Кардиоваскулярная активность селективного ингибитора аргиназы II Якушев Владимир Иванович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1 Эндотелий сосудов и его роль в регуляции сосудистого тонуса 12

1.2 Роль эндотелиальной дисфункции в этиопатогенезе кардиоваскулярной патологии и пути ее коррекции 35

1.3 L-аргинин как субстрат для продукции главного вазодилатирующего фактора 41

1.4 Ингибиторы аргиназы 45

Глава 2. Материалы и методы 53

2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению

экспериментальных исследований 53

2.1.2 Перечень используемых реактивов и веществ 54

2.2 Методы исследования 58

2.2.1 Методы исследования in vitro 58

2.2.2 Методы исследования in vivo

2.2.2.1 Подбор гипотензивных доз наиболее активного и безопасного соединения из группы производных норлейцинамида с учетом результатов изучения LD50 и расчета терапевтических доз 64

2.2.2.2 Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 66

2.2.2.3 Моделирование гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте 67

2.2.2.4 Исследование сократительной активности миокарда и кардиогемодинамики при проведении нагрузочных проб 67

2.2.2.5 Оценка выраженности развития эндотелиальной дисфункции и ее коррекции исследуемым фармакологическим агентом 68

2.2.2.6 Определение стабильных метаболитов NO 69

2.2.2.7 Моделирование хронической ишемии задней конечности 70

2.2.2.8 Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс методом лазерной доплеровской флоуметрии 71

2.2.2.9 Гистоморфометрические изменения в органах-мишенях при моделировании и коррекции ЭД и хронической ишемии конечности 71

2.2.2.10 Дизайн исследования 73

2.2.2.11 Статистический анализ результатов исследования 76

Глава 3. Результаты собственных исследований 79

3.1 Результаты исследований in vitro 79

3.1.1 Поиск молекул-кандидатов селективных ингибиторов аргиназы II 79

3.2 Результаты исследований in vivo

3.2.1 Экспериментальное изучение общетоксического действия активной фармацевтической субстанции селективного ингибитора аргиназы, вещества под шифром ZB49-0010С при острой затравке . 81

3.2.2 Подбор гипотензивных доз наиболее селективного и безопасного соединения из группы норлейцинамида, вещества ZB49-0010С в острой фармакологической пробе на интактных ненаркотизированных половозрелых крысах-самцах 82

3.2.3 Исследование дозозависимого характера эндотелио- и кардиоротективных свойств селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества под шифром ZB49-0010C при L-NAME-индуцированном дефиците NO 85

3.2.4 Изучение дозозависимого характера эндотелио и кардиопротективных свойств селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества ZB49-0010C при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции 106

3.2.5 Результаты влияния селективного ингибитора фермента аргиназа II вещества ZB49-0010C на уровень микроциркуляции и гистоархитектонику мышечной ткани при ишемии конечности на фоне моделирования L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте 125

Обсуждение результатов 133

Заключение 139

Выводы 142

Перечень сокращений и условных обозначений 144

Список литературы

• Роль эндотелиальной дисфункции в этиопатогенезе кардиоваскулярной патологии и пути ее коррекции
• Подбор гипотензивных доз наиболее активного и безопасного соединения из группы производных норлейцинамида с учетом результатов изучения LD50 и расчета терапевтических доз
• Экспериментальное изучение общетоксического действия активной фармацевтической субстанции селективного ингибитора аргиназы, вещества под шифром ZB49-0010С при острой затравке
• Исследование дозозависимого характера эндотелио- и кардиоротективных свойств селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества под шифром ZB49-0010C при L-NAME-индуцированном дефиците NO

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Одним из основных предикторов большинства сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, артериальная гипертензия, ишемическая болезниь сердца, острое нарушение мозгового кровообращения, дисциркуляторная энцефалопатия, хроническая артениальная недостаточность нижних конечностей выступает дисфункция сосудистого эндотелия или эндотелиальная дисфункция (ЭД). Под ЭД понимают дисбаланс между гуморальными факторами, обладающими вазодилатирующим и антиагрегационными свойствами (NO, эндотелиальный фактор гиперполяризации, простагландины), и факторами, спазмирующими сосуды и активирующими систему гемастаза (эндотелин-1, тромбоксан А₂, супероксид-анион). При этом, ключевым звеном этиопатогенеза ЭД является дефицит эндогенного NO. Нормально функционирующий эндотелий постоянно вырабатывает NO с помощью эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS) из L-аргинина (Дмитренко Н.П., 2008; Бабушкина А.В., 2009; Коноплева Л.Ф., 2011; Dioguardi F.S., 2011; Martens C.R., 2011).

Однако, наряду с дефицитом продукции NO, немалое значение в патогенезе ЭД имеет снижение его биодоступности, которое может быть вызвано повышеннем уровня в плазме крови ассиметричного диметиларгинина (АДМА), эндогенного конкурентного ингибитора еNOS (Achan V., 2003; Kielstein J., 2003). Еще один механизм снижения NO связан с повышенной продукцией свободных радикалов кислорода (F. de Nigris, 2003).

