Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1.1. Исследование фармакокинетики и биодоступности в создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной структуры и их оптимальных лекарственных форм 13
1.2. Аналитические методы определения пептидов 16
1.2.1. Хроматография аминокислот и пептидов 16
1.2.1.1. Методы жидкостной хроматографии пептидов 17
1.2.1.1.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография 18
1.2.1.1.2. Методы детектирования пептидов в высокоэффективной жидкостной хроматографии: УФ детектирование, масс-спектрометрия .19
1.2.1.1.3. Тонкослойная хроматография 23
1.2.1.2. Газовая хроматография 23
1.2.2. Иммунохимические методы определения пептидов 24
1.2.3. Капиллярный электрофорез 24
1.3. Критерии оценки метода (валидация методики) 25
1.4. Биодоступность лекарственных веществ 27
1.4.1. Фармацевтические факторы, влияющие на биодоступность лекарственных веществ 30
1.4.1.1. Влияние физического состояния лекарственных веществ на биодоступность лекарственных препаратов 31
1.4.1.1.1. Влияние микронизации лекарственных веществ на биодоступность лекарственных препаратов .32
1.4.1.2. Влияние вспомогательных веществ на биодоступность лекарственных средств 36
1.4.1.2.1. Технологические характеристики неусиллина, лудипресса, поливинилпирролидона, микрокристаллической целлюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы 40
1.4.1.3. Современные подходы в технологии изготовления лекарственных форм пептидных препаратов. 42
1.5. Фармакокинетические особенности коротких нейропептидов при различных способах введения 45
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1 Реактивы и материалы 51
2.1.1. Исходные вещества .51
2.1.2. Реактивы .52
2.1.3. Средства измерений .53
2.1.4. Вспомогательные устройства 53
2.1.5. Приготовление растворов подвижной фазы 54
2.1.5.1. Приготовление подвижной фазы для градиентного элюирования методом высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием 54
2.1.5.2. Приготовление подвижной фазы для градиентного элюирования методом высокоэффективной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием 54
2.2. Способы введения и сбор биологических проб 55
2.2.1. Изучение фармакокинетики ГБ-115 в опытах in vivo 55
2.3. Методики инструментального обнаружения ГБ-115 в биологическом материале .56
2.3.1. Параметры методики высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием анализа ГБ-115 56
2.3.2. Методика высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием анализа субстанции ГБ-115..56
2.3.2.1. Выбор оптимального экстрагента 58
2.3.3. Методика высокоэффективной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием анализа ГБ-115 .61
2.3.3.1. Параметры методики высокоэффективной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием анализа ГБ-115 61
2.3.4. Количественный анализ ГБ-115 методикой высокоэффективной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием 62
2.3.4.1. Определение градуировочных зависимостей .62
2.3.4.2. Метрологическая характеристика методики количественного определения ГБ-115 методом высокоэффективной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием 63
2.3.5. Статистическая обработка результатов 65
2.4. Расчёт основных фармакокинетических параметров и биологической доступности ГБ-115 65
ГЛАВА III. Фармакокинетика гб-115 после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций в дозе 100 МГ/КГ 67
ГЛАВА IV. Биодоступность различных фармацевтических композиций ГБ-115 72
4.1. Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №1 крысам в дозе 100 мг/кг 72
4.2 Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №2 крысам в дозе 100 мг/кг .75
4.3 Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №3 крысам в дозе 100 мг/кг .80
4.4 Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №4 крысам в дозе 100 мг/кг 84
V. Заключение 89
VI. Выводы 94
VII. Список литературы
- Аналитические методы определения пептидов
- Влияние микронизации лекарственных веществ на биодоступность лекарственных препаратов
- Приготовление подвижной фазы для градиентного элюирования методом высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
- Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №2 крысам в дозе 100 мг/кг
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В связи со значительным ростом заболеваний, связанных с тревожными и депрессивными расстройствами, актуальным является разработка и внедрение новых анксиолитических средств. На сегодняшний день препараты, обладающие таким фармакологическим эффектом, представлены в основном группой соединений бензодиазепинового ряда, которые широко применяются в лечебной практике более 50 лет [Воронина Т.А., 2002; Середенин и др., 2007; Baldwin D.S. et al., 2008]. Однако наличие у бензодиазепинов существенных побочных эффектов ограничивает их использование и стимулирует поиски новых анксиолитиков [Воронина Т.А., 2002; Baldwin et al., 2010; Griebel G., Holmes A., 2013]. Мишенями при поиске анксиолитиков нового поколения являются различные субъединицы ГАМК-бензодиазепинового комплекса, транслокаторный протеин (18 kD) [Nothdurfter C.et al., 2012; Rupprecht R. et al., 2009] и серотонинергическая система [Nothdurfter C.et al., 2012; Rupprecht R. et al., 2009].
