Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1. Современные представления о регуляторных пептидах 11
1.1. Проникновение РП в клетку 14
1.2. Глипролины как самостоятельные регуляторные пептиды
1.2.1. Влияние глипролинов на органы и ткани 21
1.2.2. Влияние глипролинов на клеточные популяции 28
1.3. Роль аргинина в поддержании тканевого гомеостаза 30
2. Нарушение тканевого гомеостаза ЖКТ в условиях НПВП-гастроэнтеропатии 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Характеристика исследуемых веществ 37
2.2. Организация экспериментов 40
2.3. Подготовка биоматериала для гистологических исследований 41
2.4. Модель НПВП-гастроэнтеропатии 42
2.5. Метод авторадиографии 43
2.6. Модель оксидативного стресса в культуре пульмональных фибробластов 44
2.7. Метод хемилюминесценции 44
2.8. Метод морфометрии зон ядрышкового организатора (ЯОР) 46
2.9. Статистическая обработка результатов 47
Результаты исследования 48
Глава 3. Влияние глипролинов на синтез днк, площадь эрозивно-язвенных повреждений и процессы свободнорадикального окисления в клетках покровного эпителия жкт на модели нпвп-гастроэнтеропатии 48
3.1. Влияние глипролинов на площадь эрозивно-язвенных повреждений 48
3.2. Влияние глипролинов на тканевый гомеостаз покровного эпителия языка 53
3.3. Влияние глипролинов на тканевый гомеостаз покровного эпителия желудка 55
3.4. Влияние на тканевый гомеостаз покровного эпителия 12-перстной кишки 58
Резюме 59
ГЛАВА 4. Влияние глипролинов на ядрышковый организатор, процессы синтеза ДНК и свободнорадикального окисления вкультуре клеток пульмональных фибробластов новорождённых белых крыс 65
4.1. Влияние глипролинов на процессы синтеза ДНК в культуре клеток пульмональных фибробластов 65
4.2. Влияние глипролинов на ядрышковый организатор в культуре клеток пульмональных фибробластов 68
4.3. Влияние глипролинов на процессы свободнорадикального окисления в культуре клеток пульмональных фибробластов 71
Резюме 72
Обсуждение результатов исследования 77
Заключение 91
Выводы 92
Список литературы 94
- Глипролины как самостоятельные регуляторные пептиды
- Подготовка биоматериала для гистологических исследований
- Влияние глипролинов на тканевый гомеостаз покровного эпителия языка
- Влияние глипролинов на ядрышковый организатор в культуре клеток пульмональных фибробластов
Введение к работе
Актуальность темы. Пептидные последовательности рассматриваются как перспективные лекарственные препараты (Алексеев К.В. и соавт., 2011). Мировой рынок современных пептидных препаратов оценивается в сумму порядка 40 миллиардов долларов. За 2014 год общее число зарегистрированных в мире международных непатентованных наименований, согласно данным ВОЗ, составило около 8,5-9 тысяч (Витер В.И. и соавт., 2014), а пептидных препаратов - всего 40. Из них 12 разработаны в России (Н.В. Коробов и соавт., 2011).
Регуляторные пептиды (РП) являются особым классом биологически активных веществ (БАВ), содержащихся во всех тканях организма млекопитающих. Эти БАВ представляют интерес для фармакологии, так как обладают рядом преимуществ: высокая эффективность в низких концентрациях (10-9 и ниже), малое количество побочных эффектов, достаточные возможности для комбинаций аминокислот в молекуле (Хавинсон В.Х., Кветная Т.В., 2005; Лебедько О.А., Тимошин С.С., 2011; Craik D.J. et al., 2013; Каменский А.А. и соавт., 2015).
После открытия класса РП встал вопрос об их нестабильности в тканях и жидких средах организма (Ashmarin I.P. et al., 2005). В качестве стабилизатора пептидных структур был предложен трипептид глипролинового ряда Pro-Gly-Pro (PGP). Глипролины, как самостоятельные РП, обладают широким спектром биологической активности: влияют на процессы формирования иммунитета (Андреева Л.А. и соавт., 2011), обладают антистрессорной активностью (Копылова Г.Н. и соавт., 2007), проявляют гастропротективные эффекты на различных моделях язвообразования, угнетают желудочную секрецию кислоты у крыс (Г.Е. Самонина и др., 2008; Фалалеева Т.М. и соавт., 2010а,б,в).
Имеются сведения о разнонаправленных эффектах глипролинов: угнетение синтеза ДНК в культуре нормальных кератиноцитов человека (Yiwei M. et al., 2011; стимуляция синтеза ДНК в условиях экспериментальной ишемии (Ставчанский В.В. и соавт., 2011); увеличение выживаемость нервных клеток (Сторожевых Т.П. и соавт., 2007).
По данным Е.Ю. Животовой и соавт. (2011) -казоморфин-7, содержащий в своей структуре трипептид PGP, стимулирует синтез NO, проявляя гастропротективные свойства.