Как известно, L-аргинин как единственный субстрат для синтеза NO, активно биотрансформируется под действием фемента аргиназа. Концетрация L-аргинина в плазме крови колеблется в зависимости от великого множества как коррегируемых, так и некоррегируемых факторов (Bger, R.H., 2007; Покровский М.В., 2008; Корокин М. В., 2011).

Известно, что метаболизм L-аргинина в клетках протекает двумя путями (Gronros J., 2011). Первый путь – L-аргинин посредством аргиназы гидролизуется в орнитин и мочевину. Второй – L-аргинин превращается в оксид азота и цитруллин, катализируется NO-синтазой. Ферменты аргиназа и NO-синтаза конкурируют между собой за общий субстрат – L-аргинин (Kim J.H., 2009; Pokrovskiy M.V., 2011).

Аргиназа, фермент цикла синтеза мочевины, обладает высокой активностью, превышая таковую NO-синтазы. Она представлена в виде двух изоформ: аргиназа I – печеночная форма и аргиназа II – внепеченочная форма, локализующихся чаще в почках, простате, тонкой кишке (Huynh N.N., 2009; Costanzo D.L., 2010; Kim O.Y., 2012). По данным ряда современных авторов, повышение активности аргиназы II наблюдается при многих патологиях, таких как сахарный диабет, бронхиальная астма, гломерулонефрит, псориаз (Vaisman B.L., 2012; Cho W.K., 2013). Как известно, аргиназа II ингибирует еNOS, препятствуя, таким образом, продукции оксида азота. Рядом исследований установлено, что ингибирование этого энзима способствует увеличению

продукции оксида азота и предотвращению дисфункциональных нарушений в эндотелии (Vanhoutte P.M., 2008; Jung C., 2011; Yepuri G., 2012).

Степень разработанности проблемы. К природным ингибиторам аргиназы относятся такие аминокислоты, как орнитин, лейцин, валин, лизин, изолейцин и норвалин. Все ингибиторы аргиназы делятся на селективные и неселективные, а также на специфические, действующие непосредственно на сам фермент и блокирующие его активный центр, и неспецифичные, действующие на фермент опосредованно. С целью ингибирования аргиназы пытались применять NOHA, являющийся промежуточным звеном в синтезе NO. Однако в связи с тем, что данное вещество является еще и коферментом цитохрома P₄₅₀, применение его оказалось весьма затруднительным, и взамен ему был синтезирован N-гидрокси-нор-L-аргинин (nor-NOHA) (Gornik, H.L., 2004; Santhanam L., 2008). Также в качестве ингибитора аргиназы исследовали -дифлуорометилорнитин in vitro и in vivo. Указанный фермент блокирует орнитиндекарбоксилазу и увеличивает содержание L-аргинина через цикл мочевины. Однако для уменьшения активности аргиназы требуются его большие концентрации, а это способствует усилению независимых сосудистых реакций и накоплению орнитина. Достаточно высокую активность в отношении снижения активности аргиназы проявили такие вещества, как S-(2-бороноэтил)-L-цистеин и 2(S)-амино-6-гексановой кислоты. Еще одним ингибитором аргиназы является L-норвалин (Berkowitz D.E., 2003; Цепелева С.А., 2011).

Однако описанные на сегодняшний день ингибиторы аргиназы являются малоселективными либо неселективными и подавляют активность как аргиназы II, так и аргиназы I. Снижение активности аргиназы I сопряжено с рядом нежелательных эффектов. В экспериментах с нокаутом гена аргиназы I у мышей наблюдались тяжелые симптомы гипераммониемии. Все животные погибали в срок от 10 до 14 дней постнатального развития (Iyer R.K, 2002).

Имеено поэтому актуальным является поиск новых высокоселективных ингибиторов аргиназы II, изучение их кардиопротективных и эндотелиопротективных свойств. На сегодняшний день на мировом фармацевтическом рынке нет лекарственных средств из группы селективных ингибиторов аргиназы II.

Цель исследования: повысить эффективность фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием селективных ингибиторов аргиназы II, производных норлейцинамида.

Задачи исследования:

1. Осуществить отбор молекул-кандидатов, селективных ингибиторов фермента аргиназа II по критериям селективности и безопасности в тестах in vitro.

2. В острой фармакологической пробе провести подбор гипотензивных доз наиболее активного и безопасного соединения из группы производных норлейцинамида.

3. Исследовать эндотелио- и кардиопротективную активность селективного ингибитора аргиназы II под шифром ZB49-0010C в широком

диапазоне доз при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита эндогенного оксида азота.

4. Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность селективного ингибитора аргиназы II под шифром ZB49-0010C в широком диапазоне доз при гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

5. Оценить противоишемическую активность селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C при моделировании хронической ишемии конечности на фоне L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота.

