Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Патофизиология, экспериментальные модели и лечение заболеваний верхних дыхательных путей (литературный обзор) 11
1.1. Классификация, эпидемиология, описание заболеваний верхних дыхательных путей 11
1.2. Патофизиология воспаления верхних дыхательных путей 15
1.3. Экспериментальные модели заболеваний верхних дыхательных путей 24
1.4. Лечение заболеваний верхних дыхательных путей 30
Глава 2. Методы исследования 40
2.1. Исследуемые препараты 40
2.2. Тест-система 51
2.3. Оборудование 55
2.4. Реагенты 55
2.5. Провоспалительные агенты 56
2.6. Разработка и валидация экспериментальной модели острого шейного лимфаденита 58
2.7. Оценка эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита 63
2.8. Разработка и валидация экспериментальной модели острого риносинусита 65
2.9. Оценка эффективности препарата фрешнос в сравнении с виброцилом и аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита 72
2.10. Манипуляции с животными 73
2.11. Методы биохимического анализа 73
2.12. Методы гематологического анализа з
2.13. Патофизиологическиие методы исследования 75
2.14. Методы патоморфологического анализа 75
2.15. Статистическая обработка данных 77
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 79
3.1. Результаты разработки и валидации новой модели экспериментального острого шейного лимфаденита 79
3.2. Результаты изучения специфической фармакологической активности клс-04 в сравнении с тантум вер де, диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита 99
3.3. Результаты разработки и валидации новой модели экспериментального острого риносинусита 112
3.4. Результаты изучения специфической фармакологической активности препарата фрешнос в сравнении с вибронилом и аквамарисом на модели экспериментального острого риносинусита 122
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 133
Заключение 148
Выводы 150
Практические рекомендации 152
Список литературы 153
- Экспериментальные модели заболеваний верхних дыхательных путей
- Оценка эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита
- Оценка эффективности препарата фрешнос в сравнении с виброцилом и аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита
- Результаты разработки и валидации новой модели экспериментального острого риносинусита
Экспериментальные модели заболеваний верхних дыхательных путей
Таким образом, в развитии риносинусита наиболее важными факторами являются воспаление и отек слизистой носа и синусов, нарушение их аэрации и дренирования, бактериальная инфекция. Начальная назофарингеальная инфекция может распространяться на смежные структуры, в результате чего могут развиться синусит, средний отит, эпиглотит, ларингит, бронхит и пневмония (Дюран М. и соавт., 2002).
Важную роль в лечении риносинуситов играет антибактериальная терапия. Синусит занимает пятое место среди заболеваний по частоте назначения антибиотиков. Эффективность лечения во многом зависит от правильного выбора и назначения антибактериального препарата. К сожалению, во многих случаях антибактериальная терапия проводится нерационально, что приводит к хронизации заболеваний и развитию резистентности микроорганизмов (Young J. et al.,2008; Петрова Л.Г., 2012).
В настоящее время идет активный поиск новых препаратов, которые позволили бы интенсифицировать лечебный процесс и уменьшить воспалительную реакцию со снижением гнойного воспаления и глубоких повреждений в виде язвенно-некротических дефектов, уменьшить количество осложнений, а также препятствовать переходу заболевания в хроническую форму. Таким образом, развитие и внедрение новых лекарственных препаратов остается актуальной задачей современной фармакологии. Острый тонзиллит (ангина) - это острое воспаление, которое поражает небные миндалины (в большинстве случаев), язычную миндалину, глоточную миндалину, боковые валики или гортань. Чаще всего ангиной болеют дети и взрослые до 35-40 лет. Возбудителями ангины являются такие микроорганизмы, как стафилококки, стрептококки, грибки рода Candida и т.д. Предрасполагающими факторами к развитию ангины относятся переохлаждение, перегревание, снижение иммунитета, задымленность и запыленность воздуха, механические повреждения миндалин. Инфицирование при ангине может происходить двумя путями: экзогенным (в большинстве случаев) и эндогенным. Экзогенное инфицирование происходит воздушно-капельным и алиментарным путем, эндогенное инфицирование - вследствие наличия в полости рта или носоглотки очага воспаления (кариес, болезни десен, хронический тонзиллит и т.д.). Различают четыре разновидности ангины: катаральную, фолликулярную, лакунарную и флегмозную (Челенкова И.Н. и соавт., 2010).