В последние годы интенсивные поиски анксиолитиков проводятся среди веществ, оказывающих влияние на нейропептидную систему (кортикотропин-рилизинг фактор, холецистокинин, тахикинин и др.) [Belzung C. et al., 2006; Holmes A. et al., 2003; Griebel G., Holsboer F., 2012; Андреева Л.А. и др., 2010].
К настоящему времени установлена важная роль эндогенного нейропептида холецистокинина в патогенезе тревожных расстройств, депрессии и шизофрении [Fink H. et al., 1998; Bourin M. et al, 1996; Bradwejn J. et al., 2001; Zwanzger P. et al., 2012; Del Boca C. et al., 2012].
Так как эндогенные нейропептиды имеют низкую энзиматическую устойчивость, подвержены гидролизу в ЖКТ, активны только после проникновения через ГЭБ, возникла необходимость поиска потенциальных анксиолитиков (антагонистов холецистокининовых рецепторов) с более компактной и защищённой структурой, эффективных при системном введении.
Исходя из гипотезы, разработанной Т.А. Гудашевой ещё в 1985 г., о возможности имитации структуры непептидного прототипа с определённой нейротропной активностью, а также активного фрагмента исходного пептида с аналогичной активностью, был синтезирован новый дипептидный анксиолитик ГБ-115 (амид N-фенил-N-гексаноил-L-глицил-L-триптофан) – ретроаналог холецистокинина-4 [Гудашева Т.А., 2011; Гудашева Т.А. и др., 2007; Гудашева Т.А. и др., 2006]. Установлена фармакологическая активность соединения: экспериментально доказано, что ГБ-115 проявляет анксиолитическое, антиалкогольное, антидепрессивное и анальгетическое действие [Колик Л.Г., 2012].
В связи с вышесказанным актуальным является изучение фармакокинетики и биодоступности субстанций и различных фармацевтических композиций нового дипептидного анксиолитика ГБ-115. При этом важным является разработка аналитических методик качественного и количественного определения ГБ-115 в биологическом материале для проведения исследования его фармакокинетики, расчёта относительной биодоступности и выбора оптимальной лекарственной формы препарата, отличающейся высокими показателями скорости и степени всасывания.
Целью настоящего исследования явилось изучение фармакокинетики и биодоступности кристаллической и микронизированной субстанций, а также четырёх фармацевтических композиций ГБ-115.
Задачи исследования
1. Разработать методики качественного и количественного определения анксиолитика ГБ-115 в биоматериале.
2. Валидировать метод количественного определения ГБ-115 с использованием ВЭЖХ с УФ-детектором.
3. Изучить фармакокинетику ГБ-115 после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций вещества в эксперименте на крысах.
4. Изучить фармакокинетику ГБ-115 после перорального введения четырёх различных экспериментальных образцов фармацевтических композиций анксиолитика у крыс.
5. Рассчитать основные фармакокинетические параметры ГБ-115 у крыс после введения фармацевтических композиций и субстанций соединения и на основании их сравнительного анализа рекомендовать его оптимальную фармацевтическую композицию.
Научная новизна
Разработаны методики на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором для качественного определения и идентификации структуры дипептидного анксиолитка ГБ-115 и количественного определения неизмененного ГБ-115 в биологическом материале на основе ВЭЖХ с УФ-детектором.
Впервые в сравнительном аспекте проведено изучение экспериментальной фармакокинетики ГБ-115 у крыс после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций и 4-х новых лабораторных образцов фармацевтических композиций анксиолитика, отличающихся по технологии приготовления и составу вспомогательных веществ. Показано, что различные вспомогательные вещества (лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или гипромеллоза, неусиллин, лудипресс, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном), входящие в состав фармацевтических композиций, и технология приготовления существенным образом влияют на фармакокинетику изучаемого дипептида и следствием ее оптимизации является улучшение фармакокинетических свойств разрабатываемого соединения, а именно, увеличения полноты всасывания, максимальной концентрации, скорости и степени всасывания и в конечном итоге биодоступности ГБ-115. На основе полученных экспериментальных данных показано, что определяющую роль в оптимизации фармацевтической композиции ГБ-115 играют, во-первых, использование микронизированной субстанции соединения, и, во-вторых, применение таких вспомогательных веществ, как поливинилпирролидон и гидроксипропилметилцеллюлоза.