Перспективными, в отношении поиска новых кандидатов в препараты являются глипролины PGP и его аргининсодержащие аналоги RGP и PRPGP. Присутствие аргинина в структуре опиоидных пептидов - даларгине (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-OH) и седатине (Arg-Tyr-D-Ala-Phe-Gly-OH) является облигатным фактором для стимуляции синтеза ДНК, ослабления апоптоза и выраженности оксидативного стресса на моделях гастро- и энтеропатии (Болоняева Н.А. и соавт., 2005; Животова Е.Ю. и соавт., 2007, 2011; Флейшман
М.Ю. и соавт., 2009; Алексеенко С.А. и соавт., 2010). Впоследствии даларгин получил статус официнального препарата для лечения язвенных заболеваний ЖКТ, а седатин применяется в ветеринарии (Бочкарев А.В., 2001).
В доступной литературе не встречаются данные о том, каким образом пептиды семейства глипролинов PGP, RGP и PRPGP влияют на одно из звеньев патогенеза НПВП-гастроэнтеропатии («пролиферация - апоптоз») в экспериментальной модели НПВП-гастроэнтеропатия. Также отсутствуют сведения об активности изучаемых глипролинов в условиях оксидативного стресса в культуре пульмональных фибробластов новорожденных белых крыс.
Цель исследования
Изучить влияние глипролинов и их аргининсодержащих аналогов на состояние тканевого гомеостаза покровного эпителия ЖКТ и клеточной культуры пульмональных фибробластов в физиологических условиях и в условиях стресса.
Задачи исследования
1. Изучить влияние PGP и его аргининсодержащих аналогов на процессы
синтеза ДНК:
в покровном эпителии белых мышей в физиологических условиях;
в покровном эпителии белых мышей в условиях НПВП-гастроэнтеропатии;
в культуре клеток пульмональных фибробластов в физиологических условиях;
в культуре клеток пульмональных фибробластов в условиях оксидативного стресса;
-
Изучить влияние PGP и его аргининсодержащих аналогов на площадь эрозивно-язвенных повреждений в покровном эпителии белых мышей методом компьютерной морфометрии на модели НПВП-гастроэнтеропатии;
-
Оценить роль процессов свободнорадикального окисления в реализации цитогенетических эффектов PGP и его аргининсодержащих аналогов в покровном эпителии ЖКТ белых мышей и в культуре клеток пульмональных фибробластов новорожденных белых крыс.
Научная новизна работы
Впервые получены сведения о характере влияния глипролинов и их аргининсодержащих аналогов на процессы синтеза ДНК в нормальных условиях и при НПВП-гастроэнтеропатии в различных видах покровного эпителия ЖКТ; на активность зон ЯОР в нормальных условиях и при оксидативном стрессе; на процессы свободнорадикального окисления в эпителии ЖКТ и культуре клеток.
Получены данные, позволяющие рассматривать уменьшение окислительного стресса как основной механизм действия глипролинов.
Доказано, что введение пептида PGP ведет к уменьшению язвенных поражений, ослаблению оксидативного стресса, интенсификации процессов синтеза ДНК как у животных с НПВП-гастроэнтеропатией, так и на модели оксидативного стресса в культуре клеток.
Практическая значимость работы
Полученные результаты исследований раскрывают возможные
механизмы действия глипролина PGP; переносимость дозы пептидов PGP, RGP, PRPGP в 1 мг/кг.
Работа экспериментально обосновывает эффекты трипептида PGP (доза 1 мг/кг) в качестве кандидата для проведения трех клинических фаз исследований с возможностью регистрации как самостоятельного средства для лечения НПВП-гастроэнтеропатий. Применение пептидного препарата увеличит безопасность фармакотерапии, так как пептидные препараты – это естественные для организма аминокислоты, что позволит улучшить прогноз и качество жизни пациентов с НПВП-гастроэнтеропатией.
Положения, выносимые на защиту
-
Глипролин PGP (1 мг/кг) стимулирует синтез ДНК в покровных эпителиях языка, желудка и 12-перстной кишки в условиях НПВП-гастроэнтеропатии.
-
Аргининсодержащие олигопептиды RGP и PRPGP (1 мг/кг) оказывают разнонаправленное действие на показатели синтеза ДНК в покровных эпителиях языка, желудка и 12-перстной кишки в условиях НПВП-гастроэнтеропатии.
-
Глипролин PGP в концентрации 0,1 мг/л стимулирует показатели ядрышкового организатора (ЯОР) и синтез ДНК в первичной культуре пульмональных фибробластов новорожденных белых крыс на фоне оксидативного стресса.
-
Предварительное введение глипролина PGP (1 мг/кг) на модели НПВП-гастроэнтеропатии способствовало снижению площади язвенно-эрозивных повреждений СОЖ, в отличие от введения аргининсодержащих пептидов RGP и PRPGP (1 мг/кг).
-
Трипептид PGP в условиях патологии in vivo и in vitro способствовал снижению показателей оксидативного стресса, в отличие от аргининсодержащих олигопептидов RGP и PRPGP.
