Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Ботаническая характеристика продуцента БАС Inula viscosa 13
1.2 I.viscosa как источник биологически активных веществ 16
1.3 Биологическая активность БАС I.viscosa 20
1.4 Разработка противовоспалительных и ранозаживляющих средств растительного происхождения 26
1.5 Продуценты рода Inula 31
1.6 Аппликационные мазевые лекарственные формы для лечения ран 33
Заключение по главе 1 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Материалы исследования 37
2.1.1 Лекарственное растительное сырье 37
2.1.2 Вспомогательные вещества и стандартные образцы 38
2.2. Методы исследования 39
2.2.1 Идентификация лекарственного растительного сырья I.viscosa 39
2.2.1.1 Макроскопический анализ 39
2.2.1.3 Определение наличия в сырье некоторых групп БАС 40
2.2.1.4 Числовые показатели 42
2.2.2 Методики фитохимического исследования состава БАС в траве I.viscosa 43
2.2.2.1 Исследование БАС травы I.viscosa методами УФ спектрофотометрии и ТСХ. 43
2.2.2.2. Методика фракционирования БАС целевого фрагмента метаболома I.viscosa в различных растворителях 44
2.2.2.3 Изучение фитохимического состава травы I.viscosa методом УВЭЖХ/МС 45
2.2.2.4 Методика определения качественного состава летучих компонентов I.viscosa 47
2.2.2.5 Методика определения эфирного масла 48
2.2.3 Стандартизация сырья I.viscosa, жидкого экстракта и геля 48
2.2.4 Технологические методы исследования 48
2.2.4.1 Методики определения технологических характеристик травы I.viscosa 48
2.2.4.2 Разработка способа получения жидкого экстракта 48
2.2.4.3 Методики определения показателей качества жидкого экстракта 49
2.2.4.4 Методика оценки фармацевтической доступности БАС из «Жэтривис-гель» 51
2.2.5 Методы определения биологических свойств БАС I.viscosa, «Жэтривис» и «Жэтривис-гель» 52
2.2.5.1 Методика скрининга биологической активности in silico 52
2.2.5.2 Методика оценки противовоспалительной активности с помощью СФБТС 52
2.2.5.3 Микробиологические исследования 53
2.2.5.4 Определение биологической активности in vivo 55
2.2.6 Статистическая обработка 57
Заключение по главе 2 58
Дизайн исследования 59
Глава 3. Фармакогностическое изучение травы Inula viscosa 60
3.1 Обоснование выбора вида сырья I.viscosa 60
3.1.1. Оценка содержания экстрактивных веществ в траве I.viscosa 62
3.1.2 Изучение содержания целевых БАС в сырье I.viscosa 63
3.2. Морфология, макро- и микроскопические признаки травы I.viscosa 65
3.3. Качественные реакции 70
3.4. Изучение БАС целевого фрагмента метаболома травы I.viscosa 71
3.4.1 Установление подлинности сырья I.viscosa методами УФ-спектрофотометрии и ТСХ 71
3.4.2 Изучение фитохимического состава травы I. viscosa методом УВЭЖХ/МС 74
3.4.3 Определение содержания летучих компонентов в траве I.viscosa 80
3.5. Числовые показатели травы I.viscosa 82
3.6 Разработка методик количественного определения действующих веществ в сырье I.viscosa приемлемых для сквозной стандартизации 84
3.6.1. Разработка методики определения содержания суммы фенольных соединений 84
3.6.2. Разработка методики определения содержания суммы флавоноидов в сырье 86
3.7 Обоснование биологической активности БАС I.viscosa in silico 89
Выводы по главе 3 91
Глава 4. Разработка технологии получения жидкого экстракта травы Inula viscosa и геля на его основе 93
4.1. Разработка технологии жидкого экстракта травы I.viscosa 93
4.1.1 Технологические характеристики сырья I.viscosa 93
4.1.2. Разработка способа получения жидкого экстракта из травы I.viscosa (1:1) 94
4.1.3 Стандартизация жидкого экстракта I.viscosa (1:1) «Жэтривис» 97
4.2. Обоснование содержания экстракта I.viscosa в составе аппликационных ЛФ методами in vitro и in vivo 101
4.2.1 Определение бактериостатической и фунгистатической активности «Жэтривис» в опытах in vitro 101
4.2.2 Установление противовоспалительной активности с использованием специфической биотест-системы in vitro 102
4.2.3 Установление противовоспалительной активности «Жэтривис» in vivo на модели острого воспаления 104
4.3. Разработка состава и технологии аппликационной лекарственной формы с экстрактом травы I.viscosa «Жэтривис-гель» 105
