндометрии у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки 90
3.4. Клинический случай: полный ответ на терапию ингибитором ароматазы анастрозолом 91
Глава 4. Обсуждение результатов 98
Выводы 114
Практические рекомендации 116
Список сокращений, условных обозначений и терминов 117
Список литературы 121
- Фармакологические характеристики ингибиторов ароматазы (классификация и свойства)
- Животные и условия их содержания
- Клиническая характеристика пациенток, получавших анастрозол в неоадъювантном режиме по поводу РЭ
- Динамика скоростей кровотока в артериях матки у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки
Введение к работе
Актуальность. Рак эндометрия (РЭ) представляет собой не только клиническую, но и социально-экономическую проблему, так как инцидентность данного заболевания вместе с другими гормонально-зависимыми опухолями в Российской Федерации за последние несколько десятков лет увеличилась более чем в 2 раза, причем результаты лечения во многих регионах являются неудовлетворительными [Кузнецов В. В., Нечушкина В. М., 2004; Ур м а н ч е е ва А. Ф., 2004; Та б а к м а н Ю.Ю., 2009; Чиссов В. И. и др., 2011; Кап-рин А. Д. и др., 2014; Greer B. E., 2009; Tewari K.S. et al., 2012]. Новые тех нологии хирургического лечения — активное тиражирование эндовидео хирургии — не улучшили отдаленные результаты лечения. В недавно выполненном под контролем Gynecologic Oncology Group (GOG) проспективном клиническом исследовании LAP2 (n = 2596) частота рецидивов заболевания в течение 3 лет наблюдения у пациентов с I–IIA стадией рака тела матки (n = 2181) после хирургического лечения составила более 11% [Gunderson C. C. et al., 2014].
Противоопухолевое медикаментозное лечение занимает определенное место в терапии рака эндометрия, значимость которого увеличивается при диссеминированных и метастатических формах заболевания, а также при рецидивной болезни [Maxwell G. L. et al., 2006; King L. P . , M i l l e r D. S., 2009; Altman A.D., 2012; Sommeijer D.W. et al., 2013]. Значимая доля РЭ экспрес-сирует различные изоформы рецепторов стероидных гормонов, при этом, в том числе, от качественного и количественного соотношения рецепторов к эстрогену и прогестерону и их изоформ зависит модулирующий эффект прогестагенов и антиэстрогенов, включая ингибиторы ароматазы (ИА). Однако первичные злокачественные новообразования (ЗНО) тела матки с высоким риском рецидива (низкая дифференцировка, неэндометриоидные гистотипы (светлоклеточный, серозно-папиллярный и др.)) в меньшей степени экспрессируют функциональные рецепторы к прогестерону, так же как и при рецидивной болезни и первично метастастатических формах эндомет-риоидного рака с первоначально высокой и умеренной степенью дифферен-цировки. Средний удельный вес объективных ответов на различные варианты гормональной терапии у пациентов с диссеминированными формами заболевания и/или рецидивирующим раком эндометрия составляет около 25% при средней продолжительности ремиссии или безрецидивного периода до 9 месяцев [Tigpen T. et al., GOG, 1993, 1995; Von Minckwitz G. et al., 2002].
Биосинтез эстрогенов как в гонадах, так и внегонадно, в том числе и в ткани некоторых новообразований, катализируется ферментным комплексом ароматаза, представленным митохондриальным цитохромом Р450. Высокий уровень экспрессии ароматазы определяется при распространенных формах РЭ и/или низкодифференцированном эндометриальном раке [Берштейн Л. М. и др., 2004, 2009, 2011; Mocbel K., 2002; Berstein L. M. et al., 2005; Miller D. et al., 2012]. Даже небольшое увеличение локальной продукции эстрогенов может быть значительным для канцерогенеза и опухолевой прогрессии, так как в микроокружающей среде рецепторы эстрогенов опухолевой ткани являются доступными для локально продуцируемых эстрогенов в пределах малигнизировавшихся клеток [Mocbel K., 2002; Jongen V. H.W.M. et al., 2006; Kesmodel S.B. et al., 2014].
Степень разработанности темы исследования. Эндокринная терапия является как частью комплексной терапии злокачественных новообразований, так и в некоторых случаях самостоятельным видом лечения. В настоящее время ИА III поколения являются перспективным классом новых противоопухолевых препаратов. В исследованиях последних лет получены данные об экспресии ароматазы внутри эндометриальной ткани, установлены корреляционные связи между высокими уровнями экспрессии аро-матазы в строме ткани рака эндометрия и неблагоприятным прогнозом заболевания, продемонстрировано повышение рисков развития РЭ при полиморфизме гена CYP 19 [Mocbel K., 2002; Berstein L. M. et al., 2005; Kesmodel S.B. et al., 2014]. Ус т а н о в л е н о , что угнетение фермента ароматазы приводит к снижению уровня эстрогенов в случае гормонально-чувствительной опухоли и замедлению ее роста [Rose P.G. et al., 2010]. Однако остаются противоречивые данные о взаимоотношениях между рецепторным статусом опухоли и уровнями экспрессии фермента ароматазы, возможных предикторах ответа на терапию ИА, также до конца не ясен доскональный механизм противоопухолевых эффектов ИА в злокачественно измененных тканях и малигнизированных клетках [Берштейн Л. М., 2000; Берштейн Л. М. и др., 2005; Бочкарева Н. В. и др., 2007; Maluf F. C. et al., 2001; Altman A. D. et al., 2012; Hamilton K.J. et al., 2014].
