Экспериментальное изучение психотропной активности производных пиразоло[c]пиридина ГИЖ-72 и пирролодиазепина ГМАЛ-24 в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса Кудряшов Никита Викторович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 15

1.1. Патогенез депрессивных расстройств 15

1.1.1. Роль дендритного ремоделирования в патогенезе депрессии 16

1.1.2. Роль системы эндогенных нейростероидов в патогенезе депрессии 19

1.1.3. Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в патогенезе депрессии

1.2. Антидепрессанты: молекулярные мишени и особенности применения 25

1.3. Экспериментальное моделирование тревоги и депрессии: проблемы релевантности и их возможное решение 36

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46

2.1. Экспериментальные животные 46

2.2. Изученные вещества 46

2.3. Моделирование хронического стресса 47

2.3.1. Непредсказуемый хронический умеренный стресс 47

2.4. Оценка антидепрессивной активности 48

2.4.1. Тест вынужденного плавания 48

2.5. Оценка когнитивной функции 48

2.5.1. Водный лабиринт Морриса 48

2.6. Оценка уровня тревоги 49

2.6.1. Открытое поле 49

2.6.2. Тест закапывания шариков 50

2.6.3. Черно-белая камера 50

2.6.4. Гипофагия 51

2.7. Оценка нейролептической активности 51

2.7.1. Апоморфиновая вертикализация 51

2.8. Изучение интероцептивных свойств 52

2.8.1. Лекарственная дифференцировка 52

2.9. Нейрохимический анализ 53

2.9.1. Определение уровня моноаминов и их метаболитов 53

2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 54

ГЛАВА 3. Оценка антидепрессивной активности изучаемых веществ

3.1. Влияние продолжительности предварительного плавания на эффекты флуоксетина в тесте вынужденного плавания 56

3.2. Особенности антидепрессивных эффектов флуоксетина и амитриптилина в модификации теста вынужденного плавания 59

3.3. Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса 60

3.4. Изучение антидепрессивной активности производного пиразоло[C]пиридина ГИЖ-72 при отсутствии стресса 65

3.5. Изучение антидепрессивной активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после субхронического введения в условиях непредсказуемого умеренного хронического стресса 69

3.6. Особенности антидепрессивной активности ГИЖ-72 после хронического перорального введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса

3.7. Изучение эффектов ГИЖ-72 в водном лабиринте Морриса после хронического

введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса 77

ГЛАВА 4. Оценка анксиолитической активности изучаемых веществ

4.1. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ при однократном введени в отсутствии стресса 79

4.1.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочно-исследовательскую реакцию 79

4.1.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей 81

4.1.3. Влияние ГИЖ-72 на апоморфиновую вертикализацию 85

4.1.4. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции в «черно-белой камере» 87 4.2. Особенности анксиолитической активности изучаемых веществ в условиях

непредсказуемого хронического умеренного стресса 88

4.2.1. Влияние изучаемых веществ на ориентировочно-исследовательскую реакцию 89

4.2.2. Влияние изучаемых веществ на компульсивное поведение мышей 94

4.2.3. Влияние изучаемых веществ на тревожные реакции мышей в «черно-белой камере» 96

4.2.4. Особенности анксиолитической активности ГИЖ-72 в тесте «гипофагия» после хронического перорального введения 99

ГЛАВА 5. Нейрохимические и поведенческие аспекты хронического введения антидепрессантов в условиях стресса 101

5.1. Влияние непредсказуемого умеренного хронического стресса на эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания 102

5.2. Нейрохимические изменения 104

ГЛАВА 6. Изучение роли системы эндогенных нейростероидов в реализации психотропных эффектов ГИЖ-72 и препаратов сравнения 109

6.1. Нейростероидогенез и тревожные реакции у мышей 111

6.2. Влияние нарушения нейростероидогенеза на эффекты ГИЖ-72 и флувоксамина в тесте «открытое поле» 113

6.3. Нейростероидогенез и компульсивное поведение у мышей 116

6.4. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и препаратов сравнения 118

6.5. Влияние нарушения нейростероидогенеза на антидепрессивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина 121

ГЛАВА 7. Изучение роли гамка-рецептора в реализации психотропных эффектов гиж-72 123

7.1. Лекарственная дифференцировка «коразол – физиологический раствор» 123

ГЛАВА 8. Обсуждение результатов 126

Заключение 154

Выводы 159 практические рекомендации 161

Список сокращений 162

Список литературы 163

• Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в патогенезе депрессии
• Непредсказуемый хронический умеренный стресс
• Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса
• Нейрохимические изменения

Введение к работе

Актуальность работы. Стремительный рост заболеваемости тревожно-

депрессивными расстройствами и негативный эпидемиологический прогноз (Kessler R.C. and Bromet E.J. //Annu. Rev. Public Health. 2013. V34. P.119-138) обуславливают актуальность поиска новых средств фармакологической коррекции указанных психопатологий, которые будут обладать широким спектром терапевтического действия и достаточным профилем безопасности.

