Введение к работе
Актуальность проблемы. Тема настоящего исследования тесно переплетается с одной из ведущих задач Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН - определение метаболического статуса человеческого организма (Л. А. Пиру-зян, 2004) для реализации принципа индивидуализации лекарственной терапии и, в частности, иммунодепрессивной терапии. Широкое использование иммунодепрессантов ставит перед клиницистами задачу оценить индивидуальную, наследственно обусловленную чувствительность (резистентность) к лекарственному воздействию. Очевидно, что для решения этой задачи, прежде всего, необходимы целенаправленные экспериментальные исследования.
Вопрос о значении наследственных факторов в определении степени иммуноде-прессии, возникающей под влиянием химиопрепаратов-иммунодепрессантов, ранее систематически исследовался экспериментальной группой лаборатории иммуно генетики Института медицинской генетики АМН СССР.
Всё началось с экспериментального факта, обнаруженного Львом Алексеевичем Певницким в процессе работы над докторской диссертацией (Л. А. Певницкий, 1974) -наличие межлинейных различий у мышей в степени лекарственно индуцируемой иммунологической толерантности. Это состояние специфической иммунологической ареак-тивности (неотвечаемости) возникает в результате сочетанного введения в организм экспериментального животного огромной дозы антигена (тем самым активируется весь им-мунокомпетентный клон) и лекарственного препарата-иммунодепрессанта, приводящего к элиминации активированного антигеном клона клеток иммунной системы (так называемая, клональная форма толерантности, см. Л. Н. Фонталин и Л. А. Певницкий, 1978). Данное состояние специфично - сохраняется полноценный иммунный ответ на другие антигены. Наилучшие результаты были получены у мышей при использовании в качестве антигена эритроцитов барана (ЭБ), в качестве иммунодепрессанта - циклофосфамида (ЦФ). Длительность состояния полученной таким образом иммунологической толерантности сохранялась до 1 года (почти половина мышиной жизни).
Нами первоначально был изучен вопрос о существовании подобных межлинейных различий у мышей в степени подавления ЦФ первичной иммунной реакции на оптимальную иммуногенную дозу ЭБ. В широком диапазоне доз иммунодепрессанта мы выявили линии мышей, контрастно реагирующих на иммуно депрессивное воздействие:
-2-BALB/cJLacSto (резистентная линия) и DBA/2JSto (чувствительная линия) (Л. А. Пев-ницкий, Л. Ю. Телегин, В. Н. Болыпев, 1977).
При анализе причин обнаруженных различий мы установили, что иммунологические механизмы здесь играют подчинённую роль: сопоставление нормальной реакции мышей разных генотипов на антиген и степени относительной иммунодепрессии показало, что между этими параметрами связи нет. Так, например, при использовании ЭБ в дозе 5x10 клеток высота иммунного ответа в контроле была практически одинаковой у мышей исследуемых линий, тогда как показатели относительной иммунодепрессии существенно различались. Следует также отметить, что гены комплекса Н-2, по-видимому, не определяют чувствительность (резистентность) к препарату, поскольку мыши контрастных генотипов BALB/c и DBA/2 имеют одинаковый Н-2-гаплотип - Н-2 ( .html и ). Причину межлинейных различий при иммунодепрессии и иммунологической толерантности следовало искать в особенностях поведения лекарственного препарата-иммунодепрессанта в организме мышей разных генотипов.
Мы исследовали (Л. Ю. Телегин, 1981) следующие маркерные признаки фармако-кинетики и фармакодинамики ЦФ в организме мышей разных линий: особенности метаболизма ЦФ в микросомах клеток печени; фармакокинетику содержания в сыворотке крови активных алкилирующих метаболитов ЦФ; иммунодепрессивное действие на тест-клетки ЦФ, активированного in vitro ("активный" постмикросомальный супернатант) и in vivo ("активная сыворотка"); чувствительность иммунокомпетентных клеток селезёнки к иммунодепрессивному влиянию "активной сыворотки".
В результате проведённых исследований было установлено, что для мышей "резистентного" генотипа BALB/c по сравнению с мышами "чувствительной" линии DBA/2 была характерна более высокая скорость метаболизма ЦФ в печени, большее содержание активных алкилирующих метаболитов в крови, но меньшая чувствительность иммунокомпетентных клеток-мишеней селезёнки. В процессе проведения опытов был обнаружен ранее неизвестный факт отсутствия параллелизма между содержанием активных алкилирующих продуктов метаболизма ЦФ в образцах "активной сыворотки" и её иммуно-депрессивным действием в отношении тест-клеток. Тогда была высказана гипотеза, объясняющая это явление, - усиление интактным ЦФ действия своих активных метаболитов - и она нуждалась в экспериментальной проверке.