4.3.1. Разработка состава аппликационной формы 105
4.3.2. Разработка технологии «Жэтривис-гель» 110
4.4. Стандартизация «Жэтривис-гель». 112
4.4.1. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в «Жэтривис-гель» 113
4.4.2. Микробиологическая чистота «Жэтривис-гель» 114
4.4.3 Изучение стабильности «Жэтривис-гель» 114
4.5. Биофармацевтические исследования «Жэтривис-гель» 118
4.5.1. Изучение кинетики высвобождения флавоноидов из «Жэтривис гель» 118
4.5.2 Подтверждение специфической активности «Жэтривис-гель» на модели термического ожога 118
Выводы по главе 4 120
Общие выводы 121
Заключение 123
Практические рекомендации 124
Перспективы дальнейшей разработки темы 124
Перечень сокращений 125
Список используемой литературы 127
Приложения 142
- I.viscosa как источник биологически активных веществ
- Методики определения показателей качества жидкого экстракта
- Изучение фитохимического состава травы I. viscosa методом УВЭЖХ/МС
- Подтверждение специфической активности «Жэтривис-гель» на модели термического ожога
I.viscosa как источник биологически активных веществ
Исследованию химического состава I.viscosa посвящены многочисленные публикации в зарубежных источниках, основная часть которых рассматривает состав эфирного масла растения [62, 85, 90 ].
Так, итальянские ученые проводили исследования состава эфирного масла I.viscosa, собранного в четырех различных районах Апулии (провинция в Южной Италии) [112]. Масло выделяли методом дистилляции с использованием прибора Клевенджера из свежих листьев и соцветий растения. Дистилляция проводилась в течении 3 часов, после чего выделяли эфирное масло, обрабатывая дистиллят гексаном. Химический состав масла установлен при помощи ГХ и подтвержден с использованием Н1-ЯМР. Выход масла составил 0,37% и его состав различается у цветков и листьев. Эфирное масло, выделенное из цветков, содержало значительное количество монотерпеновых соединений, сесквитерпеновых углеводородов и ненасыщенных ароматических соединений. В составе эфирного масла, выделенного из листьев, в большем количестве присутствовали кислородсодержащие сесквитерпеновые соединения. [112]. Методом ГХ-МС установлено наличие в экстрактах I.viscosa костовой, изокостовой, илликовой кислот, а также томентозина, инувисколида [77,120].
Состав эфирного масла, выделенного из растения I.viscosa (L.), также изучался исследователями из Алжирского университета [100]. В ходе эксперимента эфирное масло растения было получено двумя способами – гидродистилляцией и паровой перегонкой. Полученное масло было исследовано с использованием ГХ-МС. В результате, было установлено, что состав масел, полученных различными способами, неоднороден. Эфирное масло (метод гидродистилляции) имело характерный состав, в нем присутствовали: линоленовая кислота (7,80%); пальмитиновая кислота (5,38%); бутилгидрокситолуол (4,11%); 12-карбоксиэудесма-3,11(13)-диен (28,88%) и фокиенол (3,37%). В другом образце эфирного масла (метод перегонка с водяным паром) присутствовали: 2,3-дидегидрокостовая кислота (3,25%); бутилгидрокситолуол (2,63%); 12-карбоксиэудесма-3,11(13)-диен (56,81%) и пентакосан (2,31%). Изображения некоторых, из вышеназванных структур приведены на рисунке 1.3.
Приведенные данные коррелируют с результатами изучения состава эфирного масла I.viscosae в Сирии [61,92,130] и Иордании [55,58].
В составе эфирного масла I.viscosae, произрастающего на территории Ливана [72] 16% всех компонентов составлял эпибициклооксифелландрен (III).
Из эфирного масла I.viscosa, в эксперименте [146] был выделен инулоксин А (рис. 1.4), структура которого была доказана методами УФ-, ИК спектроскопии.
Эфирное масло растения, произрастающего на территории Корсики, имеет несколько отличный состав [78]. Анализ, проведенный с использованием ГХ-МС и 13C-NMR, продемонстрировал, что в выделенном образце содержится 71 компонент. Основными составляющими являются фокиенол (21.1%), (Е)-неролидол (8.6%) и эудесм-6-ен-4-ол (6.2%). Содержание неролидола, производных сесквитерпеновых и флавоноидных соединений в девясиле липком, собранном на территории Валенсии (Испания), было установлено с использованием газовой хроматографии и 13CNMR [147].