Научная новизна. В работе впервые в опытах in vitro проведено изучение специфической ингибирующей активности и безопасности молекул-кандидатов, селективных ингибиторов фермента аргиназа II из группы производных норлейцинамида. Также впервые показано в опытах in vitro, что соединение под шифром ZB49-0010C, из группы производных норлейцинамида, обладает наибольшей селективностью и ингибирующей активностью в отношении фермента аргиназа II. При этом данное вещество in vivo оказывает дозозависимое гипотензивное, эндотелиопротективное и кардиопротективное действие на фоне L-NAME-индуцированной и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД, которое наиболее выражено в дозе 10 мг/кг при внутрижелудочном введении. Эндотелиопротективное действие проявляется в предотвращении повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) и снижении концентрации стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови. Кардиопротективное действие проявляется в предотвращении повышения уровня ЛДЖ в пробе на адренореактивность и снижения миокардиального резерва при проведении пробы на нагрузку сопротивлением, а также в профилактике развития гипертрофии миокарда левого желудочка. В ходе исследования изучено дозозависимое противоишемическое действие селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C на модели хронической ишемии конечности у крыс, которое наиболее выражено в дозе 10 мг/кг и проявляется в предотвращении падения уровня микроциркуляции на 29-е сутки эксперимента в ишемизированной конечности и в протективном действии при морфологоическом исследовании гистоархитектоники мышечной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе
исследований in vitro установлено, что соединение ZB49-0010C из группы
производных норлейцинамида обладает наибольшей селективностью и
ингибирующей активностью в отношении фермента аргиназа II. Результаты
исследования позволяют констатировать дозозависимое гипотензивное
действие, эндотелиопротективную, кардиопротективную и

противоишемическую активность у селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C.

Методология и методы исследования. В проведённом исследовании использовался комплексный подход, включающий в себя современную методологию поиска и отбора молекул-кандидатов для создания инновационного препарата, нацеленного на селективное ингибирование аргиназы II. При этом последовательно применены методы исследования in

vitro специфической активности, селективности и безопасности, с последующим тестированием наиболее безопасной, специфичной и высокоселективной молекулы in vivo путем изучения гипотензивной, эндотелио- и кардиотропной, а также противоишемической активности в опытах на лабораторных животных. Дизайн исследования был составлен в соответствии с этическими нормами работы с лабораторными животными и с учетом наиболее верифецированых методов и методик, с использованием современного наукоемкого оборудования, позволяющих получить достоверные и репрезентативные результаты.

Положения, выносимые на защиту:

1. Из 3-х исследованных соединений вещество под лабораторным
шифром ZB49-0010C из группы производных норлейцинамида in vitro
проявляет наиболее выраженную ингибирующую активность (в концентрации
30 мкмоль) по отношению фермента аргиназа II, являясь его полным
ингибитором. Данное соединение не связывается с hERG-каналом
кардиомиоцита и не ингибирует его при концентрациях до 40 мкМ, что
свидетельствует о его безопасности in vitro.

2. Селективный ингибитор аргиназы II, вещество ZB49-0010C обладает дозозависимом гипотензивным действием и эндотелио- и кардиопротективной активностью при L-NAME- и гипергомоцистеин-индуцированной ЭД.

3. Селективный ингибитор аргиназы II, вещество ZB49-0010С обладает дозозозависимым противоишеимическим действием при моделировании хронической ишемии конечности на фоне L-NAME-индуцированого дефицита NO.

Степень достоверности и апробация результатов. Научные положения и выводы диссертационного исследования обоснованы адекватным решением поставленных задач путем выбора экспериментальных моделей и методологии исследования, современного оборудования, отвалидированных методик и программного обеспечения, необходимого для правильной математической и статистической обработки полученных результатов.

Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета с 2009 г. по 2015 г., в частности на 74-й, 75-й, 76-й, 77-й, 79-й и 80-й итоговой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2009, 2010, 2011, 2012, 2014 и 2015); на ежегодной научной сессии НИУ «БелГУ» (Белгород 2013, 2014, 2015), молодежном научно-инновационном конкурсе «У.М.Н.И.К» (Белгород, 2013, 2014), на форуме «Селигер-2010» в рамках смены Зворыкинского проекта «Инновации и техническое творчество». Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр фармакологии, госпитальной хирургии, биохимии, акушерства и гинекологии, Центра доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ». Номер государственной регистрации темы: АААА-А16-116041310089-2.

Публикации. Положения диссертации опубликованы в 12 работах в центральной и местной печати, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных

ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, и содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации. По результатам диссертационного исследования подано 3 заявки на получение патента РФ.