Среди тревожных расстройств особое место занимает обсессивно-компульсивное
расстройство – тревожное заболевание, связанное с появлением навязчивых и тревожных
мыслей (обсессии), которые сопровождаются навязчивым поведением (компульсии),
направленным на снижение тревоги (Veale D. And Roberts A. // BMJ. 2014. V348. g2183).
Основу фармакотерапии обсессивно-компульсивного расстройства составляют

антидепрессанты, а также анксиолитики бензодиазепинового ряда и низкие дозы нейролептиков (Decloedt E.H. and Stein D.J. //Neuropsychiatr. Dis. Treat. 2010. V6. P. 233-242; Marazziti D. et al. // Curr. Top Med. Chem. 2012. V12(4). P. 238-253). На сегодняшний день существует проблема резистентности к терапии селективными ингибиторами обратного захвата серотонина (СИОЗС) и трициклическим антидепрессантом (ТЦА) кломипрамином, преодоление которой, в некоторых случаях, удается достичь путем наращивания дозы, либо комбинированием антидепрессантов с антипсихотическими препаратами (Decloedt E.H. and Stein D.J., 2010), что может увеличить риск развития нежелательных лекарственных реакций и ставит под сомнение безопасность терапии. Вышеизложенное обуславливает задачу разработки новых эффективных лекарственных средств терапии обсессивно-компульсивного расстройства, в том числе изучения антикомпульсивной активности среди новых фармакологических веществ.

Развитие концепции стресса, основа которой была заложена Гансом Селье (Selye H. Stress in Health and Disease. NY:McGrawHill. 1976. 515P), привело к формированию представления об основополагающей роли стрессового фактора, как триггерного механизма в патогенезе многих психопатологий, в т.ч. и аффективных расстройств. Непредсказуемый хронический умеренный стресс (НХУС) – экспериментальная парадигма, различные модификации которой в последнее время приобретают все большую популярность для моделирования взаимосвязи между аффективными расстройствами и воздействием на организм непредвиденных стрессовых событий (Darwish I.E. et al. // Int. J. Physiol. Pathophysiol.Pharmacol. 2013. V5(2). P. 128-136; Gronli J. Doctoral thesis. The University of Bergen. 2006; Hill M.N. et al. // Neurosci. Biobehav.Rev. 2012.V36(9). P. 2085-2117; Javelot H. // Behav. Brain. Res. 2014. V261. P. 8-16). Использование модели НХУС позволяет, с одной стороны, сделать экспериментальные модели тревоги и депрессии более чувствительными, с другой – оценить динамику активности фармакологических веществ, в том числе и новых оригинальных соединений, в условиях длительной стрессовой экспозиции.

Экспериментальные и клинические данные указывают на возможную роль стресс-зависимых систем, таких как гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая ось (Heinzmann J. et al. // Pharmacopsychiatry. 2011. V21. A54; Hernandez M.E. et al. // Clin. Dev. Immunol. 2013: 267871; Wang C. et al. // Pharmacol. Biochem. Behav. 2014. V116. P.116-128) и система эндогенных нейростероидов, в реализации психотропных эффектов антидепрессантов из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) (Fry J.P. et al. //

Br. J. Pharmacol. 2014. V171(24). P.5870-5880; Griffin L. and Mellon S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V96(23). P. 13512-13517; Maurice T. And Su T. // Pharmacol. Ther. 2009. V124(2). P.195-206; Uzunova V. et al. // Psychopharmacology. 2006. V186. P.351-361). Современные представления о нейробиологических аспектах стресса рассматривают нейростероидогенез как основу физиологической реакции на стресс (Sarkar J. et al. // J. Neurosci. – 2011. V31(50). P.18198-18210).

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» был синтезирован ряд
производных пиразоло[C]пиридина и пирролодиазепинов, среди которых были отобраны
соединения ГИЖ-72 (4,6-диметил-2-(4-хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-

C]пиридин-3-он, хлоралгидрат) и ГМАЛ-24 (2-(2-гидроксиэтил)-1,2,4,5-тетрагидро-3Н-пирроло [1,2а][1,4] диазепин-3-он), обладающие антидепрессивным и анксиолитическим эффектами, а также низкой токсичностью (Мелетова О.К. дис. канд. биол. наук: 14.00.25. М.: 2007; Середенин С.Б. и др.//Патент 2472795 РФ. 2013).

Вышеизложенное делает актуальным экспериментальное изучение

антикомпульсивного эффекта соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24, особенностей их анксиолитических и антидепрессивных свойств в условиях длительной стрессовой экспозиции, а также роли системы эндогенных нейростероидов в механизме действия антикомпульсивной активности психотропных препаратов.

Степень разработанности проблемы. Психотропные эффекты синтезированных в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» оригинальных гетероциклических соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 были обнаружены при скрининге анксиолитической и антидепрессивной активности (МелетоваО.К., 2007; Середенин С.Б. и др., 2013), что послужило основой для расширенного изучения их активности в условиях моделирования патологии при длительном применении.

На сегодняшний день изучены многие нейробиологические аспекты НХУС (Bekris S.et al. // Behav. Brain.Res. 2005.V161(1). P.45-49; FarhanM.et al. // Pak. J. Pharm. Sci. 2014. V27(4). P.879-884; HidkindR. et al. // Eur. Neuropsychopharmacol. 2003. 13(1). P. 19-28; Hill M.N. et al., 2012), а также поведенческие и нейрохимические эффекты отдельных препаратов в условиях данной модели (Azpiroz A.et al. // Psychoneuroendocrinology. 1999. V24(3). P.345-361; Darwish I.E. et al., 2013; Ducottet C. et al. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2003. V27(4). P.625-631; Pitychoutisa P.M. et al. // Neurosci. 2012. V210. P.152-167; Rong H. et al. // Int. J. Mol. Sci. 2010. V11(12). P.5310-5322; Wang et al., 2014). Однако многие вопросы, связанные с механизмами действия фармакологических агентов в условиях длительной стрессовой экспозиции, которые могут отличаться от таковых при отсутствии стресса остаются открытыми.

