Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 19
1.1.Острая и хроническая почечная недостаточность 19
1.1.1. Распространенность острой и хронической почечной недостаточности 20
1.1.2. Диагностика острой и хронической почечной недостаточности 22
1.1.3. Современные методы лечения ишемической острой почечной недостаточности 27
1.1.4. Современные методы лечения хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным гломерулонефритом 36
1.2. Использование гравитационной терапии в медицине 37
1.2.1. Медико-биологические аспекты гравитационной терапии 38
1.2.2. Применение гравитационной терапии в медицине 40
1.3. Гравитационная терапия и почки 42
Глава 2. Материалы и методы исследования
Глава 3. Действие фармакологических средств на выделительную функцию почек 81
3.1. Влияние диуретиков на выделительную функцию почек 82
3.2. Влияние фармакологических средств синтетического происхождения на экскреторную функцию почек
3.3 Воздействие фармакологических средств природного происхождения на выделительную функцию почек 88
Глава 4. Влияние различных режимов гравитационного воздействия на экскреторную функцию почек 95
4.1. Разработка новых схем и режимов гравитационного воздействия в экспериментальных условиях 95
4.2. Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения к почкам животного на диурез, салурез и креатининурез 98
4.3. Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения от почек животного на экскреторную функцию почек 102
4.4. Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения к голове животного на почечную экскрецию воды, электролитов и креатинина 106
4.5. Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения к хвосту животного на выделительную функцию почек 109
Глава 5. Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на стуктурные особенности и функциональное состояние почек и их сосудов 114
5.1. Локализация и механизм действия оптимального режима гравитационного воздействия на клубочковую фильтрацию и канальцевый транспорт натрия 114
5.2. Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на биохимические показатели крови и мочи 117
5.3. Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на показатели пульса и артериального давления 119
5.4. Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на УЗИ параметры почек и УЗДГ параметры сосудов почек 122
5.5. Морфофункциональные изменения почек под влиянием оптимального режима гравитационного воздействия 122
Глава 6. Анализ комбинированного влияния фармакологических средств и оптимального режима гравитационного воздействия на выделительную функцию почек 129
6.1. Комбинированное влияние диуретиков и оптимального режима гравитационного воздействия на диурез, салурез и креатининурез 129
6.2. Комбинированное влияние фармакологических средств синтетического происхождения и оптимального режима гравитационного
воздействия на экскреторную функцию почек 141
6.3. Комбинированное влияние фармакологических средств природного происхождения и оптимального режима гравитационного воздействия на экскреторную функцию почек 136
Глава 7. Эффективность фармакотерапии, гравитационной терапии и их комбинации при ишемической острой почечной недостаточности 148
7.1. Влияние фармакотерапии, гравитационной терапии и их комбинации на тяжесть острой почечной недостаточности в постишемическом периоде 149
7.2. Влияние фармакотерапии, гравитационной терапии и их комбинации на УЗИ параметры почек и УЗДГ параметры сосудов почек крыс с ишемической острой почечной недостаточностью 172
7.3. Действие фармакотерапии, гравитационной терапии и их комбинации на морфологические параметры почек крыс с ишемической острой почечной недостаточностью 174
Глава 8. Влияние фармакологических средств, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинаций на транспортныепроцессы в модельных опытах 198
8.1. Влияние фармакологических средств, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинаций на транспорт натрия в модельных опытах на отрезках тонкой кишки 198
8.2. Влияние фармакологических средств, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинаций на проницаемость стенки эритроцитов для флуоресцентного зонда АНС 207
8.3. Влияние фармакологических средств, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинаций на парацеллюлярный транспорт уранина в модельных опытах на отрезках тонкой кишки 217
Глава 9. Эффективность иммуносупрессивной терапии, гравитационной терапии и их комбинации при экспериментальной хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом 225
9.1. Влияние иммуносупрессивной терапии, гравитационной терапии и их комбинации на тяжесть хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом 226
9.2. Влияние иммуносупрессивной терапии, гравитационной терапии и их комбинации на УЗИ параметры почек и УЗДГ параметры сосудов почек крыс с хронической почечной недостаточностью, вызванной аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом 229
9.3. Воздействие иммуносупрессивной терапии, гравитационной терапии и их комбинации на морфологические параметры почек крыс с хронической почечной недостаточностью, вызванной аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом 231
Глава 10. Обсуждение полученных результатов 238
Выводы 262
Практические рекомендации 264
Перечень сокращений и условных обозначений .265
Список литературы .
- Современные методы лечения хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным гломерулонефритом
- Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения к почкам животного на диурез, салурез и креатининурез
- Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на биохимические показатели крови и мочи
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В различных странах мира в среднем на 1 миллион населения приходится 30-60 случаев острой почечной недостаточности в год (Thakar C.V., Christianson A., Freyberg R. et al. Crit. Care Med. 2009. Vol.37. Р.2552-2558). Несмотря на постоянное совершенствование методов фармакотерапии и технологии проведения гемодиализа, летальность при развитии острой почечной недостаточности составляет 26-50% (Waikar S.S., Curhan G.C., Wald R. et al. J. Am. Soc. Nephrol. 2006. Vol.17. Р.1143-1150). Численность больных с хронической почечной недостаточностью в странах Европы, Соединенных Штатов Америки и Японии составляет в среднем 300 на 1 миллион населения, в России – 212 на 1 миллион населения среди больных старше 15 лет (Игнатова М.С. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2000. №1. С.24-29; Кузьмин О.Б., Пугаева М.О., Жежа В.В., Нефрология. 2006. Т.10. №2. С.18-27; Сигитова О.Н. Вестник современной клинической медицины. 2008. №1(1). С.83-87; Ватазин А.В., Астахов П.В., Зулькарнаев А.Б., Федулкина В.А. Общественное здоровье и здравоохранение. 2013. №3. С.4-9; Калюжин В.В., Уразова О.И., Калюжина Е.В. Бюллетень Сибирской медицины. 2015. Т.14. №4. C.87-98). Хроническая почечная недостаточность находится на одиннадцатом месте в структуре общей смертности. Совокупность эпидемиологических данных свидетельствует об актуальности проблемы лечения острой почечной недостаточности и предотвращения ее перехода в хроническую форму для нефрологии, фармакологии и медицины в целом.
