Экспериментальное (доклиническое) изучение оригинального репаранта на основе альгиновой кислоты Зеленцов Роман Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Литературный обзор 11

1.1. Раны и травмы: актуальность в России и мире 11

1.2. Механизмы заживления ран 15

1.3. Направления фармакологической коррекции раневого процесса 18

1.3.1. Лекарственные препараты на основе компонентов крови животных 21

1.3.2. Витамины и витаминоподобные препараты 26

1.3.3. Препараты на основе дезоксирибонуклеиновой кислоты 31

1.3.4. Группа производных пиримидинов 33

1.3.5. Фитопрепараты и продукты пчеловодства 35

1.3.6. Гиалуроновая кислота и ее производные 36

1.3.7. Применение альгинатов в лечении ран 38

Глава 2. Материалы и методы исследования 48

2.1. Предмет исследования 48

2.2. Методы изучения репаративной активности 50

2.3. База эксперимента 52

2.4. Расчет размера выборки 52

2.5. Изучение профиля безопасности 53

2.5.1. Методика изучения «острой» токсичности 53

2.5.2. Исследование «хронической» токсичности 55

2.6. Методика изучения репаративной активности на экспериментальной модели асептической плоскостной кожно фасциальной раны 57

2.6.1. Планиметрия экспериментальных ран 59

2.6.2. Методы обзорного гистологического исследования 59

2.6.3. Количественные гистоморфологические методы 61

2.6.4. Статистические методы 62

2.7. Оценка фармакокинетических свойств оригинальной субстанции на основе деструктурированной альгиновой кислоты 62

2.8. Метод оценки пролиферативной активности. 64

2.8.1. Методика выполнения иммуногистохимического исследования 66

2.8.2. Методика количественной оценки результатов иммуногистохимического исследования 67

Глава 3. Определение профиля безопасности субстанции на основе деструктурированной альгиновой кислоты 70

3.1. Изучение «острой» токсичности 70

3.2. Изучение «хронической» токсичности 71

Глава 4. Определение эффективной дозы субстанции на основе деструктурированной альгиновой кислоты 75

4.1. Визуальная и планиметрическая оценка 76

4.2. Данные обзорного патоморфологического исследования 79

4.3. Результаты окулярного морфометрического исследования 82

Глава 5. Оценка репаративной активности энзиматически деструктурированной альгиновой кислоты 86

5.1. Визуальная и планиметрическая оценка 86

5.2. Результаты окулярного морфометрического исследования 90

5.3. Результаты оценки фармакокинетических свойств энзиматически деструктурированной альгиновой кислоты 94

5.4. Результаты оценки пролиферативной активности 101

Обсуждение результатов 106

Заключение 113

Выводы 114

Список сокращений 115

Список использованной литературы 116

Приложения 132

• Витамины и витаминоподобные препараты
• Применение альгинатов в лечении ран
• Результаты окулярного морфометрического исследования
• Результаты оценки пролиферативной активности

Введение к работе

Актуальность темы. Для Российской Федерации (РФ), испытывающей существенный дефицит в отечественных лекарственных препаратах (ЛП), крайне важны поиск и разработка оригинальных, эффективных ЛП на основе местных природных источников, в частности, обладающих репаративной активностью.

В РФ ежегодно в лечебных учреждениях регистрируется более 13 млн. новых случаев травм (Росстат, 2017). Ведущее место среди всех повреждений занимают поверхностные травмы, которые составляют более 34% (Росстат, 2017), а вместе с ранами и травмами кровеносных сосудов, на которые приходится более 18% (Росстат, 2017), составляют больше половины всей травматической патологии. По данным Министерства здравоохранения РФ количество травм и повреждений остается стабильно высоким (Росстат, 2017), что может быть связано с комплексом социально-экономических причин.

Высокая распространенность травматических повреждений в структуре общей заболеваемости с отчетливой тенденцией к росту данной патологии, делает актуальным вопрос фармакологического поиска и разработки оригинальных фармацевтических субстанций, оказывающих терапевтическое действие на раневой процесс.

