Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Проблемы антибактериальной терапии и возможные пути их решения (литературный обзор) 12
1.1. Проблема резистентности представителей условно-патогенной флоры, вызывающей нозокомиальные и внебольничные инфекции 12
1.2. Поиск новых лекарственных средств методом компьютерного прогнозирования 26
Глава 2. Материалы и методы 28
2.1. Объекты исследования 28
2.2. Штаммы микроорганизмов, использованные в исследовании, их идентификация и условия культивирования 28
2.3. Микробиологические методы 30
2.4. Животные, использованные в исследовании, условия содержания 31
2.5. Определение содержания веществ в крови животных при однократном введении 33
2.6. Модели, использованные для исследования активности соединений in vivo 33
2.7. Исследование острой токсичности 35
2.8. Исследование хронической токсичности 36
2.9. Исследование возможных механизмов действия 38
2.10. Статистические методы исследования 41
Глава 3. Исследование антибактериальной активности производных 1,3-диазинона -4 и их нециклических предшественников в отношении отдельных представителей родов бактерий (первичный скрининг) 42
3.1. Изучение чувствительности Staphylococcus aureus 42
3.2. Изучение чувствительности Streptococcus pyogenes 43
3.3. Изучение чувствительности Escherichia coli 44
3.4. Изучение чувствительности Pseudomonas aeruginosa 45
3.5. Изучение чувствительности Proteus mirabilis 46
3.6. Изучение чувствительности Klebsiella pneumоniaе 47
3.7. Резюме 49
Глава 4. Исследование антибактериальной активности соединений лидеров методом серийных разведений 50
4.1. Изучение активности соединений-лидеров в отношении Staphylococcus aureus 50
4.2. Изучение активности соединений-лидеров в отношении штаммов бактерий рода Streptococcus 57
4.3. Изучение активности соединений-лидеров в отношении штаммов Escherichia coli 62
4.4. Изучение активности соединений-лидеров в отношении Pseudomonas aeruginosa 67
4.5. Изучение активности соединений-лидеров в отношении бактерий рода Proteus 71
4.6. Изучение активности соединений-лидеров в отношении бактерий рода Klebsiella 76
4.7. Резюме 79
Глава 5. Изучение активности соединений лидеров на моделях in vivo 81
5.1. Исследование суточной кинетики соединений-лидеров в организме животных 81
5.2. Исследование активности соединений в отношении грамм-отрицательной флоры на примере модели экспериментального перитонита, вызванного Escherichia coli 82
5.3. Исследование активности соединений в отношении грамположительной флоры на примере модели экспериментального сепсиса, вызванного Staphylococcus aureus 84
5.4. Резюме 86
Глава 6. Исследование лекарственной безопасности соединений-лидеров 87
6.1. Исследование острой токсичности 87
6.2. Исследование хронической токсичности 87
6.3. Резюме 116
Глава 7. Исследование возможных механизмов действия соединений-лидеров 118
7.1. Изучение воздействия соединений-лидеров на показатели иммунитета крыс 118
7.2. Оценка влияния соединений-лидеров на показатели про- и антиоксидантной системы 120
7.3. Резюме 122
Глава 8. Обсуждение собственных результатов 123
Заключение 141
Выводы 143
Перечень сокращений и условных обозначений 145
Список литературы 146
- Проблема резистентности представителей условно-патогенной флоры, вызывающей нозокомиальные и внебольничные инфекции
- Изучение активности соединений-лидеров в отношении Staphylococcus aureus
- Исследование хронической токсичности
- Оценка влияния соединений-лидеров на показатели про- и антиоксидантной системы
Введение к работе
Актуальность темы
Проблема резистентности к противомикробным препаратам является на
сегодняшний день не прогнозом на будущее, а представляет собой серьёзнейшую
опасность уже в настоящее время, так как проявляется в каждом регионе мира и,
уже сейчас, угрожает здоровью каждого человека, независимо от возраста и места
проживания (ВОЗ, 2013; ВОЗ, 2014; Official Jornal of the European Union, 2004).
Появление микроорганизмов, устойчивых в отношении антибиотиков, широкое
распространение множественно устойчивых и панрезистентных штаммов
значительно снижают эффективность антибактериальной терапии (ВОЗ, 2013).
Бактерии различных видов, обладающие антибиотикоустойчивостью, являются
основными возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской
помощи. Их способность к эпидемиологическому распространению
обусловливает резкое повышение заболеваемости внутрибольничными
инфекциями и рост количества внутрибольничных вспышек инфекций (Агкацева С.А. И, 2001; Ирсимбетова Н., 2017; Sigman-Igra Y., 2002). Самая высокая распространенность отмечается в отделениях интенсивной терапии. Необычно высокая частота инфекций кровотока выявлена в хирургических отделениях (Брусина Е.Б., 2006; MsBean M., 2001; Solomkin J.S., 2003).