В современной медицинской практике используется множество медикаментозных схем терапии острой и хронической нефропатии. Однако фармакологические препараты, применяемые для лечения почечной недостаточности, часто малоэффективны, с повышением дозы вызывают ряд побочных эффектов, усугубляющих тяжесть поражения почек (Бесова Н. Врач. 2012. №11. С.35-38; Хорошилов С.Е. Буковинский медицинский вестник. 2012. Т.16. №3(63), ч.2. С.31-35; Wiedermann C.J. BMC Emerg. Med. 2008. Vol.8. P.1; Prowle J.R. Nat. Rev. Nephrol. 2010. Vol.6. P.107-115). В связи с этим проблема лечения почечной недостаточности продолжает оставаться актуальной. Это обосновывает большое число исследований, проводимых в данной области с целью поиска новых нефропротекторов, как среди известных лекарственных средств, так и среди вновь синтезированных соединений (Сивак К.В. Автореф. дис… канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 2007. 16 с.; Кумышева Л.А., Коростелев С.А., Марченко С.Д. Фармация. 2009. №2. С.39-41; Кутина А.В., Марина А.С., Зайцева К.В. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т.73. №10. С.21-24; Кузьмин О.Б., Ландарь Л.Н., Бучнева
Н.В. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2014. Т.77. №7. С.16-19; Штрыголь С.Ю., Товчига О.В., Койро О.О., Степанова С.И. Лекарственные растения, почки и обмен мочевой кислоты. Харьков: Титул, 2014. 424 с.; Sward K., Valsson F., Odencrants P. et al. Crit. Care Med. 2004. Vol.32. P.1310-1315).
Ряд литературных данных свидетельствует о том, что если на ранних стадиях развития экспериментальной ишемической острой почечной недостаточности обеспечить выработку почками большого количества мочи за счет повышения уровня клубочковой фильтрации и снижения канальцевой реабсорбции, то просвет коллабированных почечных канальцев значительно увеличивается, а эпителий канальцев остается более сохранным (Дубищев А.В. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1991. Т.54. №4. С.76; Золотухин П.В., Беланова А.А., Лебедева Ю.А. и др. Нефрология. 2015. Т.19. №5. С.17-22; Wang H.E., Muntner P., Chertow G.M. et al. Am. J. Nephrol. 2012. Vol.35. P.349-355). Все это в совокупности способствует регрессии заболевания и восстановлению чувствительности почек к фармакологическому воздействию. Но большинство используемых в практике диуретических средств, с различными механизмами действия, стимулируют диурез преимущественно за счет угнетения канальцевой реабсорбции, не обладают способностью увеличивать клубочковую фильтрацию, или даже, напротив, уменьшают ее. Исключением являются петлевые диуретики, в частности фуросемид, однако и он стимулирует клубочковую фильтрацию только при профилактическом применении, при лечении уже развившейся острой почечной недостаточности он практически не влияет на процессы фильтрации (Дубищев А.В. Дис… докт. мед. наук: 14.00.25. Куйбышев, 1988. 353 с.).
При хронической почечной недостаточности аутоиммунного генеза в клинической
практике применяются преимущественно аппаратные методы лечения, из
фармакологических средств наиболее часто используются иммуносупрессоры. После радикального лечения терминальной почечной недостаточности (трансплантации почки) иммуносупрессивная терапия выходит на первый план. Однако иммуносупрессоры обладают выраженными нефротоксическими свойствами, снижают клубочковую фильтрацию, повышают канальцевую реабсорбцию, способствуя развитию антидиуреза (Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Цыгин А.Н., Шилов Е.М. Нефрология. 2014. Т.18. №4. С. 93-100).
Угнетение же экскреторной функции почек и процессов фильтрации при острой и
хронической почечной недостаточности закономерно приводит к снижению
чувствительности пораженного органа к фармакологическому воздействию и уменьшению эффективности проводимой фармакотерапии. И вновь возникает необходимость увеличения дозировки лекарственных препаратов, что закономерно способствует повышению частоты возникновения побочных эффектов.
В настоящее время лекарственные средства, избирательно усиливающие почечный
кровоток и клубочковую фильтрацию, отсутствуют, однако имеется ряд
физиотерапевтических методов, улучшающих кровообращение в органах и тканях: баротерапия, гравитационная терапия, озонотерапия, электротерапия, магнитотерапия, ультразвуковая терапия (Хунов А.З. Дис… канд. мед. наук: 14.01.23. Москва, 2011, 158 с.; Пикалова М.В. Дис… канд. мед. наук: 14.03.11. Самара, 2012, 139 с.; Додонов А.Г., Сонис А.Г., Яшков А.В. Современные тенденции развития науки и технологий. 2016. №10-5. С.21-25). Среди них наиболее выраженный эффект стимуляции кровотока оказывает метод гравитационной терапии, применяемый в травматологии, ортопедии, хирургии, гинекологии, терапии для интенсификации кровообращения и регенеративных процессов (Котельников Г.П. Гравитационная терапия: монография. М.: Медицина, 2003. 244 с.; Макарова Н.В. Дис… канд. мед. наук. 14.00.01, 03.00.25. Самара, 2008. 176 с.; Eremina N.V., Popov M.N. Folia Otorhinolaryngologiae et Pathologiae Respiratoriae. 2015. Vol.21. №3. P.54-56). Литературные данные, отражающие результаты исследований влияния центробежных ускорений на экскреторную функцию почек людей и животных, немногочисленны и противоречивы (Васильев П.В., Котовская А.Р. Длительно действующие ускорения (перегрузки) // Космическая биология и медицина. М.: Наука, 1966. С.105-137; Розенблюм Д.Е. Авиакосмическая медицина. М. 1967. С.100-101; Куприянов В.В. Арх. анат. гистол. и эмбриол. 1971. №11. С.17-30; Краснов И.Б. Космическая биология. 1986. Т.20. №6. С.51-58). Режимы гравитационного воздействия, оказывающего положительное влияние на почечный кровоток и выделительную функцию почек, как в норме, так и при нефропатии, до настоящего времени не выявлены.