На Севере Европейской части РФ большой интерес в отношении ресурсоведения и фармакоэкономики представляют природные запасы Белого и Баренцева морей, в том числе, ламинария (Laminaria saccharina). Ламинария является источником альгиновой кислоты, сульфатированных полисахаридов (фукоидан), нейтральных полисахаридов (ламинарин), многоатомных спиртов (маннит) и др., имеющих выраженную фармакологическую активность. Стоит отметить, что по данным Министерства природных ресурсов РФ, в Белом море сосредоточены существенные запасы ламинариевых водорослей, а их использование осуществляется не в полном объеме (Минприроды РФ, 2011).

Вышеизложенное, позволяет говорить о перспективе углубленного изучения фармсубстанции на основе регионального биоресурса Архангельской области - ламинарии (Laminaria saccharina) и исследования ее репаративного (ранозаживляющего) потенциала.

Степень разработанности темы. Применение морских бурых водорослей для лечения ран уходят в глубину веков. Одним из наиболее значимых в данном плане химических веществ являются альгиновые кислоты. Наиболее изученной является абсорбционная активность альгинатов в области раневого процесса (Горюнов СВ., 2004). Альгинаты биосовместимы и не вызывают реакций на подлежащие ткани, они нетоксичны, биодеградируют и гиппоаллергенны (Попов В.А., 2013).

Использование солей альгиновой кислоты не наносит ущерба окружающей среде. Таким образом, описанные свойства позволяют охарактеризовать альгинаты как средство многогранного воздействия на раневой процесс.

На сегодняшний день имеется представление о том, что воздействие солей альгинатов на рану происходит в трех основных направлениях:

1. Физическое: способность к термоизоляции, абсорбированию и сохранению влаги в ране.

2. Химическое: гемо статический эффект, вследствие замены ионов кальция ионами натрия из раневого экссудата и крови.

3. Биологическое: клеточная миграция и изоляция бактерий, за счет обволакивания их гелем.

Клиническими исследованиями, посвященными альгинатам, как средствам лечения ран, признаны труды B. Gilchrist и A. Martin, а также R.Fraser и Т. Gilchrist, увидевшие свет в 1983 году. Полученные исследователями результаты полностью подтвердили данные G Blaine, полученные более полувека назад.

Британский ученый Attwood исследовал заживление ран под повязкой на основе альгинатов у 107 пациентов с ожогами. Было определено, что под повязкой на основе альгинатов рана заживала на 3 дня раньше, чем под традиционными повязками. В это же время инфильтрированность ран у группы пациентов, пролеченных повязками на основе альгинатов, была ниже, чем в контрольной. Покрытые альгинатами раны кровоточили меньше, чем под другими традиционными покрытиями, такими как марлевые (Attwood А., 1989). Так же исследователями было отмечено, что пребывание пациентов в стационаре при лечении повязками на основе альгинатов сокращалось в среднем на 3 дня (Attwood А., 1989).

Все проведенные ранее исследования делают перспективным применение альгиновой кислоты в качестве репаративного агента. Однако, исследований позволяющих оценить взаимосвязь между молекулярной массой альгиновой и кислоты и ее репаративной активностью выполнено не было.

Цель исследования. Экспериментальное обоснование репаративной активности у оригинальной фармацевтической субстанции на основе альгиновой кислоты.

Предмет исследования. Полученная путем биотехнологии оригинальная фармацевтическая субстанция с потенциальной высокой репаративной активностью.

Задачи исследования:

1. Оценить в ходе эксперимента безопасность применения тестируемого потенциального лекарственного вещества (определение острой и хронической токсичности).

2. Определить эффективную дозу исследуемой фармацевтической субстанции.

3. Исследовать влияние фармсубстанции на основе альгиновой кислоты в остром эксперименте на процессы репаративной регенерации.

4. Изучить механизм ранозаживляющего эффекта тестируемой
субстанции.

Научная новизна. Изучаемая в эксперименте фармацевтическая субстанция получена в лабораторных условиях впервые и не имеет аналогов в мире, что подтверждено патентным поиском. Методика выделения оригинальной молекулы является ноу-хау исследования.

Теоретическая и практическая значимость работы. Возможность создания опытного образца инновационной фармацевтической продукции (лекарственное вещество), который ориентирован на пилотное, а затем массовое производство широкого потребления в различных областях медицины. Потенциальные потребители продукции как в розничном секторе (жители Архангельской области и других регионов РФ), так и в оптовом (больничные аптеки).