Если в отношении РМЖ получены данные проспективных рандомизированных исследований, в которых продемонстрировано, что в постменопаузе ИА достоверно превосходят тамоксифен в качестве 1-й линии гормональной терапии, как по частоте достижения объективного ответа, так и времени до прогрессирования [Mauri D. et al., 2006], то количество клинических исследований, посвященных лечению РЭ, остается незначительным [Данилова М. А.
и др., 2008; Maluf F.C. et al., 2001; Berstein L. М., 2002; Ma B. B. et al., 2004; Bellone S. et al., 2008], что не позволяет определить стадию заболевания, фенотип опухоли и другие критерии для назначения ИА. Отсутствие регламентированных показаний к ИА как средствам противоопухолевой терапии и формирующиеся клинические протоколы свидетельствуют о недостаточной разработанности темы исследования.
В связи с вышеизложенным, на сегодняшний день привлекает особое внимание применение ингибиторов ароматазы в лечении больных РЭ на разных стадиях опухолевого процесса как препаратов патогенетической терапии гормонально-зависимых опухолей, блокирующих синтез эстрогенов.
Цель исследования. Изучение влияния нестероидного ингибитора ароматазы третьего поколения анастрозола на маркеры пролиферации и апоптоза в злокачественно измененном эндометрии для патогенетического обоснования применения лекарственных соединений данной группы в лечении рака эндометрия.
Задачи исследования:
-
Изучить противоопухолевый эффект нестероидного ингибитора ароматазы третьего поколения анастрозола на экспериментальной модели животных с перевиваемой опухолью, полученной из клеток рака эндометрия.
-
Изучить антипролиферативный эффект ингибитора ароматазы третьего поколения анастрозола на эндометрий у пациенток, получавших данный препарат в качестве эндокринной терапии ЗНО молочной железы.
-
Изучить действие анастрозола на экспрессию фермента ароматаза в злокачественно измененном эндометрии.
-
Изучить действие анастрозола на экспрессию маркеров пролиферации и апоптоза в злокачественно измененном эндометрии при назначении препарата в неоадъювантном режиме.
-
Изучить противоопухолевый эффект анастрозола на злокачественно измененный эндометрий с помощью цветного допплеровского картирования при назначении препарата в неоадъювантном режиме. Научная новизна. Впервые на экспериментальной модели опухолевого
процесса, индуцированного введением в организм мышей клеток рака эндометрия, продемонстрирован противоопухолевый эффект анастрозола. Впервые в клинических исследованиях выявлен выраженный антипролифера тивный эффект ингибитора ароматазы анастрозола на эндометрий, что подтверж дается данными гистероскопических и морфологических исследований у пациен ток, получавших эндокринную терапию по поводу РМЖ.
В результате проведенных иммуногистохимических исследований впервые продемонстрировано, что ингибитор ароматазы третьего поколения анастро-
зол снижает экспрессию фермента ароматазы и маркера пролиферации Ki-67 в злокачественно измененном эндометрии.
Изучен противоопухолевый эффект анастрозола на злокачественно измененный эндометрий в случае применения препарата в неоадъювантном режиме. Морфологические и иммуногистохимические исследования, а также данные допплеровского картирования продемонстрировали, что анастрозол достоверно снижает скорость кровотока в маточных артериях и внутриопу-холевых сосудах, а также изменяет морфологическую характеристику малиг-низированного эндометрия в сторону повышения степени дифференциров-ки опухолевой ткани.
Те о р е т и ч е с к а я и практическая значимость. Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов стероидных гормонов и маркеров пролиферации и апоптоза в ткани эндометрия у пациенток, использующих различные средства адъювантной и индукционной гормональной терапии, определило дополнительные преимущества применения ИА у больных РМЖ. Исследование экспрессии фермента ароматазы и рецепторов стероидных гормонов в ткани злокачественно измененного эндометрия до и после применения ИА в неоадъювантном режиме расширило представление о механизме действия ИА.
Полученные экспериментальные данные, свидетельствующие о противоопухолевом эффекте ингибитора ароматазы третьего поколения анастрозола, проявляющемся в увеличении продолжительности жизни животных с перевиваемой опухолью, позволили провести клинические исследования по протоколу № 11.09-ВА, одобренные экспертной комиссией по противоопухолевым лекарственным средствам ФГБУ «Научный центр экспертизы медицинского применения» и Этическим комитетом Министерства здраво охранения и социального развития Российской Федерации. Полученные клинические данные будут положены в основу большого рандомизированного клинического исследования об эффективности лечения ИА третьего поколения рецидивирующего РЭ. Наши данные и накапливающиеся сведения мировых исследований в этом направлении позволят зарегистрировать новые показания для нестероидных ингибиторов ароматазы третьего поколения как препаратов, применяемых в качестве эндокринной терапии РЭ.
