Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Патогенез отморожений 12
1.2 Вопросы классификации отморожений 19
1.3 Современные принципы диагностики отморожений 23
1.4 Консервативное лечение отморожений 26
1.5 Хирургическое лечение отморожений 29
1.6 Применение опиоидного пептида DSLET 32
1.7 Применение серотонина адипината 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1 Объект исследований 43
2.2 Хирургическая тактика 45
2.3 Измерение микроциркуляторных показателей 45
2.4 Определение биохимических показателей 46
2.5 Морфологическое исследование кожных покровов 46
2.6 Анализ летальных исходов и выживаемости 47
2.7 Обоснование доз исследуемых препаратов 47
2.8 Статистическая обработка результатов исследований 48
ГЛАВА 3. Собственные исследования
3.1 Динамика флоуметрических, биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс контрольной группы 1 50
3.2 Динамика флоуметрических, биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс опытной группы 1 с применением серотонинергического препарата серотонина адипинат 66
3.3 Динамика флоуметрических, биохимических и
морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс опытной группы 2 с применением опиоидного пептида DSLET 81
3.4 Динамика флоуметрических, биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс опытной группы 3 с применением комбинации серотонинергического препарата серотонина адипинат и опиоидного пептида DSLET 95
3.5 Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения и применением активной хирургической тактики у крыс контрольной группы 2 110
3.6 Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс на фоне активной хирургической тактики опытной группы 4 с применением серотонинергического препарата серотонина адипинат 119
3.7 Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс на фоне активной хирургической тактики опытной группы 5 с применением опиоидного пептида DSLET 130
3.8 Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс на фоне активной хирургической тактики опытной группы 6 с применением комбинации серотонинергического препарата серотонина адипинат и опиоидного пептида DSLET 141
Заключение 153
Выводы 174
Список сокращений 176
Список литературы
- Современные принципы диагностики отморожений
- Измерение микроциркуляторных показателей
- Динамика флоуметрических, биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс опытной группы 1 с применением серотонинергического препарата серотонина адипинат
- Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс на фоне активной хирургической тактики опытной группы 6 с применением комбинации серотонинергического препарата серотонина адипинат и опиоидного пептида DSLET
Введение к работе
Актуальность темы. Отморожение является термической травмой, которая возникает под воздействием низких температур на ткани человека. Повреждения организма низкими температурами встречаются практически во всех частях нашей планеты и являются одной из важнейших проблем современной медицины, как в военное, так и в мирное время.
Локальная холодовая травма в России, значительная территория которой подвержена воздействию низких температур, в последние годы приобретает все большую актуальность с ростом численности социально неблагополучного населения (Томина Е.А., 2008). Важность и значимость отморожений определяется тем, что в основном (75-90% случаев) страдает наиболее трудоспособная (до 50 лет) часть населения, что ведет не только к продолжительной потере трудоспособности, но и к инвалидизации пациентов (Брегадзе А.А., 2006; Рыбдылов Д.Д., 2004).
Отморожения представляют собой спектр повреждений от необратимого разрушения до обратимых изменений клеток, наблюдаемых после согревания. Эти изменения включают увеличение отека тканей, сосудистого стаза и распространяющегося тромбоза, ведущего к развитию микроциркуляторного коллапса и дальнейшего некроза ткани (Иванов В.А. и др., 2008).
Несмотря на существующие достижения в области хирургии, лечение отморожений на современном этапе остается открытой проблемой. С появлением новых антибактериальных и дезинтоксикационных средств удалось существенно снизить тяжесть явлений интоксикации у пострадавших с глубокими отморожениями, но при этом количество ампутаций остается высоким (Сизоненко В.А., 2007).
Материальные затраты на лечение пострадавших с локальной холодовой травмой в 3 раза превышают стоимость лечения общехирургического больного. Средняя продолжительность лечения отморожений более чем в 2 раза превышает длительность лечения больных с ожогами. При отморожениях III– IV степени сроки лечения варьируют от 34 до 78 дней (Карайланов М.Г., 2008).
По данным литературы, большой интерес представляет перспектива использования синтетических опиоидных пептидов, которые обладают уникальной совокупностью физиологических свойств. Являясь ведущим компонентом антистрессорной системы организма, опиоидные пептиды не только подавляют продукцию стрессорных гормонов (АКТГ, кортизола, катехоламинов), но и проявляют иммуномодуляторные свойства (Николаев С.Б., 2004), влияют на рост сосудов и костномозговую ткань (Ляшев Ю.Д., 2002).
В то же время доказаны многочисленные точки приложения серотонина адипината: под его воздействием происходит стимулирующее действие на гладкую мускулатуру сосудов, снижается интенсивность свободно-радикального окисления, увеличивается стойкость капилляров (Горпинич А.Б. и др., 2008) нормализуется функция нейтрофилов при различной патологии (Лазарев Е.В., 2004).
В этой связи несомненный интерес представляет изучение возможности дополнительной фармакологической коррекции стандартной терапии отморожений препаратами из группы опиоидных пептидов и серотонинергических средств.
