Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Условия развития уратного нефролитиаза и подходы к его коррекции (обзор литературы)
1.1. Патофизиологические факторы, способствующие развитию уратного нефролитиаза 11
1.2. Инсулинорезистентность как фактор развития уратного нефролитиаза .14
1.3. Биохимические аспекты развития инсулинорезистентности 16
1.4. Патофизиологическая роль инсулинорезистентности 20
1.5. Современные методы лечения уратного нефролитиаза 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 30
2.1. Экспериментальные животные 30
2.2. Моделирование уратного нефролитиаза 31
2.3. Лекарственные средства и обоснование их использования 33
2.4. Методы биохимических исследований 35
2.5. Гистологическое исследование 46
2.6. Методы статистической обработки 47
Глава 3. Моделирование уратного нефролитиаза у крыс 48
Глава 4. Влияние метформина на течение экспериментального уратного нефролитиаза у крыс 64
4.1. Режим «профилактика» 64
4.2. Режим «лечение» 72
Глава 5. Влияние дапаглифлозина на течение экспериментального уратного нефролитиаза у крыс 78
5.1. Режим «профилактика» 78
5.2. Режим «лечение» 86
Глава 6. Влияние пиоглитазона на течение экспериментального уратного нефролитиаза у крыс 92
6.1. Режим «профилактика» 92
6.2. Режим «лечение» 100 обсуждение результатов исследования 106
Выводы 117
Список сокращений 119
Список литературы
- Патофизиологическая роль инсулинорезистентности
- Моделирование уратного нефролитиаза
- Режим «профилактика»
- Режим «лечение»
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Уратный нефролитиаз – патологический процесс, возникающий вследствие нарушения пуринового обмена, приводящего к гиперурикемии и гиперурикозурии, и сопровождающийся отложением в почках кристаллов мочевой кислоты (МК). В последние десятилетия распространение уратного нефролитиаза в развитых странах значительно возросло. Частота возникновения мочекислых камней составляет в среднем 7-10% от общего количества конкрементов, образующихся в почках (Барскова В.Г. и соавт., 2011; Bushinsky D.A. et al., 2000; Gault M.H. et al., 2000). При этом в лечении таких больных зачастую приходится использовать хирургические методы либо ударно-волновую литотрипсию, что требует госпитализации и длительного периода реабилитации (Баринов Э.Ф. и соавт., 2014). В то же время химическая природа уратных конкрементов такова, что под воздействием определенных физико-химических факторов они могут полностью растворяться (Рапопорт Л.М. и соавт., 2015). Фармакологическая модуляция таких факторов может способствовать эффективному и безопасному литолизу уратных камней, в связи с чем имеет высокую актуальность.
Сегодня не вызывает сомнений взаимосвязь уратного нефролитиаза с метаболическим синдромом (МС) (Калинченко С.Ю. и соавт., 2011; Антипова В.Н. и соавт., 2015). По статистике, частота развития уратного нефролитиаза у пациентов с МС достигает 21,9% против 4,1% без такового (Барскова В.Г. и соавт., 2012; Akman T. et al., 2012). При этом известно, что наряду с изменениями в углеводном и липидном обменах, при МС отмечаются признаки нарушения метаболизма пуринов (Scales C.D. et al., 2007; West B. et al., 2008; Rendina D. et al., 2009).
Изучение особенностей патогенеза МС позволили выявить чрезмерную ацидификацию мочи, обусловленную нарушением образования и почечного транспорта аммония (Sakhaee K. et al., 2008; Bobulescu I.A. et al., 2013). Результаты исследований показывают, что главную роль в повышении кислотности мочи играет снижение чувствительности почечных тканей к инсулину (Abate N. et al., 2004; Cameron M.A. et al., 2006). Установлено, что инсулин, активируя свои рецепторы в почечных канальцах, стимулирует активность изоформы 3 Na+/H+ обменника, который обеспечивает перенос через мембрану NH3 в просвет канальца (Curthoys N.P., 2013).
При этом известно, что растворимость кристаллов МК напрямую зависит от pH среды, в которой они находятся. При снижении pH мочи до 5,5 МК становится в 20 раз менее растворимой, что даже в условиях нормальной экскреции МК значительно повышает вероятность ее кристаллизации и образования микролитов (Рапопорт Л.М. и соавт., 2015).