Любая из форм ангины может привести к таким осложнениям, как острый отит, отек гортани, острый ларингит, флегмона шеи, острый шейный лимфаденит, окологлоточный абсцесс. Диагностируют ангину посредством анамнеза, фарингоскопии и лабораторных исследований (бактериологических, цитологических и т.д.). Больных ангиной необходимо по мере возможностей оградить от контактов с другими людьми (особенно детьми), так как данное заболевание относится к разряду острых инфекционных. Лечат ангину, как правило, на дому. В качестве лечения используют антибиотики, местные противомикробные препараты, жаропонижающие и общеукрепляющие средства.
Дыхательная функция носа это транспорт вдыхаемого и выдыхаемого воздуха. Проходя через полость носа, воздушный поток испытывает сопротивление со стороны внутриносовых структур. Приблизительно две трети всего сопротивления приходится на область самого узкого места верхних дыхательных путей, располагающегося на уровне переднего конца нижней носовой раковины -носового клапана, оставшаяся одна треть - на подвижную часть преддверия носа (Морозова СВ., Митюк A.M., 2011; Гуров А.В., Мужичкова А.В., 2014).
Степень носового сопротивления воздушному потоку обусловлена различными факторами. В первую очередь носовая резистентность зависит от сосудов нижних носовых раковин. Застой крови в пещеристых венозных сплетениях приводит к набуханию раковин, которые увеличиваются в размерах, что приводит к сужению просвета носового клапана, вплоть до полной обструкции полости носа. На резистентность носа могут повлиять различные внешние факторы и патологические процессы слизистой полости носа: воспаление, аллергические реакции, гипервентиляция, вдыхание холодного воздуха и др. Резистеность носа зависит от положения тела в пространстве - повышается в положении лежа. При применении сосудосуживающих препаратов, физической нагрузке, атрофических процессах в полости носа - снижается (Морозова СВ., Митюк A.M., 2011).
Воздушный поток, проходящий через обе половины носа, неравномерен. Чаще всего у человека наблюдается цикличность изменений резистентности носа воздушному потоку, проходящему через левую и правую половины носа, при этом суммарное сопротивление остается постоянным. В слизистой оболочке полости носа находится кавернозная венозная ткань, состоянием которой регулируется прохождение воздушного потока через полость носа. При увеличении размеров кавернозной ткани возникает сужение просвета носовых ходов и сопротивление потоку воздуха повышается. Описанный процесс носит название носового цикла (Лопатин А.С, 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006).
Носовой цикл - циклические изменения степени набухания слизистой оболочки полости носа. Длительность носового цикла составляет в среднем от 1 до 6 часов. Классический носовой цикл состоит из фазы вазоконстрикции (рабочей) и фазы вазодилатации (отдыха). При условии, если перегородка носа не имеет выраженной деформации и находится по средней линии, изменение резистентности воздушного потока является строго периодичным. В противном случае происходит нарушение циклических изменений резистентности, что может привести к развитию хронического ринита. Таким образом, формирование половин полости носа, то есть парного органа является основной физиологической функцией перегородки (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006.).
Слизистая оболочка носа с момента рождения постоянно подвергается воздействию различных факторов: инфекционных, химических, физических (температура, влажность, газы и др.). В полости носа происходит увлажнение, согревание и очищение вдыхаемого воздуха от бактерий, вирусов, грибковых спор и взвешенных частиц. Таким образом выполняется одна из важнейших функций полости носа - защитная (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006.).