Степень разработанности темы. За последние годы были проведены многочисленные исследования, посвященные изучению путей повышения эффективности лечения отморожений (Винник Ю.С. и др., 2012; Дрожжин Е.В. и др., 2008; Козинец Г.П. и др., 2011; Таранова Е.В., 2009; Цхай В.Ф. и др., 2013), а также совершенствованию хирургической тактики лечения отморожений (Гостищев В.К. и др., 2010; Козинец Г.П. и др., 2005; Лобан Е.К. и др., 2010; Слесаренко С.В. и др., 2010). Ведущая роль в развитии некроза при контактном отморожении принадлежит нарушениям микроциркуляции и реперфузионному синдрому (Брегадзе А.А., 2006; Горелик И.Э. и др., 2008; Кричевский А.Л. и др., 1997; Мальцева Л.А. и др., 2005; Стекольников Н.Ю., 2012; Шаповалов К.Г., Сизоненко В.А., 2009; Bhatnagar A., et al. 2002; Murphy J.V. et al., 2000), при этом, в первую очередь, постишемическому и реперфузионному повреждению подвергается эндотелий, что позволяет рассматривать эндотелиальную дисфункцию в качестве одного из ключевых и наиболее ранних звеньев патогенеза холодовой травмы (Винник Ю.С. и др., 2014; Томина Е.А. и др., 2008; Шапкин Ю.Г. и др., 2014).
К настоящему моменту накоплено большое количество информации о спектре биологических эффектов, которыми обладают опиоидные пептиды в модуляции периферического сосудистого тонуса в условиях острого стресса, профилактике ишемических и реперфузионных повреждений (Бебякова Н.А. и др., 2006; Бобынцев И.И. и др., 2006; Булгаков С.А., 2011; Зозуля А.А. и др., 1990; Солин А.В., 2012; Николаев С.Б., 2004; Панькова Т.Д. и др., 1990; Реброва Т.Ю. и др., 2001) и серотонина адипинат в качестве корректора таких патологических состояний, как сосудистая недостаточность и расстройства микроциркуляции, раневой процесс, нарушения иммунного статуса и др. (Аманбаев М.А., 2010; Ахметзянов В.Ф. и др., 2006; Арефьев Е.А. и др., 2007; Горячева А.А. и др., 2007; Козлов И.А. и др., 2006; Лазаренко В.А. и др., 2001; Симоненков А.П. и др., 2005; Толстых М.П. и др., 2006; Шур В.Ю. и др., 2014).
Несмотря на широкое применение лекарственной терапии при отморожениях, в доступной литературе не обнаружено данных об использовании селективного агониста дельта опиоидных рецепторов DSLET и серотонинергического средства – серотонина адипината или их комбинации на фоне активной хирургической тактики контактного отморожения, что позволило в настоящем исследовании раскрыть перспективу их целенаправленного изучения в качестве дополнения к существующим методам лечения.
Цель исследования. Улучшение результатов лечения контактного отморожения путем оптимизации хирургической тактики в комбинации с серотонина адипинатом и DSLET у экспериментальных животных.
Задачи исследования:
1. Оценить развитие альтеративных и репаративных изменений при контактном отморожении в эксперименте с использованием лазерной
допплеровской флоуметрии, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
-
Изучить эффективность применения опиоидного пептида DSLET, серотонина адипината и их комбинации на уровень микроциркуляции в пограничной некрозу зоне у животных при моделировании контактного отморожения в эксперименте.
-
Изучить эффективность применения опиоидного пептида DSLET, серотонина адипината и их комбинации без и в сочетании с некрэктомией на систему биохимических показателей оксидантно-антиоксидантной защиты при моделировании контактного отморожения в эксперименте.
-
Изучить эффективность применения опиоидного пептида DSLET, серотонина адипината и их комбинации без и в сочетании с некрэктомией на морфологические изменения у животных при моделировании контактного отморожения в эксперименте.
-
Оценить эффективность применения опиоидного пептида DSLET, серотонина адипината и их комбинации без и в сочетании с некрэктомией на выживаемость животных при моделировании контактного отморожения в эксперименте.
Научная новизна. В ходе проведенного исследования впервые в эксперименте на животных установлено протективное действие сочетания активной хирургической тактики с монотерапией DSLET 10 мкг/кг, монотерапией серотонином адипинатом 4,5 мг/кг, и комбинацией DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг, при этом выявлено наиболее выраженное влияние комбинированного лечения на эффективность коррекции контактного отморожения.
Впервые установлены антиоксидантные и противовоспалительные эффекты комбинации DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг при лечении контактного отморожения у животных без и в сочетании с активной хирургической тактикой.
Морфологическое исследование подтвердило высокую органо-протективную активность комбинированого лечения DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипинатом 4,5 мг/кг на фоне активной хирургической тактики, стимулирующую процессы регенерации и репарации.
В работе впервые приведены результаты оценки эффективности применения комбинации опиоидного пептида DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг на выживаемость животных при моделировании контактного отморожения.