Цель и задачи исследований. Настоящее диссертационное исследование является логическим продолжением ранее проведённых нами работ. Дальнейшее выяснение меха-
-3-низмов действия и особенностей поведения в организме циклофосфамида, объясняющих генетические различия в реакции на этот лекарственный препарат, явилось целью настоящей работы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Выяснить, сохранятся ли подобные соотношения между мышами линий BALB/c и DBA/2 при использовании в качестве иммунодепрессантов лекарственных препаратов иной структуры и механизма действия (сарколизин, тио-фосфамид, цитозинарабинозид, циклоспорин А).
-
Исследовать сравнительную чувствительность иммунокомпетентных клеток-мишеней (Т- и В-клеток селезёнки) мышей линий BALB/c и DBA/2 к иммуно-депрессивному действию ЦФ in vitro.
-
Изучить чувствительность лимфоцитов периферической крови человека к действию ЦФ и тиофосфамида, определить степень изменчивости этого признака, выделить разные типы реакции на химиопрепараты (высоко- и низкореаги-рующие индивидуумы) и исследовать возможные механизмы различий в чувствительности к иммунодепрессантам.
-
Изучить особенности острого токсического действия ЦФ у мышей BALB/c и DBA/2, обладающих контрастной чувствительностью к иммунодепрессивному действию ЦФ (активность некоторых ферментов метаболизма ЦФ, кинетика токсического метаболита ЦФ, акролеина, кинетические показатели содержания свободных сульфгидрильных групп).
-
Определить уровень репликативного и репаративного синтеза ДНК в сплено-цитах интактных мышей BALB/c и DBA/2 как возможного фактора, определяющего разную чувствительность клеток-мишеней мышей данных генотипов к действию ЦФ.
-
В разных экспериментальных условиях подробно исследовать ранее не установленный механизм биологического действия ЦФ, проверив выдвинутую ранее нами гипотезу (Л. Ю. Телегин, 1981) об усилении нативным ЦФ действия собственных активных метаболитов.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработан фармакогенетический подход для выяснения причин разной чувствительности к действию циклофосфамида.
-
Мыши двух линий, для которых характерна неодинаковая чувствительность к иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vivo (BALB/cJLacSto -
-4-низкая, DBA/2JSto - высокая), имеют такой же тип чувствительности in vivo и к другим иммунодепрессантам - сарколизину, тиофосфамиду, цитозинараби-нозиду и циклоспорину А.
-
Клетки селезёнки мышей линии BALB/cJLacSto обладают более высокой резистентностью к действию циклофосфамида, сарколизина, тиофосфамида и цито-зинарабинозида, чем клетки селезёнки мышей линии DBA/2JSto. Таким образом, наблюдается прямая корреляция между степенью чувствительности мышей этих линий к иммунодепрессантам in vivo и степенью подавления иммунной реакции их иммунокомпетентных клеток in vitro.
-
Т- и В-клетки селезёнки мышей "резистентной" к циклофосфамиду линии BALB/cJLacSto более устойчивы к иммунодепрессивному действию циклофосфамида in vitro, чем Т- и В-клетки селезёнки мышей "чувствительной" к этому иммунодепрессанту линии DBA/2JSto. У мышей обеих линий Т-лимфоциты поражаются циклофосфамидом сильнее, чем В-клетки.
-
Существует выраженная фенотипическая изменчивость чувствительности лимфоцитов периферической крови человека к подавлению антипролифера-тивного потенциала с помощью циклофосфамида и тиофосфамида. Выделены контрастные и промежуточные типы реагирования на данные алкилирующие агенты. Как и в опытах на животных, тип чувствительности клеток сохраняется независимо от вида применённого алкилирующего агента.
-
Признак "тип чувствительности" к действию циклофосфамида и тиофосфамида характеризуется относительным постоянством и не зависит от величины показателя "индекс стимуляции". Отсутствует ассоциация данного признака с фенотипом HLA-A-B-C лимфоцитов.