Благодаря целому ряду экспериментальных и клинических работ, к настоящему времени начинают формироваться представления о значительной роли системы эндогенных нейростероидов в патогенезе аффективных расстройств (Bckstrm T.et al. // Prog. Neurobiol. 2014. V113. P.88-94; Bali A. and Jaggi A. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2014. V48. P.64-78; Frye C.A. et al. // Neuroscience. 2006. V138(3). P.1007-1014), а также в реализации психотропных эффектов некоторых классов антидепрессантов, в частности СИОЗС (FryJ.P. et al., 2014; Griffin L. and Mellon S., 1999; Maurice T. and Su T., 2009; Uzunova V.et al., 2006).

Цель исследования - экспериментальное изучение психотропной активности оригинальных гетероциклических соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 при длительном введении и в условиях НХУС в сравнении с классическими антидепрессантами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить влияние НХУС на эффекты амитриптилина, флуоксетина, ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 в тесте вынужденного плавания при однократном и длительном введении.

2. Изучить влияние НХУС на содержание моноаминов и их метаболитов в головном мозге мышей после однократного и хронического введения амитриптилина и флуоксетина

3. Изучить анксиолитическую активность ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 после однократного введения при отсутствии стресса и после длительного введения в условиях НХУС.

4. Изучить антикомпульсивную активность ГИЖ-72 при однократном и длительном введении в условиях НХУС в тесте закапывания шариков для мышей в сравнении с флувоксамином.

5. Изучить влияние подавления активности 5-редуктазы и 3-гидроксистероид дегидрогеназы на компульсивное поведение и ориентировочно-исследовательскую реакцию мышей линий BALB/C и С57BL/6.

6. Оценить влияние селективной блокады митохондриального транслокационного белка 18 кДа (TSPO) на антидепрессивную и антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина.

7. Изучить роль ГАМКА-рецептора в реализации эффектов ГИЖ-72 на модели оперантного метода лекарственной дифференцировки.

Научная новизна работы. Впервые показано, что антидепрессивный эффект флуоксетина в тесте вынужденного плавания, в отличие от амитриптилина, находится в зависимости от кратности введения и продолжительности действия НХУС - претерпевает инверсию при субхроническом и отсутствует при однократном введении в условии НХУС.

В ходе комплексного изучения анксиолитической активности ГИЖ-72 и ГМАЛ-24 впервые установлено, что:

ГИЖ-72 обладает анксиолитическим эффектом у мышей линии BALB/C при однократном и длительном введении, а также сохраняет противотревожные свойства через 24 ч после отмены хронического введения в условиях НХУС.

ГИЖ-72 демонстрирует антикомпульсивную активность у мышей линий BALB/C и С57BL/6, которая не только сохраняется, но и усиливается при длительном введении в условиях НХУС, а также не исчезает через 24 ч после отмены курсового введения.

ГМАЛ-24 после длительного введения в условиях НХУС ослабляет тревожные реакции мышей линии BALB/C в тестах «открытое поле» и «закапывание шариков».

При фармакологической блокаде основных ферментов метаболизма прогестерона в ЦНС впервые установлено, что компульсивное поведение мышей линий BALB/C и С57BL/6, в отличие от ориентировочно-исследовательской реакции, подавляется только при селективном ингибировании 5-редуктазы.

Впервые показано, что селективная блокада TSPO при применении РК11195 устраняет антидепрессивный эффект флуоксетина и приводит к продепрессивному

действию ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания у мышей. Антикомпульсивная активность ГИЖ-72 и флуоксетина не зависит от функциональной активности TSPO.

При проведении комплексного поведенческого и нейрохимического анализа антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина в условиях НХУС, установлена корреляция между антидепрессивными свойствами изучаемых препаратов и изменениями в моноаминергической системе головного мозга мышей на фоне длительной стрессовой экспозиции.

Впервые показано, что лиганды сигма-1-рецепторов, в частности флувоксамин, потенцируют эффекты ингибиторов 5-редуктазы.

В условиях оперантной модели лекарственной дифференцировки было впервые установлено, что интероцептивные эффекты коразола не ингибируются введением ГИЖ-72, что указывает на отсутствие у ГИЖ-72 свойств лиганда положительных модуляторных сайтов ГАМК_А-рецептора.

Впервые показано, что антидепрессивный эффект флуоксетина в тесте вынужденного плавания у мышей находится в зависимости от наличия процедуры предварительного плавания и ее продолжительности.

Научно-практическая значимость. Отсутствие антидепрессивного эффекта флуоксетина при однократном введении и его продепрессивное действие при субхроническом введении в условиях НХУС позволяет рассматривать проблемы резистентности и усугубления депрессивной симптоматики на фоне терапии СИОЗС с позиции зависимости эффектов флуоксетина от определнной стадии стресса.

Особенности анксиолитической активности ГИЖ-72 в условиях трансляционной модели обсессивно-компульсивного расстройства (в тесте закапывания шариков) при НХУС позволяют рассматривать ГИЖ-72 в качестве перспективного средства для будущих клинических исследований.

Сохранение анксиолитической активности ГИЖ-72 через 24 ч после прекращения курса хронического введения в условиях стресса свидетельствует об отсутствии синдрома отмены у изучаемого соединения, что обуславливает его преимущество по сравнению с другими анксиолитическими средствами.