Предложена оптимальная схема применения активной хирургической тактики на фоне введения комбинации DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг внутрибрюшинно на первые, 3, 5, 7 сутки для коррекции нарушений оксидантно-антиоксидантного и цитокинового статуса, микроциркуляторных и морфологических изменений кожи при контактном отморожении у животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обоснована эффективность применения сочетания активной хирургической
тактики с фармакологической коррекцией контактного отморожения комбинацией DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг при внутрибрюшинном введении.
По результатам исследования преимущество комбинации DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг на фоне активной хирургической тактики подтверждалось увеличением выживаемости животных на 13,4% относительно контрольной группы животных.
Полученные в эксперименте данные позволяют рекомендовать комбинацию DSLET 10 мкг/кг и серотонина адипината 4,5 мг/кг на фоне активной хирургической тактики для дальнейших доклинических и клинических испытаний в качестве дополнения к стандартной терапии контактного отморожения.
Материалы диссертации включены в учебную программу и используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, а также вошли в научно-исследовательскую работу Научно-исследовательского института экологической медицины Курского государственного медицинского университета, включены в учебные программы и используются в лекционных курсах на кафедре хирургических болезней Кубанского медицинского института (г. Краснодар), на кафедре медицинской биологии и генетики Северного государственного медицинского университета (г. Архангельск).
Методология и методы исследования. В диссертационном исследовании использован комплексный подход к изучению показателей оксидантно-антиоксидантного статуса, уровеня провоспалительных цитокинов, а также микроциркуляторных и морфологических изменений при экспериментальном контактном отморожении на фоне применения опиоидного пептида DSLET и серотонинергического средства серотонина адипината в качестве дополнения к существующим стандартам лечения отморожения.
Изучение фармакологических корригирующих эффектов монотерапии опиоидным пептидом DSLET 10 мкг/кг и серотонинергическим средством серотонина адипинатом 4,5 мг/кг и их комбинации проводилось с использованием лабораторных методов оценки малонового диальдегида, активности каталазы, супероксиддисмутазы и общей антиокислительной активности сыворотки крови крыс, уровня конечных стабильных метаболитов оксида азота, цитокинового статуса интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли-альфа, а также лазерной допплеровской флоуметрии для оценки уровня регионарного кровотока в пограничной некрозу зоне. Выраженность и распространенность альтеративных и репаративных изменений поврежденных тканей, формирование грануляционного вала подтверждались гистологическими методами исследования.
Эффективность применения опиоидного пептида DSLET, серотонина адипината и их комбинации в сочетании с активной хирургической тактикой на выживаемость животных при моделировании контактного отморожения оценивалась по методу Kaplan-Maier с анализом достоверности различий с использованием F-критерия Кокса.
Положения, выносимые на защиту:
-
Комбинированное применение серотонина адипината 4,5 мг/кг и DSLET 10 мкг/кг в сочетании с активной хирургической тактикой оказывает более выраженное корригирующее действие на показатели оксидантно-антиоксидантного статуса, уровень провоспалительных цитокинов и конечных стабильных метаболитов оксида азота по сравнению с монотерапией серотонина адипинатом 4,5 мг/кг и DSLET 10 мкг/кг при моделировании контактного отморожения.
-
Комбинированное применение серотонина адипината 4,5 мг/кг и DSLET 10 мкг/кг способствует более выраженному повышению уровня регионарного кровотока в пограничной некрозу зоне по сравнению с монотерапией серотонина адипинатом 4,5 мг/кг и DSLET 10 мкг/кг при экспериментальном контактном отморожении.
-
Комбинированное применение серотонина адипината 4,5 мг/кг и DSLET 10 мкг/кг в сочетании с активной хирургической тактикой способствует снижению выраженности и распространённости альтеративных изменений, ускорению формирования грануляционного вала, более интенсивному развитию репаративных процессов при моделировании холодовой травмы.
Степень достоверности и апробация результатов. Диссертационное исследование проведено на достаточном для выполнения поставленных цели и задач научно-методическом уровне с использованием комплекса лабораторно-инструментальных подходов, современных методов статистической обработки фактического материала, что подтверждает высокую достоверность полученных результатов и объективизирует полученные выводы.
Основные положения диссертации представлены на V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2012), итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета (Курск, 2013), 80-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», проводимой в рамках «Недели медицинской науки» (Курск, 2015).
Апробация результатов диссертации состоялась на совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, хирургических болезней ФПО, травматологии и ортопедии, патологической анатомии, НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета.
Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели, задач и поиске путей их реализации. Лично автором проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме выполняемой диссертации, были выполнены экспериментальные исследования на 600 самцах белых крыс линии Wistar. При непосредственном участии автора осуществлялось моделирование контактного отморожения, выведение
животных из эксперимента с измерением уровня микроциркуляции, забором крови и тканей с последующим проведением биохимического и морфологического исследований, статистическая обработка полученных результатов, их научное обоснование и обобщение. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, 4 из них – в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 219 источников, из них 154 отечественных и 65 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, содержит таблиц – 25, рисунков – 27.