Методология исследования. В диссертационном исследовании использованы фармакологические, гистологические и статистические методы исследования.

Методология исследования базируется на принципах по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Рассмотрены возможности использования оригинального соединения на основе альгиновой кислоты для ускорения процессов репаративной регенерации на модели раневого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оригинальное соединение на основе альгиновой кислоты обладает благоприятным профилем безопасности - относится к веществам малоопасным (ГОСТ 12.1.007-76).

2. Эффективная доза оригинальной субстанции на основе альгиновой кислоты составляет 2 мг/мл.

3. Оригинальная молекула на основе деструктурированной альгиновой кислоты обладает выраженной репаративной (ранозаживляющей) активностью.

4. Энзиматически де структурированная альгиновая кислота обладает пролиферативной активностью.

5. Энзиматически де структурированная альгиновая кислота способна аккумулироваться в области тканевого дефекта (при наличии раневого повреждения), а также в области коллагеновых волокон интактной кожи.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов проведенного исследования подтверждается достаточным объемом

б

лабораторного материала, использованием современных

высокоинформативных методов исследования и адекватным выбором методов статистического анализа.

Реализация результатов. Произведена пилотная партия образца геля для наружного применения "Ламидин" (в алюминиевых тубах по 15,0 г) на базе ООО "Малое инновационное предприятие "СГМУ". в 2018 году запланировано масштабирование данного производства.

Апробация результатов. Основные положения настоящего диссертационного исследования доложены: в рамках XLII Ломоносовских чтений Итоговой научной сессии СГМУ и СНЦ СЗО РАМН «Северная хирургическая школа: к 100-летию со дня рождения Н.М. Амосова» (г. Архангельск, 2013 г.), Межвузовская научной конференции «Медицина и гуманитарные знания: области соприкосновения» (г. Архангельск, 2013 г.), V Международной заочной научно-практической конференции «Научные аспекты инновационных исследований» (г. Самара, 2014 г.), I Международном молодежном медицинском форуме «Медицина будущего -Арктике» (г. Архангельск, 2014 г.), II Международном молодежном медицинском форуме «Медицина будущего - Арктике» (г. Архангельск, 2015 г.) V Международного молодежного инновационного форума «Молодежный инновационный центр-2014» (г. Нижний Новгород, 2014 г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 3 - в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Личный вклад автора. Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании и проведении экспериментальных исследований, составлении протоколов исследований, анализе полученных результатов. Автором написана диссертация и автореферат.

Практическая реализация результатов. Произведена пилотная партия образца геля для наружного применения "Ламидин" (в алюминиевых тубах по 15,0 г) на базе ООО "Малое инновационное предприятие "СГМУ". в 2018 году запланировано масштабирование данного производства.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах и состоит из введения, обзора литературных источников, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа проиллюстрирована 13 таблицами и 27 рисунками. Литературный указатель содержит ссылки на 163 научных публикаций, источники данных, а также нормативно-правовую документацию.

Витамины и витаминоподобные препараты

Биосинтетические процессы как физиологической, так и репаративной регенерации требуют субстратного обеспечения, в том числе и витаминного. Одним из препаратов, относящихся к группе витаминов и витаминоподобных веществ является бета-каротин (рис. 4) - непредельный углеводород из группы каротиноидов (брутто-формула C40H56). Он способен ускорять процессы репаративной регенерации при вялозаживающих ранах, иммунодефицитных состояниях и гиповитаминозе А [92]. Каротиноиды могут быть получены с помощью химического синтеза [23] или выделены из природных источников – микроорганизмов и растений.

Поскольку каротиноиды, полученные синтетическим путем, не в полной мере соответствуют натуральным, а также могут вызывать аллергические реакции [92], они не используются в медицинской практике.

Преимущественно применяются каротиноиды, произведенные из природного сырья. В качестве растительных источников бета-каротина выступают томаты, шпинат, салат и др. Но применению растений в качестве источника каротиноидов присущ ряд недостатков: необходимость выделения крупных площадей для выращивания культур растений; сезонный характер сбора сырья; зависимость от состояния почв и урожайности, которая снижается в связи с увеличением источников болезней, поражающих растительное сырье. Поскольку каротиноиды представлены в составе белковых комплексов, затрудняется их высвобождение и биодоступность из сока овощей. Так, при низком потреблении в пищу липидов усвояемость каротина из овощей крайне низкая. Существует микробиологический синтез бета-каротина из клеток дрожжей, мицелиальных грибов, актиномицетов, бактерий и водорослей [28].