Выявленная зависимость антидепрессивного эффекта флуоксетина, в тесте
вынужденного плавания у мышей, от предварительной посадки и ее продолжительности
свидетельствует о необходимости процедуры предварительного плавания

продолжительностью 5 мин за 24 ч до теста, которая позволит сделать модель более чувствительной при скрининге антидепрессивной активности в рядах новых соединений.

Методология и методы исследования. Эксперименты проведены с

использованием целостного организма (поведенческий анализ) и на уровне систем (нейрохимический анализ). В представленной работе были применены методы фармакологического анализа (использование фармакологических анализаторов и референтых препаратов), генетического анализа поведения (использование инбредных линий животных) и метод лекарственной дифференцировки. С целью моделирования взаимосвязи тревожно-депрессивных расстройств и стрессовых событий в работе была использована модель НХУС различной продолжительности. Для оценки степени проявления депрессивных реакций и уровня тревожности были использованы следующие экспериментальные методы: тест вынужденного плавания в собственной модификации, водный лабиринт Морриса, тест «открытое поле», тест «черно-белая камера», тест

«гипофагия», тест закапывания шариков. Для моделирования нарушений различных звеньев процесса нейростероидогенеза были использованы фармакологические анализаторы, блокирующие принципиальные этапы метаболизма прогестерона в ЦНС. Измерение содержания моноаминов и их метаболитов в головном мозге мышей проводили с помощью метода ВЭЖХ. Роль ГАМК_А-рецептора в реализации психотропных эффектов ГИЖ-72 оценивали при помощи метода лекарственной дифференцировки.

Связь темы диссертации с планом научных работ учреждения.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексного научного исследования ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (Рег. № 01201169192), а также в рамках гранта РФФИ №13-04-01596.

Положения, выносимые на защиту:

8. Антидепрессивный эффект флуоксетина, в отличие от амитриптилина, зависит от кратности введения и продолжительности стрессовой экспозиции. Антидепрессивный эффект амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания сопровождается уменьшением оборота серотонина в гиппокампе и повышением уровня норадреналина в гипоталамусе при длительном введении в условиях НХУС.

9. ГИЖ-72 обладает анксиолитическим эффектом после однократного и длительного введения, а также его отмены в условиях НХУС, в то время как ГМАЛ-24 только после длительного введения.

10. Антикомпульсивный эффект ГИЖ-72 проявляется после однократного и длительного введения в условиях НХУС, ГМАЛ-24 – только после длительного; введение флувоксамина в стрессовых условиях приводит к усилению компульсивного поведения.

11. Тревожное поведение мышей инбредных линий BALB/c и С57BL/6 в тесте закапывания шариков подавляется только при селективной блокаде 5-редуктазы, в то время как в тесте «открытое поле» уровень тревоги усиливается при блокаде 5-редуктазы и TSPO.

12. Селективная блокада TSPO изменяет антидепрессивную, но не антикомпульсивную активность ГИЖ-72 и флуоксетина. ГИЖ-72 не влияет на интероцептивные эффекты коразола на оперантной модели лекарственной дифференцировки, что свидетельствует об отсутствии у ГИЖ-72 свойств позитивного модулятора ГАМК_А-рецептора.

Личный вклад автора. Автором был проведен анализ отечественной и
зарубежной литературы по изучаемой проблеме, а также полностью выполнена вся
экспериментальная часть, касающаяся поведенческих исследований. Модификация теста
вынужденного плавания, включающая процедуру предварительного плавания

продолжительностью 5 мин, является личной разработкой автора. При активном участии автора проведен нейрохимический анализ содержания уровней моноаминов и их метаболитов в различных структурах головного мозга мышей. Основные публикации по теме диссертации были подготовлены при активном участии автора.

Степень достоверности. Должный уровень достоверности полученных

результатов подтверждается использованием достаточного объема статистических

выборок, выбором общепризнанных методов экспериментальной оценки изучаемых эффектов, использованием референтных препаратов и методов статистической обработки.

Апробация работы. Результаты настоящего исследования были представлены на 27 конгрессе European College of Neuropsychopharmacology (Берлин, 2014), всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Медицинская весна 2015» (Москва, 2015), на 6-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2015).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, реферируемых ВАК при Минобрнауки РФ, и 3 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 198 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Работа сопровождается 22 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 301 источник, из которых 10 отечественных.

Роль гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси в патогенезе депрессии

На сегодняшний день сформировалось понимание фундаментальной роли эндогенных нейростероидов в формировании аффективных расстройств [Bckstrm et al., 2014; Bali and Jaggi, 2014; Frye et al., 2006]. Биосинтез нейростероидов в головном мозге является консервативным свойством позвоночных и обнаружен у рыб, амфибий, птиц, млекопитающих. Как установлено, к индукции центрального (преимущественно в гиппокампе, миндалевидном комплексе и гипоталамусе) биосинтеза нейростероидов приводит активация митохондриального транслокационного белка 18 кДа (который ранее называли периферическим бензодиазепиновым рецептором или бензодиазепиновым митохондриальным рецептором) [Gavish et al., 1999]. В результате нейростероидогенеза в ЦНС образуется аллопрегнанолон, который является позитивным модулятором нейростероидного сайта ГАМКА рецепторов [Reddy, 2010].