Несмотря на достижения в здравоохранении, проблема нозокомиальных инфекций остаётся одной из самых острых в современных условиях и приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость (Жукова Э.В., 2015; Зуева Л.П., 2004; Любимова А.В. , 2011; Рафальский В.В., 2008; Raymond D.P., 2003; , 2006; , 2010). По данным ряда исследователей, уровень смертности в группе госпитализированных и приобретших внутрибольничные инфекции в 8-10 раз превышает таковой среди больных, госпитализированных без внутрибольничных инфекций 2008; Amazian K. et al, 2010; et al., 2003).
Многолетние динамические наблюдения за рубежом и в России, в том
числе в рамках деятельности Межрегиональной ассоциации по клинической
микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), наглядно
свидетельствуют, что устойчивость микроорганизмов к антимикробным
лекарственным средствам становится всё более значимой и актуальной
проблемой здравоохранения, влияющей на эффективность проводимой терапии
больных с инфекциями бактериальной этиологии и профилактики
распространения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.
Степень разработанности темы
Признавая глобальность проблемы резистентности в мировом масштабе,
ряд государств, международных ведомств, различных организаций объединили
свои усилия в борьбе с данной проблемой, выработав единую стратегию борьбы с
антибиотикоустойчивостью (ВОЗ, 2014; Европейский региональный комитет,
2011; Кулмагамбетов И.Р. и др., 2017; Резолюция Всемирной ассамблеи
здравоохранения (WHA54.11), 2001; Резолюция Всемирной ассамблеи
здравоохранения (WHA58.27), 2005; Antibiotic use in eastern Europe: a cross-national
database study in coordination with the WHO Regional Office for Europe, 2014; Antimicrobial resistance. Global Report on surveillance, 2014; Европейский региональный комитет ВОЗ, 2011; Edited by: Dr. Bernardus Ganter, Dr. John Telling. – World Health Organization, 2011; Kanayama A. et al., 2015; Ministerial Conference Antibiotic Resistance: Joining Forces for Future Health» The Hague Netherlands. 2014; European Centrefor Disease Prevention and Control, Stockholm, 2009).
Несмотря на интенсивную деятельность по сдерживанию и контролю за антибиотикорезистентностью, принимаемые меры во всех шести регионах ВОЗ, проблема остаётся крайне актуальной. В связи с этим ВОЗ опубликовала список «приоритетных патогенов» (Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics: who publication, February, 2017), призванный стать ориентиром и стимулом для научных исследований и разработок в области создания новых антибактериальных препаратов.
На современном этапе использование различных компьютерных методов
поиска биологически активных соединений (БАС) и доступность ряда
программ, позволяет достоверно и целенаправленно решать сложные задачи
специалистам, создающим лекарственные вещества. Для этого используют
различные базы данных. Содержащиеся в них материалы позволяют выявить
перспективные соединения, учитывая строение активных лигандов,
фармакоформных фрагментов, а также структуры белковых мишеней (Кодониди И.П. и др., 2013, Оганесян Э.Т. и др., 2013; Stahura F.L. et al., 2004; Kiss R. Et al., 2008; Klebe, G, 2003).
Предварительный анализ фармакологических свойств, базирующийся на
современных представлениях о закономерностях взаимосвязи «структура-
активность» (Лазарева А.В. и др., 2015), новых производных 1,3-диазинона-4 и
их ациклических предшественников показал их возможную
антимикобактериальную, противолепрозную, а также выраженную
противопаразитарную активность. Учитывая, что в качестве биологических мишеней при конструировании соединений были выбраны ферменты дигидроптероатсинтетаза и дигидрофолатредуктаза, участвующие в процессах превращения ПАБК, а конкурентное ингибирование ПАБК лежит в основе механизмов действия многих антибактериальных препаратов (Хёльтье Х.-Д. и др., 2010), исследование активности данных соединений в отношении условно-патогенной флоры, вызывающей как нозокомиальные, так и внебольничные инфекции, представляется перспективным.
Цель исследования: изучить активность и безопасность новых
производных 1,3-диазинона-4 и их нециклических предшественников в
отношении представителей условно-патогенной флоры, вызывающих
нозокомиальные и внебольничные инфекции. Выявить перспективные соединения для создания эффективных противомикробных препаратов.
Задачи исследования:
1. Провести первичный скрининг соединений под лабораторными шифрами ПЯТd1, ПЯТs2, ПЯТs3, ПЯТs4, ПЯТs5, ПЯТs6, ПЯТs7, ПЯТd8, ПЯТd9, ПЯТd10, ПЯТd11, ПЯТd12, ЯТd13, ПЯТd14, ПЯТd15 в отношении St. aureus, St. pyogenes, E. coli, Ps. aueroginosa, P. mirabilis, P. vulgaris, K.
рneumonia. Выявить активные соединения.
-
Исследовать действие активных соединений методом серийных разведений в отношении коллекционных штаммов бактерий и изолятов, выделенных от больных. Определить соединения-лидеры.
-
Исследовать активность соединений лидеров in vivo на модели экспериментального сепсиса, вызванного St. aureus и экспериментального перитонита, вызванного E. coli.