В научных публикациях встречаются данные о широком спектре соединений флавоноидной и сесквитерпеновой [79,142,161], а также тритерпеновой [98] структуры, содержащихся в надземных частях I.viscosa. Так, в извлечениях, полученных из растений, собранных во Франции, Испании и Турции, были обнаружены 9 новых флавоноидов [159].
Как уже было упомянуто выше, листья растения обильно покрыты железистыми волосками, которые выделяют сложную, вязкую смесь, в составе которой обнаружены многочисленные сесквитерпеновые кислоты и агликоны флавоноидов [113,133].
Исследования, проведенные в университете Анкары [97] продемонстрировали содержание достаточно большого количества флавона гиспидулина (4,5,7-тригидрокси-6-метоксифлавон) в цветках I.viscosae. Было установлено, что цветки I.viscosae содержат 0,151± 0,007 г/100 г от сухого веса сырья флавона гиспидулина.
В метанольном извлечении листьев I.viscosae были идентифицированы несколько полифенольных соединений, являющихся производными 1,3 дикофеилхиннойкислоты (1,3-diCQA) и проявляющих сильные антиоксидантные свойства. В Хорватии, методом СФМ, был определен количественный состав БАС метаболома I.viscosae в различных частях растения: фенольные кислоты 1,71-5,92%, флавоноиды 0,157-0,498%, выявлено , что в листьях содержится наибольшее количество фенольных кислот 4,56-11,30% [119].
Были определены сезонные колебания концентраций продуктов первичного метаболизма (углеводов, липидов и белковых веществ) в надземных и подземных частях I.viscosa, произрастающего в Греции [126]. Установлено, что содержание растворимых углеводов во всех органах растения, увеличивается в течении летнего периода, тогда как в этот же временной промежуток наблюдалось снижение содержания липидных фракций и крахмала. Также установлена корреляция между концентрацией азота и растворимого сахара в органах растения в периоды роста и развития растения.
Методики определения показателей качества жидкого экстракта
Определение содержания спирта этилового в фармацевтической субстанции - жидком экстракте травы I.viscosa Таблица 2.5 – Условия хроматографирования спирта
Методика: Хроматографируют испытуемый раствор 3 раза, регистрируют хроматограммы, измеряют площади пиков растворителей (табл.2.5)
Содержание этанола в субстанции (Х) в процентах рассчитывают по формуле:
S-а0-Р S - площадь пика этанола на хроматограмме
Х =; где:
S0"а испытуемого раствора;
So –площадь пика этанола на хроматограмме раствора сравнения;
а - навеска экстракта I. viscosa, мг;
ао - навеска стандартного образца этанола, мг;
Р - содержание основного вещества в стандартном образце этанола
Описание, определение содержания сухого остатка и тяжелых металлов проводилось в соответствии с ОФС.1.4.1.0021.15 «Экстракты». Суммарное содержание тяжелых металлов в жидком экстракте определяли методом 2 по ОФС 1.2.2.2.0012.15. Определение плотности экстракта было проведено в соответствии с ОФС.1.2.1.0014.15 «Плотность» - метод 3.
Определение рН 10% водного извлечения геля проводили потенциометрически на рН-метре «Mettler Toledo» S 80-К в соответствии с требованиями ОФС. 1.2.1.0004.15 «Ионометрия, пункт 3 Потенциометрическое определение рН».
Определение вязкости образцов геля осуществляли на ротационном вискозиметре «Rheotest-2» типа RV (ГДР) согласно методике прибора на малом цилиндре с объемом тестируемой пробы 25 мл. каждый образец тестировался троектратно с интервалом времени 20 мин при 20С. Показания прибора снимали в диапазоне скоростей сдвига от 0,333 до 145,8 об/с (по 12 позициям) от меньшего к большему и обратно. Полученные показания обрабатывались по разработанной авторской программе «Rheotest».
Касательное напряжение сдвига: т = z а, - касательное напряжение, н/м;
где: - показание прибора, дел;
z - константа цилиндра, н/(м х дел).