В ряде клинических работ было показано, что большое депрессивное расстройство, предменструальное дисфорическое расстройство, депрессия на поздних сроках беременности, тревожные расстройства и другие нарушения эмоциональной сферы сопровождаются снижением уровня аллопрегнанолона в крови и ликворе больных [Hellgren et al., 2014; Schle et al., 2014], в то время как антидепрессанты, в частности селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, способны повышать его концентрацию [Griffin and Mellon, 1999; Uzunova et al., 1998, 2004, 2006].

Система эндогенных нейростероидов также вовлечена в регуляцию ответа организма на стресс [Torres et al., 2001] и имеет свою определенную специфику на фоне острого и хронического стрессового воздействия [Bali and Jaggi, 2014].

Было показано, что острый плавательный стресс длительностью 10 мин приводит к повышению уровня аллопрегнанолона в коре, гипоталамусе и плазме крыс [Purdy et al., 1991]. Основная роль аллопрегнанолона при стрессе, по-видимому, заключается в регуляции функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси – устранении ее гиперактивации [Wirth et al., 2007]. Аллопрегнанолон подавляет транскрипцию генов АКТГ и кортикотропин-рилинзг гормона, оказывая анксиолитическое и антистрессорное действие [Bali and Jaggi, 2014]. Кроме того, аллопрегнанолон может снижать активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси за счет позитивной модуляции ГАМКА-рецепторов паравентрикулярного ядра гипоталамуса [Gunn et al., 2011]. Повышение уровня аллопрегнанолона отмечается также и у людей после острого стресса [Droogleever Fortuyn et al., 2004].

Хронический стресс, сопровождающийся сильным повышением уровней кортикостерона, приводит к снижению уровня аллопрегнанолона и экспрессии мРНК 5-редуктазы I типа. Важно отметить, что почти все эксперименты, посвященные изучению взаимодействия аллопрегеналона и хронического стресса, были проведены на моделях социальной изоляции [Bali and Jaggi, 2014]. Снижение концентрации аллопрегнанолона на фоне хронического стресса может быть следствием развития толерантности ГАМКА-рецептора к модулирующему действию аллопрегненалона [Turkmen et al., 2011].

Аффективные расстройства, сопровождающиеся снижением содержания аллопрегнанолона, могут быть не просто следствием дефицита нейростероидов в ЦНС, а результатом действия низких доз аллопрегнанолона. Как было показано в экспериментах, низкие дозы аллопрегнанолона приводят к развитию анксиогенных реакций у животных [Beauchamp et al., 2000; Fish et al., 2005; Miczek et al., 2003; Pinna et al., 2003; 2005]. Эндогенные нейростероиды могут обладать бимодальными свойствами в отношении ЦНС, т.е. низкие дозы отвечают за развитие депрессии и тревоги, а высокие – обладают противоположным действием. Система эндогенных нейростероидов играет важную роль в защитно адаптивных механизмах организма и может выступать в качестве одного из основных звеньев патогенеза депрессии и ряда других аффективных расстройств. Как и в случае с концепцией дендритного ремоделирования, рассмотрение эндогенных нейростероидов в качестве одного из элементов патогенеза депрессивных расстройств позволяет сохранить основополагающую роль стрессового фактора, как пускового стимула депрессии. С другой стороны, прослеживается связь нейростероидов с процессами нейродегенерации и нейрогенеза, что также подкрепляет положение о вовлеченности этой системы в патогенез депрессивных расстройств. Во-первых, аллопрегнанолон является положительным модулятором ГАМКА-рецепторов и обладает способностью угнетать глутаматергическую нейротрансмиссию в ЦНС [Bali and Jaggi, 2014], которая, как говорилось ранее, является основной причиной уменьшения количества дендритных шипиков и ретракции дендритов, что в свою очередь приводит к нарушению нейрональной пластичности. Во-вторых, сам аллопрегненалон способен стимулировать процессы нейрогенеза, что было продемонстрировано на модели болезни Альцгеймера [Irwin and Brinton, 2014].

Непредсказуемый хронический умеренный стресс

Эксперимент проводили по оригинальной методике marble burying test для мышей [Witki, 2008]. Использовали мышей инбредных линий BALB/C и С57BL/6.В качестве экспериментальной установки использовали индивидуальные поликарбонатные боксы для грызунов (31,5х23х15,7 см), которые на 5 см заполняли плотно утрамбованными опилками. В экспериментальной комнате поддерживали минимальный уровень шума и освещение в 100 лк. Предварительно животных помещали в индивидуальные боксы с подстилкой на 30 мин с целью ознакомления. После предварительной посадки опилки вновь утрамбовывали и помещали на них 9 стеклянных шариков диаметром 1,5 см (по схеме 3 на 3). Мышей помещали в индивидуальные боксы с шариками на 30 мин по истечению которых подсчитывали количество зарытых шариков (зарытыми считались шарики, погруженные в подстилку на 2/3).

Черно-белая камера представляла собой бокс 16х27х30 см, разделенный на два отсека. Одна половина камеры была ярко освещена светодиодной лампой (390 лк), вторая оставалась затемненной (2 лк). В ходе эксперимента мышь помещали на светлую сторону и в течение 5 мин регистрировали: латентный период (время, прошедшее от момента посадки животного на светлую сторону до первого перехода в темный отсек установки), количество переходов между отсеками и вертикальную активность на светлой стороне, «стрейчи» (максимально возможное вытягивания тела при исследовании пространства с одновременной фиксацией задних конечностей) [Bourin and Hascot, 2003].