Современные принципы диагностики отморожений
Тяжесть отморожений определяется степенью поражения, их распространенностью и характером клинического течения.
На течение патологического процесса, несомненно, оказывает влияние характер и время первой помощи, срок поступления в лечебное учреждение, где может быть начата рациональная комплексная терапия [19, 188].
Одной из актуальнейших задач современной клинической медицины является поиск методов лечения отморожений конечностей, позволяющих сократить сроки временной утраты трудоспособности и предотвратить инвалидизацию больных.
При отморожениях лечение должно быть направлено на сохранение жизни пострадавших от холодовой травмы, по возможности быстрое восстановление кровообращения и нарушенного тканевого обмена, предупреждение развития инфекции, а также зоны некроза мягких тканей или ограничение последней, проведение рациональной антибактериальной терапии, ускорение заживления ран, максимальное восстановление функции, при отморожениях IV степени максимальное сохранение культи [16, 20, 206]. Лечение отморожений начинается с оказания первой помощи. От времени начала лечения и ее интенсивности зависят исход холодовой травмы и уровень ампутации [44]. При оказании первой помощи нужно руководствоваться принципом: отмороженные ткани, независимо от длительности и силы действия холодового фактора, должны считаться потенциально жизнеспособными [20].
Лечение отморожений начинается в дореактивном периоде и заключается в изоляции поврежденной конечности от внешнего тепла с одновременным общим согреванием пострадавшего [28, 65].
В настоящее время во всем мире применяют следующий алгоритм оказания медицинской помощи при отморожениях: теплоизолирующие повязки по А.Я. Голомидову на 18–24 ч, точнее, до чувства появления тепла [4, 5, 40], наложение иммобилизации, особенно пострадавшим от холодовой травмы с нарушениями сознания [4, 40], внутреннее согревание организма [6], адекватное обезболивание, вплоть до наркотических аналгетиков [181].
Однако сохранение пониженной температуры и спазма сосудов глубоких слоев тканей не способствует восстановлению обменных процессов в согретых внешних слоях [140]. Патогенетически оправданной в настоящее время считается методика медленного согревания. Она направлена, в первую очередь, на восстановление нарушенного кровообращения путем согревания изнутри кнаружи за счет внутренней теплопродукции [22, 65, 68]. Восстановление температуры термоизоляции для первичного восстановления кровотока и обменных процессов в глубоколежащих тканях. Адекватному восстановлению температуры и кровотока пораженных тканей может способствовать сверхвысокочастотное (СВЧ) излучение волн сантиметрового (СМВ) диапазона, позволяющего за счет эндогенно образующегося тепла проводить разогрев на всю глубину заинтересованного сегмента с разницей температур между поверхностными и глубокими слоями не более 0,5С в одну минуту [1, 30, 34].
Одновременно начинают медикаментозное лечение. Для борьбы с прогрессирующим тромбозом сосудов используют гепарин либо препараты на основе тканевого активатора плазминогена (тромболитики) [163]. По мнению ряда зарубежных авторов, ведущую роль в консервативном лечении отморожений должны играть не антикоагулянты, а сосудорасширяющие средства и препараты, улучшающие реологические свойства крови. С этой целью, как правило, используют ацетилсалициловую кислоту, трентал, никотиновую кислоту, но-шпу, папаверин, новокаин [87].
Для получения максимального терапевтического эффекта предпочтительно внутриартериальное введение лекарственных препаратов, поскольку при этом концентрация вещества в пораженной конечности в 28 раз выше, чем при внутривенном введении. Важным и необходимым компонентом профилактики является применение столбнячного анатоксина [200]. Для ликвидации сосудистого спазма, болевого синдрома и улучшения показателей микроциркуляции в раннем реактивном периоде рекомендуется выполнение различных блокад (узлов симпатического ствола, периферических нервов), футлярной, интра- и периневральной, вагосимпатической и др. Однако длительность эффекта ограничена, и сопровождается опасностью инфицирования места катетеризации и риском развития неврита [180].
С внедрением малоинвазивной видеоэндоскопической хирургии стало возможным выполнение торакоскопической симпатэктомии. Торакоскопическая симпатэктомия способствует улучшению микроциркуляции, сосудистого тонуса и течения раневого процесса у больных с местной холодовой травмой верхних конечностей. Эффект от ее выполнения наблюдается на протяжении нескольких лет. Применение данной методики в комплексной терапии позволило сократить на 2–3 дня сроки формирования демаркационной линии, на 4–5 дней ускорить запуск регенеративных процессов у пациентов с отморожениями верхних конечностей [148]. Также проводят антибактериальную терапию [181] и дыхательную гимнастику. Исходя из того, что при отморожениях развивается гипоксия и окислительный стресс представляется целесообразным применять антигипоксанты и антиоксиданты [3]. Также важна роль физиотерапевтических методов лечения, среди которых можно отметить диадинамические токи, местные световые ванны и др. [27].