Динамическая вязкость: ц= /Бг, ц- динамическая вязкость, Па с;
где: - касательное напряжение, н/м;
Dr - градиент скорости сдвига, с"1
Изучение фитохимического состава травы I. viscosa методом УВЭЖХ/МС
Для изучения БАС, извлекаемых из травы I.viscosa, согласно методике, изложенной в разделе 2.2.2.2, получены четыре фракции 1-ая - водная, 2-ая -бутанольная, 3-я – этилацетатная и 4-ая - хлороформная. Компонентный состав БАС каждой из этих фракций был изучен с помощью УВЭЖХ-МС, полная детализация результатов представлена в приложении -2.
При этом исследовали спектральные характеристики только тех пиков, которые составляли не менее 1% всей площади пиков на ТАС-хроматограмме (сумма всех длин волн диодно-матричного детектора от 200 до 500 нм). На первом этапе изучения полученных спектров проведено обнаружение полифенольных кислот. Так, только в водной фракции (№1) установлено наличие хлорогеновой кислоты (пик с временем удерживания 3,61 мин). При этом во фракциях 1 – 3 наблюдаются спектры веществ с такой же массой, но с другим временем удерживания (3,72 и 3,99 мин).
Можно предположить, что они являются изомерами хлорогеновой кислоты, например, по месту образования эфирной связи caffeic acid с quinic acid (рис. 3.19):
Кроме этого, в спектре фракции №1 присутствуют шесть продуктов присоединения 2х остатков caffeic acid к quinic acid в виде пиков с временами удерживания 5,5; 8,95; 9,31; 9,44; 9.61 и 10,59 мин. Хотя в справочной
Во фракции извлечении №3 выявлено наличие вещества, образованного тремя остатками caffeic acid с quinic acid (3,4,5ricaffeoylquinic acid).
В бутанольной и этилацетатной фракциях (№ 2 и 3) присутствует свободная кофейная кислота (пик с временем удерживания 4,74 мин).
В водной фракции (№1) присутствуют многочисленные вещества, представляющие собой эфиры caffeic acid и altraric acid (или такие изомеры, как например, глюкуроновая кислота). Два пика с временами удерживания 4,52 и 4,76 мин и одинаковыми спектрами соответствуют Dicaffeoyl-D-altraric acid.
Три пика с временами удерживания 9,59; 10,71 и 11,08 представляют Tricaffeoyl-D-altraric acid.
Один пик во фракции №1 идентифицирован как 2,3,4,5etracaffeoyl-D-altraric acid. Эта же фракция имеет пик вещества с временем удерживания 7,30 мин и молекулярной массой 622, содержащего остаток caffeic acid. Поиск в базах данных показал, что таким соединением может быть, например, Crenatoside. Таким образом, по сумме площадей пиков соединений, отражающей количественную меру производных кофейной кислоты, лидирует фракция №1, а в хлороформной фракции (№4) эти компоненты отсутствуют. Бутанольная фракция (№2) содержит только эти компоненты.
Следующим этапом нашей работы являлось идентификацияфлавоноидных соединений в исследуемых фракциях.
1. Определение Flavononols (Dihydroflavonols) Флавононолы (Дигидрофлавонолы)
Эти соединения имеют характерный УФ-спектр с максимумом вблизи к 290 нм и продукты фрагментации в режиме регистрации позитивных ионов до пика m/z=153 или 167.
Во фракциях № 3 и 4 наблюдается пик вещества с временем удерживания 8,32 мин, соответствующий taxifolin (дигидрокверцетин). Кроме того, в этих фракциях имеется пик соединения с временем удерживания 15,52 мин - одного из возможного ацетилированного его производного, например, 3-O-Acetyltaxifolin.
В хлороформной фракции (№4) наблюдается пик вещества с временем удерживания 14,89 мин, которое может иметь структуру метилированного таксифолина, например, Padmatin, поскольку его ацилированная форма описана в литературе. Его ацилированное производное наблюдается во фракциях №3 и 4 в виде пика с временем удерживания 21,65 мин и может иметь структуру 3-O-Acetylpadmatin.
Пик на хроматограмме фракции №4 с временем удерживания 18.4 мин имеет молекулярный вес 302 и ион фрагмента 167, что позволяет предположить его структуру как 7-Methylaromadendrin.
Таким образом, флавононолы (Дигидрофлавонолы) содержатся в большей степени во фракции №4, а в водной и бутанольной фракциях (№ 1 и 2) не обнаруживаются.