В связи с этим актуальным является поиск новых фармакологических средств, режимов гравитационного воздействия и их комбинаций, обладающих нефропротекторными свойствами, для лечения экспериментальной почечной недостаточности.
Цель исследования
Поиск и обоснование применения оптимальных комбинаций фармакологических средств и гравитационного воздействия при экспериментальной почечной недостаточности.
Задачи исследования
-
Провести сравнительный анализ эффективности используемых в практике диуретических средств с различными механизмами действия (аминофиллин, ацетазоламид, фуросемид, гидрохлоротиазид, комбинированный препарат гидрохлоротиазида и триамтерена) в эксперименте.
-
Провести поиск и экспериментальное изучение новых фармакологических средств, обладающих диуретической активностью и способностью увеличивать клубочковую
фильтрацию.
-
Проанализировать влияние гравитационного воздействия на клубочковую фильтрацию и экскреторную функцию почек.
-
Проанализировать клубочковый механизм стимуляции экскреторной функции почек отобранным режимом гравитационного воздействия.
-
Исследовать влияние сочетанного воздействия фармакологических средств и гипергравитации на клубочковую фильтрацию и канальцевую реабсорбцию у интактных животных.
-
Исследовать влияние отобранных фармакологических средств, режима гравитационного воздействия и их комбинаций на экскреторную функцию почек, скорость клубочковой фильтрации, биохимические показатели крови, мочи и функционально-морфологические параметры клубочково-канальцевого аппарата на модели экспериментальной ишемической острой почечной недостаточности.
-
Исследовать канальцевый механизм стимуляции экскреторной функции почек при применении отобранных фармакологических средств и режима гравитационного воздействия ex vivo.
-
Проанализировать влияние иммуносупрессивной терапии, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинации на скорость клубочковой фильтрации, биохимические показатели крови, мочи и функционально-морфологические параметры клубочково-канальцевого аппарата на модели экспериментальной аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
Методология и методы исследования
Исследование проведено на мелких лабораторных животных. Работа включает
эксперименты на интактных животных, а также на грызунах с экспериментальной
ишемической острой почечной недостаточностью и аутоиммунной хронической почечной
недостаточностью. В опытах, выполненных на интактных животных, проанализировано
влияние на экскреторную функцию почек известных диуретических средств (аминофиллин,
ацетазоламид, фуросемид, гидрохлоротиазид, комбинированный препарат
гидрохлоротиазида и триамтерена) и новых фармакологических средств синтетического (блокатор 5-НТ3-рецепторов РУ-63) и природного (сухой экстракт травы зверобоя, рутин, гумат магния и другие) происхождения. Все диуретики применялись в средней терапевтической дозе, за исключением фуросемида, вызывающего максимальный диурез, взятого в пороговой дозе. Диуретические дозы новых фармакологических средств подбирались экспериментальным путем.
В отдельных сериях экспериментов исследовалась возможность увеличения
клубочковой фильтрации и стимуляции выделительной функции почек методом гравитационного воздействия. Был произведен поиск и анализ оптимального режима гравитационного воздействия, обладающего указанными свойствами. Ряд опытов был посвящен изучению влияния на экскреторную функцию почек новых фармакологических средств и известных диуретиков в сочетании с оптимальным режимом гравитационного воздействия.
Ишемическая модель острой почечной недостаточности была получена путем одностороннего пережатия почечной ножки (артерии, вены и мочеточника) сосудистым зажимом на 1,5 ч. Вторая почка при этом удалялась, чтобы не было возможности контралатеральному органу изменить оценку тяжести экспериментального поражения органа (Лебедев А.А., Посохов В.П. Фармакология и токсикология. 1981. Т.44. №3. С.309-314). В период с 1 по 7 сутки после операции было проведено изучение диуретического, салуретического и нефропротекторного действия отобранных фармакологических средств (РУ-63, рутина, гумата магния, гидрохлоротиазида), гравитационного воздействия и их комбинаций.
В опытах ex vivo был проанализирован канальцевый механизм стимуляции экскреторной функции почек наиболее эффективными при экспериментальной ишемической острой почечной недостаточности фармакологическими средствами, гипергравитацией и их комбинациями.
Модель аутоиммунной хронической почечной недостаточности (хронического мембранозного гломерулонефрита) создавалась путем иммунизации крыс суспензией почечного антигена материнской особи по определенной схеме (Коломеец Н.Ю., Косарева П.В., Аверьянова Н.И., Черешнев В.А. Патент РФ на изобр. №2373583. 2009. Бюл. №32. 6 с.). Спустя месяц после первичной иммунизации начинали лечение крыс с аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом: методом иммуносупрессивной терапии (циклоспорин + микофеноловая кислота + преднизолон), методом гравитационной терапии и их комбинацией. Исследование диуретического, салуретического и нефропротекторного действия указанных методов производили на 30 сутки непрерывного лечения экспериментальной аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
В работе применялись фармакологические, биохимические, ультразвуковые, гистологические, морфометрические и статистические методы исследования.
Все проведенные эксперименты рассмотрены и одобрены Комитетом по биоэтике при Самарском государственном медицинском университете, протокол №81/1 от 15 июля 2009 г.