Гипофагия – экспериментальная модель тревожного поведения, основанная на том, что грызуны, которых поместили в новую обстановку, будут потреблять пишу в значительно меньших количествах и после длительного обследования окружающего пространства [Buccafusco, 2009]. В качестве экспериментальной установки использовали пластиковый прозрачный цилиндр высотой 50 см и диаметром 30 см с освещением 390 лк. В центр установки помещали 1 брикет сухого корма для мышей, после чего – само животное, которое предварительно было подвергнуто 24 ч пищевой депривации. Оценивали время (латентный период) до момента первой попытки взять пищу. Уменьшение латентного времени рассматривали как коррелят снижения тревожности.

Нейролептическую активность оценивали по методике апоморфинового клайминга [Островская и др., 2012]. В ходе эксперимента оценивали интенсивность вертикализации мышей С57BL/6 путем подсчета количества лап на прутьях в момент регистрации (каждые 2 мин). После статистической обработки данный параметр был представлен в качестве единиц вертикальной активности. Дополнительно фиксировалась активность животных в баллах: 1 балл соответствовал обнюхиванию прутьев, 2 балла – покусыванию прутьев или жевательным движениям. Общая продолжительность теста составляла 60 мин.

Оперантные рефлексы вырабатывали одновременно у 6-ти крыс в 6-ти камерах Скиннера (фирмы Lafayette Instrument Со, США). Каждый из 6-ти оперантных боксов соединялся через интерфейс Lafayette Instrument Со с компьютером и принтером и контролировался программой ABЕTII (США). Рефлексы у животных начинали вырабатывать после 24-часовой водной депривации, в качестве безусловного раздражителя использовали питьевое подкрепление: 1 капля воды объемом 0,125 мл при осуществлении адекватной реакции. Выработку лекарственной дифференцировки осуществляли в соответствии со стандартным протоколом [Калинина и др., 2008; Buccafusco, 2009]. Первый этап обучения состоял в предварительной выработке базового оперантного поведения в режиме фиксированного отношения FR10, при котором каждое 10-е нажатие на любой из двух рычагов подкрепляли 1 каплей воды объемом 0,125 мл. Затем переходили к обучению крыс реакции альтернативного выбора рычагов в зависимости от инъекции контрольного раствора или психотропного вещества, включая первые два сеанса на фоне действия контрольного раствора в общую последовательность чередования дифференцируемых стимулов. Обучение животных лекарственной дифференцировке коразола и физиологического раствора осуществляли в течение 10 мин, длительность тренировки при использовании в качестве дифференцируемых стимулов коразола и контрольного раствора составляла 15 мин.

По достижении стабилизации текущего процесса обучения ЛкД и воспроизведения ЛкД осуществляли заместительное тестирование или блокаду интероцептивных эффектов коразола. В тесте на антагонизм ГИЖ-72 и феназепам вводили за 30 мин до коразола. Коразол вводили за 15 мин до тестирования. При заместительном тестировании ГИЖ-72 и феназепам вводили за 40 мин до теста. Время теста составляло от 2 до 5 мин, тестовые сессии независимо от реакции животных подкрепляли и не подкрепляли случайным образом.

Параметрами оценки воспроизведения интероцептивных эффектов тренировочных и тестовых комбинаций являлись:1) средний по группе % выборов рычага, соотнесенного в процессе обучения с инъекцией тренировочного препарата; 2) % крыс, осуществляющих выбор рычагов, ассоциируемых с каждым из дифференцируемых стимулов.

Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса

Классический вариант теста вынужденного плавания предполагает регистрацию одного основного параметра – времени иммобилизации, уменьшение которого рассматривают как коррелят антидепрессивной активности изучаемого вещества [Porsolt et al., 1977]. Однако, некоторые авторы [Page et al., 1999; Perona et al., 2008] указывают на необходимость регистрации нескольких параметров: клайминга, плавания и иммобилизации, поскольку экспериментально установлено, что различные классы антидеперессантов неодинаково изменяют эти параметры [Page et al., 1999; Perona et al., 2008]. Это может быть информативным для формирования представления о преобладающей роли того или иного компонента в механизме действия изучаемого вещества на экспериментальном этапе. Поскольку в представленной работе предполагается использование модификации теста вынужденного плавания, представляется целесообразным первоначально исследовать антидепрессивные свойства препаратов сравнения – флуоксетина и амитриптилина.

Амитриптилин (10 мг/кг, внутрибрюшинно) после однократного введения демонстрировал антидепрессивный эффект (таблица 3.2.1) с изменением соотношения регистрируемых параметров, характерным для трициклических антидепрессантов: клайминг увеличивался на 52,7 с (р 0,01), плавание на 101,3 с (р 0,01), время иммобилизации сокращалось на 157,3 с (p 0,01). В тоже время, флуоксетин обнаруживал активность, характерную для селективных ингибиторов обратного захвата серотонина – уменьшал время иммобилизации на 57,8 с (р 0,05) с одновременным увеличением продолжительности плавания на 51,5 с (р 0,05).