Методология и методы исследования. Методологической основой исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена с использованием экспериментального, морфологического (гистологический, иммуногистохимический), клинического (аналитический, эхографический, эндоскопический) и статистического методов. Объектом
исследований явились экспериментальная модель рака эндометрия, воспроизведенная на лабораторных животных с перевиваемой опухолевой культурой, а также клинический материал онкологических больных, получавших анастро-зол по поводу РМЖ и РЭ. Предметом исследования и анализа явился механизм противоопухолевого действия ингибитора ароматазы III поколения анастро-зола в отношении рака эндометрия. Структура и логическая организация работы определены целью и задачами исследования и включают ряд этапов: определение противоопухолевых свойств ингибитора ароматазы III поколения анастрозола в отношении РЭ, определение эхографических, эндоскопических, гистологических и иммуногистохимических данных эндометрия у пациентов, получающих анастрозол и препарат сравнения — тамоксифен, динамика эхографических и иммуногистохимических данных у больных, получающих анастрозол в качестве эндокринотерапии РЭ в неоадъювантном режиме. Ввод, статистическую обработку и анализ данных проводили с использованием пакета программ статистической обработки результатов SPSS Statistics 17.0 для Windows. В работе использовали методы описательной статистики с дифференцированной оценкой значимости различий показателей в зависимости от типа распределения в исследуемой выборке (нормального или ненормального), проведения межгруппового сравнения различий признака, сравнения парных (сопряженных) выборок.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В эксперименте с перевиваемой опухолью, полученной из клеток рака эндометрия, противоопухолевый эффект ингибитора ароматазы анастрозола проявляется в виде уменьшения асцита и увеличения продолжительности жизни животных.
-
Ингибитор ароматазы третьего поколения анастрозол оказывает выраженный антипролиферативный эффект на эндометрий, что подтверждается данными морфологических и иммуногистохимических исследований.
-
Применение нестероидного ингибитора ароматазы третьего поколения анастрозола в качестве эндокринной терапии рака молочной железы в течение трех лет предотвращает развитие гиперпластических процессов и рака эндометрия по сравнению с тамоксифеном.
-
Противоопухолевые эффекты ингибитора ароматазы анастрозола на злокачественно измененный эндометрий при применении препарата в нео-адъювантном режиме связаны с ингибированием экспрессии фермента ароматазы, маркера пролиферации Ki-67 в ткани опухоли, а также со снижением скорости кровотока в маточных артериях и внутриопухолевых сосудах.
Степень достоверности и апробация результатов. Проведено комплексное обследование пациенток, находящихся на лечении и динамическом наблюдении по основному заболеванию в Санкт-Петербургском городском клиническом онкологическом диспансере. О достоверности полученных результатов свидетельствует значительное количество наблюдений: оценено состояние эндометрия у 299 пациенток с использованием современных инструментальных и лабораторных методов. Клинический материал дополнен экспериментальными данными, полученными на модели лабораторных животных с перевиваемой опухолью РЭ. Научные положения документированы наглядными (схемы, рисунки) и аналитическими (таблицы и рисунки, содержащие диаграммы и графики) материалами. На основании результатов проведенных исследований обоснованы противоопухолевые свойства ИА III поколения анастрозола при лечении РЭ.
Результаты работы представлены, доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современное состояние диагностики, лечения и реабилитации в онкогинекологии» (Санкт-Петербург, 2010), XIX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2015).
Апробация диссертационной работы проведена на межкафедральном заседании кафедры фармакологии ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации и кафедры онкологии факультета последипломного образования ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Использованные в диссертационном исследовании методы и подходы к достижению научной цели до начала их использования были одобрены Комитетом по вопросам этики (заседание № 8 от 24.12.2007 года) при ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Реализация результатов работы. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы НИР ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Минздрава России. Оригинальные авторские подходы методического характера диссертационного исследования внедрены в практической деятельности врачей-специалистов Санкт-Петербургского клинического онкологического диспансера и в научно-исследовательской деятельности и в системе последипломной подготовки врачей-специалистов на кафедре онкологии факультета
последипломного образования ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедре онкологии, детской онкологии и лучевой терапии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Личный вклад автора. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы: проведен сбор и анализ литературы по теме диссертационного исследования, сформулированы цель и задачи, определены объем и методы исследований, выполнены планирование, организация, клиническое обследование пациенток, включенных в исследование, проведены анализ и обобщение полученных результатов, сформулированы выводы и практические рекомендации. Автором лично выполнено эндоскопическое исследование (гистероскопия) всем без исключения пациенткам, включенным в исследование, выполнен постаналитический этап иммуногистохимического исследования с формированием баз данных количественных значений исследуемых признаков с последующим анализом полученной информации при помощи статистических программных приложений для персонального компьютера. Спланирован дизайн, проведены анализ и статистическая обработка экспериментальных данных противоопухолевой эффективности анастро-зола на модели перевиваемой культуры рака эндометрия. Доля участия автора в получении и накоплении результатов — 100%, в статистической обработке — 100%, в проведении экспериментального исследования — 60%, в проведении эндоскопического исследования — 100%, иммуногистохимиче-ского исследования — 60%, эхографического исследования — 100%.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 — в журналах, рекомендованных ВАК, 3 статьи в научно-практических журналах, 2 публикации тезисов, в которых достаточно полно изложены материалы диссертации.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель содержит 193 наименования, в том числе 53 отечественных и 140 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 12 рисунками.