Мукоцилиарный клиренс (от англ. clearance - очищение) - выведение ринобронхиального секрета, которое обусловлено колебательными движениями ресничек однослойного многорядного мерцательного эпителия слизистой оболочки (Морозова СВ., Митюк A.M., 2011).
Мукоцилиарный транспорт - один из основных механизмов системы местной защиты, обеспечивающий санацию дыхательных путей, необходимый потенциал барьерной, иммунной и очистительной функции дыхательного тракта. Очищение дыхательных путей от чужеродных частиц, бактерий, химических веществ происходит благодаря оседанию их на слизистых оболочках и последующему выведению вместе со слизью (Лопатин А.С., 2010; Пискунов Г.З., Пискунов С.З., 2006.).
Оценка эффективности КЛС-04 в сравнении с тантум верде, диклофенаком и дексаметазоном на экспериментальной модели острого шейного лимфаденита
По активности примерно в 25 раз превосходит гидрокортизон. Максимальный эффект при однократном пероральном приеме достигается через 1-2 ч. Дексаметазон хорошо абсорбируется в пищеварительном тракте, распределяясь в тканях организма. Объем распределения подобен у больных всех возрастных групп. Метаболизируется в печени. Максимальная концентрация Дексаметазона в ликворе определяется через 4 ч после в/в введения и составляет 15-20% от концентрации в плазме крови. Выделяется почками, незначительное количество выводится с желчью. Период полувыведения из плазмы - 3-5 ч. Около 80% Дексаметазона экскретируется с мочой в виде глюкуронида на протяжении 24 ч.
Показания к применению:
Эндокринные нарушения — острая недостаточность коры надпочечников; при подготовке к оперативному вмешательству или в случае тяжелой травмы/заболевания у пациентов с недостаточностью коры надпочечников или недостаточным адренокортикальным резервом.
Шок различной этиологии при неэффективности других методов лечения, анафилактический шок, шок у пациентов с недостаточностью коры надпочечников. Отек мозга при первичных опухолях головного мозга или метастазах в мозгу, при краниотомии или черепно-мозговых травмах. Системные заболевания соединительной ткани. Злокачественные заболевания - паллиативное лечение лейкозов и лимфомы у взрослых, острый лейкоз у детей, гиперкальциемия у пациентов со злокачественными опухолями. Заболевания крови - острые гемолитические анемии, агранулоцитоз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура у взрослых. Тяжелые инфекционные заболевания. Диагностический тест для выявления гиперфункции коры надпочечников. Обострение хронического обструктивного бронхита и бронхиальной астмы. Внутрисуставное введение применяется при тяжелых формах ревматоидного артрита с нарушением функции сустава и отсутствием эффекта от традиционной терапии, при других заболеваниях, сопровождающихся развитием синовита с накоплением выпота в полости сустава (препарат вводят после аспирации синовиальной жидкости).
Местное применение (введение в пораженный участок) показано при склеротическом фолликулите, кольцевидной гранулеме и саркоидозе кожи.
Субконъюнктивальное, ретробульбарное и парабульбарное введение показано при угрозе утраты зрения, аллергических заболеваниях, иммунодефиците, пролиферативных изменениях в глазной ямке, симпатическом офтальмите и терапии иммунодепрессантами после трансплантации роговицы.