Степень достоверности
Все изложенные материалы, факты, положения и выводы
аргументированы, обоснованы и достоверны. Выводы диссертации вытекают из содержания работы. Основные положения исследования имеют научное и
практическое значение. Достоверность полученных результатов и выводов основывается на достаточном объеме выборки, использовании современных методов исследования, корректном анализе полученных данных, адекватной статистической обработке.
Апробация результатов исследования
Результаты работы представлены и обсуждены на: 71-ой, 72-ой Итоговых
научных региональных конференциях молодых учёных и студентов ДВГМУ с
международным участием «Актуальные вопросы современной медицины»
(Хабаровск, 2014, 2015); II и III Региональных конференциях с международным
участием «Актуальные вопросы экспериментальной биологии и медицины»
(Хабаровск, 2014, 2015); XVII и XVIII краевых конкурсах молодых учёных и
аспирантов в секции «Медицинские и биологические науки» (Хабаровск, 2015 –
II место, 2016 – II место); IX Международной научно-практической
конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные
исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2015);
XVII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых
ученых с международным участием «Актуальные проблемы
экспериментальной, профилактической и клинической медицины»
(Владивосток, 2016), международной конференции «III Japanese-Russian
International Conference on Socially Significant Human Diseases: Medical, Environmental and Technical Problems and these Solutions» (Obihiro - Japan, 2016), международной конференции «World Life Science Conference» (Beijing - China, 2016).
Публикации
Основные положения диссертационного исследования отражены в 18 печатных работах, из них, - 4 опубликованы, 2 приняты к печати в периодических изданиях, рекомендованных ВАК.
Внедрение в практику
Основные положения и выводы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии и клинической фармакологии ФГБОУ ВО ДВГМУ Минздрава России.
Личный вклад автора в разработку темы
Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России. Автором сформулированы цели и задачи диссертационного исследования. Все исследования выполнены автором самостоятельно, при консультативно-методической помощи сотрудников ЦНИЛ.
Автор лично проводил статистическую обработку и интерпретацию полученных данных; сформулировал основные выводы диссертационного исследования.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах, иллюстрирована 15 таблицами, 25 рисунками и включает в себя введение, литературный обзор, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, их обсуждение и выводы. Библиографический список включает в себя 294 источника, в том числе 70 зарубежных.
Глипролины как самостоятельные регуляторные пептиды
Важную роль в поддержании тканевого гомеостаза различные группы исследователей отводят аминокислоте аргинин (Fleishman M. Yu. et al., 2004; Болоняева Н.А. и соавт., 2005; Флейшман М.Ю. и соавт., 2009; Животова Е.Ю. и соавт., 2009, 2011а,б, 2012, 2013; Копыльчук Г.П., Бучковская И.М., 2014). Аргинин участвует в синтезе эндотелиального оксида азота. Оксид азота синтезируется путём присоединения NO-синтазой к атому азота гуанидиновой группы молекулярного кислорода, с одновременным синтезом другой аминокислоты – цитруллина (Сосунов А.А., 2000). Оксид азота является сигнальной структурой в сердечно-сосудистой системе (Sazonova E.N. et al., 2002; Yu J. et al., 2014; Lee D.L. et al., 2015; Meyer G. et al., 2015; Siman F.D. et al., 2015), один из факторов релаксации мышечных клеток сосудов (Андреева Л.А. и соавт., 2013б), стимулирует образование цитокинов, высвобождение гормонов поджелудочной железы и др. (Кишко Т.О. и соавт., 2008). По данным Глебова А.Н., Зинчука В.В. (2005) в формировании кислородтранспортной функции крови, возможно, участвует L-аргинин-NO система. Согласно исследованиям in vitro Жлоба А.А. и соавт., (2013) аргинин, наряду с лизином, может выделяться в больших количествах в процессе фибринолиза.
Исследователями отмечается широкий спектр терапевтического действия аргинина: гепатотропные, противомикробные, иммунотропные, психотропные свойства (Галкин Б.Н., 2003; Кишко Т.О. и соавт., 2008). Приём L-аргинина per os лицами, перенёсшими аортокоронарное шунтирование, вызвал снижение уровня эндотелиальной дисфункции (Lucotti P. et al., 2009).
Получены данные (Chuang S.M. et al., 2011) о восстановлении после овариоэктомии функций мочевого пузыря у самок кроликов на фоне лечения L-аргинином. Введение L-аргинина после экспериментальной ишемии снижает повреждение кишечника у мышей, повышая уровень тканевого оксида азота (II). Реоксигенация подобного эффекта не давала (Cintra A.E. et al., 2008).
В работе Покровской Т.Г., (2008) показано, что введение L-аргинина (200 мг/кг), предупреждает эндотелиальную дисфункцию у крыс в модели дефицита азота (введение L-NAME).