Амитриптилин и флуоксетин обладают антидепрессивным эффектом в модификации теста вынужденного плавания для мышей, что свидетельствует о возможности использования данной модификации для дальнейших исследований антидепрессивной активности препаратов сравнения, а также соединений ГИЖ-72 и ГМАЛ-24

Особенности антидепрессивной активности амитриптилина и флуоксетина при различных режимах введения в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса В большинстве случаев протоколы скрининга антидепрессивной активности среди новых оригинальных соединений предполагают оценку эффекта при однократном введении у здоровых животных при стандартном содержании, как правило, с минимальным воздействием стрессовых факторов перед поведенческими экспериментами [Castagne et al., 2006; Petit Demouliere et al., 2005; Porsolt et al., 1977]. Проблема релевантности экспериментальных условий исследования антидепрессивной и противотревожной активности была обозначена в работах Франко Борсини [Borsini et al., 2002; Borsini, 2012], согласно которым прогностическую ценность имеют результаты, полученные в условиях моделирования патологии при длительном введении, при этом отсутствие эффектов у здоровых животных следует считать положительным признаком. В связи с этим, определенный интерес представляет изучение влияния непредсказуемого хронического умеренного стресса на эффекты антидепрессантов в тесте вынужденного плавания при различной кратности введения. Схема эксперимента представлена в таблице 3.3.1. А) Острое введение без воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Однократное введение амитриптилина сопровождалось уменьшением времени иммобилизации в 11,2 раза (р 0,01), увеличением клайминга в 4,4 раза и плавания в 1,8 (р 0,01) по сравнению с контрольной группой. При остром введении флуоксетина отмечалось снижение времени иммобилизации в 1,5 раза (p 0,05) и увеличение времени плавания в 1,4 раза (p 0,05) без изменения клайминга (рис 3.3.1). Б) Субхроническое введение и 14-дневный непредсказуемый умеренный хронический стресс. Флуоксетин при однократном введении (замене субхронических инъекций физиологического раствора на острое введение флуоксетина в тесте вынужденного плавания) не вызывал достоверных изменений какого-либо из регистрируемых параметров в сравнении с контролем; субхроническое введение приводило к увеличению времени иммобилизации в 1,5 раза (р 0,01) и уменьшению плавания в 2,9 раза (р 0,01), клайминг отсутствовал. Амитриптилин при остром введении уменьшал время иммобилизации в 2,7 раза (p 0,01), увеличивая одновременно плавание и клайминг в 1,5 и 6,5 раз соответственно (p 0,01). На фоне субхронического введения амитриптилина время иммобилизации сокращалось в 2,5 раза (р 0,01), также было отмечено увеличение продолжительности клайминга в 6,9 раз и плавания в 1,4 раза (p 0,05). По сравнению с острым введением без воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса, амитриптилин демонстрировал менее выраженный антидепрессивный эффект – примерно в 4 раза слабее влиял на сокращение времени иммобилизации (p 0,05) и 1,4 раза на период плавания (p 0,05), в то время как клайминг сохранялся на том же уровне. В) Хроническое введение и 28-дневный непредсказуемый умеренный хронический стресс. Однократное и хроническое введение флуоксетина приводило к уменьшению иммобилизации и увеличению плавания. Иммобилизация при однократном введении уменьшалась в 1,7 раза (p 0,01), при хроническом – в 4,7 раза (p 0,01); плавание увеличивалось в 4,7 и 4,8 раза (p 0,01) при остром и хроническом введении соответственно. Амитриптилин как при остром, так и при хроническом введении уменьшал время иммобилизации в 2,8 и 4,7 раза (p 0,01) соответственно; время плавания увеличивалось в 4,7 раза (p 0,01); на фоне введения амитриптилина регистрировался клайминг (p 0,01), который отсутствовал у контрольной группы. Антидепрессивный эффект амитриптилина также был менее выражен по сравнению с острым введением препарата без воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса (p 0,05). Достоверных отличий между эффектами амитриптилина при остром и хроническом введении на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса не было, но имелась тенденция к усилению клайминга и антииммобилизационного эффекта при хроническом введении амитриптилина.

Полученные данные свидетельствуют о том, что эффекты амитриптилина и флуоксетина в тесте вынужденного плавания находятся в зависимости от непредсказуемого хронического умеренного стресса. Так, антидепрессивный эффект амитриптилина сохраняется на фоне непредсказуемого хронического умеренного стресса, но уменьшается его выраженность – снижается антииммобилизационный эффект и влияние препарата на продолжительность плавания, в то время как клайминг не зависит от воздействия непредсказуемого умеренного хронического стресса. Флуоксетин же, напротив, демонстрирует зависимость активности от воздействия непредсказуемого хронического умеренного стресса, более того, субхроническое введение флуоксетина сопровождалось инверсией антидепрессивного эффекта.

Нейрохимические изменения

Вопрос о том, в какой степени блокада того или иного этапа биосинтеза нейростероидов в ЦНС влияет на уровень тревожности мышей различных линий в современной литературе освещен слабо. Известно, что эффективность анксиолитиков зависит от генетически контролируемого типа поведения при стрессовом воздействии [Середенин и др., 2001]. В связи с этим актуальность приобретает вопрос о специфике поведенческих ответов на блокаду нейростероидогенеза у инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовых реакций. С этой целью было проведено сравнительное изучение влияния веществ, селективно ингибирующих основные этапы биосинтеза нейростероидов ЦНС, на уровень исследовательской активности мышей линий BALB/C и С57BL/6.

Мыши инбредных линий BALB/C и С57BL/6 различались по своей исследовательской активности (таблица 6.1.1): КОИР для первых составил 23,2 ± 1,8, для вторых – 66,9 ± 5,6 (р 0,05), что согласуется с данными литературы [Середенин и др., 2001].