Фармакологические характеристики ингибиторов ароматазы (классификация и свойства)
Развитие применения ИА и начало их использования в клинической практике было обусловлено случайно обнаруженным клиническим противоопухолевым эффектом: ингибитор цитохрома Р450 аминоглютетимид оказался эффективным в лечении распространенного рака молочной железы у постменопаузальных женщин. К исходу 1984 года были опубликованы результаты нескольких исследований и клинических наблюдений, в которых были продемонстрированы достигнутые в результате применения ингибиторов ароматазы как средств противоопухолевой терапии объективные ответы, а также было отмечено уменьшение ароматазной активности. Например, в одной из первых таких публикаций в результате использования аминоглютетимида для лечения распространенного рака эндометрия в относительно невысоких дозах удельный вес достижения объективных ответов составил 22,2% (у 4 из 18 пациенток). Кроме ряда нежелательных побочных эффектов и неблагоприятного токсичного профиля, аминоглютетимид не полностью ингибировал ароматазную активность [112].
Ароматаза по сути является ферментным комплексом микросом, членом цитохрома Р450, который осуществляет в рамках всего организма завершающий этап биосинтеза эстрогенов, обеспечивая химическую реакцию ароматизации С19-стероидов — конверсию андрогенов в эстрогены: биосинтез эстрона из андростендиона, эстрадиола — из тестостерона [191]. Эти химические реакции могут происходить в тканях и органах, где экспрессируется ароматаза: в яичниках, жировой ткани, плаценте, молочных железах, мышцах, головном мозге, фибробластах, остеобластах, печени и др. Ароматизация является скорее универсальной, чем ткане- или органоспецифичной реакцией женского организма (рис. 1 и 2), а наличие ароматазы вне органов репродуктивной системы обеспечивает внегонадный синтез эстрогенов [54, 59, 72, 166, 192].
Фармакологическое развитие лекарственных средств, ингибирующих реакцию ароматизации, прошло несколько этапов. Первое поколение препаратов, обладающих антиароматазной активностью, было представлено аминоглютетимидами (аминоглютетимид и тестолактон) — ингибиторами синтеза глюкокортикоидов. Изначально синтезированный как противоэпилептический препарат, аминоглютетимид обладает, как было установлено впоследствии, способностью подавлять различные этапы стероидогенеза, включая точку входа разветвления боковой цепи холестерина, а также другие важные этапы биосинтеза кортизола и андрогена. Аминоглютетимид наряду с кетоконазолом, метирапоном и митотаном в настоящее время используют для медикаментозной адреналэктомии, что имеет место при избыточной секреции АКТГ и при гормон-продуцирующих опухолях надпочечников. Все препараты, в той или иной степени влияющие на биосинтез кортизола, обладают высоким профилем токсичности и выраженными побочными эффектами, в основном, связанными с недостачностью кортизола [162]. Ингибиторы ароматазы второй генерации (форместан и фадразол) имели более избирательное действие. Клиническая эффективность форместана была продемонстрирована при распространенных гормоночувствительных карциномах молочной железы. Однако эти препараты вводили внутримышечно, и многие пациенты (около 17%) имели локальные воспалительные реакции и лихорадочные состояния, по частоте развития сравнимые с побочными эффектами аминоглютетимида [45].
Третье поколение ингибиторов ароматазы, включающее анастрозол и летрозол, которые имеют более селективное действие в отношении фермента ароматазы, ингибируют только данный фермент и обладают высокой терапевтической активностью. Немаловажным является наличие обратимого действия данных препаратов [61, 87, 162].
Тестолактон, экземестан и форместан являются стероидами и классифицируются как ингибиторы ароматазы первого типа, в то время как аминоглютетимид, анастрозол, летрозол, фадрозол и ворозол являются нестероидными и классифицируются как ингибиторы ароматазы второго типа [69, 80]. Ингибиторы ароматазы не оказывают эстрогенного действия на печень и матку, поэтому они не оказывают неблагоприятного влияния на эти органы, в противоположность тамоксифену [83].