Введение молекулы аргинина в синтетический шовный материал положительно влияет на процессы свободно-радикального окисления, снижает содержание макроэргических комплексов после проведения экспериментальной энтеротомии (Dikhtenko T.H. et al., 2013). L-аргинин в нормальных условиях стимулирует гуморальный ответ, а также может оказывать стресслимитирующую активность по отношению ко всем звеньям иммунитета в условиях стресса (Северьянова Л.А. и соавт., 2007). Изменение пространственной структуры молекулы аргинина влияет на биологическую активность аналогов гормонов. Замена L-аргинина D-аргинином в аналоге гормона задней доли гипофиза низших позвоночных – вазотоцине, устраняет его натрийуретическое действие (Кутина А.В. и соавт., 2008).
Нативные аргининсодержащие и синтетические полиаргининовые последовательности охарактеризованы в обзоре Закуцкого А.Н. и соавт., 2008. Последовательность аминокислот Asp-Argyr содержится в белках A-семейства на цитоплазматической поверхности третьего трансмембранного домена рецептора, сопряжённого с G-белками - GPCR (G-protein-coupled receptor) (Gether U., 2000). В организме А-семейство представлено , -адрено-, M-холино-, H2-гистаминовыми рецепторами и многими другими. Аргинин в них играет центральную роль – благодаря ему происходит связывание G-белка.
Последовательность Arg-Gly-Asp содержится во внеклеточных гликопротеинах и распознается интегринами. Вещества, содержащие Arg-Gly Asp, связывающиеся с интегринами, но не функционирующие как высокомолекулярный гликопротеин, получили название «дизинтегрины» - они нарушают цитоадгезию. Наиболее перспективными клиническими аспектами применения дизинтегринов являются их противосвёртывающие; противоопухолевые и противометастатические свойства (Закуцкий А.Н. и соавт., 2008).
Последовательность Arg-Ser принимает участие в сплайсинге, а также транспорте мРНК в цитоплазму и регуляции процесса трансляции (Graveley B.R., 2000; Sanford J.R. et al., 2005). Особый интерес представляет последовательность Pro-Arg. В белках и пептидах пролин, расположенный с N-конца, увеличивает чувствительность к протеолизу, в отличие от расположения на C-конце (Vanhoof G. et al., 1995). Пептид тафцин(Thr-Lys-Pro-Arg), образующийся из IgG1, содержит дипептид Pro-Arg (Naijar V.A., 1983).
Дипептид Phe-Arg (С-концевой) входит в состав брадикинина и атриопептина II. Его отщепление приводит к потере активности брадикинина (Kaplan A.P., 1993). С другой стороны, этот дипептид в атриопептине II необходим для распознавания рецепторов в сосудистом русле (Currie M.G. et al., 1984). Дальнейшие исследования позволили создать пептидометики, содержащие группу С-концевую группу Phe-Arg. Все они обладали тропностью к сосудам (вазодилатация) и тромбоцитам (антиагрегантный эффект) (Alexopoulos K. et al., 2004). При перестановке местами аминокислот в С-концевом дипептиде до последовательности Arg-Phe (меланоцитстимулирующий гормон, нейропептид FF) получены прямо противоположные эффекты – увеличение артериального давления и частоты сердечных сокращений. При удалении С-концевой группы Arg-Phe в меланоцитстимулирующем гормоне и сходных с ним структурах терялось влияние на сердечно-сосудистую систему (Nijsen M.J. et al., 2000).
Выделенная из мозга быка аминокислотная последовательность Tyr-Arg (киоторфин) (Takagi H. et al., 1979) обладает анальгетическим эффектом. Такой дипептид образуется благодаря киоторфинсинтазе. Она формирует олигопептид из исходных аминокислот (тирозин, аргинин) либо путём разрушения белков-предшественников (Ueda, H. et al., 1987). Спустя некоторое время был выделен неокиоторфин – пентапептид Thr-Ser-Lysyr-Arg (Kiso Y. et al., 1983). Источником его образования является -цепь гемоглобина (фрагмент 137-141) (Sazonova O.V. et al., 2003). Неокиоторфин проявляет анальгетические свойства (Kiso Y. et al., 1983) и является мощным стимулом пролиферации (Sazonova O.V. et al., 2003).
В литературе также встречаются данные об утяжелении этаноловых язв при введении L-аргинина в дозе 500 мг/100 г веса животных (Ferraz J.G. et al., 1994). Кишко Т.О. и соавт., 2008 указывают, что введение избытка аргинина в организм может не только не оказать терапевтического эффекта, но и ухудшить состояние за счет гиперпродукции пероксинитрита.
Введение в структуру пептидов аргинина опосредует ряд эффектов. При интраназальном введении крысам глипролина PGR (Pro-Gly-Arg, аргинин находится на C-конце) проявляет антитоксические свойства при моделировании аллоксан-индуцированного сахарного диабета, не допускает сдвиг коагуляционного гемостаза в сторону гиперкоагуляции (Ульянов А.М., 2009). При изучении свойств пептида структуры PGR показано, что при том же пути введения он снижает уровень глюкозы в крови и поддерживает противосвёртывающую систему крови (Андреева Л.А. и соавт., 2012). Глипролин PGP и его аналоги способны оказывать цитопротективное действие на различных моделях язвообразования, в том числе, при введении экспериментальным животным НПВП. Влияние пептидов PGP и PRPGP на модели НПВП-гастроэнтеропатии ранее не изучалось.