Апробация результатов
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в
материалах II, IV Российских фитотерапевтических съездов (Москва, 2010; 2012); II
Международной научно-практической конференции «Высокие технологии,
фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); Х Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2012); XIX, XX Международных научно-практических конференций молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств» (Харьков, 2012; 2013); IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); Научно-практической конференции с международным участием «Фармакология, физиология и патология почек» (Черновцы, 2012); Евразийского конгресса «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013); Первой всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); Всероссийской конференции с международным участием «Доклинические исследования в инновационной медицине и биотехнологиях» (Самара, 2013); V Международного Молодежного Медицинского Конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013» (Санкт-Петербург, 2013); Научно-практической конференции с международным участием и школой молодых ученых «Фармакология, физиология и патология почек, мочевыводящих путей и водно-солевого обмена» (Харьков, 2014); Седьмой Российско-Китайской конференции по медицине и фармакологии (КНР, Харбин, 2015); Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки», посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 2015); IV Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, профилактики и лечения профессионально обусловленных заболеваний» (Сочи, 2016) и других конференций.
Апробация работы состоялась 30 июня 2016 года на заседании кафедр фармакологии
имени з.д.н. РФ профессора А.А. Лебедева, профессиональных болезней и клинической
фармакологии, доказательной медицины и клинической фармакологии ИПО, медицинской
реабилитации, спортивной медицины, физиотерапии и курортологии, Института
экспериментальной медицины и биологии совместно с научной проблемной комиссией по
химико-фармацевтическим наукам Самарского государственного медицинского
университета.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в разработке концепции исследования, в основе
которой лежит научно-информационный поиск, обосновании цели и постановке задач. Автор принимал непосредственное участие в постановке всех серий экспериментов. Сбор и статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных результатов, оформление рукописи диссертации проведены лично автором. Определяющим является вклад автора в подготовку научных докладов, публикаций и патентов, а также внедрение результатов в практическую медицину.
Положения, выносимые на защиту
1. Используемые в практике диуретические средства с различными механизмами
действия (аминофиллин, ацетазоламид, фуросемид, гидрохлоротиазид, комбинированный
препарат гидрохлоротиазида и триамтерена) не обладают способностью одновременно
стимулировать клубочковую фильтрацию и угнетать канальцевую реабсорбцию. Обладая
такими свойствами, сухой экстракт травы зверобоя и гумат магния стимулируют диурез,
салурез и креатининурез. Селективный блокатор 5-НТ3-рецепторов РУ-63 и рутин
стимулируют только диурез и салурез.
2. Гравитационное воздействие стимулирует экскреторную функцию почек.
Оптимальным для стимуляции экскреторной функции почек является режим
гравитационного воздействия 3g в направлении вектора центробежного ускорения к почкам
животного.
-
Отобранный режим гравитационного воздействия стимулирует экскреторную функцию почек за счет повышения средней скорости кровотока по стволу почечной артерии, возрастания скорости клубочковой фильтрации и снижения канальцевой реабсорбции.
-
Гравитационное воздействие в отобранном режиме стимулирует мочегонное действие используемых в практике диуретических средств за счет оптимизации экскреторной функции почек при одновременном повышении клубочковой фильтрации и снижении канальцевой реабсорбции.
-
РУ-63, рутин и гидрохлоротиазид реализуют нефропротекторный эффект за счет ускоренного восстановления экскреторной функции почек на модели ишемической острой почечной недостаточности. Гипергравитация повышает эффективность данных фармакологических средств.
-
Гравитационное воздействие в отобранном режиме повышает эффективность и уменьшает побочные эффекты иммуносупрессивной терапии на модели аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
Научная новизна
Экспериментально установлено, что используемые в практике диуретические средства с различными механизмами действия (аминофиллин, ацетазоламид, фуросемид,
гидрохлоротиазид, комбинированный препарат гидрохлоротиазида и триамтерена) не
обладают способностью одновременно повышать клубочковую фильтрацию и
стимулировать экскреторную функцию почек.
Впервые установлено, что блокатор серотониновых 5-НТ3-рецепторов РУ-63 обладает оптимальными диуретическими и салуретическими свойствами для применения в сочетании с гравитационным воздействием.
Охарактеризован фармакологический спектр действия фитодиуретиков в аспекте их преимущественного влияния на канальцевый компонент и лишь в отдельных случаях дополнительной стимуляции клубочковой фильтрации. Установлено, что двойным механизмом действия на выделительную функцию почек обладает и препарат пелоидов гумат магния.
Впервые установлено, что гипергравитация дополняет диуретическое действие фармакологических средств с канальцевым механизмом действия клубочковым компонентом, а фармакологических средств с клубочковым механизмом действия – канальцевым компонентом.
Выявлено повышение эффективности РУ-63, рутина, гидрохлоротиазида и гумата магния в сочетании с гравитационным воздействием на модели ишемической острой почечной недостаточности.
Установлено повышение эффективности и снижение токсичности
иммуносупрессивной терапии в сочетании с гравитационным воздействием на модели аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
Теоретическая и практическая значимость работы
Работа носит фундаментальный характер и представляет собой поиск
фармакологических средств для лечения острой и хронической почечной недостаточности, а также методов позволяющих повысить эффективность проводимой фармакотерапии.
Теоретические достижения, представленные в предыдущем разделе, определяют практическую значимость работы. Результаты проведенных экспериментов обосновывают применение комбинаций диуретиков и гравитационного воздействия при ишемической острой почечной недостаточности, а также иммуносупрессоров и гравитационного воздействия при аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
Полученные результаты перспективны для внесения в регистрационное досье для получения разрешения на клинические исследования эффективности применения диуретиков в сочетании с гравитационным воздействием при ишемической острой почечной недостаточности, а также иммуносупрессоров в сочетании с гравитационным воздействием при аутоиммунной хронической почечной недостаточности.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены на уровне Министерства здравоохранения Самарской области. Форма внедрения – информационное письмо Министерства здравоохранения Самарской области (№30/2957 от 05.12.2016 г.).