Научно-практическая значимость
Сравнительный анализ фармакокинетических параметров показал значительные преимущества по биодоступности двух фармацевтических композиций, что позволило рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения.
Результаты фармакокинетических исследований вошли в заявку на получения патента на изобретение: «Фармацевтическая композиция амида N-(6-фенилгексаноил) глицил-L-триптофана, выполненная в твердой лекарственной форме и способы ее получения».
Личный вклад автора
Автор принимал непосредственное участие во всех экспериментах, проводил обработку и анализ полученных результатов. Автором были подготовлены основные публикации по материалам диссертации, сформулированы положения и выводы работы.
Апробация работы
Основные результаты работы были освещены и доложены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых учёных с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012); Евразийском конгрессе с международным участием – «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013); Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Проблема разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); IX международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины», (Москва, 2013 г.); Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика», (Воронеж, 2013 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ), 2 статьи и 5 тезисов докладов в материалах российских и международных конференций.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 107 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Содержит 21 таблицу и 10 рисунков. Список литературы включает 143 источника, из них 112 зарубежных и 31 отечественных.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Методики экстракции, качественного и количественного определения ГБ-115 в биоматериале с использованием ВЭЖХ с масс-спектрометрическим и ультрафиолетовым детекторами, дающие возможность провести фармакокинетические и биофармацевтические исследования.
-
Перспективность использования микронизированной субстанции ГБ-115 в приготовлении лекарственной формы с позиций фармакокинетики.
-
Поливинилпирролидон в форме твёрдой дисперсной системы и гидроксипропилметилцеллюлоза значительно увеличивают скорость и степень всасывания ГБ-115.
-
Биофармацевтические доказательства преимущества двух оптимальных фармацевтических композиций, обладающих большей относительной биодоступностью.
Экспериментальная часть
Материалы и методы исследования
В качестве стандартных веществ была использована фармацевтическая субстанция ГБ-115 (амид N-фенил-N-гексаноил-L-глицил-L-триптофан), содержание основного вещества в которой было не ниже 99%.
В работе использовались кристаллическая и микронизированная субстанции ГБ-115, а также 4 лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115, предоставленные опытно-технологическим отделом ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН, отличающихся по составу и технологии приготовления:
Фармацевтическая композиция №1: Субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;
Фармацевтическая композиция №2: Микронизированная субстанция ГБ-115, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном;
Фармацевтическая композиция №3: Микронизированная субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;
Фармацевтическая композиция №4: Микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза.
Экспериментальные животные
Фармакокинетику ГБ-115 изучали после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций и фармацевтических композиций в виде водной суспензии белым беспородным крысам самцам (массой 180-220 г.), полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12-ти часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Исследования проводили на здоровых, бодрствующих животных. До проведения исследования животные находились в течение 12 часов на водной диете.
Масс-спектрометрический анализ соединения ГБ-115 в плазме крови крыс
Анализ биологических проб ГБ-115 проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хромотографии с масс-спектрометрическим детектором для точной идентификации структуры пептида. Разделение проводили с помощью хроматографа Agilent 1200 Series LC-MSD TRAP (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) с автоматическим вводом проб, детектора “Agilent 6300 series ion-trap” (США) и компьютера с соответствующим пакетом для обсчёта хроматограмм. Мобильная фаза состояла из 1 л водного раствора с добавлением 50 мл 0.1 М раствора ацетата аммония и 5 мл муравьиной кислоты (А) и 100% ацетонитрила (В). ВЭЖХ анализ проводился в режиме градиентного элюирования: 0 мин – 5 % (В), 5 мин – 60% (В), 7 мин – 80% (В), 12 мин – 80% (В), 15 мин – 10% (В). Градиент был разработан экспериментальным путём. Скорость потока подвижной фазы составляла 0.25 мл/мин. Температура колонки составила 30С. Объём вкола: 1 L.
Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) и регистрацией как положительных, так и отрицательных ионов. В результате позитивной ионизации образуется ряд положительных ионов с m/z 473, 457, 435, 418, которые предположительно соответствуют катионированным молекулярным ионам [М+K]+, [М+Na]+, [MH]+ и [MH-NH3]+ соответственно. Наличие большого количества пиков затрудняет количественное определение анализируемого вещества. Поэтому была выбрана негативная ионизация, посредством которой образуется один отрицательный ион с m/z - 434, который в дальнейшем подвергается фрагментации с образованием ионов с массовыми числами – 286 и 304, что предположительно соответствует следующим фрагментам: ацетат глицил-L-триптофана и гидроксилированный ацетат глицил-L-триптофана соответственно.
В качестве распыляющего газа использовали азот со скоростью – 9 л/мин. Как масс-анализатор была выбрана ионная ловушка.
Методика количественного определения соединения ГБ-115 в плазме крови крыс с применением метода высокоэффективной хроматографии с УФ-детектором.
Анализ проб плазмы крови крыс проводили с использованием метода ВЭЖХ с УФ-детектором. Разделение проводили на жидкостном хроматографе, состоящем из изократической помпы SYSTEM COLD 127 (США), ультрафиолетового детектора и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчёта хроматограмм "Амперсенд" (Россия).
Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке - Luna 5u C 18 (2) 100A, 250х4.6 мм, детектирование проводили при длине волны 282 нм, что позволило избежать влияния коэкстрактивных веществ, которые бы мешали определению ГБ-115. При использовании диапазона длин волн 200-230 нм наблюдается совпадение максимумов поглощения ГБ-115 и примесей, что и обусловило выбор максимума поглощения в УФ-свете при длине волны 282 нм.
Подвижная фаза – ацетонитрил : вода (400 : 450), трифторуксусная кислота. Скорость потока подвижной фазы - 1.0 мл/мин. pH раствора составлял 3.2.
Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (22-24 С). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане, что позволило избежать дополнительных пиков во время анализа. Подвергавшуюся анализу пробу вводили при помощи микрошприца через инжектор в петлю хроматографа объёмом 100 мкл.
Обработка биологических проб, экстракция ГБ-115 из биологических образцов
Подготовка плазмы крови крыс к хроматографическому анализу
Экстракцию ГБ-115 из биологических образцов проводили следующим способом: к 1 мл плазмы крови крыс, содержащей ГБ-115, добавляли двукратный объём ацетонитрила для осаждения белков. Водно-ацетонитрильный раствор центрифугировали при Т - 2 С со скоростью 4000 об/мин в течение 10 минут. Далее отбирали очищенную от белков плазму, добавляли 5 мл эфира, встряхивали в течение 15 минут, отделяли эфирный слой и высушивали в токе азота досуха, остаток растворяли в элюенте и вводили в систему ВЭЖХ-УФ.
Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных
Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно-независимым методом (программа “M-IND”), (Агафонов А.А., Пиотровский В.К., 1991):
AUC0 (нг/мл х мин) – площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества – время», рассчитывается от момента введения до бесконечности;
AUC0Т (нг/мл х мин) – площадь под фармакокинетической кривой, рассчитывается от момента введения до момента последней регистрации концентрации исследуемого соединения;
С (нг/мл) – концентрация препарата в плазме крови после перорального введения;
Tмакс (мин) – время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;
Смакс (нг/мл) – максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме крови после перорального введения;
Cмакс/AUC (мин-1) – параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;
MRT (мин) – среднее время пребывания лекарственного вещества в организме;
Kэл (мин-1) – константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;
T1/2 (мин) – период, за который выводится половина введённой и всосавшейся дозы лекарственного вещества;
Vzpo, (л) – гипотетический объём распределения;
F (%) – относительная биодоступность (AUC0Т(A)/ AUC0Т(B) x 100%).
Статистическая обработка полученных результатов
Полученные экспериментальные данные были математически и статистически обработаны с помощью программы «Excel v.11.0» («Statistica 6.0»). Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001].
Поскольку представленные фармакокинетические кривые были построены по усреднённым значениям 5-8 полученных данных на каждую временную точку, то при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Расчёт фармакокинетических параметров проводился с использованием программы M-Ind (Пиотровский В.К., 1984). На всех графиках представлены средние значения Хср±SD (SD – стандартное отклонение).