Подготовка биоматериала для гистологических исследований
Метод авторадиографии выявляет ядра, находящиеся в синтетическом периоде митотического цикла. В этом периоде клетки способны активно захватывать тимидин, включая его в синтез ДНК. Этот метод отличает объективность и точность оценки процессов синтеза ДНК в клетках (Шабалкин И.П. и соавт., 2014).
В эксперименте in vivo за час до эвтаназии животных вводили 3H-тимидин (ФГУП «Изотоп», г. Санкт-Петербург) внутрибрюшинно в дозе 1 мкКu/г массы тела. В эксперименте in vitro клеточные монослои инкубировали при 37оС в растворе Хенкса с добавлением 3Н-тимидина в концентрации 1 мкКюри/мл в течение 1 часа. После инкубации монослои тщательно промывали в растворе Хенкса и фиксировали в 96% этаноле.
Срезы готовили по принятой в лаборатории методике. Для проведения авторадиографии использовали фотоэмульсию Ilford Scientific Product K.2 Emulsion in gel form (CAT 1355109). Расплавленную фотоэмульсию наносили на предметные стёкла, содержащие депарафинированные срезы, при помощи петли из тонкой проволоки. Обработанные предметные стёкла отстаивались в светонепроницаемом боксе при температуре +4оС на срок 24-28 суток. После выдержки, препараты проявляли проявителем Д-19, фиксировали 33% раствором тиосульфата натрия, затем промывали водой и окрашивали гематоксилином.
Индекс меченых ядер (ИМЯ) рассчитывали на основании просмотра 2500 клеток и выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ) оценивали полуколичественно: под «низкой» интенсивностью метки понимали наличие зёрен серебра, занимающих менее 50% площади ядра. «Высокой» считалась интенсивность метки, включающей, в площади ядра, более 50% «сливных» зёрен серебра. Для анализа распределения ядер по интенсивности метки просматривали 200 меченых клеток. Подсчёт показателей проводили на микроскопе МИКМЕД-6 при увеличении х90, используя иммерсионное масло.
Оксидативный стресс моделировали добавлением в 15 мл инкубационной среды 0,001 мл 3% Н2О2 (60 мкМ) с экспозицией в течение 2 часов (Самохвалов В.А. и др., 2003). Формировали 6 групп: 1 – «контроль»; 2 – «PGP» (воздействие пептида в течение 6 часов); 3 – «RGP» (воздействие пептида в течение 6 часов); 4 – «оксидативный стресс» (добавление в культуральную среду Н2О2 с экспозицией в течение 2 часов); 5 – «PGP + оксидативный стресс» (воздействие пептида в течение 6 часов с обработкой культуры в заключительные 2 часа инкубации перекисью водорода); 6 – «RGP + оксидативный стресс» (воздействие пептида в течение 6 часов с обработкой культуры в заключительные 2 часа инкубации перекисью водорода).
Для оценки процессов свободнорадикального окисления в тканях животных применяли метод хемилюминесценции (ХМЛ). Хемилюминесцентный анализ проводили в гомогенатах свежего биоматериала. Результаты анализа, полученные в милливольтах, рассчитывали на 1 грамм влажной ткани в относительных единицах.
Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Стандартизация сигнала проводилась с использованием встроенной программы «Finlab». Алгоритм метода включал определение следующих показателей: Для проведения хемилюминесцентного анализа, фибробласты снимали с подложки с помощью раствора Трипсина-Версена (Биолот, Россия) и трёхкратно отмывали раствором Хенкса. Подсчёт клеток в суспензии фибробластов проводили в камере Горяева. Для хемилюминесцентного анализа использовали 1х106 клеток. Люцигенин (N,N-dimethyl-9,9-biacridinium dinitrate; Sigma-Aldrich) добавляли в конечной концентрации 5 M. Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B «PERKIN ELMER». Стандартизация сигнала проводилась с использованием встроенной программы «Finlab». Определяли светосумму люцигенин-зависимого свечения (Sluc) за 5 минут, которую выражали в относительных единицах.
Для идентификации ядрышек в ядрах различных клеточных популяций с целью оценки белоксинтетической функции предложены методики Н.Н. Мамаевым (1989) и Д.Э. Коржевским (1990). Зона ЯОР распознается в виде фибриллярного центра (А.В. Юркевич и соавт., 2005). Технику окрашивания серебром в растворе желатина (коллоидное серебро) называют общепринятым термином AgNOR или AgЯОР (Бугоркова С.А. и соавт., 2015, Бокарев А.В. и соавт., 2009). Суть метода в реакции специфического связывания нитрата серебра с негистоновыми хромосомными белками (аргирофильные белки - С23, В23, UBF и РНК-полимераза I (Бугоркова С.А. и соавт., 2015)). Нитрат серебра взаимодействует только с теми ЯОР, которые в фазе G2 участвуют в синтезе рРНК (Ploton D. et al., 1988).