Таким образом, инсулин-зависимая ацидификация мочи при МС провоцирует формирование уратных камней. В то же время, существуют способы фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину:
повышение аффинности инсулиновых рецепторов, изменения их конформации и стимуляции рецепторных и пострецепторных путей передачи сигнала (Александров А.А., 2012; Кравчук Е.Н. и соавт., 2013; Евсина М.Г. и соавт., 2015);
компенсаторное повышение восприимчивости инсулиновых рецепторов на фоне снижения реабсорбции глюкозы в почках путем ингибирования натрий-глюкозного котранспортера 2 типа (SGLT-2) в эпителиоцитах канальцев (Евсина М.Г. и соавт., 2015; Мкртумян А.М., 2016);
повышение количества инсулиновых рецепторов на клеточной мембране путем активации ядерных рецепторов, активируемых пролифераторами пероксисом гамма (PPAR-) (Балаболкин М.И. и соавт., 2005; Александров А.А., 2011; Евсина М.Г. и соавт., 2015).
Учитывая вышесказанное, мы предположили, что фармакологическая модуляция чувствительности тканей к инсулину при уратном нефролитиазе может способствовать ослаблению литогенных процессов.
Степень разработанности
В нескольких исследованиях, посвященных проблеме МС и уратного нефролитиаза, было установлено, что нефролитиаз значительно чаще выявляется у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2) в сравнении с недиабетическими пациентами (Meydan N. et al., 2003; Taylor E.N.et al., 2005). В двух специально проведенных клинических обследованиях больных мочекаменной болезнью было показано, что среди пациентов с сопутствующим СД 2 уратные камни выявлялись у 33,9% и 35,7%, тогда как при отсутствии сахарного диабета эти цифры составляли 6,2% и 11,3% соответственно (Pak C.Y. et al., 2003; Daudon M. et al., 2006). Кроме того, доказано, что повышенная резистентность к инсулину приводит к уменьшению секреции аммония, что ведет к снижению буферной емкости мочи и способствует ее ацидификации (Chobanian M.C. et al., 1987; Nissim I. et al., 1995; Krivosikova Z. et al., 1998). Однако исследования, посвященные применению препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, с целью коррекции уратного нефролитиаза, практически не проводились.
Цель исследования
Комплексная оценка эффективности ряда противодиабетических препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, в профилактике и лечении экспериментального уратного нефролитиаза.
Задачи исследования
-
Воспроизвести модель уратного нефролитиаза с учетом современных методических подходов и изучить возможную патогенетическую роль процессов свободно-радикального окисления в развитии экспериментального уратного нефролитиаза;
-
Изучить влияние метформина на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободно-радикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.
-
Оценить влияние дапаглифлозина на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободно-радикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.
-
Изучить влияние пиоглитазона на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободно-радикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.
-
Сравнить эффективность профилактической и терапевтической модуляции чувствительности тканей к инсулину метформином, дапаглифлозином и пиоглитазоном при экспериментальном уратном нефролитиазе.
Научная новизна
Впервые продемонстрирована возможность эффективной коррекции уратного нефролитиаза путем фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину.
Впервые установлено, что применение метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона приводит к существенному ослаблению камнеобразования при экспериментальном уратном нефролитиазе.
Впервые установлено, что с целью коррекции уратного нефролитиаза в режиме профилактики наиболее эффективным является метформин, в режиме лечения – пиоглитазон. В обоих режимах введения максимальную эффективность среди изученных препаратов проявляет дапаглифлозин.
Впервые обнаружены ранее неизвестные особенности протекания уратного нефролитиаза в условиях повышения чувствительности тканей к инсулину.
Впервые определено новое показание к применению метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона.
Теоретическая и практическая значимость работы
Получены данные прикладного характера о возможности эффективной коррекции уратного нефролитиаза при помощи фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину.
Открыты новые фармакологические эффекты метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона, которые в совокупности с их уже известными свойствами позволяют рекомендовать назначение инсулин-модулирующей терапии при мочекаменной болезни, сочетающейся с МС.
Результаты исследования расширяют и совершенствуют врачебный арсенал медикаментозного лечения мочекаменной болезни.
Методология и методы исследования
Согласно поставленным задачам были выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России. В качестве объектов исследования использовались самцы крыс сток Вистар. Основные методы исследования: биохимические (определение уровня МК и креатинина в суточной моче и плазме крови животных, определение в моче общего белка, активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), N-ацетил--D-глюкозаминидазы (НАГ), определение в крови и почечной ткани активности каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГПО), супероксиддисмутазы (СОД), концентрации восстановленного глутатиона (ВГ) и тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП), общей антиоксидантной активности (ОАА) и общей прооксидантной активности (ОПА)), морфологические (микроскопия срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, при четырехсоткратном увеличении) и морфометрические методы (подсчет количества уратных микролитов в просвете канальцев на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином при двухсоткратном увеличении).