При попадании в организм бета-каротин подвергается биотрансформации в печени с образованием различных активных форм витамина A (ретинол, ретиноевая кислота), которые связываются с ретинолтранспортирующим белком и транспортируютя в органы и ткани, где обязательны для формирования и роста костной, тестикулярной, овариальной тканей, регулирует дифференцировку эпителиальной ткани, являются кофактороми многих биохимических реакций. Выведение бета-картина осуществляется почками и с желчью.

По данным ряда исследований каротиноиды обладают слабо выраженным иммуностимулирующим эффектом [82, 115]. Наибольший эффект продемонстрирован у лиц (людей и животных), испытывающих пероксидный стресс (заболевания, неправильный режим питания, пожилой возраст). У здоровых эффект часто отсутствует или проявляется минимально [99].

Иммуностимулирующая активность бета-каротина обусловлена увеличением пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Пероксидный радикал тормозит пролиферацию Т-лимфоцитов [118], но химическая структура бета-каротина ненасыщенная и это позволяет данному соединению адсорбировать свет и тормозить накопление и выработку активных форм кислорода и свободных радикалов. Отсутствие пероксидных радикалов повышает способность Т-лимфоцитов к бластогенезу [137].

Данный эффект является неспецифическим для большинства липофильных антиоксидантов (ретинол, токоферол, лютеин, криптоксантин, астаксантин) [76].

Повышение пролиферативной активности Т-лимфоцитов под влиянием бета-каротина продемонстрировано также в экспериментальных исследованиях на моделях с культурами лимфоцитов (не только Т-лимфоцитов). Показано, что Т-лимфоциты с бета-каротином сильнее пролиферируют, по сравнению с контрольными и был сделан вывод, что в условиях инфицирования препарат бета-каротина будет ускорять иммунную реакцию [107]. Наличие интерлейкинов 1,2,4 влияет на дифференциацию и рост Т-хелперов. Данные цитокины синтезируются в самих макрофагах и Т-лимфоцитах. Бета-каротин, влияя на перекисные процессы, значительно повышает активность макрофагов. Помимо фагоцитоза макрофаги осуществляют презентацию антигена и оказывают стимулирующее действие на соответствующие Т-хелперы, что приводит к росту числа последних при наличии антигена [142].

Некоторыми исследователями проводится параллель между иммуностимулирующей активностью бета-каротина и его влиянием на арахидоновую кислоту, а также на её метаболиты [90]. Предполагается, что механизм действия бета-каротина заключается в подавлении синтеза продуктов ксакадной метаболической деградации арахидоновой кислоты, в частности омега-жирные кислоты, за счёт чего угнетается продукция простагландина Е2 [139], который оказывает супрессорное действие на NK-клетки. Таким образом, снижая содержание простагландина Е2, бета-каротин опосредованно повышает активность NK-клеток. NK-клетки в свою очередь продуцируют гамма-интерферон [88].

Сообщалось, что бета-каротин, являясь высокоэффективным антиоксидантом, уменьшает вероятность развития онкологической патологии у людей [41]. Однако, исследование опубликованное в 1994 году в «The New England Journal of Medicine» продемонстрировало, что применение бета-каротина на 18 % повышает вероятность возникновения злокачественной онкопатологии [145].

Следующее исследование, опубликованное в «Journal of the National Cancer Institute», указало на увеличение числа раковых заболеваний на 28 % у курильщиков, вследствие приема каротина [79].

Обобщенные данные также подтвердили предположение о том, что у курильщиков потребление в высоких дозах бета-каротина ведет к повышению риска возникновения рака легких [81].

Следует заметить, что доказанное канцерогенное действие бета-каротина имеет место только у курильщиков и лиц, контактирующих с вредными веществами. Конкретный механизм такого действия каротина на сегодняшний день неизвестен.

В тоже время высокая распространенность курения среди населения и удручающая экологическая обстановка в большинстве городов Российской Федерации делает затруднительным и даже опасным применение препаратов на основе каротиноидов. Отсюда следует вывод, что препараты на основе бета-каритина имеют четко зависимую связь с курением и контактом с вредными веществами.