Измерение микроциркуляторных показателей
Выраженность перекисного окисления липидов в крови животных оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) [14]. Кроме того, определяли активность каталазы [15], супероксиддисмутазы (СОД) [66] и общую антиокислительную активность (ОАА) сыворотки крови крыс [135]. Уровень конечных стабильных метаболитов оксида азота (суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав реактива Грисса [83].
Количественное содержание провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 (ИЛ-6),фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-) определяли с помощью ИФА наборов для крыс «Rat TNF- Platinum ELISA» и «Rat IL-6 Platinum ELISA» фирмы «eBioscience», Австрия.
После выведения животных из эксперимента забирался участок тканей спины, включающий зону отморожения и 5 мм окружающих интактных тканей. Исследовали состояние поврежденных тканей на поверхности и разрезе, визуально учитывали особенности их строения. Для гистологического исследования брали 4-5 кусочков ткани из видимой области повреждения и из пограничной области. Кусочки ткани фиксировали в 10% растворе формалина на фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение двух недель, заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона. 2.6 Анализ летальных исходов и выживаемости
Летальность оценивалась в контрольных 1-2 группах и опытных 1-6 группах животных, получавших лечение, отдельно от основных экспериментальных групп. Процент летальности в каждой группе рассчитывался как отношение числа погибших животных к общему числу животных в данной группе, взятых в эксперимент. После суммирования полученных результатов процента летальности на протяжении всего эксперимента к 14-м суткам рассчитывали общий процент летальности.
На основании полученных данных о летальности животных были составлены таблицы выживаемости крыс с целью изучения влияния исследуемых препаратов и их комбинации на выживаемость животных при моделировании контактного отморожения, данные таблицы выживаемости были проанализированы при помощи программы STATISTICA 8.0. На основании данных таблиц выживаемости для каждой экспериментальной группы были построены соответствующие кумулятивные кривые выживаемости по методу Kaplan-Maier. Анализ достоверности различий влияния исследуемых препаратов и их комбинации в сравнении с контрольными группами на выживаемость крыс проводили по методу Cox-Mantel с использованием F-критерия Кокса. Достоверными считались различия сравниваемых параметров при р 0,05.
После моделирования контактного отморожения исследуемые вещества вводили в соответствующих дозах один раз в сутки внутрибрюшинно на первые, 3-и, 5-е и 7-е сутки эксперимента. Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных испытаний, выполненных на крысах, получавших исследуемые вещества [74, 90, 103].
В работе использован Серотонина адипинат (Serotonini adipinas) (производства НПЦ «Фармзащита», Россия; регистрационное удостоверение №: ЛС-002272) для применения в медицинской практике, полученный синтетическим путем. Фармакологическая группа: гемостатическое, серотонинергическое средство. При выборе доз исходили из средней терапевтической дозы для человека с последующим межвидовым переносом доз с помощью коэффициента пересчета для животных, в частности крыс (Freireich et al., 1966; Уланова И.П. и др., 1968) согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005) [110]. Средняя терапевтическая доза серотонина адипината составляет 10-100 мг, в настоящем экспериментальном исследовании фармакологические эффекты серотонина адипината на модели контактного отморожения изучались исходя из суточной дозы 60 мг для человека массой 70 кг, которая в результате переноса доз на крысу составила 4,5 мг/кг/сут. Препарат разводили в 0,9% растворе натрия хлорида и вводили внутрибрюшинно на первые, 3-и, 5-е и 7-е сутки после моделирования контактного отморожения.
В работе также использован синтетический селективный агонист дельта-опиоидных рецепторов DSLET (Тир-Д-Сер-Гли-Фен-Лей-Трп). Исследуемый опиоидный пептид растворяли в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мкг на 1 кг массы тела животного, что соответствует данным научной литературы, согласно которым DSLET в выбранной дозе проявляет антистрессорное, иммуномодулирующее и регенерирующее действие в эксперименте [90]. Исследуемый пептид DSLET был синтезирован в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН (зав. лабораторией, д.м.н. Ж.Д. Беспалова).
Достоверность наблюдавшихся при действии исследуемых препаратов изменений параметров, как абсолютных, так и в процентах от исходного уровня, определяли путем расчета средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (±m), среднего квадратического отклонения (d) и оценки достоверности различий сравниваемых параметров между группами с использованием функции test для групп с разными дисперсиями из программного пакета Microsoft Excel 2010. Для оценки достоверности различий показателей выживаемости в опытных группах по сравнению с контрольными группами применялся F-критерий Кокса в программе СТАТИСТИКА 8.0. Достоверными считались различия сравниваемых параметров при р 0,05.