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе: ФГБОУ ВО «Рязанского государственного медицинского университета» Минздрава России на кафедре фармакологии с курсом фармации ФДПО в дисциплине «Фармакология» в разделе «Частная фармакология» по темам «Диуретические средства» и «Гормональные препараты», а также в дисциплине «Клиническая фармакология» в разделе «Частная клиническая фармакология» по теме «Клиническая фармакология диуретических средств»; ФГБОУ ВО «Уральского государственного медицинского университета» Минздрава России на кафедре фармакологии и клинической фармакологии в разделе «Частная фармакология» по теме «Мочегонные средства»; ФГБОУ ВО «Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского» Минздрава России на кафедре фармакологии в разделе «Лекарственные средства, регулирующие функции исполнительных органов» по теме «Диуретики».
Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России на кафедре фармакологии имени з.д.н. РФ профессора А.А. Лебедева в разделе «Частная фармакология» по темам «Диуретики», «Гормональные препараты», на кафедре профессиональных болезней и клинической фармакологии в разделе «Частная клиническая фармакология» по теме «Клиническая фармакология диуретиков»; на кафедре доказательной медицины и клинической фармакологии ИПО в разделе «Клиническая фармакология»; на кафедре медицинской реабилитации, спортивной медицины, физиотерапии и курортологии в разделе «Физиотерапия» по теме «Лечение заболеваний почек и мочевыводящих путей»; на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии в цикле «Основы фитотерапии» по теме «Применение наиболее распространенных растений в медицине».
Связь задач исследования с основным планом научно-исследовательских работ
университета
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России по темам «Комплексные исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов природного и синтетического происхождения» (№ госрегистрации 01200900568) и «Комплексные исследования по разработке лекарственных средств природного и синтетического происхождения» (№ госрегистрации 115042810034).
Сведения о публикациях по теме диссертации
Соискатель имеет 145 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 73 печатные работы общим объемом 11,08 печатных листов, в том числе 20 статей в научных журналах и изданиях, включенных в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем по теме дисертации получено 15 патентов РФ, опубликовано 5 статей в периодических изданиях, 31 работа – в материалах всероссийских и международных конференций, 2 работы – в региональных изданиях.
Объем и структура диссертации
Современные методы лечения хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным гломерулонефритом
Первым симптом, который указывает на развитие острой почечной недостаточности, является уменьшение суточного диуреза. В зависимости от тяжести и стадии заболевания может развиваться олигурия (снижение объема выделяемой мочи) и анурия (полное отсутствие выделения мочи), причем часто происходит колебание показателей суточного диуреза в пределах от 1 до 2,5 л [126, 287].
Среди наиболее информативных лабораторных методов диагностики острой почечной недостаточности находится общий анализ мочи, анализ мочи по Нечипоренко и Зимницкому, общий анализ крови, биохимический анализ крови и мочи. Из инструментальных методов исследования больных с острой нефропатией следует отметить, прежде всего, ультразвуковое исследование (УЗИ) почек и ультразвуковая доплерография сосудов почек (УЗДГ) [20, 62, 235, 258].
В общем анализе мочи при острой почечной недостаточности на первое место выходит микроскопия осадка, которая дает ответ на вопрос, какой этиологии острая нефропатия. При преренальной нефропатии он часто без особенностей. Реже никаких изменений не наблюдается при постренальной острой почечной недостаточности, однако часто в этом случае видны лейкоциты, эритроциты, эпителиальные и зернистые цилиндры [4]. Для первичного повреждения почек характерен осадок, содержащий клетки канальцевого эпителия, эпителиальные цилиндры и многочисленные пигментированные коричневатые зернистые цилиндры. На аллергический нефрит указывают эозинофилы в моче, а эритроциты позволяют предположить наличие у больного гломерулонефрита. Кроме того, при олигурической стадии острой почечной недостаточности отмечается снижение относительной плотности мочи, связанное с нарушением концентрационной функции почек [211].
В общем анализе крови выявляется эритроцитопения преимущественно за счет гемодилюции, вызванной задержкой ионов натрия в организме [309].
Одним из главных критериев, позволяющих поставить диагноз острая почечная недостаточность, является ежедневный непрерывно прогрессирующий подъем уровня креатинина сыворотки крови. Важным показателем также является уровень креатинина мочи, так как позволяет на ранних этапах развития острой почечной недостаточности использовать диагностические индексы, помогающие установить этиологию нефропатии [315]. Одним из таких индексов является клиренс креатинина, позволяющий судить о скорости клубочковой фильтрации и отражающий скорость очищения крови от креатинина. Также есть следующие показатели: соотношение осмоляльностей мочи и плазмы, концентрации натрия в моче и в плазме крови и другие [217, 328].
Среди изменений биохимических лабораторных показателей для острой почечной недостаточности характерна прогрессирующая азотемия, ацидоз, гиперкалиемия и гипонатриемия. Обычно отмечается умеренный ежедневный подъем уровня креатинина и мочевины в сыворотке крови [168, 213]. Повышение уровня сывороточного креатинина больше, чем на 2 мг%/сут, указывает на гиперпродукцию креатинина в результате острого некроза скелетных мышц. Возможен умеренный ацидоз, медленное повышение концентрации калия в плазме крови и умеренная гипонатриемия, связанная с избытком воды. Гематологическая картина соответствует нормохромно-нормоцитарной анемии средней тяжести [329]. Острая почечная недостаточность, спровоцированная острым повреждением почечных канальцев, имеет три фазы: продромальную, олигурическую и постолигурическую. Продолжительность продромальной фазы зависит от таких факторов, как степень гипотензии (для преренальной острой почечной недостаточности) или количество поглощенного токсина (для ренальной острой почечной недостаточности) [63, 337].