-
Исследовать острую токсичность и лекарственную безопасность соединений-лидеров в условиях 30-дневного введения. Влияние на: динамику веса, массовые коэффициенты внутренних органов; показатели мочи; показатели периферической крови; биохимические показатели сыворотки крови; на психоэмоциональный статус и когнитивные функции в тесте «Открытое поле»; на гистоморфологические показатели внутренних органов крыс.
-
Изучить возможные механизмы действия соединений: воздействие на иммунную (реакция гиперчувствительности замедленного типа, реакция прямой гемагглютинации, фагоцитарная активность перитониальных макрофагов) и на антиоксидантную систему (определение каталазы и ТБК-активных продуктов в печени).
Научная новизна исследования
Впервые проведено исследование активности новых производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников в отношении ряда представителей условно-патогенной флоры: St. aureus, St. pyogenes, E. coli, Ps. aeruginosa, P. mirabilis, P. vulgaris, K. рneumoniae. Выявлены соединения, оказывающие бактериостатическое действие, перспективные для дальнейшей разработки. Впервые показана эффективность производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников при экспериментальном перитоните и экспериментальном сепсисе животных, проявляющаяся снижением симптомов интоксикации, летальности и эрадикации патогена. Исследованы возможные механизмы действия производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников: их воздействие на показатели иммунной и антиоксидантной системы. Исследована безопасность соединений-лидеров, показано, что они являются практически нетоксичными веществами.
Теоретическая и практическая значимость работы
Подтверждена актуальность компьютерного прогнозирования веществ с заданной биологической активностью. Среди новых производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников путём микробиологического скрининга in vitro выявлены соединения, обладающие активностью в отношении представителей условно-патогенной флоры, в том числе, резистентной к применяемым антибиотикам; подтверждена их активность in vivo на моделях экспериментального перитонита и сепсиса. Показана актуальность их дальнейшей разработки как перспективных для создания новых антибактериальных препаратов.
Методология и методы диссертационного исследования
Методология настоящего исследования спланирована согласно
поставленной цели. Анализ научной литературы, посвященной проблеме,
проведен на основе формально-логических методов исследования.
Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. При выполнении работы использовали микробиологические, экспериментальные, клинические, химические и статистические методы исследования.
Объектами исследования являлись новые производные 1,3-диазинона-4 и их ациклические предшественники, синтезированные на основе компьютерного прогнозирования.
Предмет исследования: активность новых производных 1,3-диазинона-4 и их ациклических предшественников под лабораторными шифрами ПЯТd1, ПЯТs2, ПЯТs3, ПЯТs4, ПЯТs5, ПЯТs6 ПЯТs7, ПЯТd8, ПЯТd9, ПЯТd10, ПЯТd11, ПЯТd12, ПЯТd13, ПЯТd14, ПЯТd15 в отношении представителей условно-патогенной флоры St. aureus, St. viridans, St. pyogenes, St. agalactiae, E. coli, Ps. aeruginosa, P. mirabilis, P. vulgaris, K. рneumoniae, в том числе, резистентных, к применяемым в лечебной практике, антибиотикам.
Положения, выносимые на защиту
1. Микробиологический скрининг новых производных 1,3-диазинона-4 и
их ациклических предшественников под лабораторными шифрами ПЯТd1,
ПЯТs2, ПЯТs3, ПЯТs4, ПЯТs5, ПЯТs6 ПЯТs7, ПЯТd8, ПЯТd9, ПЯТd10,
ПЯТd11, ПЯТd12, ПЯТd13, ПЯТd14, ПЯТd15 позволил выявить соединения,
подавляющие рост St. aureus, St. viridans, St. pyogenes, St. agalactiae, E. coli, Ps.
aeruginosa, P. mirabilis, P. vulgaris, K. рneumoniae, в том числе, резистентных к
применяемым в лечебной практике, антибиотикам, в концентрациях,
отвечающих требованиям, предъявляемым к антибактериальным препаратам.
2. Cоединения-лидеры в условиях in vivo проявляют
химиотерапевтическую эффективность, подтверждающуюся выживаемостью,
улучшением клинической картины, положительной динамикой освобождения
организма экспериментальных животных от возбудителя.
-
Соединения-лидеры в условиях 30-и дневного введения в дозе 50 мг/кг не оказывают токсического влияния на организм животных.
-
Соединения-лидеры обладают комплексом механизмов и действуют не только на бактериальную клетку путём конкурентного ингибирования ПАБК, но и влияют на организм в целом, стимулируя иммунитет, особенно клеточное звено, и ингибируя процессы пероксидации.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов базируется на использовании достаточного количества экспериментального материала, обеспечивающего репрезентативность выборок, статистическая обработка которых проведена посредством программы «BioStat-2009» (Analist Soft Ins., США).