-
Причина разной чувствительности лимфоцитов периферической крови человека может быть связана с неодинаковой способностью цитозолей лимфоцитов инактивировать исследуемые алкилирующие агенты, что, в свою очередь, может быть обусловлено внутриклеточным балансом тиоловых соединений.
-
Имеются контрастные межлинейные различия у мышей в чувствительности к токсическому действию циклофосфамида при однократном внутрибрюшинном введении циклофосфамида в дозе 350 мг/кг. В печени, крови и селезёнки "высокочувствительных" к токсическому действию циклофосфамида мышей DBA/2JSto обнаружены изменения следующих показателей, отличающиеся от таковых мышей BALB/cJLacSto: более низкая активность в печени изоформы
цитохрома Р450, ответственной за активацию циклофосфамида; более низкое содержание в печени интактных мышей SH-групп; большая площадь под кривой содержания в печени токсического метаболита циклофосфамида - акролеина; более высокое содержание алкогольдегидрогеназы в крови - маркёра центрилобулярного повреждения печени; в крови выявлено более низкое содержание акролеина, а также было более низким содержание SH-групп; в селезёнке - уровень SH-групп был ниже, а содержание акролеина - выше, чем у BALB/cJLacSto.
-
В спленоцитах интактных мышей DBA/2JSto по сравнению с мышами BALB/cJLacSto отмечается более низкий уровень репликативного и репаратив-ного синтеза ДНК.
-
В трёх экспериментальных системах удалось доказать наличие нового механизма действия циклофосфамида: интактный препарат, неактивный per se, усиливает иммунодепрессивное, антипролиферативное и мутагенное действие своих собственных активных метаболитов.
Научная новизна работы. Использование фармакогенетического подхода позволило впервые выявить генетически контролируемые факторы, их роль и значение в определении степени чувствительности (устойчивости) к действию циклофосфамида. Впервые было показано, что высокая степень чувствительности к действию циклофосфамида определяется сочетанием низкой активности систем активации и инактивации препарата в процессе метаболизма, что обеспечивает феномен усиления циклофосфамидом биологического действия собственных активных метаболитов; низкого содержания свободных сульфгидрильных групп в клетках-мишенях и низкой активностью в них систем репарации повреждений ДНК. Фенотип устойчивости к действию ЦФ in vivo определяется максимальным значением этих показателей. Впервые обнаружено явление усиления циклофосфамидом действия своих собственных активных метаболитов, и существование этого феномена была доказано при исследовании иммунодепрессивного, антипролифера-тивного и мутагенного действия циклофосфамида.
Практическая ценность работы. Проведённые исследования вносят вклад в понимание механизмов действия циклофосфамида, открывая новые возможности при разработке наиболее эффективных способов подавления пролиферативной реакции клеток при их экстракорпоральной обработке (получен патент РФ № 2393481, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 июня 2010 г.). Полученные сведения о конкретизации механизмов, с помощью которых реализуются генети-
ческие различия в действии иммунодепрессивных и противораковых препаратов, могут быть применены при разработке подходов к персонифицированной медицине, главный принцип которой - "лечить не болезнь, а больного" - был сформулирован знаменитым русским терапевтом Михаилом Яковлевичем Мудровым ещё в 1820 г. в книге "Слово о способе учить и учиться медицине практической": "Я намерен сообщить вам новую истину, которой многие не поверят и которую, может быть, не все из вас постигнут. Врачевание не состоит в лечении болезни... Врачевание состоит в лечении самого больного.... Каждый больной, по различию сложения своего, требует особого лечения, хотя болезнь одна и та же" (цит. по А. Л. Мясников, 1951).
Апробация работы. Результаты работы были доложены на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул", Ялта, 1989 г.; Всесоюзной конференции "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы", Москва, 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки", Минск, 1991 г.; I Съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992 г.; I Съезде Вавилов-ского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 20-25 декабря 1994 г.; Межлабораторной конференции ІГГП ФХФ РАН, 8 сентября 2010 г., Конференции лаборатории биофизической биохимии Гематологического научного центра РАМН, 11 октября 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из "Введения", главы 1 "Обзор литературы", раздела "Экспериментальная часть", который содержит главы "Материалы и методы", "Результаты опытов", "Обсуждение экспериментальных данных", глав "Заключение", "Выводы" и списка цитируемой литературы. Работа содержит 155 страниц машинописного текста, 21 таблицу и 26 рисунков. Список литературы включает 247 источников, из них 42 - на русском языке.