Фармакологические свойства: Стерилизованная изотоническая морская вода способствует поддержанию нормального физиологического состояния слизистой оболочки полости носа. Препарат способствует разжижению слизи и нормализации ее выработки в бокаловидных клетках слизистой оболочки носовой полости. Микроэлементы, входящие в состав препарата, улучшают функцию мерцательного эпителия, оказывают противовоспалительное, очищающее, стимулирующее, восстановительное действие на слизистую оболочку полости носа. При аллергических и вазомоторных ринитах препарат способствует смыванию и удалению аллергенов и гаптенов со слизистой носа, уменьшению местного воспалительного процесса. Аквамарис, применяемый с гигиеническими целями, способствует очищению слизистой от осевшей на ней уличной и комнатной пыли. Показания: - острые и хронические воспалительные заболевания полости носа, придаточных пазух и носоглотки; - аденоиды; - послеоперационный период (после операций на полости носа); аллергические и вазомоторные риниты (особенно у лиц, предрасположенных или страдающих повышенной чувствительностью к лекарственным препаратам, в том числе у беременных женщин и в период лактации); - профилактика и лечение в составе комплексной терапии инфекций полости носа в осенне-зимний период (в том числе у беременных женщин и в период лактации); - сухость слизистой оболочки полости носа; сохранение физиологических характеристик слизистой оболочки полости носа в измененных микроклиматических условиях - у лиц, живущих и работающих в помещениях с кондиционированным воздухом и/или центральным отоплением; у людей, слизистая оболочка верхних дыхательных путей которых постоянно подвергается вредным воздействиям (курильщики, водители автотранспорта, люди, работающие в горячих и запыленных цехах, а также находящиеся в регионах с суровыми климатическими условиями).
Оценка эффективности препарата фрешнос в сравнении с виброцилом и аквамарисом на экспериментальной модели острого риносинусита
Через 120 часов было показано схожее распределение данного показателя для всех экспериментальных групп, при этом аналогично показателю разницы массы пораженного и интактного лимфатических узлов наблюдалась тенденция к снижению выраженности отека лимфатических узлов.
Учитывая, приведенные выше данные о наиболее выраженном воспалительном ответе у животных через 72 часа от момента введения провоспалительных агентов, для оценки гистологических изменений в ткани лимфатического узла при введении провоспалительных агентов были использованы лимфатические узлы от 5-ти животных из каждой экспериментальной группы, эвтаназированных через 72 часа от момента индукции воспаления.
Установлено, что в интактной группе животных поверхность лимфатических узлов была покрыта соединительнотканной капсулой. От капсулы внутрь узла отходили трабекулы, образованные соединительной тканью. Между капсулой, трабекулами и скоплениями лимфоидной ткани в лимфатических узлах располагались синусы, содержавшие небольшое количество макрофагов. Корковая зона состояла из первичных и вторичных фолликулов и паракортикальной зоны. Первичные фолликулы содержали непролиферирующие В-лимфоциты, вторичные - имели герминативные (светлые) центры размножения и состояли из пролиферировавших В-лимфоцитов, макрофагов. Количество вторичных фолликулов в лимфатических узлах было незначительным. Мозговая зона состояла из В-лимфоцитов и плазматических клеток, густо заполняющих эту часть лимфатических узлов. Гистиоцитов в синусах лимфатических узлов не наблюдалось (рисунок 20).
В лимфатических узлах группы, получавшей ЛПС, имела место картина острого неспецифического лимфаденита. Гистологическое строение оставалось сохраненным, наблюдалось увеличение фолликулов в корковом слое -гиперплазия и увеличение количества фолликулов с герминативными центрами размножения (рисунок 21). При этом площадь герминативных центров лимфатических узлов была статистически значимо увеличена почти в два раза по сравнению с интактной группой (таблица 19).
В синусах лимфатических узлов наблюдался умеренно выраженный и выраженный гистиоцитоз от 1 до 3 баллов (рисунок 21), что также имело статистически значимые отличия от интактной группы. В мозговой зоне лимфатических узлов наблюдалось увеличение количества плазматических клеток (плазматизация) (таблица 19).
В лимфатических узлах животных на фоне применения каррагенина имело место острое воспаление с картиной лимфаденита (рисунок 22), выраженное несколько в меньшей степени по сравнению с группой, получившей ЛПС однако статистически не отличавшееся от него (таблица 19).