2. Определение Flavonols (Флавонолы), Flavons (Флавоны) и их гликозидов. Эти соединения имеют максимум поглощения при 335-375 нм и в случае гликозидов фрагментируются в режиме регистрации позитивных ионов только до агликона.
Фракция №1 содержит 3 пика флавоноидов, имеющих предположительно структуры Linariifolioside, Quercetin 3-glucuronide и Luteolin 7-O-glucuronide с временами удерживания 7,74; 8,09 и 8,29 мин, которые отсутствуют в других фракциях.
Во фракции №2 флавоноиды не обнаружены.
Ряд пиков присутствуют в обоих фракциях №3 и 4. Пик с временем удерживания 14,02 мин имеет молекулярную массу 332, что возможно соответствует структуре Quercetagetin 3 -methyl ether.
Пик соединения с временем удерживания 14,16 мин имеет молекулярный вес 316, что в соответствии с справочными данными позволяет предположить структуру 3-Methylquercetin.
Пик со временем удерживания 15,12 мин имеет такой же молекулярный вес 316, но предположительно имеет структуру Nepetin, наличие которого упоминается в литературе.
Пик с временем удерживания 15,39 мин имеет молекулярный вес 346 и может иметь структуру Tomentin (3,7-Dimethylquercetagetin).
Пик с временем удерживания 16,80 мин имеет молекулярный вес 300. На основании литературных данных из всех возможных изомеров предпочтение можно отдать структуре Hispidulin.
Пик с временем удерживания 20,66 мин имеет молекулярный вес 316 и предположительно имеет структуру Rhamnetin.
В извлечениях №3 и 4 присутствует пик с временем удерживания 13,81 мин, для которого не удалось подобрать возможную структуру.
В извлечении№3 присутствуют 4 пика с временами удерживания 8,21; 8,52; 9,93 и 10,30 мин, которые отсутствуют в других извлечениях и могут иметь структуры Hyperoside, Quercetagetin 3 -methyl ether 3-glucoside, Isorhamnetin-3-O-glucoside и Quercetagetin 3 ,4 -dimethyl-3-O-glucoside. В извлечении№4 присутствуют 3 пика с временами удерживания 18,53; 18,73 и 19,11 мин, которые отсутствуют в других извлечениях и могут иметь структуры 3 ,3-Dimethylquercetin (был обнаружен ранее согласно литературным данным), Rhamnazin и Centaureidin.
Таким образом, наибольшее количество флавонов и флавонолов содержится во фракции №3, а во фракции № 2 они не обнаружены.
3. Соединения, не относящиеся к флавоноидам и другим полифенольным компонентам
Подтверждение специфической активности «Жэтривис-гель» на модели термического ожога
Для подтверждения приемлемости состава и технологии разработанного геля определена фармацевтическая доступность действующих веществ с использованием разработанной методики количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин. Учитывая отсутствие прямой корреляции между фармацевтической доступностью БАС и эффективность препарата, метод равновесного диализа по Крувчинскому может быть использован в качестве показателя способности высвобождать действующие вещества из основы [2].
С помощью методики, описанной в главе 2, фармацевтическая доступность БАС «Жэтривис-гель» была изучена по скорости и полноте высвобождения суммы флавоноидов в пересчете на рутин (рис. 4.5).
Таким образом, фармацевтическая доступность целевых БАС из «Жэтривис-гель», рассчитанная по сумме флавоноидов в пересчете на рутин и составляющая 80±5% за 4 часа эксперимента, свидетельствует о правильности разработанного состава и технологии получения препарата.
Результаты изучения репаративной активности «Жэтривис-гель» в эксперименте, выполненном по методике, описанной в п. 2.2.5.4.2. представлены в таблице 4.17.
Критерием оценки противоожогового действия служил срок наступления полного заживления ран. Полное заживление ожоговых ран у животных, которых лечили препаратом «Жэтривис- гель», наступило на 17 сутки, что на 6 дней раньше, чем в контроле (заживление на 23 сутки).
Препарат сравнения вызывал полное заживление на 21 сутки, что на 2 дня раньше, чем в контроле и позже, чем в группе животных, которых лечили «Жэтривис-гель». Образец основы (плацебо) вызывал полное заживление на 21 сутки.
Результаты доклинического экспериментального изучения показали, что «Жэтривис-гель» обладает лечебным эффектом в условиях модели термического ожога, превышающим лечебный эффект препарата сравнения.
«Жэтривис-гель» не оказывал местно-раздражающего действия, аллергических проявлений не наблюдалось.