Основные положения, выносимые на защиту
-
Фармакологическая модуляция чувствительности тканей к инсулину путем длительного введения метформина, пиоглитазона и дапаглифлозина сопровождается существенным облегчением протекания экспериментального уратного нефролитиаза.
-
Применение пиоглитазона и метформина сопровождается тенденцией к ослаблению ацидификации мочи при сопутствующем уменьшении концентрации мочевой кислоты в крови и ее экскреции, ослаблении повреждающего фактора и оксидативного стресса в почках и снижении количества уратных микролитов.
-
Введение дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом вызывает сдвиг pH мочи в кислую сторону, однако обусловливает снижение концентрации мочевой кислоты в плазме крови и ее экскреции с мочой, снижение активности процессов свободно-радикального окисления и количества уратных микролитов в почках.
-
Метформин оказывает наиболее благоприятное действие в условиях профилактики уратного нефролитиаза. Пиоглитазон проявляет максимальную активность в режиме лечения данной патологии. Дапаглифлозин превосходит описанные выше препараты по эффективности в отношении уратного нефролитиаза в обоих режимах применения лекарственных средств.
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности полученных данных подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современного оборудования и качественных реактивов, применением современных биохимических, морфологических и морфометрических методов и методологических подходов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены лабораторными данными, анализом литературы, точностью статистической обработки полученных результатов.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета (2014-2016), I Итоговой конференции Научного общества молодых ученых, инноваторов и студентов Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2016), XVIII городской научно-
практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2016), Всероссийском молодежном форуме с международным участием «Неделя науки – 2016» (Ставрополь, 2016), I Международной морфологической научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Морфологические науки – фундаментальная основа практической медицины», посвященной памяти профессора М.Я. Субботина (Новосибирск, 2016), VII Международной научной конференции «Science4health 2016» (Москва, 2016).
Публикации
Результаты диссертации опубликованы в 9 научных работах, в том числе 6 – в изданиях из Перечня российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, утвержденного Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 15 таблицами, состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материал и методы исследования, 4 главы с результатами), заключения и списка литературы, в котором приведено 275 источников, из которых 174 иностранных авторов.
Патофизиологическая роль инсулинорезистентности
Существует несколько условий, определяющих развитие уратного нефролитиаза. Первое – наличие хотя бы одного или нескольких из следующих факторов: чрезмерно кислый pH мочи, гиперурикемия и гиперурикозурия, сниженный объем образующейся мочи. Второе – наличие ряда сопутствующих заболеваний и состояний, таких как подагра, СД 2, а также МС или его отдельные компоненты [36].
Неспецифическим и универсальным фактором, способствующим образованию всех типов почечных конкрементов, является низкий объем мочи [22, 79]. В связи с ограниченной растворимостью МК, повышение её концентрации при сниженном объеме мочи приводит к пересыщению МК и созданию условий, способствующих осаждению МК и мононатриевого урата [114, 227].
Следствием возрастания содержания урата в крови является увеличение его экскреции с мочой с развитием гиперурикозурии. T. Y и A. Gutman в своей работе показали строгую линейную зависимость между концентрацией МК в плазме крови и уратным нефролитиазом. У пациентов с уровнем МК в плазме ниже 7 мг/дл микролиты определялись лишь в 9,9% случаев, а при увеличении концентрации МК в плазме до 13 мг/дл и выше, конкременты определялись уже в 53% случаев [273]. Позже многие исследователи подтвердили эти результаты и пришли к выводу о том, что подагра является фактором повышенного риска образования почечных камней [12, 182, 217, 248]. Помимо подагры существуют другие состояния, которые сопровождаются увеличением экскреции МК с мочой. Среди них следует выделить генетический дефект фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансферазы (синдром Леша-Нихана). Этот фермент предотвращает клеточное разрушение пуринов, а нарушение его активности приводит к развитию тяжелой гиперурикемии [73, 186, 213]. Некоторые наследственные заболевания также характеризуются гиперурикемией и могут сопровождаться развитием уратного нефролитиаза. Среди них болезнь Вильсона-Коновалова, Хартнапа, Гирке, синдромы Келли-Зигмиллера, Фанкони [78, 160, 206, 268]. Гиперурикемия может развиваться на фоне химиотерапии при миело- и лимфопролиферативных заболеваниях вследствие катаболизма опухолевых клеток, гемолитической и серповидно-клеточной анемии, полицитемии и псориаза в результате усиленного клеточного оборота [186, 213, 256]. Кроме того, гиперурикемия может быть следствием длительного применения ряда лекарственных препаратов, к которым относятся тиазидовые и петлевые диуретики, ингибиторы карбоангидразы, ряд нестероидных противовоспалительных препаратов, некоторые антибиотики, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, блокаторы ангиотензиновых рецепторов, статины, современные противовирусные средства [73, 123].