Личный вклад автора. Автором, под руководством научного руководителя, составлен план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнен весь комплекс научных экспериментальных исследований, включенных в диссертацию. Автором лично проведены рандомизация животных экспериментальных групп, введение фармакологических агентов с целью моделирования и коррекции патологии, вивесекция с проведением всех хирургических манипуляций и нагрузочных проб с последующей их математической, статистической обработкой и анализом полученных результатов, а также выполнение биохимических, морфологических исследований при методологической помощи научного руководителя и консультантов. При этом автором в процессе экспериментальных исследований были установлены дозозависимое гипотензивное, эндотелиопротективное, кардиопротективное и противоишемическое действие селективного ингибитора аргиназы II.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 178 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 39 рисунками, 11 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсуждения результатов, заключения, выводов, перечня сокращений и условных обозначений и списка литературы, включающего 239 источников, в том числе 147 зарубежных.

Роль эндотелиальной дисфункции в этиопатогенезе кардиоваскулярной патологии и пути ее коррекции

На основании вышесказанного, в настоящее время появились предположения об участии оксида азота в развитии глутаматной нейротоксичности и таких заболеваний, как эпилепсия, болезнь Паркинсона, Альцгеймера, так как при этих состояниях наблюдается нарушение функционирования глутаматэргических синапсов. Оксид азота может модулировать реакцию дыхательного центра на гиперкапнию, воздействуя на секрецию медиатора в глутаминэргических синапсах [74, 75].

Оксид азота является модулятором передачи импульсов и через ангиотензиновые рецепторы второго типа. Такая реакция характерна для дилатации коронарных микроартерий [93]. Содействуя расслаблению гладких мышц кровеносных сосудов, NO способствует возникновению гипотонии в большом и малом кругах кровообращения [174]. Действие альдостерона на сосуды почек тоже опосредуется NO [210].

В опытах на новорожденных белых крысах было установлено влияние оксида азота на действие опиоидного пептида динорфина А на слизистую оболочку трахеи [51]. Также большую роль оксид азота играет в формировании обонятельной памяти, в развитии и модуляции болевых ощущений: некоторыми исследователями было обнаружено увеличение числа NO-эргических нейронов у крыс в структурах рострального и каудального ядер как на стороне раздражения, так и на противоположной стороне в первые часы после болевого раздражения [35].

Помимо гуанилатциклазы, оксид азота может также активировать и аденилатциклазу, способствуя превращению АТФ в цАМФ, и таким образом участвовать в образовании единой энергетической цепи: цАМФ и цГМФ.

Итак, оксид азота в физиологических условиях является ключевым фактором поддержания гомеостаза и одной из важнейших сигнальных молекул в организме, как в качестве межклеточного медиатора, так и в роли внутриклеточного мессенджера. Посредством оксида азота эндотелий выполняет свою регуляторную роль, поддерживая структуру и тонус сосудов, а также реологические свойства крови в зависимости от функционального состояния органа или ткани. Будучи продуктом синтеза эндотелия, он в то же время выполняет защитную функцию для последнего, предохраняя его от повреждения [56, 57].

Стимуляторами синтеза оксида азота являются железосодержащие ферменты (в первую очередь гемоглобин), а также увеличение скорости кровотока и его давления (напряжение сдвига). Последнее используется в качестве пробы для определения состояния сосудов [65, 68]. Синтез оксида азота возрастает под действием ацетилхолина и кининов, в том числе брадикинина. В то же время ангиотензин угнетает синтез оксида азота, находясь с ним в антагонистических отношениях. Повышение содержания ангиотнезина может приводить к образованию токсических соединений – продуктов окисления оксида азота (пероксинитрит).

На основании вышесказанного можно заключить, что активность синтеза оксида азота в каждый конкретный момент времени и в определенных органах зависит от целого ряда факторов. Огромное значение имеет соответствие количества оксида азота физиологической норме.

Помимо оксида азота еще одним мощным физиологическим вазодилататором, антиагрегантом и антикоагулянтом является простациклин (простагландин PgI2). Синтез простациклина осуществляется преимущественно в эндотелии и стенках сосудов, а также в тромбоцитах. Простациклин является одним из продуктов окисления арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути, синтез его в эндотелии сосудов был обнаружен раньше, чем оксида азота [195].

В некоторых исследованиях было установлено повышенное потребление простациклина легкими при тяжелых формах легочной гипертензии, чего не наблюдается в физиологических условиях. По мнению авторов, данная реакция носит компенсаторный характер с целью нормализации артериального давления в легких [78].

Основные эффекты простациклина аналогичны таковым оксида азота. Только, в отличие от NO, мессенджером II типа для простациклина является АТФ. Воздействуя на аденилатциклазу, простациклин увеличивает содержание в клетке цАМФ и снижает уровень Са2+ в цитоплазме. Как описано выше, уменьшение концентрации внутриклеточного кальция в гладких мышцах сосудов препятствует их сокращению и вызывает вазодилатацию, а уменьшение содержания кальция на поверхности эндотелия и в тромбоцитах препятствует их адгезии и агрегации, тем самым предотвращая тромбообразование и сохраняя функциональные свойства эндотелия.