Селективный блокатор TSPO РК11195 (5 мг/кг) у мышей линии BALB/C вызывал снижение всех регистрируемых параметров ОИР, по сравнению с показателями в группе контрольных животных. Финастерид (15 мг/кг) уменьшал горизонтальную и вертикальную активность и не оказывал влияния на число обследованных отверстий и индекс тревожности. Индометацин (10 мг/кг) оказывал ингибирующее действие лишь в отношении горизонтальной активности животных, тем не менее все же снижал КОИР в 2 раза, по сравнению с контролем подобно финастериду.

Селективное ингибирование активности TSPO у мышей С57BL/6 вызывало уменьшение горизонтальной активности и КОИР. Финастерид снижал все регистрируемые параметры поведения в тесте «открытое поле», оказывая наиболее значительные изменения в отношении центральной активности. Индометацин уменьшал горизонтальную активность и число обследований отверстий, не оказывая влияния на вертикальную активность мышей С57BL/6. Депримирующее действие финастерида сочеталось с уменьшением индекса тревожности. Ослабление исследовательского поведения, вызванное применением РК11195 или индометацина, не сопровождалось уменьшением активности в центральной части установки.

Селективная блокада митохондриального транслокационного белка 18 кДа путем системного введения РК11195 (5 мг/кг) снижает коэффициент ориентировочно-исследовательской реакции на 76% у самцов мышей BALB/C и на 19% - у самцов мышей С57BL/6, по сравнению с контрольными группами животных. РК11195 в 3-4 раза снижает активность мышей BALB/C в центральной части экспериментальной установки, что свидетельствует об усилении тревожности животных.

Финастерид (15 мг/кг) и индометацин (10 мг/кг) вызывают снижение коэффициента ориентировочно-исследовательской реакции у мышей независимо от типа эмоционально-стрессовой реакции на 34-53%. Прегненолон (20 мг/кг) обладает активирующим действием в тесте «открытое поле» у мышей BALB/C, увеличивая коэффициент ориентировочно-исследовательской реакции животных на 51%, по сравнению с контрольной группой мышей, но при этом на 68% усиливает депримирующий эффект финастерида.

Учитывая широкое применение СИОЗС в фармакотерапии тревожных расстройств, включая обсессивно-компульсивное расстройство, панические атаки и посттравматический синдром [Decloedt and Stein, 2010; Marazziti et al., 2012], определенный интерес вызывает вопрос: какое место отводится системе эндогенных нейростероидов в противотревожном или напротив анксиогенном действии препаратов этой группы?

Вторым важным моментом являются условия проведения самого эксперимента. Стоит отметить, что стрессовые события зачастую могут выступать в роли триггерного механизма при обострении симптоматики или ухудшении течения перечисленных расстройств [Boileau, 2011; Rosso et al., 2012]. Кроме того, данные литературы [Farhan and Haleem, 2015; Wang et al., 2014] и собственных экспериментов прямо указывают на возможную инверсию эффектов СИОЗС в отношении тревожных реакций. В связи с этим, изучение вовлеченности системы эндогенных (которая сама по себе является стресс-зависимой системой) в механизм противотревожного/ анксиогенного эффекта СИОЗС должно проводиться в условиях длительной стрессовой экспозиции. Для этих целей подходит процедура непредсказуемого хронического умеренного стресса, поскольку именно она призвана имитировать те стрессовые события, с которыми сталкивается среднестатистический человек в повседневной жизни [Gronli, 2006; Hill et al., 2012].

В дополнение к вышесказанному нужно отметить, что ГИЖ-72 – новое и оригинальное соединение с неустановленным механизмом действия, поэтому изучение роли системы эндогенных нейростероидов в реализации анксиолитического эффекта последнего может быть выполнено в рамках задачи по изучению механизма действия данного соединения.

В качестве вещества, селективно нарушающего нейростероидогенез, был выбран финастерид, поскольку наиболее выраженное депримирующее действие в отношении ориентировочно-исследовательских реакций у мышей в тесте «открытое поле» было выявлено именно после введения финастерида, которое также не зависело от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции (см. главу 6.1).

Перед началом эксперимента все животные были подвергнуты процедуре непредсказуемого хронического умеренного стресса продолжительностью 21 день. Контрольная группа животных, которые были подвержены длительной стрессовой экспозиции, демонстрировали подавление центральной активности по сравнению с животными интактной группы (таблица 6.2.1). Введение финастерида (15 мг/кг) сопровождалось усилением центральной активности, повышением индекса тревожности и увеличением КОИР в 1,9 раза (p 0,05), что свидетельствует об активирующим действии селективного ингибитора 5-редуктазы в условиях непредсказуемого хронического умеренного стресса. ГИЖ-72 (20 мг/кг) и флувоксамин (25 мг/кг) уменьшали интенсивность вертикализации в 4,5 и 9,0 раза (p 0,05) соответственно.

Совместное введение финастерида (15 мг/кг) и ГИЖ-72 (20 мг/кг) приводило к увеличению вертикальной активности в 3,4 раза (p 0,05) и уменьшению обследований отверстий в 2 раза (p 0,05) по сравнению с введением финастерида (15 мг/кг).

При комбинированном введении финастерида (15 мг/кг) и флувоксамина (25 мг/кг) было отмечено усиление активирующего действия финастерида: увеличение центральной активности в 6 раз (p 0,05), индекса тревожности в 4,2 раза (р 0,05) и КОИР в 2,5 раза (p 0,05) по сравнению с введением одного финастерида.