Динамика флоуметрических, биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс опытной группы 1 с применением серотонинергического препарата серотонина адипинат
При оценке уровня микроциркуляции в опытной группе 1 было выявлено, что введение серотонина адипината в дозе 4,5 мг/кг, способствовало повышению уровня микроциркуляции в пограничной некрозу зоне. Введение серотонина адипината характеризовалось достоверным повышением уровня микроциркуляции на 85,4 % и 66,1 % в пограничной некрозу зоне на первые и 3-и сутки, соответственно, в сравнении с контрольной группой 1. На 7-е и 14-е сутки эксперимента продолжалось восстановление микроциркуляции, но при этом оставалась достоверно ниже зарегистрированного в группе интактных животных (Рисунок 5). Полученные нами результаты подтверждают данные литературы о том, что после моделирования экспериментального отморожения серотонинергическое средство серотонина адипинат вызывает не только сокращение гладкой мускулатуры и вазоконстрикцию, но также и вазодилатацию, т. е. нормализует автоматизм и сократительную активность гладкой мускулатуры, благодаря этому восстанавливается физиологический механизм вазомоции, устраняется тканевая гипоксия. Серотонин способствует повышению стойкости капилляров, связывается в крови с гепарином, образуя комплекс «гепарин–серотонин», который обладает антикоагулянтной и литической активностью, отличной от литической активности фермента плазмина и способен лизировать нестабилизированные сгустки фибрина [74]. Динамика биохимических изменений Динамика уровня биохимических показателей в опытной группе 1, получавшей серотонина адипинат в дозе 4,5 мг/кг массы тела крыс, при экспериментальном контактном отморожении представлена в таблице 5.
В контрольной группе 1 повышение МДА характеризуется максимальным возрастанием в 1,8 раз на первые сутки с последующим сохранением высоких значений МДА на 3-и, 7-е и 14-е сутки эксперимента по сравнению с интактной группой животных. Так, в сыворотке крови нелеченых животных отмечалось достоверное повышение концентрации МДА на 81,1% - первые сутки, на 41,6% 3-и сутки, на 47,0% - 7-е сутки, на 25,3% -14-е сутки эксперимента (Таблица 5).
В опытной группе 1 с первых по 7-е сутки не было выявлено достоверного снижения МДА относительно контрольной группы 1, однако, на 14-е сутки на фоне введения серотонина адипината в дозе 4,5 мг/кг уровень МДА приближался к значениям интактных животных (р 0,05) (Таблица 5). Таблица 5 - Динамика биохимических показателей в опытной группе 1 при экспериментальном контактном отморожении. Биохимические показатели Исследуемые группы Сроки исследования сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки МДА,мкМоль/л интактные 1,81±0,05у 1,81±0,06у 2,01±0,09у 1,98±0,07у контроль 1 3,27±0,16х 2,56±0,17х 2,95±0,06х 2,48±0,10х опытная группа 1 3,33±0,16х 2,53±0,11х 2,76±0,18х 2,08±0,19 КАТ,мкат/л интактные 8,29±0,24 8,83±0,20у 9,12±0,18у 9,02±0,25у контроль 1 8,99±0,25 11,43±0,43х 5,85±0,37х 7,79±0,20х опытная группа 1 8,72±0,20 10,76±0,35 7,48±0,16ху 9,07±0,15у СОД,усл.ед./мл интактные 12,62±0,17у 12,29±0,27у 12,09±0,18у 12,47±0,09у контроль 1 8,26±0,15 Х9,12±0,22 9,94±0,36 Х12,00±0,20 опытная группа 1 8,50±0,15 9,23±0,13 X10,22±0,11 12,42±0,13 ОАА,% интактные 28,23±0,57 27,84±0,46у 27,49±0,40у 28,15±0,37у контроль 1 27,85±0,52 33,35±0,69 13,71±0,64 22,57±0,74 опытная группа 1 27,98±0,44 37,00±0,66ху 22,50±0,77ху 28,55±0,36у NOх,мкМоль/л интактные 5,23±0,15у 5,35±0,16у 5,26±0,14у 5,40±0,13у контроль 1 3,62±0,14х 2,75±0,15х 3,19±0,17х 3,46±0,19х опытная группа 1 3,38±0,12х 2,98±0,12х 3,35±0,12х 4,59±0,16ху ИЛ-6,пг/мл интактные 4,02±0,29 4,37±0,23у 3,89±0,20у 4,15±0,24у контроль 1 4,39±0,15 24,32±0,71х 13,25±0,17х 9,14±0,56х опытная группа 1 4,04±0,18 20,70±0,83ху 7,60±0,43ху 4,63±0,32у ФНО-,пг/мл интактные 2,66±0,25у 2,40±0,15у 2,45±0,19у 2,27±0,16у контроль 1 3,86±0,3l Х16,25±0,75 8,63±0,38 х5,85±0,37 опытная группа 1 3,76±0,16 13,35±0,38ху 5,61±0,36ху 2,94±0,22ху Примечания: у- р 0,05 в сравнении с контрольной группой 1; х- р 0,05 в сравнении с интактной группой. В контрольной группе 1 отмечалось компенсаторное повышение активности одного из основных ферментов антиоксидантной защиты – каталазы на 29,6% на 3-и сутки эксперимента, с последующим его снижением на 35,9% и 13,5% на 7-е и 14-е сутки, соответственно, относительно группы интактных крыс (Таблица 5). На фоне лечения серотонина адипинатом у крыс с моделью отморожения отмечалось незначительное снижение уровня каталазы в опытной группе 1 на 1-е и 3-и сутки эксперимента с дальнейшим повышением на 28,1% на 7-е сутки, и на 16,3% на 14-е сутки относительно контрольной группы 1 (р 0,05), к концу эксперимента уровень каталазы не отличался от значений интактных животных (Таблица 5).