Не менее важным патогенетическим фактором, способствующим образованию уратных камней, является гиперурикозурия. При увеличении концентрации МК в первичной моче создаются хорошие условия для ее преципитации в почечном интерстиции с последующей кристаллизацией [73, 203].
К развитию гиперурикозурии могут приводить как генетические причины, так и воздействие приобретенных факторов. Врожденная гиперурикозурия возникает вследствие нарушений почечного транспорта урата по причине мутаций почечных транспортеров МК [122, 186, 187, 221, 243]. Приобретенная гиперурикозурия может быть обусловлена богатой пуринами диетой и применением урикозурических лекарственных средств, таких как пиразинамид, пробеницид, бензбромарон, сульфинпиразон, фенилбутазон, ацетилсалициловая кислота в больших дозах, лозартан, фенофибрат, аторвастатин [115, 146, 186, 218, 226, 254]. Главным условием формирования уратных микролитов является ацидификация мочи. В крови, pH которой составляет 7,34-7,36, МК находится в ионизированном состоянии в форме растворимого мононатриевого урата. Попадая в условия чрезмерно кислой мочи (pH5,5), МК становится в 20 раз менее растворимой, чем мононатриевый урат, что резко увеличивает преципитацию и способствует образованию конкрементов [40, 186, 191, 196, 206, 231]. К возникновению повышенной ацидификации мочи может привести нарушение буферной емкости мочи и повышение образования титруемых кислот [19, 180, 212, 231].
МС включает в себя абдоминальное ожирение, снижение чувствительности периферических тканей к инсулину, повышение уровня инсулина в плазме крови, нарушение липидного и пуринового обмена, а также артериальную гипертензию (АГ) [15, 58]. При этом в основе большинства изменений, составляющих МС, лежит инсулинорезистентность (ИР) [55, 75, 98, 99, 220].
ИР – состояние, которое характеризуется потребностью инсулиночувствительных тканей в более высокой концентрации инсулина чем в норме для реализации его биологических эффектов. Это обусловливает нарастание гиперинсулинемии (ГИ) при ИР [38]. Физиологическая, метаболическая, эндокринная и неэндокринная ИР может быть обусловлена как генетическими факторами, так и внешними причинами [26]. Феномен ИР изучен недостаточно глубоко. Разнообразие известных этиологических и патогенетических факторов ее развития подтверждает неоднозначность и сложность данного процесса. Порой невозможно достоверно установить, что явилось первопричиной – нозология, вызвавшая ИР, или ИР, послужившая триггером к возникновению заболевания.
В то же время, сегодня не вызывает сомнений связь ИР и других компонентов МС с уратным нефролитиазом [110, 127, 200]. Хотя уратные конкременты составляют лишь 7% от общего числа почечных камней, в различных группах людей этот процент существенно различается [260]. Так, среди пациентов с ожирением мочекислые микролиты составляют 63% от общего числа камнеобразователей [199]. Общая частота МС в РФ у пациентов с подагрой составляет в среднем 57% [94]. T. Akman и соавт. показали, что уратные микролиты встречаются у 21,9% пациентов с МС и лишь у 4,1% лиц без такового [250]. В ряде исследований установлено, что частота образования уратных камней имеет прямую зависимость от увеличения массы тела или наличия СД 2 [186, 246, 259].
Моделирование уратного нефролитиаза
ЛДГ - цитозольный фермент канальцевого эпителия. Его повышение в моче обусловлено явлениями цитолиза, что делает возможным его использование в качестве соответствующего маркера [69]. Активность ЛДГ в моче определяли с помощью готового набора реактивов (ЛДГ-Витал, Россия). В основе метода лежит реакция восстановления пирувата до молочной кислоты. Эта реакция катализируется лактатдегидрогеназой, а ее скорость пропорциональна активности фермента.