В лимфатических узлах крыс, получивших формалин (рисунок 23), также наблюдалась картина острого неспецифического лимфаденита, что проявилось в гиперплазии лимфоидных фолликулов коркового слоя за счет вторичных фолликулов. Первичные фолликулы без светлых центров размножения были единичными. Площадь герминативных центров возрастала в пораженных лимфатических узлах. В синусах таких узлов наблюдался выраженный гистиоцитоз (2-4 балла). В мозговой зоне была выявлена выраженная плазматизация ткани. Рисунок 22 - Крыса самка, получившая Рисунок 23 - Крыса самка, получившая каррагенин. Пораженный лимфатический формалин. Пораженный лимфатический узел. Герминативные центры вторичных узел. Увеличенный герминативный центр лимфоидных фолликулов (стрелка). Окраска вторичного лимфоидного фолликула гематоксилином и эозином. Увеличение 100 (стрелка). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 100 Таблица 19 Площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов и гистиоцитоз синусов в пораженных лимфатических узлах шеи крыс через 72 часа от момента индукции патологии, М±т Группа Количествои пол животных Площадьгерминативныхцентров лимфоидныхфолликулов в пораженных ЛУ, мм2хЮ"3 ГистиоцитозсинусовпораженныхЛУ, баллы
Таким образом, гистологически подтверждено, что при экспериментальном моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс, получавших разные провоспалительные агенты, в регионарных лимфатических узлах развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая характеризовалась увеличением площади герминативных центров лимфоидных фолликулов в пораженных лимфатических узлах и увеличением выраженности гистиоцитоза синусов.
В ходе разработки экспериментальной модели острого шейного лимфаденита было установлено, что наиболее выраженный воспалительный ответ по гистологическим показателям был показан при введении в ткань лимфатического узла самок крыс раствора ЛПС в дозе 0,1 мг/кг и каррагенина в дозе 0,8 мг/кг.
Результаты разработки и валидации новой модели экспериментального острого риносинусита
Разработанная экспериментальная модель была валидирована по показателям правильность (точность) и сходимость. Модель воспроизводима вне зависимости от времени года по основным показателям экспериментальной патологии: уровень СРВ и лейкоцитов через 72 часа от момента индукции патологии, уровень TNF-a через 4 часа и INF-y через 16 часов, степень отека пораженных лимфатических узлов через 72 часа (разница массы пораженного и интактного лимфатических узлов и процент потери массы пораженного лимфатического узла при лиофильном высушивании), гистометрия герминативных центров лимфоидных фолликулов и степень гистиоцитоза пораженных лимфатических узлов. По результатам статистической обработки показателей экспериментальной патологии методом ANOVA было показано, что по всем исследованным показателям дисперсионный анализ не выявил статистически значимых отличий между серями экспериментов. Таким образом, можно утверждать, что при соблюдении стандартных условий содержания лабораторных животных фактор времени года не влияет на результаты исследования. эффективности нового препарата КЛС-04 был выполнен эксперимент на 100 крысах-самках линии Вистар. Было сформировано 10 экспериментальных групп по 10 животных в каждой группе.
В качестве препаратов сравнения были выбраны зарегистрированные на территории РФ препараты тантум верде, диклофенак и дексаметазон, обладающие выраженным противовоспалительным эффектом.
Для установления эффективной дозы препарата КЛС-04 он был изучен в широком диапазоне доз: 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг.
Путь введения для КЛС-04 и тантум верде - распыление на заднюю стенку глотки, аналогично пути применения в клинической практике. Для диклофенака и дексаметазона были выбраны пути введения, аналогичные клиническому применению - пероральный и внутримышечный, соответственно, при этом были использованы терапевтические дозы данных препаратов в пересчете на массу экспериментальных животных с учетом метаболических коэффициентов.
Исследуемый препарат и препараты сравнения вводили животным один раз в сутки, на протяжении 10-ти дней до индукции лимфаденита и 3 дня после.
Введение препаратов осуществляли с помощью специального шприца и зонда для эндотрахеального введения (IA-1C-M Penn-Century Inc., USA).