По своей сути, ИА наряду с фулвестраном представляют собой системные антиэстрогенные препараты. Ингибирование ароматазной реакции блокирует синтез эстрогенов, а конкретно синтез эстрадиола, при незначительном влиянии на синтез эстрона, в результате чего происходит снижение уровеня эстрадиола в периферической крови до уровня, определяемого у женщин в постменопаузе. Именно этот фармакологический эффект используют для лечения люминального (положительного по экспрессии эстрогенов) рака молочной железы.
В 1996–1997 гг. растущее число фармацевтических препаратов, синтезированных в качестве ингибиторов ароматазы, обозначило новую эру в клинической практике в лечении гормонально зависимых неоплазий. Относительно недавно, в 1998 году, была продемонстрирована наиболее высокая противоопухолевая активность ИА в сравнении с селективным модулятором эстрогеновых рецепторов — тамоксифеном [112, 162]. Однако до настоящего времени остаются невыясненными два важных аспекта, которые следует принимать во внимание, когда ингибиторы ароматазы используются в качестве лечения гормонально зависимых злокачественных новообразований. Первый — это вопрос наличия возможных предиктивных маркеров чувствительности или резистентности к ИА в полученных гистологических образцах опухоли перед началом лечения пациентки, второй — точные механизмы противоопухолевого действия ингибиторов ароматазы в клетках и/или ткани карциномы.
После аминоглютетимида и тестолактона (первое поколения ингибиторов ароматазы) и второго (форместан и фадразол) появилось третье поколение (анастрозол, летрозол, экземестан и ворозол) ингибиторов ароматазы, эффективность действия которых оказалась от 1000 до 10 000 раз сильнее, чем аминоглютетимида [162]. Препараты третьей (до настоящего времени последней) генерации являются более специфичными по сравнению с прошлыми поколениями препаратов для связывающих сайтов фермента ароматазы, и побочные эффекты при достаточно длительном ежедневном приеме незначительны или умеренно выражены, что обеспечивает высокую переносимость лекарственных препаратов пациентами при длительном приеме. Так, особенности механизма действия экземестана обеспечивают как выраженное угнетение ароматазы (на 98%), так и снижение уровня эстрогенов (на 90%) уже через 7 дней от начала лечения [110].
Животные и условия их содержания
На II этапе комплексного ультразвукового исследования выполняется трансвагинальное сканирование в режиме «реального времени», во время которого оценивают общие размеры матки, структуру миометрия, особое внимание, как одному из маркеров гиперплазии эндометрия в постменопаузе, уделяется определению параметров срединного маточного эха (М-эхо) — отражения сигнала от эндометрия и стенок полости матки. Определяется величина переднезаднего размера, а также исследуются эхографическая структура, акустические свойства, при четкой визуализации или подозрении на наличие опухоли — локализация, контуры, форма и степень инвазивного роста.
В норме миометрий имеет гомогенное строение средней эхогенности, эндометрий в постменопаузе имеет однородную структуру средней эхогенности с незначительным повышением яркости отражения.
Гиперплазия эндометрия характеризуется увеличением переднезаднего размера М-эха, которое имеет овоидную или удлиненно-овоидную форму. Структура срединного маточного эха бывает гиперэхогенной, однородной (в 76% случаев) и неоднородной (в 24%), за счет эхонегативных включений — кистозно-расширенных желез эндометрия. Величина переднезаднего размера М-эха при гиперпластических процессах у пациенток в постменопаузе более 6 мм. Полипы эндометрия визуализируются внутри расширенной (или неизмененной) полости матки в виде, как правило, округлых или овоидной формы образований, имеющих обычно достаточно ровные контуры. В отличие от субмукозной формы миомы матки (узлов), для полипов эндометрия характерна более низкая эхогенность. Как правило, при небольших размерах они не изменяют форму матки, но при полипах больших размеров полость матки отмечается умеренно расширенной соответственно размерам полипа.
К сожалению, у злокачественной трансформации эндометрия нет специфических эхографических признаков, поэтому эхографическое исследование при данной патологии имеет следующие цели: определение локализации, формы, структуры и размеров первичной опухоли, глубины инвазии в миометрий, наличия/отсутствия распространения первичной опухоли на шейку матки, параметрий, яичники, а также выявление региональных метастазов.
Как описано выше, при диагностике РЭ уделяется должное внимание толщине М-эха, при этом в постменопаузе наиболее ценным эхографическим показателем является величина переднезаднего размера М-эха более 8 мм. Однако в постменопаузальном периоде в качестве пороговых диагностических критериев гиперпластических процессов эндометрия по разным данным выбирают толщину М-эха 4 мм, 5 мм или 6 мм. При этом чувствительность трансвагинального ультразвукового сканирования для всех нозологических форм патологии эндометрия составляет 78,2–100%, специфичность — 60–100%, точность — 82– 96,2%. С другой стороны, при комбинировании рутинного УЗИ с трехмерной эхографией, а также при сочетании с эндоскопическими методами (гистероскопией и/или виртуальной гистероскопией) информативность метода в оценке степени инвазии опухоли повышается до 90% [2].