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ХХ Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития науки и технологий», г. Белгород, 2016; Международной научно-практической конференции, посвященной 120-летию Астраханского клинического лепрозория, г.Астрахань, 2016; Международной научно-
практической конференции «Наука сегодня: теоретические и практические основы», 2016, г. Вологда; Научно-практической конференция с международным участием: «Фармацевтические науки: от теории к практике», г.Астрахань, 2016; Международной научной конференции «Научный диалог: Вопросы медицины» Санкт-Петербург, 2017; IX Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с международным участием, Москва, 2017; III Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты экспериментальной и клинической фармакологии: от молекулы к лекарству». Пятигорск, 2017; заседаниях учёного совета ФГБУ «Научно-исследовательского института по изучению лепры» Минздрава России, заседаниях кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии ПМФИ-филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский медицинский университет» Минздрава России.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, 5 из них в журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора
Диссертант самостоятельно провел информационный поиск, анализ источников литературы, как российских, так и зарубежных. Принимал непосредственное участие в планировании и выполнении экспериментов при исследовании лекарственной безопасности соединений. При исследовании антибактериальной активности веществ познакомился и изучил методы микробиологического скрининга, методы исследования специфической активности соединений на моделях in vivo. Самостоятельно выполнил оформление первичной документации, статистическую обработку результатов, проанализировал и интерпретировал полученные данные.
Объем и структура работы
Диссертация выполнена на 178 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов. Работа иллюстрирована 65 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 280 источников: 153 отечественных и 127 зарубежных.
Проблема резистентности представителей условно-патогенной флоры, вызывающей нозокомиальные и внебольничные инфекции
Проблема резистентности к противомикробным препаратам является на сегодняшний день не прогнозом на будущее, а представляет собой серьёзнейшую опасность уже в настоящее время, так как проявляется в каждом регионе мира и, уже сейчас, угрожает здоровью каждого человека, независимо от возраста и места проживания. Появление микроорганизмов, устойчивых в отношении антибиотиков, широкое распространение множественноустойчивых и панрезистентных штаммов значительно снижают эффективность антибактериальной терапии [24, 136, 166, 187]. Бактерии различных видов, обладающие антибиотикоустойчивостью, являются основными возбудителями инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Их способность к эпидемиологическому распространению обусловливает резкое повышение заболеваемости внутрибольничными инфекциями и рост количества внутрибольничных вспышек инфекций [3, 51, 254]. Самая высокая распространенность отмечается в отделениях интенсивной терапии. Необычайно высокая частота инфекций кровотока выявлена в хирургических отделениях [19, 144, 233, 262].
Несмотря на достижения в здравоохранении, проблема нозокомиальных инфекций остаётся одной из самых острых в современных условиях и приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость [39, 74, 143, 149, 213, 240, 249]. По данным ряда исследователей, уровень смертности в группе госпитализированных и приобретших внутрибольничные инфекции в 8-10 раз превышает таковой среди госпитализированных без внутрибольничных инфекций [154, 238, 239].
На протяжении, как минимум, пятнадцати последних лет в структуре нозокомиальных инфекций в различных странах мира лидирующее положение занимают грамотрицательные возбудители [202]. О росте частоты инфекций у пациентов ОРИТ, вызываемых E.сoli свидетельствует ряд исследований [38, 106, 210]. Результаты многоцентрового проспективного исследования OASIS в 20 микробиологических лабораториях Италии в период 2007-2008г.г. выявили преобладание данных патогенов как возбудителей инфекции кровотока: всего 47,4%, из которых 21,7% составили E.сoli и 7% P. aeruginosa [243, 245]. В Германии проанализированы около 5000 возбудителей, выделенных из крови и мочи, раневого отделяемого и эндотрахеальной трубки пациентов в одной из университетских клиник. Выявлено возрастание этиологической значимости E.сoli [168]. Многоцентровые исследования проводимые в Корее в 2006-2007г.г. показали, что причиной возникновения инфекций кровотока, возникших во внебольничных условиях, является в 47% случаев E.сoli. Исследования, проводимые в Средиземноморском регионе в 27 многопрофильных стационарах, показали высокий удельный вес E.сoli, P. aeruginosa, K. pneumoniae [248].
Escherichia coli является привычным обитателем кишечника здорового человека. Однако существуют высокоадаптированные клоны, приобретшие вирулентность. Факторы вирулентности позволяют хорошо приспосабливаться к другим условиям и вызывать широкий спектр заболеваний [152]. Это инфекции мочевыводящих путей, интраабдоминальные инфекции, пневмонии, инфекции в области хирургических вмешательств, менингиты, катетер-ассоциированные инфекции, остеомиелит, инфекции кожи и мягких тканей [5, 22, 31, 206, 263]. При этом инфекции любой локализации могут сопровождаться бактериемией и сепсисом [93, 162, 196, 208, 237, 242, 250, 254, 255].