Во время олигурической фазы показатель диуреза изменяется в пределах от 50 до 400 мл/сут. Длительность данного периода варьирует от 1-2 дней до 6-8 недель и сопровождается повышением уровня креатинина и мочевины плазмы крови. В постолигурическую фазу диурез нормализуется, а уровень креатинина и мочевины плазмы крови приходит в норму несколько позже. Канальцевая дисфункция может сохраняться в течение длительного периода, проявляясь потерей натрия, полиурией и метаболическим ацидозом [350].
Визуализация почек с помощью УЗИ и компьютерной томографии позволяет определить размеры органа, эхогенность его паренхимы, а с помощью УЗДГ – диаметр почечных сосудов, скорость кровотока по ним, индекс резистентности почечных сосудов. Так как нормальные и увеличенные размеры почек – это свидетельство того, что процесс обратим, а уменьшенные - могут означать переход острой почечной недостаточности в хроническую почечную недостаточность [49, 179].
Из инструментальных методов также применяется магнитно-резонансная томография (МРТ) с радиоактивными изотопами в тех случаях, когда установить причину и форму острой почечной недостаточности другими методами не представляется возможным (например, при окклюзии почечных артерий). Однако не следует забывать, что сами контрастные и радиоактивные вещества зачастую обладают нефротоксическими свойствами [21]. В том случае если и метод МРТ не помог поставить диагноз, показана почечная биопсия [222, 312]. Сегодня наиболее современными и перспективными ранними неинвазивными маркерами острой почечной недостаточности являются: липокалин-2 (NGAL) в плазме крови и в моче, интерлейкин-18 (IL-18) и молекула повреждения почки-1 (KIM-1) в моче, цистатин-С в плазме крови [14, 324].
Так липокалин-2 или NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), он же липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов [340]. Существует множество других названий липокалина. Во время острой почечной недостаточности NGAL синтезируется, попадает в кровь, фильтруется почками, но не реабсорбируется. В связи с этим при повреждении почечных канальцев происходит быстрое значительное повышение уровня NGAL, синтезированного вне почек и клетками дистальных почечных канальцев непосредственно. В плазме крови уровень NGAL возрастает в 7-15 раз, а в моче – в 25-1000 раз [333, 346]. Уровень NGAL в плазме крови и в моче повышается на 1-2 дня раньше, чем уровень креатинина плазмы крови. NGAL («ренальный тропонин») – это эффективный ранний маркер и предиктор острой почечной недостаточности [356].
Интерлейкин-18 (IL-18) – это провоспалительный цитокин, синтезируемый эпителием проксимальных почечных канальцев в ответ на действие нефротоксических факторов. Определение IL-18 в моче дает возможность диагностировать повреждение почечной ткани, спровоцированное ишемией и нефротоксинами, на самой ранней стадии. Также он является показателем тяжести острой почечной недостаточности и повышенного риска летального исхода [316, 333].
LINK2 Влияние фармакологических средств синтетического происхождения на экскреторную
В хронических экспериментах на крысах исследовалось влияние гипергравитации на показатели пульса и артериального давления (АД) животных. Формировалась 1 группа животных. Контролем служили показатели, полученные от животных, перед гравитационным воздействием, а опытом – показатели, полученные после сеанса гравитационной терапии. Измерение пульса и АД производилось при помощи специального устройства, разработанного на кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета с хвостовой манжетой [103]. Данное устройство в полуавтоматическом режиме (с нажатия кнопки) накачивало воздух в манжету, а затем его стравливало. Манжета накладывалась на хвост животного, расположенного в клетке-пенале на центрифуге ультракороткого радиуса. В ходе эксперимента было определено систолическое АД и пульс животных непосредственно перед гравитационным воздействием и сразу после него. Статистическая обработка полученных результатов производилась по непараметрическому критерию Уилкоксона для зависимых выборок.
Изучение влияния оптимального режима гравитационного воздействия на УЗИ параметры почек и УЗДГ параметры сосудов почек Животные контрольной группы (интактные животные) и опытной группы (сразу после гравитационного воздействия 3g в направлении вектора центробежного ускорения к почкам животного) получали этаминал натрия внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг и направлялись на ультразвуковое исследование. При помощи ультразвукового сканирования у крыс были установлены размеры почек, толщина и кровенаполнение паренхимы, состояние чашечно-лоханочной системы. Почечная гемодинамика была изучена методом ультразвуковой доплерографии со спектральным анализом (УЗДГ) на портативном ультразвуковом сканере SonoScape S6Pro (SonoScape, КНР) ультразвуковым линейным датчиком L741. Оценивалась максимальная систолическая скорость артериального потока - МСС (см/с), конечная диастолическая скорость артериального потока - КДС (см/с) и индекс резистентности (ИР) по формуле: МСС-КДС/МСС на уровне основной почечной артерии (1 уровень) и сегментарных артерий (верхней, средней и нижней – 2 уровень). Независимый показатель индекс резистентности почечной артерии рассчитывался автоматически для характеристики почечного сосудистого сопротивления [8, 180]. При снижении индекса резистентности на уровне основной почечной артерии менее 0,59 - 1 уровень, 0,50 - 2 уровень, диагностируется патологическая реакция сосудистой стенки артерий микроциркуляторного русла в виде ее ригидности, и, наоборот, при повышении индекса резистентности – диагностируется патологическое повышение мышечного тонуса стенки артерии. Способ позволяет повысить точность оценки гемодинамических нарушений в почках [197, 207]. Всего поставлено 2 серии хронических экспериментов (20 опытов).