Трансвагинальное исследование используют для определения стадии заболевания на основании глубины инвазии миометрия: — стадия Iа — ультразвуковых признаков инвазии миометрия нет; — стадия Ib — инвазия миометрия более чем на 50%. При этом диаметр эндометриального эха составляет более 50% переднезаднего размера матки; — стадия II — опухоль распространяется на шейку матки. Отсутствует четкая демаркационная линия между эндометриальным эхо и цервикальным каналом.
На III этапе комплексного ультразвукового исследования осуществляется цветное допплеровское картирование, что позволяет быстро определить локализацию сосудов. С этой целью представляющую собой усеченный конус зону цветного картирования («цветного окна») при установленном УЗ-датчике помещают на интересующую исследователя область. При обнаружении необходимого сосуда переходят к следующему этапу. По данным Л.А. Ашрафяна с соавт. применение цветового допплеровского картирования позволяет увеличить диагностическую точность эхографического исследования в диагностике рака эндометрия [2].
На IV этапе комплексного ультразвукового исследования выполняют допплерометрию параметров кровотока в сосудах внутренних репродуктивных органов. Для этого при установленном вагинальном датчике область, находящаяся между двумя относительно параллельными линиями протяженностью 2–3 мм (метка допплеровского «контрольного объема», которая заключает в себя просвет сосуда), в которой анализируется допплеровский спектр эхо-сигналов, устанавливается в самую яркую зону цветного картирования для получения максимально высоких скоростей кровотока. После чего на месте слегка поворачивают датчик вокруг своей оси, переключатель измерения скорости устанавливается на значения 0,2-0,5 м/с при измерении кровотока в маточных артериях и 0,01-0,10 м/с — в более мелких сосудах. Кривая скорости кровотока достаточного качества, определяемая по аудиосигналу и видеоизображению, а также содержащая максимальные значения показателей скорости для данного сосуда, фиксируется на экране монитора в виде не менее трех последовательных циклов. При детальном анализе профиля кровотока определяют максимальную систолическую и конечную диастолическую скорости кровотока. Данные параметры необходимы для определения пульсационного индекса (ПИ), индекса резистентности (ИР) и систолодиастолического отношения (СДО), которые определяют значение периферического сосудистого сопротивления.
Клиническая характеристика пациенток, получавших анастрозол в неоадъювантном режиме по поводу РЭ
Существующая парадигма о ведущей роли дериватов эстрогенов с ДНК-повреждающим действием в качестве инициирующего стимула для возникновения опухолей в гормонозависимых тканях поддерживает интерес к проведению исследований о возможности ограничения роста новообразований с помощью ингибиторов ароматазы [6, 7, 10, 115, 180].
Биосинтез эстрогенов как в гонадах, так и внегонадно, а также в ткани доброкачественных (миома матки) или злокачественных (РЭ, ЭЭС) новообразований катализируется ферментным комплексом ароматазы. Комплекс, осуществляющий ароматические реакции, представлен митохондриальным цитохромом Р-450, который является конечным продуктом гена CYP 19 [170]. Экспрессия ароматазы выявляется в ткани опухолей молочной железы, меланомы, рака легкого, предстательной железы. Активность ароматазы при раке эндометрия была впервые продемонстрирована L. Tseng с соавторами в 1982 году, причем было установлено, что экспрессия гена CYP 19 при неизмененном эндометрии не выявляется [184].
Развитие онкоэндокринологии в течение ряда последних десятилетий постепенно привело к тому, что использование ингибиторов ароматазы приобрело первостепенное значение в схемах эндокринной терапии рака молочной железы [1, 8, 21, 67, 76]. Однако в последние годы более трети научных публикаций, посвященных исследованию эффективности ингибиторов ароматазы, уже не имеют отношения к лечению маммарных карцином [14, 27, 36, 55, 61, 75, 185].
Однако до настоящего времени сохраняются два важных аспекта, которые следует принимать во внимание, когда ИА предполагается использовать в качестве лечения гормонозависимых злокачественных новообразований. Один из них — точный механизм противоопухолевых эффектов ИА в клетках карциномы, другой — возможность определения чувствительности или резистентности к ИА до начала терапии, например, путем определения экспрессии того или иного маркера (по данным иммуногистохимического исследования и/или с помощью молекулярно-генетических методов — реакции гибридизации in situ или методами с использованием секвенирования ДНК). Речь идет о продолжающемся поиске возможных прогностических и/или предиктивных маркеров эффективности гормональной терапии и/или ответа непосредственно на ИА. В настоящее время попытки поиска предиктивных маркеров для прогнозирования ответа на терапию ингибиторами ароматазы находятся на этапе накопления научных знаний [11, 12, 113]. Имеется несколько единичных сведений о попытке определения маркеров ответа на терапию ингибиторами ароматазы. Например, при мутантном типе внутриклеточной киназы PI-3-K ожидается лучший ответ на терапию ингибиторами ароматазы, чем при «диком» типе данного фермента [122]. Естественно, вслед за открытием определенного маркера сразу же встают вопросы его чувствительности и специфичности, а затем стоимости исследования и экономической целесообразности.