Более 55% штаммов E.сoli, выделенных в 2002-2004 г.г. в 22-х городах России у пациентов стационаров, являлись нечувствительными к пиперациллину, тикарциллину/клавулану, амоксициллину/клавулану. До 33% штаммов были резистентны к цефалоспоринам, около 16% - к цифоперазону/сульбактаму и пиперациллину/тазобактаму. Анализ чувствительности выделенных микроорганизмов к аминогликозидам показал высокую резистентность к гентамицину (до 53,9%). Более активным из данной группы антибиотиков был амикацин, к которому были нечувствительны не более 20% бактерий. Невысокая активность отмечалась у фторхинолонов. До половины выделенных штаммов проявляли резистентность к ципрофлоксацину, левофлоксацину, моксифлоксацину. Максимальная активность отмечалась у карбапинемов [137, 145]. В период с 2006-2008 г.г. в результате проводимых исследований в 26 городах в стационарах России установлено, что резистентность к пенициллинам повысилась (более 79%), резистентность к цефалоспоринам также продолжала нарастать: с 33% до 70-76%. Сохранялась относительно высокая активность к цефоперазон/сульбактаму и пиперациллин/тазобактаму: к ним были нечувствительны не более 10%-30%. Уровень резистентности к аминогликозидам за данный период времени не изменился, к фторхинолонам резистентность возросла до 72%. Сохранялась чувствительность к карбопинемам [137, 145].
Среди исследованных штаммов было идентифицировано около 50% БЛРС-продуцентов в 2002-2004г.г. и до 77% - в 2006-2008г.г. Для них была характерна низкая чувствительность к цефалоспоринам III –IV поколения, фторхинолонам, тикарциллину/клаввуланату, амоксициллину/ клаввуланату, гентамицину, ко-тримоксазолу. Относительно высокой активностью против БЛРС-продуцентов обладали пиперациллин/тазобактам, цефаперазон/сульфбактам, наиболее высокая активность отмечалась у карбапенемов [14, 20, 106, 183, 212].
По данным зарубежных исследователей в этот же период времени продуценты БЛРС среди нозокомиальных штаммов E.сoli составляли в США не более 2-11%, а в странах Европы 1-8% [157, 273], в Азиатско-Тихоокеанском регионе и странах Латинской Америки распространённость была выше – 12 и 13,5% соответственно. Активность таких антибиотиков, как гентамицин, ципрофлоксацин левофлоксацин в этих странах была значительно выше, чем в России [165].
Испанскими исследователями установлено, что в случае инфекций кровотока, обусловленных E.сoli и K. pneumoniae, являющимися БЛРС, общий уровень смертности больных составлял более 50%. О значительной доли E.сoli в качестве возбудителя нозокомиальных инфекций свидетельствуют данные исследований, полученные в Израиле, Катаре, при этом отмечается большая доля множественнорезистентных БЛРС-продуцирующих штаммов [220, 239].
Антибиотикорезистентность, всегда считавшаяся проблемой лишь нозокомиальных инфекций, в настоящее время актуальна и для амбулаторных инфекций. Спектр возбудителей, как правило, представлен на 85-95% E.сoli [105, 119]. Мониторинг резистентности внебольничных штаммов показывает выраженную тенденцию к её росту. В США, как и в большинстве стран Европы, отмечается в отношении данного патогена низкий уровень активности аминопеницилилинов и ко-тримоксазола [161, 164, 227], фторхинолоны в большинстве случаев остаются активными. Такие же тенденции наблюдались в России [22, 123, 127, 128, 140, 150].
Наряду с E.сoli в развитии как нозокомиальных, так и внебольничных инфекций всё большее значение приобретают такие граммотрицательные патогены, как протеи, клебсиеллы, синегнойная палочка [22, 23]. Одним из основных микробных агентов, являющимся причиной возникновения инфекций в стационарах является K. pneumoniae: на её долю приходится до 9-14% случаев [23, 178, 250].
Развитие манифестных форм инфекций микроорганизмами рода Klebsiella обусловлены наличием ряда факторов патогенности, обеспечивающих адгезию к эпителию, способность подавлять фагоцитоз и вызывать токсические реакции [37, 113]. Бактерии рода Klebsiella вызывают от 5 до 45% всех внутрибольничных кишечных инфекций, 9-57% пневмоний, 6-86% бактериемий, 7-42% инфекций мочевыделительной системы, 5-12% инфекций при хирургических вмешательствах и в области ожогов [45, 93, 120, 155].
В разных странах сообщается о заражении в условиях стационара пациентов мутированными, резистентными к применяемым антибактериальным препаратам, штаммами K. pneumoniae. Особенно актуально такое явления при ослабленном иммунитете, при пересадке органов и химиотерапии [92, 155, 169, 202]. Известна роль Klebsiella в возникновении групповых внутрибольничных инфекциях в родильных домах [41, 256]. В период с 1981 по 2004г.г. при исследовании 14 вспышек в Свердловской области выявлено, что возбудителем являлась K. pneumoniae . Летальность составила более 10%. При 8 вспышках в отделении реанимации новорожденных в 37% случаев обнаружена определяющая роль Klebsiella, летальность в различные годы зафиксирована более, чем в 20% случаев [121].