Таким образом, простациклин вызывает следующие эффекты: – подобно оксиду азота, участвует в регуляции центральной и региональной гемодинамики, регулирует сосудистый тонус, вызывая вазодилатацию, усиливает действие нитроглицерина на коронарные сосуды; – тормозит пролиферацию и миграцию гладких мышц сосудов; – обладает антифлогистическим действием; –участвует в поддержании реологических свойств крови: препятствует агрегации тромбоцитов, подавляет фактор роста тромбоцитов, усиливает тромболитическое действие стрептокиназы, антиагрегационное влияние гепарина, обладает фибринолитической активностью; – характеризуется антикатехоламинергическим действием; – защищает эндотелий и гладкие мышцы сосудов от патогенных влияний за счет мембраностабилизирующего и цитопротекторного действия; – оказывает антиатерогенное действие, подавляя синтез атерогенных ЛПНП и стимулируя образование ЛПВП. Помимо этого, простациклин стимулирует гидролиз холестерина и уменьшает его содержание в клетках [143, 170].

Следовательно, простациклин, как и оксид азота, сохраняет нормальный кровоток в микроциркуляторном русле, нормализует липидный обмен, тормозит ростовой процесс, стимулирует образование энергии из АТФ путем активации аденилатциклазы.

Подбор гипотензивных доз наиболее активного и безопасного соединения из группы производных норлейцинамида с учетом результатов изучения LD50 и расчета терапевтических доз

Список использованного программного обеспечения Данные скрининга инргибирующей активности анализировали в программе GraphPad Prizm (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Показатели гемодинамики регистрировали и анализировали с помощью компьютерной программы «AcqKnowledge 4.1», производства «Biopac» США. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «GraphPad.Prism.5.0» (США) и Excel 2007 (MS OfficeXP, США). Экспериментальные животные

Исследования были выполнены на 520 белых половозрелых крысах, самцах линии Wistar (масса 200±10 г, возраст 4–5 мес) и на 40 белых мышах обоего пола (масса 20±2 г; возраст 5–6 нед). Условия содержания: в стандартных условиях в соответствии с санитарными правилами (№ 1045-73), утвержденными МЗ СССР 06.04.73 г. по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009. Клетки – индивидуально вентилируемые «Tecniplast» для мелких лабораторных животных. Подстил – стерилизованные УФ-облучением, опилки. Корм – гранулированный для мелких лабораторных животных – грызунов. Вода – очищенная, стерилизованная УФ-облучением. Условия окружающей среды – микроклимат создается и поддерживается системой индивидуально вентилируемых клеток. Акклиматизация и отбор животных для исследования – карантин не менее 10 дней. Распределение по группам – в соответствии с массой тела. Идентификация животных – нанесение индивидуальных меток на тело.

На момент проведения исследований животные были здоровыми, без изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования. В течение 18 ч до проведения экспериментов животные находились в условиях полной пищевой депривации со свободным доступом к воде.

Обычной практикой в разработке лекарственных препаратов является выбор запасного кандидата на доклинические исследования из альтернативного, другого, чем основной кандидат, химического класса. Таким образом пытаются добиться принципиального изменения свойств, в том числе – параметров ADME и фармакокинетики, другой биотрансформацией, с отличающимися метаболитами, и таким образом избежать побочных эффектов, свойственных основному кандидату, если таковые присутствуют. В случае нашего исследования имеется только еще один класс, химически принципиально-отличный от ZB49-0010 С (2-{1-[3-(3-хлороизоксазол-5-ил)пропил]пиперидин-4-ил}-6-(дигидроксиборил)норлейцин дигидрохлорида), это – Z991-0104 (1,2,4,7тетразо-5-трет-бутиламино-6-[4H2,6диметоксифенил]пиразин ).

Исследование безопасности in vitro молекул-кандидатов, селективных ингибиторов аргиназы II

С целью верификации наиболее перспективной молекулы по критерию безопасности необходимо перовостепенно провести ииследование связывания молекул-кандидатов, селективных ингибиторов фермента аргиназа II с hERG – потенциал-зависимым K+-каналом кадиомиоцита, так как блокирование данного канала приводит к фатальным последствиям, а именно – нарушению реполяризации миокарда, увеличению продолжительности QT-интервала и последующим развитием асистолиии.

Определение влияния субстанций, исследуемых соединений на hERG K+ионный канал проводили с помощью in vitro тест-системы Invitrogen PredictorTM hERG. Исследовали связывание вещества с hERG-каналом в составе мембранной фракции при концентрации препарата 10 и 40 мкМ. Метод основан на детекции изменяющейся поляризации флуоресценции, которая уменьшается при вытеснении высокоафинного флуоресцентного лиганда – трейсера тестируемым веществом. Экспериментальные процедуры проводили в соответствии с инструкцией производителя к тест-системе PredictorTM hERG.