Предметные стёкла, содержащие монослои первичной культуры пульмональных фибробластов новорождённых белых крыс линии Wistar, погружали в 1% раствор муравьиной кислоты для протравки на 20 минут. Препараты промывали дистиллированной водой 10 минут и просушивали на воздухе. Коллоидное серебро готовили путём растворения 2 частей AgNO3 в 2 частях дистиллированной воды, с добавлением 1 части подогретого до 56С раствора желатина, приготовленного с добавлением 1% раствора муравьиной кислоты. Свежеприготовленный краситель немедленно раскапывали на предметные стекла, покрывали сухим покровным стеклом, помещали в термостат на 20 минут при температуре 37С. Затем окончательно промывали в дистиллированной воде 30 минут.
Измерение морфометрических показателей зон ядрышкового организатора (ЯОР) осуществляли с помощью программного обеспечения «МЕКОС-Ц» после видеозахвата изображения объективом х60. С помощью программы оценивали среднюю площадь ядра, суммарную площадь зон ЯОР и количество ядрышек. Для анализа показателей морфометрии просматривали 50 клеток каждого монослоя.
Статистический анализ проводили с помощью пакета функций для статистической обработки ПО Statistica 6.0 и Microsoft Office Excel 2013. Для каждой группы значений представлено среднее арифметическое значение показателя и стандартная ошибка среднего (М ± m). Нормальность распределения для малых объёмов выборок проверяли при помощи двух приближённых методов – по асимметрии и эксцессу; и графического (Лемешко Б.Ю., Лемешко С.Б., 2005). Достоверность различий анализировали с помощью теста t-критерия Стьюдента. Различия между значениями рассматривались как достоверные при выполнении условия p 0.05.
Влияние глипролинов на тканевый гомеостаз покровного эпителия языка
Введение PGP нивелировало угнетение синтеза ДНК, вызванного введением индометацина. На рисунках 6 и 7 показана СОЖ белой мыши после предварительного введения пептида PGP. Полученные результаты не противоречат данным Жуйковой С.Е. и соавт. (2004).
Отличием ответа на ведение индометацина у животных, получавших аргининсодержащие пептиды, по сравнению с PGP, является реакция со стороны процессов синтеза ДНК. При введении RGP имело место угнетение синтеза ДНК по сравнению с группой «индометацин».
Аргининсодержащие глипролины не только не усилили гастропротективные свойства, но и значительно утяжелили проявление индометациновой гастропатии: имело место увеличение площади деструкции, снижение пролиферативного потенциала, утяжеление оксидативного стресса.
В ранее проведённых исследованиях было показано, что присутствие аргинина в структуре опиоидных пептидов уменьшает площадь язвенно эрозивного поражения (Болоняева Н.А. и соавт., 2005), активирует синтез ДНК (Масленникова и соавт., 2008; Животова Е.Ю. и соавт., 2011а), ослабляет проявления оксидативного стресса. Этот процесс опосредуется активацией системы NOS-NO (Е.Ю. Животова и соавт., 2011б). По-видимому, противоположная направленность действия аргининсодержащего глипролина, зарегистрированная в настоящем исследовании, иллюстрирует известный феномен инверсии эффектов NO. Данный феномен отражает способность оксида азота, в зависимости от собственной концентрации и редокс-фона, запускать каскады сигнальной трансдукции, направленные либо на выживание клеток и пролиферацию, либо на остановку клеточного цикла и апоптоз (Thomas D.D. et al., 2008). В условиях тяжёлого оксидативного стресса возможен и прямой цитотоксический эффект пероксинитрита – продукта реакции NO с супероксид-анион радикалом (Xia Z. Et al., 2010).
В покровном эпителии 12-перстной кишки (Рисунок 8) достоверное снижение показателя синтеза ДНК (ИМЯ) вызывал пептид PRPGP (6,64±0,30 против 8,36±0,28) по сравнению с контрольной группой (Таблица 8). После однократного интрагастрального введения индометацина в дозе 250 мг/кг в группе «Индометацин» наблюдалось угнетение синтеза ДНК, что выражалось в снижении показателя ИМЯ в покровном эпителии 12-перстной кишки (5,00±0,52) по сравнению с контрольной группой (Таблица 8).
Таблица 8 Влияние введения пептидов PGP и RGP на процессы синтеза ДНК в покровном эпителии 12-перстной кишки белых мышей, получавших индометацин (M±m)
В покровном эпителии 12-перстной кишки введение пептидов PGP, RGP, PRPGP на фоне однократного введения индометацина увеличивало ИМЯ по сравнению с группой «индометацин». Предварительное введение пептидов PGP и RGP в группах «PGP+индометацин» и «RGP+индометацин» нивелировало негативное воздействие индометацина, повышая показатель уровня синтеза ДНК (7,96±0,46 и 7,60±0,58 соответственно) до значения контрольной группы (8,36±0,28). В эпителии 12-перстной кишки, по сравнению с эпителием языка белых мышей, наблюдается более выраженный репаративный эффект глипролинов PGP и RGP, чем PRPGP.