Изучение активности соединений-лидеров в отношении Staphylococcus aureus
Исследование активности соединений лидеров в отношении микроорганизмов рода Staphylococcus были проведены на двух коллекционных штаммах: S. aureus 1899, St. aureus 8172 (ФГПУ «ГосНИИгенетика», г. Москва); S. aureus ВК 181, S. aureus ВК 186 (выделены из мокроты больных – ГБУЗ АО «Городская клиническая больница №3 им. С. М. Кирова, г. Астрахань); S. aureus NIIL tya 1, 2,3,4 (выделены из трофических язв больных лепрой – ФГБУ «НИИЛ», г.Астрахань); S. aureus SES 1(выделен из зева больного – СЭС, г.Астрахань) [4].
Штаммы, использованные в работе, предварительно исследовали на чувствительность к антибиотикам. Результаты представлены в таблице 7. Из таблицы видно, что семь из девяти штаммов, взятых для исследования, являются MRS – стафилококками, один – VRSA, другие два проявляют резистентность к 2-3 антибиотикам.
Анализ посевов штаммов S.aureus 1899 и S.aureus 8172 показал, что соединение под лабораторным шифром ПЯТs3 активно подавляет их рост в диапазоне концентраций 128 – 4 мкг/мл, при этом концентрация 8-4 мкг/мл является МПК50, концентрация 128 мкг/мл соответствует МПК93-МПК100, т.е. при данной дозе практически проявляет бактерицидные свойства. К соединению ПЯТs4 у данные штаммов также выявлена чувствительность, но в диапазонах концентраций 128 -16 мкг/мл, при действии соединения ПЯТs5 МПК50 соответствовала 32 мкг/мл, а при 128 мкг/мл насчитывали не более 8-10% КОЕ от контрольных показателей. Препараты сравнения для данной группы соединений действовали менее эффективно: сульфодиметоксин в диапазоне концентраций 128 – 16 мкг/мл подавлял рост не более 40 (128 мкг/мл) – 50% (16 мкг/мл) микроорганизмов, а при инкубации посевов со стрептоцидом концентрация 128 мкг/мл соответствовала МПК25 (таблица 8).
Группа соединений ПЯТd12, ПЯТd14, ПЯТd15 действовала несколько слабее: их МПК50 соответствовала диапазону концентраций 16 – 64 мкг/мл, а при концентрация 128 мкг/мл они ингибировали рост 89-75% бактерий. Препарат сравнения для данной группы веществ дапсон действовал несколько активнее: МПК50 достигалось при концентрации 8 мкг/мл, верхняя граница активности была идентичной активности соединений (таблица 8).
В отношении S. aureus ВК 181 и ВК 186, согласно данным, полученным при определении чувствительности, MRS- стафилококков, соединение ПЯТs3 было несколько менее активным: в диапазоне концентраций 128 – 64 мкг/мл наблюдали снижение интенсивности роста бактерий на 60 до 50% соответственно. Зона действия соединения ПЯТs4 была шире: концентрации 16-32 мкг/мл соответствовали МПК50, а 128 мг/мл – 70% - 100%. Диапазон действия ПЯТs5 был ещё шире: при идентичной эффективности высокой концентрации МПК50 достигалось при 2 мкг/мл. Препараты сравнения действовали либо идентично (сульфодиметоксин), либо менее активно (стрептоцид) (таблица 9).
Соединения ПЯТd12 и ПЯТd15 в отношении данных штаммов действовали в целом эффективнее: диапазон МПК50 снижался до 4-2 мкг/мл. Для соединения ПЯТd12 концентрация 128 мкг/мл соответствовала минимальной бактерицидной концентрации. Дапсон действовал также эффективно: МПК50 соответствовало 2 мкг/мл, но бактерицидного действия не проявлял (таблица 9).
В отношении S. аureus (NIIL1,2,3,4), выделенных из трофических язв больных лепрой, соединения показали высокую активность.
Для соединения ПЯТs3 уже при концентрации в среде 1 мкг/мл было характерно подавление роста микроорганизмов в сравнении с контролем на 50%. При концентрации 128 мкг/мл вещество действовало бактерицидно (таблица 10).
Активность соединений ПЯТs4 и ПЯТs5 выявлена в диапазоне концентраций 4мкг/мл - 128 мкг/мл и составляла МПК50 – МПК75-80 соответственно. МПК50 препаратов сравнения соответствовала 128 мкг/мл -64 мкг/мл, что было значительно менее эффективно.
Из соединений группы «d» наибольшую активность демонстрировало вещество ПЯТd12: оно подавляло на 50% рост популяции данных штаммов при стабильно низкой концентрации 8-4 мкг/мл, а при концентрации 128 мкг/мл - на 95%. Соединения ПЯТd14 и ПЯТd15 действовали менее эффективно: их МПК50 смещался на более высокие концентрации. Препарат сравнения дапсон действовал соответственно соединению ПЯТd12.