Суммарный объем реакции составляет 20 мкл, содержание ДМСО – 1%. Протокол эксперимента описан далее. А. Серийное разведение веществ (100х рабочий раствор в ДМСО) Разведения в ДМСО тестируемого вещества и контроля Е-4031 в 100х необходимых концентрациях проводили в 96-луночной плашке согласно схеме (рисунок 2.1) с помощью автоматической станции Biomek2000. Для приготовления Е-4031: – добавили 60 мкл 0.4 мМ Е-4031 в ячейки А1 (исходно в наборе Е-4031 растворен в воде в концентрации 3 мМ); – добавили 100 % ДМСО по 40 мкл в ячейки А2–A8; – пошагово с перемешиванием переносили по 20 мкл раствора из предыдущей лунки в соседнюю для серийного разведения (А1–А8). Для приготовления изучаемых соединений (рисунок 2.1): – добавили 100 % ДМСО по 54 мкл в ячейки B1–B6; – добавили 6 мкл 10 мМ препарата 1 в ячейку B1, перемешали и перенесли 6 мкл 1 мМ препарата 1 в ячейку B2; – добавили 6 мкл 10 мМ препарата 2 в ячейку B3, перемешали и перенесли 6 мкл 1 мМ препарата 2 в ячейку B4; – добавили 6 мкл 10 мМ препарата 3 в ячейку B5, перемешали и перенесли 6 мкл 1 мМ препарата 3 в ячейку B6. B. Промежуточное растворение веществ (4х рабочий раствор в буфере) Добавили по 96 L буфера из набора в лунки C1-C8 и D1-D6 плашки-1

Экспериментальное изучение общетоксического действия активной фармацевтической субстанции селективного ингибитора аргиназы, вещества под шифром ZB49-0010С при острой затравке

В группе животных, получавших селективный ингибитор аргиназы II, вещество ZB49-0010C в дозе 10 мг/кг, на фоне L L-NAME-индуцированного дефицита NO миокард имел однородную структуру с равномерной плотностью расположения кардиомиоцитов и стромы. Кардиомиоциты с тонкофибриллярной структурой цитоплазмы, различимой поперечной исчерченностью, центрально расположенными мономорфными ядрами с умеренно конденсированным хроматином. Прослойки стромы тонковолокнистые, с равномерной насыщенностью фибробластическими элементами. В различных зонах миокарда (субэндокардиальные, субэпикардиальные, средние участки) отличий не обнаружено (рисунок 3.15).

При проведении морфометрических исследований установлено, что диаметр кардиомиоцитов миокарда левого желудочка в группе интактных животных соответствует физиологической норме и признаков гипертрофии не выявлено, тогда как в контрольной группе с моделирование L-NAME-индуцированной патологии выявлена выраженная гипертрофия миокарда левого желудочка, диаметр кардиомиоцитов превышал почти в два раза значения у интактных животных. При этом селективный ингибитор аргиназы II, вещество ZB49-0010C наиболее выраженно предотвращал развитие гипертрофии миокарда левого желудочка в дозе 10 мг/кг и значения диаметра кардиомиоцитов приближались к уровню интактных животных (рисунок. 3.16).

При проведении морфологических исследований почек в группе интактных животных общая структура обычная, с четкой дифференциацией на корковое и мозговое вещество и внутренней дифференциацией коркового вещества на свернутую часть и мозговые лучи. Почечные тельца с четкими контурами умеренно кровенаполненных клубочков, средней клеточностью мезангия, четко определяются мочевые пространства капсул с ровными контурами наружного листка. Определяется градиент размеров почечных телец с локализацией мелких в субкапсулярной зоне, телец средних размеров в основной – средней части коры, крупных телец в юкстамедуллярной зоне. Канальцы с четко дифференцированной структурой эпителия (рисунок 3.17).

В группе животных с L-NAME-индуцированной патологией наблюдаются участки атрофии паренхимы с коллапсом стромы, ее лимфоидной инфильтрацией, обнаруживаются диффузные изменения почечных телец в виде сморщивания, гиалиноза и склероза, гиалиноз и склероз артерий. Эпителий канальцев уплощен, на значительных участках десквамирован. Практически все канальцы заполнены плотными гиалиновыми цилиндрами (рисунок 3.18). (Данные результаты получены совместно с Цепелевой С.А. при методологической и научно-технической помощи д.м.н, профессора Должикова А.А.)

При этом использование селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C, наиболее выраженное в дозе 10 мг/кг, предотвращает развитие данных патоморфологических изменений в почках, тогда как в дозе 1 мг/кг практически не влияет на данные показатели. В серии экспериментов с введением селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C в дозе 10 мг/кг на фоне L-NAME-индуцированной патологии, кровенаполнение клубочковых капилляров и перитубулярных сосудов равномерное, без агрегационных изменений форменных элементов в просветах сосудов. Несколько больше выражено кровенаполнение сосудов мозгового вещества (рисунок. 3.19). Стенки сосудов без видимых изменений.