Еще одним препаратом из группы витаминоподобных средств является декспантенол. На сегодняшний день он широко используется в клинической практике для ускорения процессов репаративной регенерации при раневом процессе [61]. Механизмы его действия обусловлены тем, что декспантенол в организме переходит в пантотеновую кислоту, которая является составной частью коэнзима А и участвует в процессах ацетилирования, углеводном и жировом обмене, в синтезе ацетилхолина, порфиринов; стимулирует регенерацию кожи, слизистых оболочек, нормализует клеточный метаболизм, ускоряет митоз и увеличивает прочность коллагеновых волокон [46].

Оказывает регенерирующее, метаболическое и слабое противовоспалительное действие [65]. Быстро абсорбируется кожей при местном применении и превращается в пантотеновую кислоту, которая в свою очередь образует связи с белковыми компонентами плазмы крови [91].

В клинических исследованиях было установлено, что назначение декспантенола в послеоперационном периоде пациентам не только ускоряет процессы регенерации, но и снижает уровень болевых ощущений [53].

Также было показано, что назначение его в комбинации с ксилометазолином, для использования в отоларингологической практике, ведет к повышению терапевтического эффекта, по сравнению с монотерапией последнего [94].

В 1999 году было выполнено двойное слепое рандомизированное исследование [62], в котором сравнивалась эффективность фармакотерапии повреждения роговицы глазным гелем на основе гемодеривата из крови телят, по сравнению с глазной мазью, содержащей в своем составе декспантенол и витамин А. В результате было установлено, что более эффективным по динамике репарации является препарат на основе гемодеривата крови телят.

Применение альгинатов в лечении ран

Применение морских бурых водорослей для лечения раневого процесса берет свое начало в глубине веков. Моряки издавна широко использовали морские бурые водоросли при открытых ранениях в качестве повязки. В 1883 году Стендфорд из морских бурых водорослей выделил альгинат натрия, обнаружив затем и возможность производства его промышленным способом. Позже эти полисахариды были найдены во всех без исключения видах бурых водорослей. Альгиновые кислоты являются полиуронидами, состоящими из D-маннуроновой (рис. 6а) и L-гулуроновой кислот (рис. 6б) [32].

Огромные заросли ламинарии сахаристой (Laminaria saccharina), природного источника альгинатов, находятся в Черном, Северном и дальневосточных морях. Ламинария пальчаторассеченная (Laminaria digitata) распространена в умеренных и северных морях, вблизи побережья России, в Белом море. Ламинария японская (Laminaria japonica) добывается в дальневосточных морях, в том числе в Японии и Китае.

На основании данных Государственного доклада «О состоянии и об охране окружающей среды Российской Федерации в 2007 году», в акватории Баренцева моря обширные запасы ламинариевых водорослей пока не осваиваются (рис. 7). В экономической зоне РФ: у близлежащих к Кольскому полуострову островов и бухт общий допустимый улов ламинарии составляет около 16 тысяч тонн, а в районе острова Шпицберген – 14,2 тысяч тонн. Природные запасы в этих районах почти не используются. В 2007 году было добыто около 340 тонн ламинариевых водорослей, что составило всего 2% от выделенных лимитов. Объем запасов морской бурой водоросли ламинарии в Белом море остается в хорошем состоянии, и на 2007 год позволяет добывать каждый год по всей акватории до 36 тысяч тонн. В целом освоение общего допустимого улова бурых водорослей остается на низком уровне и составляет по ламинариевым водорослям не более 7% [21, 22]. На основании данных Двинско-Печорского бассейнового водного управления федерального агентства водных ресурсов на 15.12.2012 г. объем добычи ламинариевых водорослей в акватории Белого моря составил 1118,944 тонн.

Во времена Великой Отечественной войны в Британии была создана технология изготовления альгинатных волокон. Альгинатные волокона и материалы из них применялись в хозяйстве в различном качестве, пока Блайн не предложил использовать их в медицине. Был накоплен большой опыт применения альгинатов при лечении ран, и подтверждены их достоинства экспериментально на лабораторных животных с послеожоговыми ранами. В группе животных, пролеченных традиционно применяемыми ЛП, раны покрывались струпом, под которым обнаруживались некрозы. У животных раневая поверхность которых была обработана альгинатом натрия, не появлялись некрозы, в связи с чем сокращались сроки заживления [47]. В то время альгиновая кислота и ее соли применялись в основном для лечения кровоточащих ран [47].