В отношении S. аureus SES1 высокую активность показало соединение ПЯТs3: при концентрации 128 мкг/мл оно действовало бактерицидно, рост 50% популяции бактерий подавляло уже при 2 мкг/мл. Для соединения ПЯТs5 МПК50 соответствовала 8 мкг/мг. При концентрации 128 мкг/мл отмечали на 75% уменьшение количества КОЕ (в сравнении с контролем). Соединение ПЯТs4 в отношении данного штамма действовало менее активно. Менее эффективно проявили себя и препараты сравнения сульфодиметоксин и стрептоцид.
У соединений группы «d» МПК50 была несколько выше, чем у ПЯТs3 и ПЯТs5 и составляла 16 мкг/мл – 8 мкг/мл, но активнее действовали более высокие концентрации: соединения под лабораторными шифрами ПЯТd12 и ПЯТd15d при 128 мкг/мл полностью подавляли рост бактерий.
Средние статистические показатели активности соединений представлены в таблице 6. Из таблицы следует, что соединения ПЯТs3, ПЯТs4, ПЯТs5, содержащие фрагмент сульфаниламидов, значительно активнее препаратов сравнения. МПК50 вещества ПЯТs3 в 1,5 - 2,0 раза ниже МПК50 веществ ПЯТs4 и ПЯТs5, однако эта разница не является статистически достоверной. Для половины исследованных штаммов, о чём свидетельствуют показатели медианы, МПК50 не превышает 16,0 мкг/мл. Учитывая показатели медианы, самым активным из соединений данной группы является ПЯТs3: у половины штаммов рост популяции на 50% подавлялся при концентрации вещества, не превышающей 2 мкг/мл.
Из соединений, имеющих в своём составе фрагмент дапсона самым активным являлось ПЯТ(І12. У соединений ПЯТ(І14 и ПЯТ(І15 МПК50 была статистически достоверно выше. Различия средних показателей МПК50 между веществом и дапсоном не имело статистических различий, но показатели медианы свидетельствовали о большей активности дапсона. Вещество ПЯТс112 не уступало по активности соединениям ГОШЗ, I13Ts4, ПЯТБ5 (таблица 12).
Таким образом, проведённые исследования показали, что новые производные 1,3-диазинона-4 и их нециклические предшественники обладают способностью подавлять рост Staphylococcus aureus, в том числе и митициллин-резистентных. Наиболее чувствительны исследованные штаммы по совокупным показателям к соединениям roiTs3, ПЯТ(И2 [4, 129].
Исследование хронической токсичности
Наблюдение за животными показало, что все крысы в течение 30-и дней эксперимента не меняли привычного поведения: заторможенности, пассивности, асинхронных движений не наблюдалось. Шкурка животных во всех группах оставалась без изъянов, была блестящей, гладкой. Реакция крыс на манипуляции экспериментаторов была адекватной [46, 52].
Вес крыс-самцов к завершению эксперимента, как в контрольной, так и во всех экспериментальных группах увеличился на 20% – 31%. Статистически достоверной разницы между показателями не наблюдалось (таблица 42).
Вес крыс-самок к концу эксперимента во всех группах также увеличился: в контрольной и группе, получавшей ПЯТd8, очень незначительно (таблица 42).
О функциональной нагрузке на организм можно судить по массовым коэффициентам внутренних органов. Как видно из таблицы большая часть из них у крыс-самцов оставалась сопоставимой с контрольными показателями. Под действием 30-и дневного курса соединения ПЯТd8 значимых изменений данных показателей не выявлено. При введении соединения ПЯТs4 и ПЯТd12 отмечается увеличение массового коэффициента сердца и левого надпочечника, в условиях применения ПЯТs3 наблюдали статистически достоверное, но по величине небольшое (на 6%) повышение массового коэффициента мозга.
У самок из статистически значимых изменений можно отметить увеличение массового коэффициента левой почки под действием соединения ГОГШ, что не сопровождалось изменением гистоморфологической структурой органа.
Таким образом, 30-и дневное введение соединений не приводит к патологической потери веса и значимым изменениям массовых коэффициентов внутренних органов животных, что свидетельствует об отсутствии токсического влияния соединений на организм [46, 52].
Показатели мочи позволяют получить информацию о степени токсической нагрузки не только на выделительную систему, но и на организм в целом, так как позволяют судить о состоянии сердечно-сосудистой системы, опосредовано оценить активность иммунной системы.
Результаты исследование мочи в условиях 30-и дневного введения соединений представлены в таблице 45.
Из таблиц видно, что удельный вес мочи как у самцов, так и у самок при длительном поступлении в организм соединений остаётся сопоставимым с контрольными показателями. Показатели кислотность мочи у животных обоего пола во всех группах также статистически достоверно не отличались от таковых в контроле, незначительный сдвиг в сторону кислой реакции можно отметить у крыс, получавших соединение ПЯТd8.
У отдельных крыс, как самцов, так и самок (контрольных и опытных) выявлено содержание незначительного количества лейкоцитов и следовое количество белка, в пределах физиологической нормы для данного вида животных.