При оценке биохимических и гематологических показателей крови было показано снижение уровня TNF-a у экспериментальных животных через 4 часа от момента индукции патологии до значений интактных животных на фоне применения препаратов сравнения диклофенака и дексаметазона, что свидетельствует о наличии у данных препаратов выраженного противовоспалительного эффекта. При использовании препарата сравнения тантум верде наблюдалось снижение данного показателя в 2,3 раза по сравнению с контрольной группой, что также свидетельствует о наличии у данного препарата выраженного противовоспалительного эффекта, однако уровень интактных животных достигнут не был. На фоне применения исследуемого КЛС-04 была отмечена выраженная дозозависимость. В минимальной дозе противовоспалительного эффекта в отношении уровня TNF-a отмечено не было, в средних дозах снижение данного показателя составило 1,6 и 2 раза для доз 0,8 и 1,6 мг/кг, соответственно. В максимальных дозах КЛС-04 3,2 и 6,4 мг/кг противовоспалительный эффект был выражен максимально и превосходил препарат сравнения тантум верде.
В отношении показателя INF-y на фоне лечения терапевтический эффект был показан только для препаратов сравнения диклофенак и дексаметазон, где был достигнут уровень интактных животных. Также значительный терапевтический эффект был показан для исследуемого КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, уровень INF-y был статистически значимо снижен по сравнению с контрольной группой.
Статистически значимый эффект в отношении уровня СРВ наблюдался только на фоне применения КЛС-04 в максимальных дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, снижение уровня СРВ произошло до показателей интактных животных.
Через 72 часа от момента индукции патологии уровень лейкоцитов увеличился в контрольной группе в 2,8 раза по сравнению с интактными животными. На фоне лечения препаратом сравнения тантум верде данный показатель был снижен в 2 раза по сравнению с контролем. Также выраженный терапевтический эффект был показан для препарата сравнения дексаметазон, снижение уровня лейкоцитов произошло до значений интактных животных. При использовании в качестве лечения исследуемого КЛС-04 была показана дозозависимость и максимально выраженный терапевтический эффект, сопоставимый с препаратом сравнения при использовании максимальной дозы 6,4 мг/кг, при этом был достигнут уровень интактных животных.
На фоне лечения во всех экспериментальных группах было показано одинаковое статистически значимое снижение процента потери массы пораженного лимфатического узла по сравнению с контрольной группой (на 28-30%), что свидетельствует о наличии у всех исследуемых препаратов во всех дозах выраженного противоотечного действия, за исключением препарата сравнения дексаметазон для которого не удалось установить противоотечный эффект ввиду высокой смертности экспериментальных животных.
Гистологически установлено, что при экспериментальном моделировании острого шейного лимфаденита в группах крыс без лечения и получавших лечение препаратами КЛС-04 и тантум верде в регионарных лимфатических узлах развивалась картина острого неспецифического лимфаденита, которая характеризовалась изменениями лимфатических узлов с иммунным ответом по гуморальному типу. При этом максимальный положительный эффект наблюдался в группах животных, получавших КЛС-04 в дозах 1,6; 3,2 и 6,4 мг/кг, что проявлялось в основном в ингибировании пролиферации лимфоцитов, но не макрофагов и гистиоцитов.
В ходе данного эксперимента было показано, что наиболее выраженным дозозависимым противовоспалительным действием обладает КЛС-04 в дозах 3,2 и 6,4 мг/кг, что позволяет рекомендовать его для применения в терапии в качестве противовоспалительного средства.
Исследование биохимических процессов метаболизма жирных кислот в последнее десятилетие привело к открытию новых классов липидных медиаторов, структурно отличающихся от известных ранее простагландинов и лейкотриенов. К ним относятся резолвины, протектины и марезины (Ishizuka Т. et al., 2008; Serhan С. et al., 2011). Предшественники этих медиаторов образуются под действием ЦОГ и ЛОГ из ю-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), включая эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую. Главной биологической ролью этих медиаторов является участие в завершении острой фазы воспаления и переход в стадию разрешения (рисунок 42).