В 1948 году В. Франц (V. Frantz) применил альгинаты в виде покрытия для обработки кровоточащих ран, язв и ожогов [72]. В тоже время М. Госсет (M. Gosset) и Ж. Мартин (J. Martin) [85] сообщили о выраженных гемостатических свойствах солей альгиновой кислоты.

Альгинаты, как гемостатики, оказались весьма эффективны в нейрохирургии [122]. В то время как резорбция альгинатов не оставляла морфологических следов в тканях [122].

После создания повязок на основе солей альгиновой кислоты были проведены клинические исследования на плохо заживающих ранах, в результате которых выяснилось, что положительная динамика течения раневого процесса прослеживается и у пациентов с труднозаживающими ранами при сахарном диабете. Основываясь на данных исследований, в 70-е годы ХХ века ученые стали создавать материалы с применением солей альгиновой кислоты.

На сегодняшний день наиболее изученной является абсорбционная активность альгинатов в области раневого процесса. Будучи гидроколлоидами, они абсорбируют почти в 20 раз больше воды, чем их масса [5]. При контакте с равеневым экссудатом или кровью, в состав которых входит большое количество натрия, в кальций-альгинатных салфетках ионы кальция замещаются ионами натрия, что приводит к образованию водорастворимого альгината натрия, который начинает образовывать на поверхности раны гель за счет высокой абсорбцонной активности и гидрофильности. Вследствие большой всасывающей способности геля альгината натрия, кроме крови и раневого экссудата, воспринимаются также частицы тканей и бактерии [5].

Затем гелем захватываются и биологически активные вещества, в частности и способствующие пролиферации. В это же время образовавшийся гель обладает высоким адгезивным действием, в результате чего повязка прилипает к месту раневого дефекта. Это, с одной стороны, приводит к появлению соответствующих болезненных ощущений пациентом при ее отделении, с другой стороны, препятствует оттоку раневого экссудата.

Вместе с этим альгинаты биосовместимы и не вызывают реакций на подлежащие ткани, нетоксичны и биодеградируют [26]. Вызываемых альгинатами аллергических реакций не описано [26]. Использование солей альгиновой кислоты не наносит ущерба окружающей среде. Таким образом, описанные свойства позволяют охарактеризовать альгинаты как средство многогранного воздействия на раневой процесс.

На сегодняшний день имеется представление о том, что воздействие солей альгинатов на рану с отделяемым происходит в трех основных направлениях:

1. Физическое: способность к термоизоляции, абсорбированию и сохранению влаги в ране.

2. Химическое: гемостатический эффект, вследствие замены ионов кальция ионами натрия из раневого экссудата и крови.

3. Биологическое: клеточная миграция и изоляция бактериальных клеток, за счет обволакивания их гелем.

Клиническими исследованиями, посвященными альгинатам как средствам лечения ран, признаны труды B. Gilchrist и A. Martin [80], а также R. Fraser и T. Gilchrist [73], увидевшие свет в 1983 году. Полученные исследователями результаты полностью подтвердили данные G. Blaine, полученные более полувека назад [47].

Опубликована работа о применении альгинатов для лечения трофических язв, инфицированных и хронических травматических ран у пациентов с сахарным диабетом [103].

Кровеостанавливающие и абсорбирующие свойства альгинатов особенно ценны при лечении ожоговых и донорских ран. A. Groves и J. Lawrence [47] сопоставили возможности альгинатов к абсорбции с хлопчатобумажной марлей и выявили, что альгинаты сорбируют почти в 3 раза больше крови. Их исследования показали, что при накладывании на донорские раны повязок на основе альгинатов, потеря крови в 2 раза меньше, по сравнению с марлей.

Результаты окулярного морфометрического исследования

В ходе количественной оценки морфологических изменений получены следующие результаты (рис. 14).