Первым этапом нашего исследования явилось изучение противоопухолевой активности нестероидного ингибитора ароматазы третьего поколения Веро-анастрозола в эксперименте на модели животных перевиваемой опухоли [48]. В качестве экспериментальной модели были взяты мыши-самцы линии С57 BL/6j с перевитыми клетками рака эндометрия. Культуру опухолевых клеток рака эндометрия вводили лабораторным животным под кожу. На 10 день пассажа опухолевых клеток в стерильных условиях были взяты опухоли от 2 мышей и проведена перевивка мышам для основного эксперимента. Оценка противоопухолевого действия проводилась на основании оценки накопления асцита по регистрации прибавки веса животных и оценки продолжительности жизни животных. Средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы с перевитыми опухолевыми клетками рака эндометрия, не получавшей какого-либо лечения, составила 25,3 ± 0,99 дня. Введение препарата Веро-анастрозол достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 45,80 ± 0,90 дня, увеличение продолжительности жизни по сравнению с контролем составило 81,1%. Кроме того, препарат Веро-анастрозол достоверно уменьшал накопление асцита у мышей с перевитыми опухолями рака эндометрия.
Прибавка веса тела у мышей, получавших исследуемый препарат, была достоверно меньше, чем в контрольной группе (41–55%). Следует отметить, что признаков интоксикации на фоне введения исследуемого препарата не зарегистрировано. В эксперименте в качестве препарата сравнения использовался мегестрол ацетат (Мегейс). Введение мегестрола ацетата, официально зарегистрированного для лечения рака эндометрия [55, 63], достоверно увеличило продолжительность жизни мышей до 45,70 ± 1,11 дня, процент увеличения продолжительности жизни по сравнению с контролем составил 79,8% для препарата Мегейс.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что нестероидный ингибитор ароматазы III поколения Веро-анастрозол проявляет выраженное противоопухолевое действие — способствует угнетению роста перевитых опухолей рака эндометрия, что проявилось в достоверном увеличении продолжительности жизни и достоверном увеличении продолжительности периода до накопления асцита экспериментальных животных по сравнению с группами контроля и сравнения [48].
Клинические исследования были разделены на следующие этапы.
Во-первых, с помощью эндоскопического исследования, заключающегося в проведении гистероскопии, а также на основании морфологических и иммуногистохимических исследований было оценено состояние эндометрия у пациенток, получавших анастрозол на протяжении трех лет в качестве эндокринной терапии рака молочной железы. Для сравнения были сформированы группа из пациенток, получавших в качестве гормонотерапии рака молочной железы тамоксифен, а также контрольная группа больных, подвергшихся хирургическому лечению по поводу доброкачественных опухолей яичника, имевших интактный эндометрий. У 97,2% пациенток, получавших анастрозол с целью лечения инфильтративно-протокового рака молочной железы, отмечается протективный эффект ингибитора ароматазы на эндометрий. В то же время пациентки, получавшие с этой же целью тамоксифен, в 36% случаев имели ту или иную патологию эндометрия, свидетельствующую об активации пролиферативных процессов в ткани эндометрия вплоть до возникновения аденокарциномы эндометрия, обнаруженной в 3% случаев (у 6 пациенток) [29]. Причем следует отметить, что образование железисто-фиброзного полипа эндометрия у единственной больной, получавшей анастрозол, по-видимому, было спровоцировано наличием текомы яичника, что было подтверждено гистологическим исследованием после проведенного хирургического лечения у данной пациентки. Следует отметить, что в настоящее время расширяются представления о синдроме стромальной гиперплазии яичников, к которому относятся текоматоз и гипертекоз. В настоящее время появляются сведения не только о дисгормональных нарушениях при текоматозе, лежащих в основе возможного формирования гиперпластических процессов, а также о системном нарушении в генах, кодирующих белки ферментных систем, регулирующих апоптоз и пролиферацию и лежащих в основе системной патологии [145]. Также имеется множество данных о роли хронического воспаления в патогенезе пролиферативных процессов, в том числе и полипов эндометрия [88]. В данном случае наличие полипа при использовании ингибиторов ароматазы, блокирующих выработку эстрогенов, возможно, объясняется вышеуказанными причинами.
Динамика скоростей кровотока в артериях матки у пациенток, получавших анастрозол в качестве неоадъювантной терапии рака тела матки
В результате ряда исследований выяснено, что внутриопухолевая активность ароматазы в ткани эндометрия коррелирует со степенью дифференцировки опухоли. Так, при новообразованиях с низкой степенью дифференцировки (G3) это повышение было достаточно четким, что могло быть объяснено участием «ароматазного механизма» в неблагоприятном клиническом течении и прогнозе подобных случаев опухолевого процесса. Данные других исследователей по большей части подтверждают эти наблюдения, но иногда расходятся с ними, что требует продолжения этой работы. В недавнем исследовании М.А. Даниловой, С.Я. Максимова с соавторами [23] неоадъювантное применение ингибиторов ароматазы спровоцировало переход высокодиффенцированной аденокарциномы эндометрия в железистую гиперплазию, что было расценено как клинический регресс опухоли, и у части больных наблюдалось повышение степени дифференцировки опухоли. В нашем исследовании применение Веро-анастрозола в неоадъювантном режиме также привело к повышению степени дифференцировки опухоли у 2 пациенток [30].