Установлено, что селективный ингибитор аргиназы II, вещество под шифром ZB49-0010C обладает дозозависимым эндотелиопротективным действием, наиболее выраженным в дозе 10 мг/кг, что проявляется в предотвращении повышения КЭД на фоне моделирования L-NAME-индуцированной ЭД, и приближении его значений к группе интактных животных. В острой фармакологической пробе ZB49-0010C обладает дозозависимым гипотензивным действием, наиболее выраженным в дозе 10 мг/кг, достигающим своего максимума спустя 30 мин после однократного внутрижелудочного введения, и достоверно не изменяющимся до 2 часов измерения АД. Обнаружено также дозозависимое антгипертензивное действие у ZB49-0010C, которое максимально проявляется в дозе 10 мг/кг на фоне моделирования L-NAME-индуцированного дефицита NO. Установлено дозозависимое кардиопротективное действие данного фармакологического агента, которое наиболее выражено также в дозе 10 мг/кг и проявляется в предотвращении повышения ЛЖД при проведении функциональной пробы на адренореактивность и снижении уровня миокардиального резерва при нагрузке сопротивлением, а также предотвращение развития гипертрофии кардиомиоцитов, выявленное при гистологическом исследовании.

Изучение дозозависимого характера эндотелио и кардиопротективных свойств селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции

Согласно дизайну исследования, моделирование гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции осуществляли путем внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг один раз в сутки в течение 7 дней подряд. Животным контрольной группы вводили внутрижелудочно 10-процентный раствор ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг, 1 раз в сутки в течение 7 дней. Исследуемое вещество ZB49-0010C в дозах 1 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг и вещество сравнения, L-норвалин в дозе 10 мг/кг вводилось 1 раз в сутки внутрижелудочно за 1 час до введения метионина в течение 7 дней.

На восьмые сутки животных брали в эксперимент в соответствии с ранее описанным протоколом.

Влияние селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества ZB49-0010C на исходные показатели артериального давления у наркотизированных крыс при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции представлены на рисунке 3.20 и в таблице 3.6. Обнаружено, что ZB49-0010C и L-норвалин не вызывает достоверного изменения значений САД и ДАД по сравнению с контрольной группой животных.

Коэффициент эндотелиальной дисфункции. Установлено, что применение селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества ZB49-0010C как в дозе 1 мг/кг, так и 5 и 10 мг/кг приводило к достоверному снижению КЭД по сравнению с контрольной группой (рисунок 3.21, таблица 3.6). При этом выявлена прямая зависимость снижения КЭД с увеличением дозы исследуемого вещества. Таким образом, наиболее выраженное снижение КЭД наблюдается в группе животных, получавших на фоне моделирования гипергомоцистеин-индуцированной ЭД ZB49-0010C в дозе 10 мг/кг.

Исследование дозозависимого характера эндотелио- и кардиоротективных свойств селективного ингибитора фермента аргиназа II, вещества под шифром ZB49-0010C при L-NAME-индуцированном дефиците NO

В нашем исследовании для оценки эндотелио- и кардиопротективной активности селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C выбраны гипергомоцистеин-индуцированная и L-NAME-индуцированная модели патологии. С целью моделирования гипергомоцистеин-индуцированной ЭД экспериментальным животным вводилась аминокислота метионин в дозе 3 г/кг внутрижелудочно один раз в день в течении 7 сут. Механизм повреждающего действия на эндотелий гомоцистеина – метаболита метионина – опосредованный. Метаболит метионина – гомоцистеин, за счет своей высокой пероксидантной активности оказывает повреждающее действие на эндотелий. Свободные радикалы вступают в реакцию с NO, образовавшимся в эндотелии, и снижают его биологическую активность. Также гомоцистеин способен вмешиваться в дисульфидообразование, что, помимо функциональных расстройств эндотелиоцитов, стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов, вызывая их ремоделирование. ЭНВД при гипергомоцистеин-индуцированной ЭД не так выражена, как при моделировании L-NAME-индуцированного дефитита NO. Возможно, это связано с уменьшением доступности экзогенного NO и меньшими значениями исходного АД. По-видимому, так можно объяснить более высокие значения КЭД при L-NAME-индуцированной патологии [40, 61, 69, 77, 91]. В организме гомоцистеин способствует образованию и накоплению в мембранах клеток и межклеточном пространстве липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) и их окислению, а также уменьшению синтеза серосодержащих гликозаминогликанов, что приводит к снижению эластичности стенок сосудов [19, 33, 42, 52, 148, 203]. При моделировании гипергомоцистеин-индуцированного дефицита оксида азота отмечалось повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,4±0,2 (0,9±0,1 в интактной группе животных), и одновременно выявлено повышение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови до 51,0±2,0 мкмоль/л (8,3±4,3 мкмоль/л в контрольной группе животных). Также при моделировании гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции отмечалось резкое снижение концентрации стабильных метаболитов оксида азота (Total Nox) в плазме крови крыс до уровня 68,9±4,3 (19,0±4,3 в интактной группе животных). При введении метионина наблюдалось резкое снижение функциональных показателей миокарда при проведении нагрузочных проб, что свидетельствует о развитии скрытой сердечной недостаточности.