В ходе изучения влияния концентрации действующего вещества на репаративные процессы были установлены статистически значимые отличия в концентрациях клеток соединительной ткани (фибробластов и фиброцитов) у групп животных, получавших тестируемое соединение на 3-и, 7-е и 14-е сутки эксперимента. Так, на третьи сутки эксперимента, статистистически значимо больше клеток соединительной ткани выявлялось у крыс, получавших деструктурированный альгинат в концентрации 2 мг/мл (р 0,001). В эксперименте на седьмые сутки статистически значимо больше клеток соединительной ткани было у группы животных получавших деструктурированный альгинат в концентрации 6 мг/мл (р 0,001). Несмотря на это в группах, получавших концентрацию 1 и 2 мг/мл, была обнаружена достаточная концентрация фибробластов и фиброцитов. На четырнадцатые сутки в зоне раневого дефекта статистически значимо больше клеток соединительной ткани было обнаружено у крыс, получавших концентрацию 2 мг/мл (р=0,005). Важно отметить, что клетки соединительной ткани играют одну из ключевых ролей в репаративных реакциях в раневом процессе, поскольку именно за счет них замещаются поврежденные тканевые структуры. Дефекты заполняются соединительной (в том числе рубцовой) тканью [24].

При оценке количества лимфоцитов на четырнадцатые сутки было выявлено статистически значимое уменьшение их количества у группы животных, получавших тестируемое соединение в концентрации 2 мг/мл по сравнению с крысами, получавшими его в дозе 1 мг/мл (р=0,004). Сравнивая концентрации изучаемого соединения 2 и 6 мг/мл на 14-е сутки эксперимента статистически значимых отличий в концентрации лимфоцитов выявлено не было (р=0,268). Малое количество лимфоцитов исключает хронизацию течения раневого процесса. А полученные данные свидетельствуют о том, что уже в концентрации 2 мг/мл деструктурированный альгинат оказывает терапевтическое действие и препятствует переходу острого процесса в хронический.

Также выявлено некоторое уменьшение количества нейтрофилов на третьи сутки эксперимента в группах животных, получавших тестируемую субстанцию в концентрации 1 и 2 мг/мл, а также близкое к статистически значимому отличие в количестве нейтрофилов на 14-е сутки эксперимента между группами, получавшими исследуемую субстанцию в концентрациях 1 и 2 мг/мл (р=0,06).

Таким образом, данные, полученные в ходе исследования, позволили определить эффективную дозу энзиматически деструктурированной соли альгиновой кислоты. Эффективная доза составила 2 мг/мл.

Результаты оценки пролиферативной активности

Для оценки пролиферативной активности было выполнено иммуногистохимическое исследование. В качестве маркера был использован неспецифический маркер пролиферации Ki67.

После обзорной визуальной оценки гистологических препаратов было установлено большее количество клеток, окрашенных маркером пролиферации, у крыс, получавших деструктурированный альгинат, по сравнению с группой контроль-препарат, раневая поверхность у которых обрабатывалась стерильным 0,9% раствором хлорида натрия. Для иллюстративности представлены гистологические фотографии (рис. 25 и 26).

Данные обзорного иммуногистохимического исследования были подтверждены количественно. Нами получены значимые статистически отличия в количестве клеток, окрашенных маркером Кi67. А поскольку данный маркер окрашивает все клетки, за исключением интерфазных [14], установлено влияние субстанции на основе деструктурированного альгината на пролиферативную активность (рис. 27).

Выявленная пролиферативная активность субстанции на основе деструктурированного альгината, вероятно, объяснима, установленной способностью накапливаться в тканях и, возможно, принимать участие в биохимических процессах, а также меньшей молекулярной массой и более низкой степенью полимеризации по сравнению с нативной молекулой альгината и гиалуроната.

В химическую структуру альгиновой кислоты входит L-гулуроновая кислота [32], которая является пространственным изомером D-глюкуроновой кислоты. Последняя представляет собой важную составную часть гликозаминогликанов, принимающих участие в регуляции процессов жизнедеятельности клеток, в том числе и оказывает влияние на пролиферативную активность клеток [18]. Поэтому фармакологическая активность оригинальной субстанции на основе альгиновой кислоты может быть объяснена возросшей биологической доступностью, вследствие изменения методом энзиматической деструкции химической структуры нативного альгината. Между тем, синтез гликозаминогликанов обеспечивают фибробласты, кумуляция в которых «меченой» флуоресцеином тестируемой субстанции и была установлена в ходе исследования.