Нами было получено, что у крыс контрольной группы 1 с моделью отморожения через 24 часа в сыворотке крови наблюдалось снижение активности СОД, что выражалось в более низких значениях 8,25 усл.ед./мл, по сравнению с интактными животными 12,61 усл.ед./мл (p 0,05), данная тенденция сохранялась на 3-и и 7-е сутки включительно и нормализировалась к 14-м суткам эксперимента (Таблица 5).
Статистически достоверного положительного влияния на первые, 3-и и 7-е сутки применения препарата серотонина адипинат на уровень СОД в эксперименте не выявлено. Отмечено снижение данного показателя, как в контрольной 1, так и в опытной группе 1, однако, на 14-е сутки на фоне введения серотонина адипината уровень СОД приближался к значениям интактных животных (Таблица 5).
После моделирования отморожения в контрольной группе 1 к 7-м суткам наблюдалось значительное снижение общей антиокислительной активности в 2 раза по сравнению с интактными животными (13,71±0,64 % против 27,49±0,40%), в дальнейшем разница между значениями контрольной 1 и интактной группой была менее выраженной и на 14-е сутки составляла 5,58 % (Таблица 5).
На фоне введения серотонина адипината отмечается достоверное повышение уровня ОАА на 64,1% на 7-е сутки и 26,5% – на 14-е сутки эксперимента по сравнению с контрольной группой 1 (р 0,05). К окончанию эксперимента уровень ОАА на фоне применения серотонина адипинат в дозе 4,5 мг/кг составил 28,55±0,36%, что достоверно не отличалось от группы интактных животных (Таблица 5). В контрольной группе 1 имело место нарушение NO-продуцирующей функции эндотелия, выражающееся в снижении концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (NOx) с первых по 14-е сутки эксперимента. Наибольшее снижение уровня NOх на 48,6% наблюдалось на третьи сутки, к концу исследования значения NOх не достигали уровня интактных животных (р 0,05) (Таблица 5).
Статистически достоверного положительного влияния от введения серотонина адипината на уровень NOх в эксперименте не выявлено. Отмечено снижение данного показателя, как в контрольной 1, так и в опытной группе 1, однако, на 14-е сутки на фоне введения серотонина адипината уровень NOх приближался к значениям интактных животных (Таблица 5).
Нами также установлено, что в контрольной группе 1 на всех сроках исследования отмечалось достоверное повышение провоспалительных цитокинов, при этом, максимальный подъем наблюдался на третьи сутки эксперимента: ФНО- был выше в 6,7 раз, ИЛ-6 – в 5,5 раза по сравнению с группой интактных животных. Следует отметить, что к 14-м суткам после отморожения, в позднем реактивном периоде, уровень провоспалительных цитокинов значительно снижался, но при этом его значения не достигали уровня у интактных крыс (Таблица 5).
Динамика биохимических и морфологических изменений при моделировании контактного отморожения у крыс на фоне активной хирургической тактики опытной группы 6 с применением комбинации серотонинергического препарата серотонина адипинат и опиоидного пептида DSLET
В опытной группе 3 с применением комбинации серотонина адипинат и DSLET наблюдалось увеличение уровня каталазы на всех сроках эксперимента. Достоверное увеличение уровня каталазы на 53,0% и 29,9% отмечалось, соответственно, на 7-е и 14-е сутки исследования в сравнении с контрольной группой 1 (р 0,05). При этом следует отметить, что уже начиная с 7-х суток эксперимента на фоне применения комбинации препаратов отмечается увеличение каталазы до уровня интактных животных (р 0,05) (Таблица 11). Нами было получено, что у крыс контрольной группы 1 с моделью отморожения через 24 часа в сыворотке крови наблюдалось снижение активности супероксиддисмутазы (СОД), что выражалось в более низких значениях 8,25 усл.ед./мл, по сравнению с интактными животными 12,61 усл.ед./мл (p 0,05), данная тенденция сохранялась на 3 и 7-е сутки включительно и нормализировалась к 14-м суткам эксперимента (Таблица 11).
Применение комбинации серотонина адипината и DSLET приводило к повышению уровня СОД в эксперименте на всех исследуемых сутках. Наблюдался достоверный подъем уровня СОД на 40,0% на 7-е сутки и на 6,4% на 14-е сутки относительно контрольной группы 1 (р 0,05), при этом, на 7-е и 14-е сутки эксперимента уровень СОД не отличался от значений интактных животных (р 0,05) (Таблица 11).