Животных выводили из эксперимента путем передозировки эфира медицинского. Забор материала производили после остановки дыхания и сердцебиения. Брюшную полость вскрывали срединным разрезом. Забору подлежали почки животного. Для проведения морфологических исследований гистологический материал (срезы почек) фиксировали в нейтральном 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заливали парафином [26, 131]. Все серийные срезы были 2 мкм толщиной, их окрашивали гематоксилином и эозином, а затем изучали на световом микроскопе фирмы «Leica Microsystems» при увеличении микроскопа 100 и 400. В ходе анализа срезов производили микрофотографирование фотокамерой фирмы «Nikon». Для получения достоверных данных при проведении измерений использовали серию дублирующих (тройных) измерений [12]. Всего было приготовлено 250 гистологических препаратов.
Морфометрический анализ также проводили на световом микроскопе фирмы «Leica Microsystems». Мормометрия – современный информативный количественный метод, который широко используется в гистологии при исследовании различных тканей и органов, позволяет провести количественную оценку гистологических изменений и объективно оценить полученные в ходе морфологических исследований результаты [272, 342]. Определялись наружный и внутренний диаметры проксимальных и дистальных почечных канальцев, толщина стенки канальцев, ширина межканальцевых промежутков, процентное соотношение функционирующих и спавшихся канальцев, кровенаполнение сосудов [67]. Всего поставлено 4 серии экспериментов (40 опытов).
Влияние гравитационного воздействия в направлении вектора центробежного ускорения к почкам животного на диурез, салурез и креатининурез
Иммунные и аутоиммунные процессы зачастую являются ведущей причиной развития различных острых и хронических заболеваний мочевыделительной системы [126]. В свою очередь, гломерулонефрит стоит на первом месте в списке причин развития как острой, так и хронической почечной недостаточности. Именно поэтому наш выбор остановился на модели хронического мембранозного гломерулонефрита. Иммуносупрессивная терапия применяется для лечения аутоиммунных заболеваний, в том числе и заболеваний почек. При терминальной хронической почечной недостаточности больному показана либо пожизненная аппаратная заместительная терапия, либо трансплантация почки. После трансплантации органа больные вынуждены пожизненно получать иммуносупрессивную терапию. Однако сами иммуносупрессоры обладают выраженными нефротоксическими свойствами, угнетают клубочковую фильтрацию и экскреторную функцию почек. В связи с этим было изучено влияние иммуносупрессоров, гравитационного воздействия и их комбинации на тяжесть экспериментальной хронической почечной недостаточности.
Исследование влияния иммуносупрессоров, оптимального режима гравитационного воздействия и их комбинации на тяжесть хронической почечной недостаточности, вызванной аутоиммунным мембранозным гломерулонефритом Модель хронического мембранозного гломерулонефрита создавалась путем иммунизации белых беспородных крыс суспензией почечного антигена материнской особи по определенной схеме [132]. Антигенную суспензию получали следующим образом: под эфирным наркозом самку крысы, имеющую потомство 4-х месячного возраста, декапитировали, почки перфузировали специальным стерильным охлажденным раствором, отсекали от почечной ножки, охлаждали, отделяли капсулу, выделяли корковый слой. Корковый слой суспендировали в ступке, а затем в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (ООО «НПП «Академприбор», Украина) в режиме 44 мГц в течение 10 мин. Полученную суспензию заливали 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида, трехкратно центрифугировали на холоде в течение 3 мин со скоростью 2000 оборотов в 1 мин, супернатант заменяли на прохладный физиологический раствор. Затем суспензию центрифугировали 10 мин при скорости 5000 оборотов в мин. Осадок взвешивали. Антиген готовили следующим образом: 200 мг осадка заливали 10 мл полного адьюванта Фрейнда. Антигенная суспензия коркового слоя почки крысы хранилась при температуре 0-4С. Иммунизировали крысят из расчета 100 мкл суспензии на 100 г массы тела животного по схеме: трехкратно внутрибрюшинно в 1, 3, 5 день, повторно однократно через 3 недели. Спустя сутки после каждой иммунизации у всех животных проводили контроль содержания в суточной моче белка. Появление белка в моче, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в крови, снижание диуреза, повышение уровня креатинина и мочевины в крови у опытных крыс относительно интактной группы животных являлось критерием развития гломерулонефрита. Воспроизводимость эксперимента составила 100%. Все крысы, подвергнутые иммунизации, имели гистологическую картину нефрита Хеймана.
Полученную модель экспериментального мембранозного хронического гломерулонефрита лечили иммуносупрессорами, гравитационным воздействием и их комбинацией. Дизайн эксперимента выглядел седующим образом: 1 группа – интактная (здоровые животные); 2 группа – контрольная (животные с нелеченым гломерулонефритом); 3 группа – опытная (гломерулонефрит, леченый комбинацией иммуносупрессоров: циклоспорин, микофеноловая кислота, преднизолон); 4 группа – опытная (животные с гломерулонефритом, леченым гравитационным воздействием 3g в направлении вектора центробежного ускорения к почкам животного); 5 группа – опытная (гломерулонефрит, леченый комбинацией иммуносупрессоров и гравитационного воздействия). Лечение начали на 30-й день после проведения первой иммунизации. Курс лечения длился 30 дней, лечебное воздействие осуществлялось в одинаковое время утром один раз в день на фоне 3% водной нагрузки. На 30-й день терапии животные после лечебных манипуляций рассаживались в обменные клетки на сутки для сбора мочи. Аналогично опытам с ишемической острой почечной недостаточностью, в полученных пробах мочи определялся объем, концентрация натрия, калия, креатинина, мочевины, белка. Также забирались пробы крови для анализа на содержание креатинина, мочевины и циркулирующих иммунных комплексов.
Всего было поставлено 5 серий экспериментов (50 опытов), из них 4 серии (40 опытов) с моделированием аутоиммунного мембранозного гломерулонефрита и 1 серия (10 опытов) интактные животные.