Перед измерением содержимое флакона с реагентом №2 (NADH, 0,18 ммоль/л) растворяли в 10 мл буферного раствора (пируват 0,6 ммоль/л, фосфат 50,0 ммоль/л). В каждую опытную пробирку вносили 1000 мкл рабочего реагента и 10 мкл профильтрованной мочи. Пробу тщательно перемешивали и инкубировали точно 60 секунд при температуре 37оС и измеряли оптическую плотность при длине волны 340 нм троекратно через промежутки времени равные 1 минуте. Для расчетов вычисляли среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (E/мин). Активность ЛДГ в моче определяли по формуле ЛДГ = AE/MUHXF , где F - коэффициент для расчета, который при 37оС и длине волны 340 нм равен 16030.
НАГ по мнению ряда авторов является наилучшим маркером поражения почек [29]. Активность НАГ определяли колориметрически по конечной точке реакции ферментативного разложения 4-нитрофенил-N-ацетил-бета-D-глюкозаминида по методике Т.П. Лавреновой [54].
Для этого 0,1 мл образца мочи, разведенной в 20 раз, смешивали с 0,1 мл 0,5 М цитратно-фосфатного буфера (pH 4,5), содержащего 7,5 мМ 4-нитрофенил-N-ацетил-бета-D-глюкозаминида (Sigma-Aldrich, США) и инкубировали 30 минут при 37оС. Реакцию останавливали добавлением 3 мл 0,1 М раствора карбоната натрия. Оптическую плотность образовавшегося 4-нитрофенола измеряли при 400 нм при длине оптического пути 1 см против контрольной пробы, для приготовления которой вместо образца мочи была взята дистиллированная вода. Концентрацию 4-нитрофенола определяли по калибровочному графику, построенному путем измерения оптической плотности стандартных растворов 4-нитрофенола.
Активность всех определяемых ферментов в моче рассчитывалась относительно концентрации креатинина в моче, выражавшейся в ммоль/л, и обозначалась в единицах U/ммоль креатинина.
В результате окисления высших жирных кислот образуются тиобарбитурат-реактивные продукты (ТБРП), которые в основном представлены малоновым диальдегидом (МДА). Метод основан на реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) в условиях высокой температуры и последующим образованием оснований Шиффа, определяющих розовую окраску проб с максимальным поглощением при длине волны 532-535 нм [23, 59]. В опытную пробирку вносили 0,5 мл дистиллированной воды, 1 мл. трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 0,1 мл 5М раствора соляной кислоты и 1 мл раствора ТБК. Для определения концентрации ТБРП в тканях почек в опытную пробу добавляли 0,5 мл гомогената почки, а для определения в крови – 0,5 мл плазмы. В контрольную пробу вносили соответствующий объем дистиллированной воды. Опытные и контрольные пробирки инкубировали на кипящей водяной бане 15 минут. Затем пробы охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Оптическую плотность окрашенных триметиновых комплексов измеряли на спектрофотометре при длине волны 535 нм против контрольной пробы. Расчет проводили по формуле ТБРП(мкмолъ) = L х 6,2 0,16 где: Ео - оптическая плотность опытной пробы; 6,2 - разведение плазмы (гомогената почки); 0,16 - коэффициент, полученный при построении калибровочной кривой малонового диальдегида.
Восстановленный глутатион является главным внутриклеточным антиоксидантом, обеспечивающим защиту компонентов клеток млекопитающих от активных форм кислорода как прямо, так и косвенно (через ферментативные реакции) [150]. Принцип метода основан на его взаимодействии с 5,5 -дитио-бис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБК). В результате реакции образуется окрашенный в желтый цвет анион 2-нитро-5-тиобензоата, имеющий максимум поглощения при длине волны 412 нм [144].
К 0,6 мл гемолизата (0,1 мл отмытых эритроцитов + 1,9 мл холодной дистиллированной воды) или гомогената добавляли 0,2 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты (Россия). Пробы центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/мин при температуре 2оC, 0,2 мл полученного супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,55 мл 0,1 М ТРИС-HCl буфера с 0,01% этилендиаминтетраацетата, pH 8,5. К полученной смеси добавляли 0,025 мл 0,4% раствора ДТНБК на метаноле. После развития окраски пробы фотометрировали с помощью спектрофотометра ПЭ-5400ви (Россия) при 412 нм и длине оптического пути 1 см против дистиллированной воды. Расчет содержания восстановленного глутатиона производили по калибровочной кривой, построенной путем анализа по вышеописанной методике растворов восстановленного глутатиона возрастающей концентрации, и выражали в мкмоль/г гемоглобина.