Для моделирования дисфункции эндотелия применялось также внутрибрюшинное введение в течение 7 дней крысам-самцам ингибитора фермента eNOS N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME-индуцированная ЭД) в дозе 25 мг/кг. L-NAME в организме превращается в активный ингибитор – L-NNA, который подавляет выработку NO путем подавления фермента eNOS. Дефицит оксида азота вызывает снижение эффектов эндотелийзависимых вазодилататоров и повышение вазоконстрикторных влияний, нарушения системной и региональной гемодинамики, повышение артериального давления, нарушение функций сердца, увеличение экспрессии адгезивных молекул эндотелия и другие [9, 57, 65, 110]. В результате экспериментов семидневная блокада NO-синтазы с помощью L-NAME приводила к развитию артериальной гипертензии (САД – 191,2±6,4; ДАД – 145,7±3,8 мм рт.ст., по сравнению с группой интактных животных САД – 138,2±3,6, ДАД – 103,9±2,7 мм рт.ст.). Кроме того, развивающийся дефицит оксида азота проявлялся увеличением КЭД в 5 раз по сравнению с его значениями в группе интактных животных, отрицательной динамикой при проведении нагрузочных проб, снижением концентрации стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови, гипертрофией миокарда, мышечного слоя сосудистой стенки. Однако коэффициент эндотелиальной дисфункции у животных с гипергомоцистеин-индуцированным дефицитом оксида азота был ниже, чем у животных с L-NAME-индуцированной патологией, что заставляет задуматься о более выраженном нарушении соотношения ЭЗВД и ЭНВД при введении L-NAME в дозе 25 мг/кг, чем при введении метионина в дозе 3 г/кг.

Основными задачами нашего исследования являлось изучение специфической активности субстанции наиболее селектиной и безопасной молекулы ингибитора аргиназы II, соединения ZB49-0010C из группы производных норлейцинамида при моделировании ЭД и ишемии конечности в эксперименте. Механизм действия селективного ингибитора аргиназы II объясняется его структурным подобием с орнитином, который является одним из продуктов метаболизма цикла мочевины. Опосредованное действие селективного ингибитора аргиназы II на активность аргиназы связано с ингибированием орнитинтранскарбамилазы, которая катализирует превращение орнитина в цитрулин цикле мочевины. В результате происходит избыточное накопление орнитина, который, в свою очередь, ингибирует аргиназу. Более того, селективный ингибитор аргиназы повышает эндогенный синтез L-аргинина из цитрулина за счет ингибирования аргининосукцинатсинтазы. Подавление активности аргининосукцинатсинтазы селективного ингибитора аргиназы II приводит к повышению эндогенного синтеза L-аргинина и восстановлению продукции NO [40, 77, 96, 97, 98, 101, 102, 105, 106, 212, 224, 232, 235, 238, 239]. В нашем исследовании селетивный ингибитор аргиназы II, вещество ZB49-0010C изучался с целью выявления у него гипотензивного, эндотелиопротективного и кардиопротективных эффектов и противоишемической активности. Гипотензивное действие селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C носило дозозависимый характер, было наиболее выражено в дозе 10 мг/кг и проявлялось в предотвращении повышения уровня АД, под действием блокады эндотелиальной NO-синтазы. Эндотелиопротективное действие селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C также носило дозозависимый характер, и было максимально выражено в дозе 10 мг/кг, что проявлялось снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции до 2,3±0,3 при NAME-индуцированной патологии и до 1,6±0,2 при гипергомоцистеин-индуцированной эндотелиальной дисфункции. Эндотелиопротективные эффекты вещества ZB49-0010C обусловлены подавлением активности аргиназы II, за счет чего происходит увеличение продукции главного вазодилатирующего медиатора эндотелия – оксида азота.

В результате диссертационного исследования были выявлены кардиопротективные свойства у селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C на обеих моделях патологии, которые проявлялись положительной динамикой при проведении нагрузочных проб (проба на адренореактивность, нагрузку сопротивлением). Удалось выявить предотвращение повышения адренореактивности и снижения миокардиального резерва. Кардиопротективная активность селективного ингибитора аргиназы II, вещества ZB49-0010C, по нашему мнению, может быть связана с повышением эндогенного синтеза L-аргинина за счет ингибирования активности аргининосукцинатсинтазы, а также накоплением L-аргинина в связи с ингибированием аргиназы. В свою очередь, L-аргинин обладает рядом свойств, благотворно влияющих на деятельность сердечно-сосудистой системы: способствовует деполяризации мембран клеток эндотелия и регулирует рН в этих клетках, а также рН крови, способствует снижению вязкости крови, снижает формирование свободных радикалов и обеспечивает удаление их из клеток эндотелия [4, 15, 30, 107, 110, 116, 119, 120, 126, 148].