В физиологических условиях введённые пятикратно пептиды PGP, RGP не влияли на показатель синтеза ДНК – ИМЯ по сравнению с контрольной группой в слизистых оболочках желудка и 12-перстной кишки. Пептид PRPGP угнетал синтез ДНК в эпителии 12-перстной кишки (Рисунок 9, Рисунок 10). Примечание: значение контрольной группы принято за 100% и обозначено горизонтальной линией, – достоверные отличия по сравнению с контролем.
Примечание: значение контрольной группы принято за 100% и обозначено горизонтальной линией. Вместе с тем, в слизистой оболочке языка, при тех же условиях введения пептидов, наблюдали снижение показателя ИМЯ (Рисунок 11):
Примечание: значение контрольной группы принято за 100% и обозначено горизонтальной линией, – достоверные отличия по сравнению с контролем.
Площадь язвенно-эрозивных повреждений достоверно снижалась только при пятикратном введении глипролина PGP в группе «PGP+индометацин». Трипептид RGP и пентапептид PRPGP способствовали увеличению площади язвенно-эрозивных повреждений по сравнению с контролем (100%) на 6 и 15% соответственно (Рисунок 12).
Примечание: значение группы индометацин принято за 100% и обозначено горизонтальной линией, – достоверные отличия по сравнению с группой «индометацин».
Важно отметить, что трипептид PGP во всех исследуемых тканях (язык, желудок, 12-перстная кишка) стимулировал синтез ДНК по сравнению с группой индометацин (Рисунок 13).
Аргининсодержащие глипролины, вводимые перед индометацином, оказывали стимулирующее действие лишь в покровном эпителии 12-перстной кишки, в покровном эпителии языка значения ИМЯ не отличались, а в желудке снижались по сравнению с группой «индометацин». Диаграмма распределения показателей хемилюминесценции показывает, что, в гомогенатах желудков самцов белых мышей в группах «RGP+индометацин» и «PRPGP+индометацин» наиболее интенсивно происходят процессы образования перекисных радикалов (увеличение показателя Sind-1), преимущественно липидной природы. Одновременно происходит снижение перекисной резистентности (увеличение показателя Н) биологического субстрата, что отражает интенсификацию процессов СРО и увеличение площади повреждения СОЖ. Пятикратное введение пептида PGP приводило к достоверному уменьшению всех показателей хемилюминесценции (Рисунок 14).
Влияние глипролинов на ядрышковый организатор в культуре клеток пульмональных фибробластов
Только предварительное пятикратное введение пептида PGP (введение индометацина на 5 сутки) стимулирует пролиферативные процессы, угнетаемые на ранних стадиях язвообразования во всех исследуемых покровных эпителиях. Об этом свидетельствует увеличение показателя ИМЯ в генеративном слое слизистых оболочек исследуемых органов. Аргининсодержащие аналоги проявили разнонаправленное действие на слизистые оболочки ЖКТ. Наибольшую цитопротективную активность в исследованиях на модели НПВП гастроэнтеропатии (авторадиография с 3H-тимидином, компьютерная морфометрия очагов деструкции в СОЖ) проявлял PGP, что согласуется с ранее полученными данными (Жуйкова С.Е. и соавт., 2004; Сангаджиева А.Д., 2013). Глипролины RGP и PRPGP в дозе 1 мг/кг на модели НПВП-гастропатии показали обратный эффект – в ответ на введение данных пептидов наблюдалось увеличение площади эрозивно-язвенных повреждений.
Глипролины воздействуют на гомеостаз СОЖ на органном уровне через несколько факторов защиты. Прежде всего, это влияние через симпатическую нервную систему (Калинин А.В., 2002): увеличение кровотока в слизистой желудка (Самонина Г.Е. и соавт., 2001), лимфотока (Жуйкова С.Е., 2003, Копылова Г.Н. и соавт., 2007), базальной и слизистой секреции бикарбонатов (Жуйкова С.Е., 2003), стимуляция слизеобразования (Жуйкова С.Е., 2003). Олигопептид PGP уменьшает воздействие агрессивных факторов: кислой секреции (базальной и стимулированной) (Фалалеева Т.М. и соавт., 2010в), провоспалительной активации тучных клеток (Умарова Б.А. и соавт., 2011).
В исследованиях, проведённых ранее в Центральной научно исследовательской лаборатории Дальневосточного государственного медицинского университета, была показана важная роль свободнорадикального статуса в реализации эффектов РП на тканевый гомеостаз (Лебедько О.А., Тимошин С.С., 2011; Животова Е.Ю. и соавт., 2011б; 2013).
В нашем исследовании также наблюдали увеличение интенсивности ХМЛ: усиление генерации свободных радикалов (показатель Sind-1) и активации (Ssp, h) на модели НПВП-гастроэнтеропатии при предварительном введении пептидов RGP и PRPGP в СОЖ.