ОПА является суммарным показателем концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов в плазме (ткани) [81]. В качестве субстрата использовали ТВИН-80 (полиоксиэтилангидросорбитана моноолеат). Являясь производным ненасыщенной жирной кислоты, ТВИН-80 позволяет смоделировать процесс перекисного окисления липидов in vitro. При этом прооксиданты, содержащиеся в опытном образце ткани (плазмы крови), окисляют ТВИН-80 с образованием вторичных продуктов окисления, концентрацию которых определяли по описанной выше реакции с ТБК.
Во флаконы из темного стекла с притертыми пробками объемом 200 мл вносили по 2 мл 1%-го раствора ТВИН-80. Для исследования ОПА в тканях почек в опытную пробу добавляли 0,2 мл гомогената, а для определения ОПА в крови – 0,2 мл плазмы. В контрольную пробирку вносили соответствующий объем дистиллированной воды, после чего пробы инкубировали 48 ч при температуре 40оC. После этого содержимое переливали в центрифужные пробирки из полимерного материала, добавляли по 1 мл 40%-го раствора ТХУ в опытную и контрольную пробы и оставляли при комнатной температуре на 60 минут. Затем пробы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 минут и добавляли к 2 мл супернатанта 1 мл 0,87%-го раствора ТБК в 0,13%-м растворе NaOH, инкубируя далее 15 минут на кипящей водяной бане. ТБК реагирует с МДА, образуя триметиновый комплекс розового цвета. Пробы охлаждали при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 535 нм против дистиллированной воды.
Режим «профилактика»
На рисунке 4 представлена динамика изменений концентрации урата в плазме крови крыс на фоне ежедневного введения ОК и МК. Из рисунка следует, что в этих условиях наблюдался последовательный рост описываемого показателя. Через 7 дней после начала введений содержание урата в плазме крови составило 0,9 (0,7; 1,4) мг/дл против 0,8 (0,6; 0,9) мг/дл у животных из контрольной группы (p = 0,358), через 14 дней этот показатель вырос до 1,7 (1,2; 2,0) мг/дл (p = 0,004), а к концу периода наблюдения установился на уровне 2,8 (1,8; 3,1) мг/дл (p = 0,003).
Наблюдавшиеся изменения привели к закономерному росту экскреции урата с мочой. На рисунке 5 представлена динамика выделения солей МК с мочой, из которого видно, что рост экскреции урата изменялся параллельно с увеличением его плазменной концентрации. Так, уже через 7 дней после начала введений выделение солей МК с мочой составило 19,9 (16,6; 24,0) мг/дл в сутки против 3,1 (2,5; 3,4) мг/дл у контрольных животных (p = 0,003). К концу второй недели этот показатель увеличился до 55,5 (43,5; 61,4) мг/дл (p = 0,003). После этого, величина выделения МК с мочой стабилизировалась, сохраняясь примерно на одном уровне, и к окончанию эксперимента составила 53,7 (21,5; 65,0) мг/дл (p = 0,014).
Следует отметить, что уже через сутки после начала введения ОК и МК наблюдалось существенное повышение диуреза у всех подопытных животных. Причем тенденция к увеличению мочеотделения сохранялась на протяжении всего эксперимента. При этом отмеченные изменения его уровня происходили параллельно с ростом СКФ, что, по-видимому, внесло вклад в обеспечение диуретической реакции. Так, СКФ в группе контроля составляла 1,4 (1,2; 1,7) мл/мин, к окончанию первой недели этот показатель вырос до 1,9 (1,4; 2,2) мл/мин, (p = 0,126), а через две недели скорость фильтрации у экспериментальных животных увеличилась до 2,8 (2,0; 3,0) мл/мин (p = 0,012 к контролю) и сохранялась на этом уровне до окончания эксперимента: 2,8 (2,2; 3,1) мл/мин (p = 0,008 к контролю).
Одновременно по ходу эксперимента фиксировались признаки повреждения нефроцитов. Так, из рисунка 6, на котором отражена экскреция белка с мочой, видно, что уже к окончанию первой недели эксперимента этот показатель более чем в два раза превышал цифры контрольной группы: 2,3 (2,0; 2,7) мг против 0,9 (0,7; 1,1) мг (p = 0,003). К концу 2 недели эксперимента упомянутый показатель превосходил контрольные значения уже в три раза и составлял 3,1 (2,5; 4,1) мг (p = 0,003). Через 3 недели экскреция белка с мочой стабилизировалась и составляла 3,2 (2,2 3,4) мг (p = 0,032). Примечательно, что такая же динамика соответствовала выше отмеченным изменениям экскреции МК с мочой.