Аналитические методы определения пептидов
Исследование фармакокинетики и биодоступности в создании новых оригинальных лекарственных средств пептидной структуры и их оптимальных лекарственных форм
Фармакокинетика – современная, быстро развивающаяся наука, которая изучает особенности проникновения лекарства в организм, распределения, биотрансформации и элиминации. Исследование этих процессов, включая их количественную оценку, и является основной целью фармакокинетики [Каркищенко Н.Н. и др., 2001; Кукес В.Г., 2009; Urso R. et al., 2002; Panchagnula R., Narisetty S., 2000].
Фармакокинетическое изучение новых фармакологически активных веществ в эксперименте является обязательным этапом при исследовании, разработке и внедрении их в медицинскую практику. Эффективность препарата напрямую зависит от процессов всасывания, распределения и выведения лекарственных веществ из организма.
Фармакокинетические данные позволяют определить путь и метод введения, место проникновения лекарственного препарата, ориентировочную схему дозирования, а также основные пути элиминации лекарственного средства [Каркищенко Н.Н. и др., 2001].
Всасывание, распределение, метаболизм и выведение лекарственного соединения – взаимосвязанные процессы. Все они подвержены влиянию множества факторов: скорость всасывания зависит от лекарственной формы препарата, концентрации действующего вещества, рН среды, в которой происходит растворение вещества, перистальтики кишечника и состояния площади поверхности всасывания. На показатели распределения и биотрансформации лекарственного препарата влияют пол, возраст, соматическое состояние организма пациента, а также состояние ферментативных систем организма, что часто обусловлено индивидуальными различиями. Так, скорость метаболизма некоторых психотропных препаратов может варьироваться от 6 до 30 часов у разных пациентов. На выведение метаболитов из организма могут влиять сопутствующие заболевания, а также влияние других лекарственных веществ [Srivastava P., 2003].
Для оценки различных фармакокинетических процессов лекарственных средств в организме животных и человека рассчитывают фармакокинетические параметры (в основном внемодельные):
AUC, нг/мл.мин – площадь по фармакокинетической кривой, представляющей собой зависимость концентрации лекарственного средства (или его метаболита) в плазме крови от времени после введения лекарственного средства.
Tмакс, мин – время достижения максимальной концентрации лекарственного вещества. Cмакс, нг/мл – максимальная концентрация лекарственного вещества. Cмакс/AUC, мин-1 – параметр, характеризующий скорость всасывания. Cl, мл/мин – плазменный клиренс, представляющий собой объём плазмы крови, который полностью очищается от препарата за единицу времени. Основные пути выведения – почки и печень. Основные физиологические факторы, определяющие клиренс, - функциональное состояние основных физиологических систем организма, объём притока крови и скорость кровотока в органе. Kэл, мин-1 – константа скорости элиминации - процент снижения концентрации вещества за единицу времени (отражает долю препарата, выводимую из организма за единицу времени). T1/2, мин – период полувыведения – время, необходимое для достижения концентрации в плазме крови на 50%. MRT, мин - среднее время удержания лекарственного вещества в организме. Vd, мл – объём распределения, который представляет собой гипотетический объём жидкости организма, необходимый для равномерного распределения всего количества введённой дозы в концентрации, аналогичной концентрации в плазме крови. Высокие значения объёма распределения свидетельствуют о том, что препарат активно проникает в биологические жидкости и ткани. F, % - биодоступность - часть дозы препарата, достигшая системного кровотока, после его внесосудистого введения [Кукес В.Г., 2009; Urso R. et al., 2002; Panchagnula R., Narisetty S., 2000].
Важно отметить условия проведения фармакокинетических экспериментов в доклинических испытаниях новых фармакологически активных соединений:
Изучаемые фармакологические средства принято считать объектом исследований, которые в доклинической практике проводятся на здоровых животных: крысах, мышах, кроликах, собаках, обезьянах и других, масса которых не должна отличаться от стандартной для каждого вида более чем на 10%.
Основными видами биологического материала являются плазма сыворотки крови, цельная кровь, различные органы и ткани, моча, фекалии.
Путь введения определяется формой лекарственного средства, рекомендованного на основании фармакокинетических исследований для дальнейшего фармакологического изучения. Методы введения могут быть различные: внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, пероральное и др. Внутрь лекарственное средство вводят животным с помощью глоточного или дуоденального зонда натощак во избежание взаимодействия лекарственного вещества с пищей.
Введение возможно многократное или однократное. При однократном введении необходимо изучить фармакокинетику активной субстанции при использовании не менее трёх уровней дозы. Это необходимо для проверки гипотезы линейности фармакокинетики.