Наличия в моче глюкозы, кетоновых тел, уробилина, билирубина, эритроцитов и других компонентов, свидетельствующих о функциональных нарушениях почек, сердечнососудистой, иммунной систем под действием вводимых веществ выявлено не было.
Таким образом, при исследовании мочи как у самок, так и у самцов не было выявлено отклонений в показателях, подтверждающих наличие токсичности вводимых соединений.
Результаты исследования показали, что введение соединений под шифрами ПЯТs4, ПЯТs3, ПЯТd8, ПЯТd12 в течение 30-и дней не приводит у крыс-самцов к существенным колебаниям показателей красной периферической крови: под действием соединений ПЯТs4 и ПЯТd12 отмечается незначительное, в пределах 10%, повышение количества эритроцитов и гемоглобина и, как следствие, показателей гематокрита (таблица 46). Из статистически достоверных отклонений можно отметить повышение коэффициента вариации эритроцитов при введении соединений ПЯТd12 и ПЯТs3, при сохранении среднего объёма эритроцита [94, 215].
У крыс-самок наблюдали статистически достоверное повышение количества эритроцитов, тромбоцитов и уровня гемоглобина при введении соединения под лабораторным шифром ПЯТs4. Изменения по величине были незначительны и не выходили за границы физиологической нормы. Под действием соединений ПЯТd1, ПЯТs2, ПЯТs3, ПЯТd8, ПЯТd12 изменения показателей красной крови относительно контроля не выявлено (таблица 47).
Под действием веществ ПЯТd1, ПЯТs2 показатели красной крови крыс обоего пола были сопоставимы с показателями в контрольной группе.
Анализ лейкограмм крыс-самцов показал, что введение соединения ПЯТs4 в течение 30 дней привело к статистически достоверному повышению в периферической крови крыс количества лейкоцитов. Абсолютное количество лимфоцитов и гранулоцитов было также значимо выше контрольных показателей, количество моноцитов оставалось сопоставимым с контролем. При этом относительное количество и лимфоцитов и гранулоцитов от контроля не отличалось, а процентное содержание моноцитов было статистически достоверно ниже (таблица 48). У самок под действием соединения ПЯТs4 также выявлено статистически значимое увеличение количества лейкоцитов и лимфоцитов, остальные показатели были сопоставимыми с контрольными (таблица 48).
При введении соединения ПЯТd12 у самцов также выявлено статистически достоверное повышение количества лейкоцитов и абсолютного содержания их фракций, относительное содержание составляющих лейкограммы соответствовало таковым у контрольных крыс (таблица 48), у самок изменений выявлено не было.
Под действием веществ под шифрами ПЯТs3 и ПЯТd8 у самцов отмечали статистически достоверное изменения относительного содержания моноцитов (снижение) и гранулоцитов (повышение), у самок изменений не наблюдали.
При введении соединений ПЯТd1 и ПЯТs2 показатели лейкопоэза, как у самцов, так и у самок, были сопоставимы с контрольными.
Таким образом, проведённое исследование показало, что 30-и дневное введение производных 1,3-диазинона-4 под лабораторными шифрами ПЯТd1, ПЯТs2, ПЯТs4, ПЯТs3, ПЯТd8, ПЯТd12 не оказывает деструктивного системного воздействия на параметры периферической крови крыс, что обусловливает перспективность их дальнейшего изучения [94, 215].
Оценка влияния соединений-лидеров на показатели про- и антиоксидантной системы
Результаты исследования активности каталазы в клетках печени крыс, как самцов, так и самок показали, что уровень активности данного фермента под действием 30-и дневного введения соединений в дозе 50 мг/кг не изменяется (таблица 64).
Результаты, полученные при исследовании процессов ПОЛ в тканях печени, свидетельствовали, что у самцов при 30-и дневном введении всех соединений, наблюдается снижение исходной концентрации МДА, в условиях ПЯТs2 и ПЯТd8 статистически достоверные.
Как видно из таблицы 65, в этих группах наблюдается снижение скорости ферментативного и аскорбатзависимого окисления. Под действием соединения ПЯТs3 у самцов выявлено незначительное снижение скорости ферментативного окисления.
У самок выявлены аналогичные тенденции в динамике показателей, значительно сильнее выраженные, чем у самцов.
Таким образом, введение соединений в дозе 50 мг/кг в течение 30-и дней оказывает влияние на процессы перекисного окисления липидов в гепатоцитах.
Результаты исследования свидетельствуют, что одним из возможных механизмов действия соединений под лабораторными шифрами ПЯТs2, ПЯТs3, ПЯТs4, ПЯТd1, ПЯТd8, ПЯТd12 является их влияние на иммуногенез. Особенно выражено их воздействие на показатели фагоцитоза и формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа иммунитета.
Исследование динамики показателей МДА в ткани печени мышей под действием изучаемых веществ, также свидетельствуют, что соединения способны оказывать ингибирующее влияние на процессы пероксидации.