Факт развившегося уратного нефролитиаза подтвердился характером изменений активности в моче ряда ферментов, отражающих наличие почечного повреждения. Как видно из таблицы 4, активность ЛДГ была значительно повышена на протяжении всего опыта, достигнув максимальных показателей к концу 2-ой недели. Активность НАГ в моче повышалась по ходу эксперимента, достигнув статистически достоверного роста на 14 сутки наблюдения. Иная динамика характеризовала изменения активности в моче ГГТ – этот показатель несколько снижался, особенно на начальной стадии эксперимента.
Как видно из таблиц 5 и 6, в процессе моделирования уратного нефролитиаза происходили некоторые изменения показателей СРО. В почечной ткани (таблица 5) это было наиболее характерно для показателей антиоксидантных ферментов КАТ и ГПО. Так, активность КАТ на 7 сутки эксперимента снижалась на 71%, а ГПО – на 37% по сравнению с аналогичными значениями контрольной группы. В этот период времени также фиксировалась тенденция к снижению активности СОД на 21%, однако этот показатель статистической достоверности не достигал. Зарегистрированное уменьшение активности антиоксидантных ферментов закономерно обеспечивало выраженное снижение ОАА более чем в два раза по сравнению с показателем контрольной группы. Аналогичная динамика в этот период времени была характерна и для показателя ОПА: на 7-е сутки эксперимента она была снижена в 1,4 раза. Концентрация ВГ в почках в конце первой недели по сравнению с показателями контрольной группы была выше на 32%. Уровень ТБРП в почечной ткани существенно не изменялся.
В целом сходная направленность изменений фиксировалась в этот период и в крови. Как видно из таблицы 6, в конце первой недели эксперимента обращает на себя внимание снижение активности ГПО и СОД в 1,3 и 1,7 раз соответственно по сравнению с таковыми показателями у контрольных животных. Активность КАТ также имела тенденцию к снижению. Существенное угнетение активности СОД и ГПО в эритроцитах крыс обеспечивало снижение ОАА по сравнению с контрольной группой на 21%. Уровень ВГ в эритроцитах на 7-е сутки эксперимента снижался в два раза. ОПА и концентрация ТБРП в этот период времени достоверно не изменялись.
С течением заболевания показатели СРО в крови крыс существенно изменялись. Как видно из таблицы 6, концентрация ТБРП в плазме постепенно нарастала: на 14-е сутки этот показатель установился на уровне контрольных значений, а к 21-м суткам превосходил их более чем в 2 раза. Показатель ОПА на второй неделе эксперимента имел тенденцию к увеличению, а на 21 сутки достигал контрольных значений, при этом статистической достоверности на протяжении всего эксперимента он не достигал. На этом фоне происходила активация СОД. Так, в конце второй недели эксперимента активность СОД была еще существенно сниженной, но затем динамика показателя коренным образом изменилась, был зарегистрирован значительный рост, и к 21-у дню он уже на 36% превосходил контрольные значения. Активность ГПО и КАТ с течением эксперимента не изменялись. Цифры ОАА на 14 сутки устанавливались на уровне, близком к контрольному, однако на 21 сутки эксперимента данный показатель значительно уменьшался.
Режим «лечение»
На рисунке 18 представлено влияние длительного введения дапаглифлозина на содержание МК в плазме крыс. Из рисунка следует, что введение препарата к окончанию периода наблюдения приводило к значительному снижению концентрации урата в плазме животных по сравнению с контрольными значениями: контрольная группа 1,3 (1,1; 1,8) мг/дл, группа «Профилактика» – 0,8 (0,7; 1,0) мг/дл (p = 0,006). Как видно из рисунка 19, уменьшение концентрации МК в плазме повлекло за собой выраженное падение ее экскреции с мочой: контрольная группа 31,5 (24,5; 33,6) мг, группа «Профилактика» – 14,6 (9,1; 21,1) мг (p = 0,004).
Учитывая важность изменения pH в патогенезе уратного нефролитиаза, необходимо отметить, что применение дапаглифлозина в профилактическом режиме, как следует из таблицы 10, привело к некоторому сдвигу этого показателя в кислую сторону по сравнению с контрольными значениями на 10%.