Влияние микронизации лекарственных веществ на биодоступность лекарственных препаратов
Абсолютная биологическая биодоступность – количество лекарственного вещества, введённого в лекарственной форме внутривенно или внутрисосудисто, которое поступает в кровообращение без влияния эффекта первого прохождения через печень или после корреляции на этот эффект [Хоружая Т. Г., Чучалин В. С., 2006]. Иными словами, абсолютная биодоступность – это отношение концентраций вещества в системном кровотоке после внесосудистого и внутрисосудистого введения.
Итак, принято считать, что при абсолютной биодоступности вся доза препарата, введённого внутривенно, поступает в большой круг кровообращения, и биодоступность вещества в этом случае принимается за 100%. Однако, есть работы, которые доказывают обратное: лекарственные соединения после внутривенного введения поступают сначала в лёгочный круг кровообращения, проходят через лёгкие, которые могут кумулировать экзогенные соединения, подвергать их экскреции или же метаболизму [Fischer U.M., Harting M.T., Jimenez F., 2009; Boer F., 1999; Белоусов Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К., 1997]. Таким образом, лёгкие выполняют роль фильтра для частиц, которые могут попадать в организм при парентеральном введении.
Относительная биодоступность – выраженное в процентах количество лекарственного вещества, высвобожденное из лекарственной формы, которое после введения достигает рецептора в количестве, достаточном для того чтобы вызвать биологический эффект. Данное определение относительной биодоступности свидетельствует о том, что лекарственное вещество не полностью достигает места действия, а становится доступным в определённом процентном содержании.
Относительную биодоступность определяют для различных лекарственных форм, для лекарственных средств при изменении технологии производства, для препаратов различных производителей и даже для различных серий препаратов, выпускаемых одной фармацевтической компанией. Обычно относительную биодоступность измеряют при одном и том же пути введения лекарственных средств. Однако этот показатель можно определять и при различных путях введения препаратов [Белоусов Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К., 1997].
Проблемами и принципами биологической доступности занимается наука биофармация, которая представляет собой научную дисциплину фармации, занимающуюся исследованием влияния физических и физико-химических свойств действующих и вспомогательных веществ в лекарственных препаратах, производимых в различных лекарственных формах и по различным технологиям, но в одинаковых дозах, на их терапевтический эффект [Хоружая Т. Г., Чучалин В. С., 2006].
В ходе различных исследований было установлено, что фармацевтические факторы оказывают существенное влияние на динамику биодоступности лекарственных веществ, стабильность лекарственных препаратов в процессе хранения, терапевтическую активность действующих веществ и на многие другие показатели. Фармацевтические факторы делятся на пять групп: 1. Химическая модификация лекарственных веществ; 2. Физико-химические свойства лекарственных веществ; 3. Вид ЛВ и способ введения лекарственных веществ; 4. Природа используемых вспомогательных веществ; 5. Способ или технология изготовления лекарственной формы. Также на биодоступность лекарственных веществ влияют так называемые эндогенные факторы. К ним относятся:
Физиологические факторы: возраст, пол, состояние организма пациента. Биохимические факторы: состояние клеточных мембран, активность клетки, наличие эндогенных субстратов, накапливаемых при различных заболеваниях (билирубин, жирные кислоты и т.д.). Патофизиологические: патологические состояния желудочно-кишечного тракта, печени, почек, сердечно-сосудистой системы, уровень транспортных белков в крови, генетически обусловленная разница в биотрансформации лекарственных веществ с пресистемным метаболизмом. Клинические: выбор схемы дозирования, путь введения, место инъекции, интеракция одновременно или последовательно вводимых лекарственных веществ [Хоружая Т. Г., Чучалин В. С., 2006; Тихонов А.И., Ярных Т.Г., Зупанец И.А., 2003].
Под физическим свойством лекарственных веществ понимают: - степень измельчения или дисперсность лекарственных веществ; - полиморфизм лекарственных веществ; - агрегатное состояние (аморфность, кристалличность, форма и характер кристаллов); - физико-химические свойства (рh, растворимость, оптическая активность, электропроводимость, температура плавления); - поверхностные свойства лекарственного вещества (поверхностное натяжение); - степень чистоты (вид и количество загрязнений, в том числе наличие микроорганизмов, аллергенов, вяжущих веществ и др.). Физическое состояние лекарственных веществ оказывает влияние на стабильность лекарственного препарата в процессе хранения, терапевтическую эффективность, скорость всасывания, проницаемости и выведения его из организма.