Влияние оптимального режима гравитационного воздействия на биохимические показатели крови и мочи
Поиск новых фармакологических методов воздействия, обладающих нефропротекторными свойствами, а также методов, повышающих их эффективность при почечной недостаточности, является важной задачей современной фармакологии, нефрологии и медицины в целом [247, 259, 290]. При нефропатии отмечается снижение чувствительности почек к фармакологическому воздействию. Однако если заставить почки вырабатывать больше мочи, тогда быстрее будут выводиться из организма продукты белкового обмена, метаболиты лекарственных веществ и токсические агенты, что будет способствовать ремиссии заболевания почек.
В связи с этим мы исследовали влияние фармакологических средств, обладающих мочегонной активностью, и повышенной гравитации на экскреторную функцию почек крыс с ишемической острой почечной недостаточностью.
Эффективность лечения острой почечной недостаточности (ОПН) сегодня оценивают не только по изменению основных показателей выделительной функции почек (диурез, салурез, креатининурез), но и по ключевым маркерам повреждения почек, отражающим тяжесть поражения данного органа: скорость клубочковой фильтрации (СКФ) и протеинурия. Скорость клубочковой фильтрации наиболее часто определяют по клиренсу эндогенного креатинина. Креатинин и мочевина являются продуктами белкового обмена в организме [4; 63]. Сегодня ряд биомаркеров, отражающих функциональное состояние почек, пополнен ферментами лактатдегидрогеназой (ЛДГ) и гаммаглутамилтрансферазой (ГГТ), экскретируемыми с мочой и позволяющими дифференцировать нефрологические заболевания на ранних стадиях [19]. К функциональным методам исследования почечной гемодинамики также относят метод ультразвуковой доплерографии со спектральным анализом (УЗДГ), в частности чаще всего в клинике используют уголнезависимый доплеровский индекс резистентности, характеризующий пульсовое наполнение отдельно взятого участка сосудистого русла. Кроме того, данный метод позволяет оценить диаметр почечных сосудов, максимальную систолическую скорость артериального потока в области устья почечной артерии и эхогенность паренхимы почек [49, 62, 256]. Также одним из наиболее точных методов диагностики в настоящее время является гистологический метод исследования, который дает возможность верифицировать диагноз и проконтролировать эффективность проводимого лечения [26, 272, 342].
Мочегонные средства широко применяются во многих отраслях медицины, в том числе в уронефрологии. Существуют данные о том, что если на ранних стадиях развития острой ишемической нефропатии посредством диуретиков обеспечить выработку почками большого количества мочи за счет повышения уровня клубочковой фильтрации и снижения канальцевой реабсорбции, то просвет коллабированных почечных канальцев значительно увеличивается, а эпителий канальцев остается более сохранным [71, 113, 352].
В предыдущих экспериментах на интактных животных нами было доказано, что ряд средств синтетического и природного происхождения на фоне гравитационного воздействия усилили свои диуретические и салуретические свойства в сравнении с их действием в условиях нормогравитации. Наиболее значимые изменения диуретической активности под действием гипергравитации произошли у следующих фармакологических средств: диуретика гидрохлоротиазида (синтетического происхождения), блокатора серотониновых 5-НТ3-рецепторов РУ-63 (синтетического происхождения), рутина (растительного происхождения), гумата магния (пелоидного происхождения). Причем под действием гипергравитации фармакологический эффект данных препаратов значительно усиливался. Предстояло детально исследовать изолированное влияние отобранных фармакологических средств, режима гравитационного воздействия, а также их совместного влияния на выделительную функцию почек крыс с постишемической острой почечной недостаточностью.
Формирование ишемической острой почечной недостаточности у лабораторных животных подтверждали следующие изменения показателей функционального состояния почек: у животных снижалась почечная экскреция воды, возрастал уровень креатинина крови, снижалась скорость клубочковой фильтрации, нарастала протеинурия.
В результате первой группы серий экспериментов по лечению нефропатии было выявлено, что в 1-е сутки постишемического периода наиболее эффективным среди трех методов лечения (гипергравитация, гидрохлоротиазид и их комбинация) оказался метод лечения ОПН, включающий в себя изолированное гравитационное воздействие (рисунок 24). В данной группе животных, отмечено умеренное возрастание диуреза с 2,24±0,14 мл/сут в группе нелеченого контроля до 2,87±0,07 мл/сут в опыте (на 28%, р=0,001), натрийуреза – с 283,66±28,76 мкмоль/сут до 423,06±24,01 мкмоль/сут (на 49%, р=0,002), калийуреза – с 39,83±4,66 мкмоль/сут до 63,87±3,51 мкмоль/сут (на 60%, р=0,001) и креатининуреза – с 4,31±0,42 мг/сут до 6,68±0,47 мг/сут (на 55%, р=0,001).
В тоже время, классический диуретик гидрохлоротиазид, введенный внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг, приводил к большему росту диуреза в сравнении с контролем до 3,83±0,13 мл/сут (на 71%, р=0,000), натрийуреза – до 421,52±23,46 мкмоль/сут (на 49%, р=0,002), а также падению креатининуреза – до 1,29±0,08 мг/сут (на 70%, р=0,000).
Влияние комбинированного метода лечения гидрохлоротиазидом и гипергравитацией способствовало максимальному возрастанию почечной экскреции воды до 4,91±0,23 мг/сут (на 119%, р=0,000), натрия – до 647,89±51,44 мкмоль/сут (на 133%, р=0,000), калия – до 53,40±3,91 мкмоль/сут (на 34%, р=0,039) и снижению креатинина – до 0,82±0,09 мг/сут (на 81%, р=0,000). Однако, комбинированный метод в сравнении с изолированной гравитационной терапией увеличивал диурез (на 71%, р=0,000), натрийурез (на 56%, р=0,000) и снижал креатининурез (на 88%, р=0,000), а относительно монотерапии гидрохлоротиазидом – стимулировал почечную экскрецию воды (на 28%, р=0,001), натрия (на 57%, р=0,000) и калия (на 47%, р=0,002), угнетая креатининурез (на 36%, р=0,001).