В экспериментальной группе имелась тенденция к увеличению СКФ по сравнению с показателями контрольной группы (на 25%). Свидетельством благоприятного влияния дапаглифлозина на состояние почечного эпителия явилось представленное в таблице 10 существенное снижение уровня ЛДГ в моче крыс в группе «Профилактика» более чем в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Активность ГГТ и НАГ в моче существенно не изменялись.
При оценке СРО в крови опытных животных обращает на себя внимание уменьшение на 40% показателя ОПА плазмы в экспериментальной группе по сравнению с контрольными значениями (таблица 11). Кроме того, на 21-е сутки эксперимента фиксировался статистически достоверный рост концентрации ВГ в крови. На этом фоне концентрация ТБРП, ОАА и активность антиоксидантных ферментов в группе животных, получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, не отличалась от контрольных значений.
При анализе показателей СРО в почках, которые отражены в таблице 12, обращает на себя внимание тенденция к увеличению ОАА и концентрации ВГ, а также к снижению ОПА в группе «Профилактика» по сравнению с группой контроля. Концентрация ТБРП в почечной ткани и активность антиоксидантных ферментов у животных, длительно получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, статистически достоверно не изменялись.
Из рисунка 20 видно, что по сравнению с контрольной группой у опытных животных наблюдается значительное уменьшение числа мочекислых камней. Если в контрольной группе количество микролитов в просвете почечных канальцев составило 19,0 (11,8; 29,0), то в группе «Профилактика» этот показатель снизился более чем в 7 раз, составив 2,5 (0,0; 8,0), p = 0,003.
Примечание – Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком ( ) отмечены достоверные изменения (p 0,05) в сравнении с контрольной группой.
Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента Таблица 10 – Динамика биохимических показателей при длительном введении дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом в профилактическом и лечебном режимах
Как видно из рисунка 21, введение дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом в лечебном режиме к 21-м суткам вызывает значительное снижение концентрации МК в плазме крови экспериментальных животных по сравнению с контрольными показателями: контрольная группа 1,3 (1,1; 1,8) мг/дл, группа «Лечение» – 0,7 (0,6; 0,8) мг/дл (p = 0,005). Как и ожидалось, это повлекло за собой выраженное уменьшение экскреции МК с мочой в группе животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме до 8,2 (5,0; 13,0) мг по сравнению с контрольной группой, в которой этот показатель составлял 31,5 (24,5; 33,6) мг (p 0,001) (рисунок 22).
Из таблицы 10 видно, что, как и в группе «Профилактика», у животных с экспериментальным уратным нефролитиазом, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, наблюдался сдвиг pH мочи в кислую сторону на 13% по сравнению с показателем контрольной группы.
Однако, несмотря на это, аналогично профилактическому режиму в условиях введения животным дапаглифлозина в лечебном режиме были зафиксированы явные признаки облегчения течения уратного нефролитиаза. Как следует из той же таблицы, в группе «Лечение» имелась тенденция к увеличению скорости клубочковой фильтрации по сравнению с показателями контрольной группы. О благоприятном эффекте дапаглифлозина на состояние почечного эпителия также косвенно свидетельствует значительное снижение уровня ЛДГ в моче крыс в группе «Лечение» в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Активность ГГТ и НАГ в моче, также как и в группе «Профилактика», существенно не изменялись.
Изучение влияния дапаглифлозина на процессы СРО в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом (таблица 11) показало, что у животных, получавших препарат в лечебном режиме, к 21-у дню эксперимента происходило значительное снижение ОПА по сравнению с группой контроля в 1,4 раза. Кроме того, из той же таблицы видно, что в экспериментальной группе на этом фоне имело место повышение концентрации ВГ. Однако прочие показатели СРО в крови у животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, статистически достоверно не изменялись.
По-видимому, снижение ОПА и увеличение концентрации ВГ в плазме явились следствием повышения ОАА в почечной ткани, которая достигла статистической достоверности в группе «Лечение» (см. таблицу 12). Интересно, что на этом фоне отмечалось значительное повышение концентрации ВГ в почках без выраженного изменения активности антиоксидантных ферментов.
Как видно из рисунка 23, у животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, по сравнению с контрольной группой наблюдалось наиболее выраженное уменьшение числа мочекислых камней. Если в контрольной группе морфометрический показатель количества микролитов в просвете почечных канальцев равнялся 19,0 (11,8; 29,0), то в группе «Лечение» их количество значительно уменьшилось и составило 0,0 (0,0; 1,5), p 0,001.