После моделирования отморожения в контрольной группе 1 к 7-м суткам наблюдалось значительное снижение общей антиокислительной активности в 2 раза по сравнению с интактными животными (13,71±0,64 % против 27,49±0,40%), в дальнейшем разница между значениями контрольной 1 и интактной группой была менее выраженной и на 14-е сутки составляла 5,58 % (Таблица 11).
В опытной группе 3 с применением комбинации серотонинергического средства серотонина адипината и опиоидного пептида DSLET наблюдалось увеличение уровня ОАА, начиная с третьих суток эксперимента. Наблюдался достоверный подъем уровня ОАА на 93,4% на 7-е сутки и на 34,0% на 14-е сутки относительно контрольной группы 1 (р 0,05). При этом следует отметить, что уже начиная с 7-х суток эксперимента на фоне применения комбинации препаратов отмечается увеличение ОАА до уровня интактных животных (р 0,05) (Таблица 11).
В контрольной группе 1 имело место нарушение NO-продуцирующей функции эндотелия, выражающееся в снижении концентрации конечных стабильных метаболитов оксида азота (NOx) с первых по 14-е сутки эксперимента. Наибольшее снижение уровня NOх на 48,6% наблюдалось на третьи сутки, к концу исследования значения NOх не достигали уровня интактных животных (р 0,05) (Таблица 11).
На фоне применения комбинации серотонина адипината и DSLET наблюдалось повышение уровня NOх, начиная с 3-х суток эксперимента. Отмечено достоверное повышение уровня NOх на 3-и, 7-е и 14-е сутки эксперимента на 26,5%, 31,0% и 51,7%, соответственно, в сравнении с контрольной группой 1 (р 0,05). К концу эксперимента на 14-е сутки достоверных отличий от интактной группы не наблюдалось (р 0,05) (Таблица 11).
Нами также установлено, что в контрольной группе 1 на всех сроках исследования отмечалось достоверное повышение провоспалительных цитокинов, при этом, максимальный подъем наблюдался на 3-и сутки эксперимента: ФНО- был выше в 6,7 раз, ИЛ-6 – в 5,5 раза по сравнению с группой интактных крыс. Следует отметить, что к 14-м суткам после отморожения, в позднем реактивном периоде, уровень провоспалительных цитокинов значительно снижался, но при этом его значения не достигали уровня у интактных крыс (Таблица 11).
Введение комбинации серотонина адипината и DSLET приводило к менее выраженному увеличению уровня провоспалительных цитокинов в крови крыс по сравнению с применением исследуемых препаратов в режиме монотерапии, что подтверждалось достоверным снижением ФНО- на 3-и, 7-е и 14-е сутки, соответственно, на 43,8%, 64,8% и 51,3% относительно контрольной группы 1 (р 0,05). Также выявлено снижение уровня цитокина ИЛ-6 на 3-и, 7-е и 14-е сутки, соответственно, на 53,3%, 63,6% и 57,0% относительно контрольной группы 1 (р 0,05). Следует отметить, что уровень интактных животных достигался для ИЛ-6 и ФНО- на 14-е сутки эксперимента (р 0,05) (Таблица 11).
Динамика морфологических изменений
В опытной группе 3, получавшей комбинированное лечение серотонином адипинатом и DSLET, к концу 1-х суток в области повреждения, наблюдаются очаги отслойки и слущивания эпителия эпидермиса, набухание клеток и пикноз ядер эпителия поверхностных отделов волосяных фолликулов. В глубоких отделах волосяных фолликулов эпителий, в основном, сохранен, встречаются набухшие и гиперхромные клетки. Выражена альтерация соединительной ткани: набухание сосочкового и сетчатого слоев дермы, имеются очаги отечного расслоения. Соединительнотканные волокна набухшие, разрыхленные. Мышечные клетки также в состоянии набухания. При окраске по Ван Гизон выявляется мукоидное набухание в соединительной ткани области повреждения.
В пограничной области наблюдается расслоение рогового слоя лишь на небольшом протяжении. Эпителиальные клетки эпидермиса сохранны. В сосочковом слое дермы при окраске по Ван Гизон выявляется мукоидное набухание соединительной ткани и стенок сосудов, очаги расслоения соединительнотканных волокон. Эндотелиальные клетки сосудистых стенок набухшие. В сетчатом слое обнаруживаются небольшие скопления нейтрофилов, макрофагов, значительный отек соединительной ткани и ее расслоение. Признаки дистонии сосудов не выявляются. Сосуды гиперемированы.
На 3-и сутки после холодовой травмы при макроскопическом исследовании область повреждения окружена тонким выбухающим демаркационным валом. Микроскопически альтеративные изменения в области повреждения представлены некрозом клеток эпидермиса, а также эпителия поверхностных отделов волосяных фолликулов. При окраске по Ван Гизон отмечается мукоидное набухание и фибриноидный некроз соединительной ткани сосочкового слоя дермы, в сетчатом слое в сравнении с предыдущими группами, также следует отметить сохранность отдельных участков соединительной ткани глубоких отделов (Рисунок 12а).