Как отмечает Михайлов В.Ф. и соавт., (2003) супероксид анион-радикал, пероксид водорода и оксид азота определяют ответ клетки на темп пролиферации, направление дифференцировки либо включение программы апоптоза. В физиологических условиях при малых концентрациях оксид азота поддерживает гомеостаз СОЖ. В ЖКТ продукцию оксида азота индуцируют две изоформы энзима NOS: эндотелиальная – eNOS и нейрональная – nNOS, третья изоформа индуцибельная iNOS синтезируется также эпителиальными клетками, помимо макрофагов и нейтрофилов. В физиологических условиях две изоформы (iNOS и eNOS) оказывают положительное влияние на тканевый гомеостаз ЖКТ. В условиях патологии результатом избыточной активации индуцибельной iNOS является образование избытка NO, участвующего в образовании супероксиданион-радикала и пероксинитрита (В.Д. Пасечников, 2013). Это также подтверждается результатами ХМЛ: показатели Sind-1 и h являются индикаторами генерации свободных радикалов, в том числе, супероксиданион 81 радикала и пероксинитрита как на органном уровне in vivo, так и в клеточной культуре in vitro.
Механизм развития процессов ПОЛ и апоптоза при приеме НПВП (индометацин) описан в работе C. Pal et al. (2012). При взаимодействии молекулы индометацина с комплексом I дыхательной цепи митохондрий происходит выброс электрона. Молекула кислорода принимает на себя электрон и превращается в супероксиданион-радикал. Супероксиданион-радикал нейтрализуется супероксиддисмутазой в пероксид водорода с последующей деградацией глутатионпероксидазой и пероксидазой. Избыточное образование пероксида водорода способствует развитию процессов СРО (Левченкова О.С. и соавт., 2014).
Купчинская С.С. (2014) отмечает, что внутри клеток АФК образуют, в том числе митохондрии. Среди АФК наиболее распространённой и стабильной молекулой является пероксид водорода. Небольшая по размерам молекула проникает через биомембраны с помощью аквапоринов, изначально описанных как водные каналы (Bienert G.P. et al., 2007). Способность к диффузии АФК даёт возможность вызывать множественные внутриклеточные реакции, а также – инициировать тканевые реакции, такие как массовая гибель клеток (Pletjushkina O.Y. et al., 2005; Кормош Н.Г., 2011).
Молекула H2O2 разобщает комплекс Цитохром С-оксидазы с кардиолипином, необходимый для поддержания ферментативной активности комплекса IV. Кардиолипин также способен окисляться в перекисные соединения. Последующее повреждение аконитазы способствует высвобождению ионов двухвалентного железа из комплексов Fe-S. Ионы Fe2+ взаимодействуют с пероксидом водорода, производя гидроксильный радикал. Этот механизм приводит к активизации процессов СРО, повреждая клетки. На активацию пролиферации или апоптоза оказывают влияние универсальные внутриклеточные мессенджеры, такие как ионы кальция Ca2+, циклические нуклеотиды (циклический ГМФ и циклический АМФ). Кроме того, индометацин активирует каскад сигнальной трансдукции путём активации Вах (проапоптозного гена) и снижения активации Bcl-2 (антиапоптический ген), повышается содержание ионов Ca2+ (Левченкова О.С. и соавт., 2014).
Проапототический ген и повышенная концентрация ионов Ca2+ открывают митохондриальные поры (mPTP), которые являются ключевыми участниками апоптоза (Левченкова О.С. и соавт., 2014). Происходит разобщение дыхательной цепи и в цитоплазму клетки через mPTP диффундирует Цитохром С, связываясь здесь с Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1 - фактор активации протеаз апоптоза) и формируя апоптосому. Затем образуются каспаза-7, каспаза-3, расщепляющие структурные белки и приводя к проявлению апоптоза.
В диссертационном исследовании выявлена способность трипептида PGP, снижать показатели ХМЛ, как в физиологических условиях, так, и в условиях индометацин-индуцируемой гастропатии. В контрольной группе (физиологические условия) содержание гидроперекисей липидов (амплитуда h) уменьшалось при введении пептида PGP на 32%, а при введении RGP - на 44%; показатель Sind-2 (величина антиоксидантной антирадикальной защиты) снижался (обратно коррелирующая зависимость) в случае с пептидом PGP на 37%, а при введении RGP - на 44%. При патологии (НПВП-гастропатия) наблюдали положительное изменение показателей ХМЛ лишь в случае введения пептида PGP: амплитуда h (содержание гидроперекисей липидов) уменьшалась на 37%, а скорость образования перекисных радикалов (Sind-1) на 40%. Можно предположить, что в физиологических условиях и при НПВП-гастропатии трипептид PGP повышает активность антиоксидантной антирадикальной системы защиты, работающую на нейтрализацию вновь образуемых АФК. Также, PGP снижает содержание гидроперекисей липидов, которые могут активировать каскады сигнальной трансдукции, направленные как на активацию антиоксидантной системы, так и апоптоза (Girotti A.W., 1998).