Согласно данным клинических рекомендаций Европейского общества медицинской онкологии (ESMO), карциносаркому эндометрия выделяют в отдельную группу ЗНО тела матки, которые относятся к группе морфологических гистотипов с неблагоприятным прогнозом [79]. По заключению экспертов ESMO, одновременное присутствие в ткани опухоли маркеров как стромальных, так и эпителиальных клеток в рамках единого генотипа позволяет рассматривать ЭСС как монофазный вариант карциносаркомы тела матки [126]. В исследовании O. Reich и S. Regauer [156] иммуногистохимическим методом была проанализирована экспрессия фермента ароматазы в ткани опухоли у пациентов (n = 23) с низкодифференцированной эндометриальной стромальной саркомой. Позитивная экспрессия фермента зафиксирована в 19 (83%) из 23 образцов при применении моноклональных антител и 20 (87%) из 23 образцов при использовании поликлональных антител. Данное исследование, демонстрирующее экспрессию фермента ароматазы в ЭСС низкой степени злокачественности, может служить базисом для дальнейшего изучения эффективности ИА в лечении женщин с ЭСС.
В онкогинекологическом отделении Городского клинического онкологического диспансера Санкт-Петербурга (ГБУЗ «СПб ГКОД») ведется набор пациентов с ЭСС, получающих терапию ИА анастрозолом. Всего в исследование в данный момент включено 6 женщин в возрасте от 52 до 65 лет с данным заболеванием ІІІ стадии. Пациентки с 2006 года находятся под диспансерным наблюдением с возможностью стационарного или амбулаторного лечения в СПб ГКОД: 5 пациенток наблюдаются по причине рецидивной болезни ЭСС после ранее проведенного комплексного лечения, 1 пациентка — в процессе периодического мониторинга после достижения полного ответа на терапию анастрозолом в 2006 году. У 3 из 5 пациенток в процессе наблюдения диагностированы локальные рецидивы, у 2 пациенток — наряду с местными рецидивами выявлены отдаленные метастазы (в обоих случаях в легкие). Диагностированные рецидивы заболевания выявлены при периодическом инструментальном обследовании в период от 8 до 14 месяцев с момента окончания комплексного лечения. Из этих пяти женщин 4 пациентки получают ИА анастрозол в дозе 1 мг 1 раз в сутки до момента выявления прогрессирования заболевания, у всех четырех пациенток эффект от лечения был расценен как стабилизация болезни. При этом у одной пациентки лечение прекращено в связи с подтверждением дальнейшего прогрессирования заболевания к окончанию 3-го месяца от начала противорецидивной терапии.
Нами описан клинический случай, в котором имело место достижение полного ответа у больной 67 лет с ЗНО тела матки IIIA стадии (эндометриальная стромальная саркома высокой степени злокачественности) в результате лечения анастрозолом, проводимого в течение 6 месяцев и назначенного после того, как в результате комплексного лечения (хирургический этап, сочетанная лучевая и химиотерапия) была зафиксирована стабилизация заболевания. Безрецидивная выживаемость составила 4 года 5 месяцев [33]. Безусловно, для выводов, касающихся оценки эффективности эндокринотерапии ЭСС с помощью ингибиторов ароматазы третьего поколения, требуется большее число включенных пациенток и соответствующий период наблюдения за данной группой больных. В ряде исследований показана высокая эффективность ИА, превосходящая результаты применения прогестагенов и антиэстрогенов других фармакологических групп при лечении ЭЭС [126, 152, 175, 187]. Обнадеживающие результаты оправдывают дальнейшее изучение данных препаратов и режимов применения. В одном случае был получен объективный ответ на терапию ИА III поколения летрозолом при лечении рецидива заболевания в течение 9 месяцев [187], в другом клиническом исследовании у 2 пациенток репродуктивного возраста с рецидивом ЭСС и метастатическим поражением органов грудной полости в результате монотерапии летрозолом был достигнут полный ответ на лечение. Следует отметить, что длительность безрецидивного периода у этих пациенток превысила 5 лет и составила 14 и 7 лет [126]. В длительном клиническом наблюдении за 10 пациентами с низкодифференцированными первичными ЭСС или рецидивной болезнью, получавшими летрозол в качестве первой или второй линии эндокринотерапии, продемонстрирован высокий удельный вес объективных ответов на терапию: выживаемость составила от 33 до 255 месяцев после выполнения гистерэктомии, выживаемость с момента постановки диагноза метастатического заболевания — от 4 до 164 месяцев [152].