Приготовление подвижной фазы для градиентного элюирования методом высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Кристаллическая (серия 9-011, срок годности – 2 года) и микронизированная (серия 8-011, срок годности – 2 года) субстанции соединения ГБ-115, а также 4 лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115 были предоставлены опытно-технологическим отделом ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН. Четыре фармацевтические композиции отличались следующим составом: Фармацевтическая композиция №1 - Кристаллическая субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс; серия - 20.03.12, срок годности - 2 года. Фармацевтическая композиция №2 - Микронизированная субстанция ГБ-115, ПВП-ТДС; серия - 19.03.12, срок годности - 2 года. Фармацевтическая композиция №3 - Микронизированная субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс; серия - 21.03.12, срок годности - 2 года. Фармацевтическая композиция №4 - Микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ); серия - 10.10.13, срок годности - 2 года.
Высокоэффективный жидкостной хромотограф “Agilent Technologies”, серии 1200 (США) с масс-спектрометрическим детектором “Agilent 6300 series ionrap” (США) и компьютер с соответствующим пакетом для обсчёта хроматограмм; жидкостной хроматограф, состоящий из изократической помпы SYSTEM COLD 127 (США), ультрафиолетовый детектор и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчёта хроматограмм "Амперсенд" (Россия); микрошприцы Hamilton вместимостью 10, 100, 500 мкл, пипетки Fortuna (объём 5 мл); весы лабораторные аналитические с погрешностью взвешивания не более ± 0,0002 г; цилиндры мерные лабораторные на 100 мл.
Шприцы медицинские вместимостью 5 мл ГОСТ 24861-91; дозаторы переменного объёма (100 мкл, 1 мл, 5 мл) со сменным одноразовыми пластиковыми наконечниками (Eppendorf, Германия); индикаторные палочки для контроля рН в диапазоне 3.0 – 5.0 (Macherey-Nagel, Германия); установка для получения деионизированной воды «Milli-Q plus» (Millipore, Франция); упариватель в токе азота «Dri-Bath» (Thermolyne, США); аппарат для встряхивания жидкости «K-550 GE» (Vortex, США), центрифуга «Rotina 46 R» (Hettich, Германия); пробирки со шлифами (5 мл, 10 мл) ГОСТ 1770-74.
Приготовление подвижной фазы для градиентного элюирования методом высокоэффективной хроматографии с масс спектрометрическим детектированием Приготовление 0.1М раствора ацетата аммония: 1.54г порошка растворяют в 200 мл деонизированной воды.
1. Раствор А: к 50 мл 0.1М раствора ацетата аммония добавляли 5 мл муравьиной кислоты и доводили объём раствора водой до литра. Полученный раствор фильтровали через фильтр Millipore (0.45 мкм) и дегазировали под вакуумом, что позволило избежать дополнительных пиков во время анализа.
2. Раствор В: 100% ацетонитрил. Сроки годности – 14 суток, условия хранения - в сухом, хорошо проветриваемом месте.
Фармакокинетику ГБ-115 изучали после перорального введения микронизированной субстанции и фармацевтических композиций в виде водной суспензии белым беспородным крысам самцам (самцы массой 200±20 г.), полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН при 12-ти часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Исследования проводили на здоровых, бодрствующих животных. До проведения исследования животные находились в течение 12 часов на водной диете.
Фармакокинетику ГБ-115 изучали после перорального введения в дозе 100 мг/кг. Препарат вводили внутрь в виде водной суспензии кристаллической и мелкодисперсной субстанций, а также четырёх фармацевтических композиций с помощью зонда в объёме до 2-х миллилитров. Крыс декапитировали через дискретные интервалы времени – 5, 10, 15,20, 30, 45, 60, 90 мин. Для исследования брали кровь опытных животных после введения ГБ-115, а также контрольных животных после введения дистиллированной воды в том же объёме.
Все операции проводили на холоде при температуре Т=-4?С. Кровь отбирали в предварительно охлаждённые гепаринизированные пробирки, содержащие 250 ед. гепарина. Плазму крови получали центрифугированием (8000 об./мин, 10 мин, Т=-4?С). Белки осаждали ex tempore добавлением двукратного объёма ацетонитрила и центрифугированием (4000 об/мин, 10 мин, Т=-4?С). Образцы хранили в морозильнике глубокого холода (-30? С) до начала проведения подготовки биопроб к анализу.
Фармакокинетика и биодоступность ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №2 крысам в дозе 100 мг/кг
Достоверность различий между величинами площади под фармакокинетической кривой фармацевтической композиции №3 и микронизированной субстанции, а также фармацевтических композиций №1, 2, 4 оценивалась с помощью критерия Стьюдента по концентрациям ГБ-115 в дискретные временные точки фармакокинетической кривой. -статистически достоверное различие при р0,05 в сравнении с фармацевтической композицией №1. Не отмечалось статистически достоверного различия при р0,05 в сравнении с фармацевтическими композициями №2, 4, а также с микронизированной субстанцией.
На стадии абсорбции соединения отмечаются значительные различия в динамике изменения концентраций ГБ-115 после введения для фармацевтической композиции №3 и субстанции, и в их количественном содержании. Для микронизированной субстанции характерно постепенное увеличение содержания активного соединения с достижением максимальной концентрации через 20 мин после введения, которая составляет 113.02 нг/мл. Максимальная концентрация ГБ-115 после введения животным фармацевтической композиции №3 была ниже и составила 97.36 нг/мл через 20 мин после введения. Но для данной фармацевтической композиции характерно наличие достаточно высоких концентраций ГБ-115 в отдалённые интервалы времени.
Характер элиминации после перорального введения фармацевтической композиции №3 более медленный, чем после введения микронизированной субстанции, причём, высокая концентрация ГБ-115 сохранялась в течение 60 мин после введения фармацевтической композиции №3, которая составила в этот интервал времени 66.35 нг/мл. Для сравнения длительности пребывания активного вещества в неизменном виде в организме испытуемых животных после введения микронизированной субстанции и фармацевтической композиции №3 необходимо сравнить следующие параметры: Kэл, T1/2, MRT, Clpo. После введения микронизированной субстанции ГБ-115, активное вещество находится менее длительное время в организме животных. На это указывают значения константы элиминации 0.0323 мин-1, периода полувыведения 21.49 мин, среднего времени удерживания ГБ-115 в организме животных 39.87 мин, а также клиренса – 4.013 л/мин. Фармацевтической композиции №3 (Kэл -0.0094 мин-1, T1/2 - 74.01 мин, MRT - 113.20 мин, Clpo – 1.672 л/мин), отличается от микронизированной субстанции более медленным выведением неизменённого вещества в течение 60 мин, что является хорошим показателем для фармацевтических композиций, содержащих пептидные соединения.
Для фармацевтической композиции №3, а также для микронизированной субстанции характерны высокие значения гипотетического объёма распределения – 178.50 л и 124.40 л соответственно. Также данные показатели свидетельствуют о лучшем распределении ГБ-115 после введения фармацевтической композиции №3 в организме испытуемых животных.
Площади под фармакокинетической кривой ГБ-115 после введения фармацевтической композиции №3 и микронизированной субстанции имеют близкие значения 4708.205 и 4019.415 нг/мл х мин соответственно и поэтому относительная биодоступность фармацевтической композиции №3 в сравнении с субстанцией составила 117.14%. При этом скорость всасывания ГБ-115 у крыс, оцениваемая по отношению Cmax/AUC, отличалась незначительно после введения фармацевтической композиции №3 и субстанции. Результаты этого раздела опубликованы в соавторстве с П.О. Бочковым, Р.В. Шевченко, В.П. Жердевым, С.С. Бойко и А.А. Литвиным [Бочков П.О. и др., 2013].
Фармакокинетические кривые ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №4 и микронизированной субстанции изучаемого соединения в дозе 100 мг/кг представлены на рисунке 10. Время регистрации соединения ГБ-115 в плазме крови крыс колеблется от 60 до 90 мин после введения микронизированной субстанции и фармацевтической композиции №4 соответственно. Максимумы концентраций наблюдаются через 20 мин после введения микронизированной субстанции и 15 мин после введения фармацевтической композиции №4. Исходя из данных рисунка 10, можно отметить, что фармакокинетическая кривая ГБ-115 после введения фармацевтической композиции №4 характеризуется более плавным характером снижения концентраций, более высокими значениями концентраций через 30 мин после введения по сравнению с микронизированной субстанцией, а также более длительной регистрацией ГБ-115 в системном кровотоке крыс.