Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
Глава 2 Материалы и методы исследования 44
Препараты и вещества 44
Животные 44
Методы исследования 45
2.1 Моделирование болезни Альцгеймера 45
2.1.1 Модель болезни Альцгеймера, вызванная внутрижелудочковым введением амилоида (25-35)
2.1.2 Модель болезни Альцгеймера, вызванная длительным введением и отменой скополамина
2.2 Модели инсультов 46
2.2.1 Моделирование фокального инсульта с помощью фототромбоза
2.2.2 Моделирование интрацеребрального геморрагического инсульта (посттравматическая гематома)
2.3 Методики исследования влияния веществ на когнитивные функции, обучение и память
2.3.1. Водный лабиринт Морриса 51
2.3.2 Обучение в Y- образном лабиринте 51
2.3.3 Обучение условному рефлексу активного избегания (УРАИ) 52
2.3.4 Обучение условной реакции пассивного избегания (УРПИ) 53
2.3.5 Амнезия условной реакции пассивного избегания, вызванная максимальным электрошоком (МЭШ)
2.3.6 Амнезия условной реакции пассивного избегания, вызванная скополамином
2.3.7 Амнезия условной реакции пассивного избегания, вызванная кетамином
2.4 Методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) 54
2.5 Методика открытого поля 55
2.6 Методика исследования неврологического дефицита по шкале Stroke-index McGrow
2.7 Методика исследования нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня
2.8 Методика исследования миорелаксации в тесте подтягивания на горизонтальной перекладине
2.9 Методики исследования антидепрессивных свойств соединений
2.9.1 Методика вынужденного плавания по Порсолту 57
2.9.2 Методика подвешивания мышей за хвост 57
2.10 Изучение противогипоксических свойств 58
2.10.1 Модель гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме 58
2.10.2 Модель гемической гипоксии с нитритом натрия 58
2.11 Моделирование судорожных состояний 58
Статистическая обработка результатов 58
Результаты исследований 60
Глава 3 Изучение нейропротективной активности ГК-2h на моделях болезни Альцгеймера
3.1 Влияние димерного пептида ГК-2h на поведение и память крыс на модели БА, вызванной внутрижелудочковым билатеральным введением крысам A(25-35)
3.2 Эффекты веществ у крыс с дефицитом холинергической системы, вызванным длительным введением и отменой скополамина
3.3 Влияние ГК-2h на брадикинезию у крыс с холинергическим дефицитом
Глава 4 Изучение нейропротекторной активности ГК-2h на моделях Инсульта
4.1 Влияние соединений на поведение и состояние животных после геморрагического инсульта
4.2 Влияние соединений на поведение и состояние животных на модели ишемического инсульта, вызванного фототромбозом
Глава 5 Общий спектр фармакологической активности ГК-2h
5.1 Изучение антиамнестических свойств 96
5.2 Изучение антидепрессивного эффекта 101
5.3 Изучение противогипоксических свойств 102
5.4 Изучение противосудорожных свойств 103
5.5 Изучение поведения животных в открытом поле и приподнятом 104 крестообразном лабиринте
Заключение 107
Выводы 113
Список сокращений и обозначений 115
Список литературы
- Модель болезни Альцгеймера, вызванная внутрижелудочковым введением амилоида (25-35)
- Амнезия условной реакции пассивного избегания, вызванная максимальным электрошоком (МЭШ)
- Эффекты веществ у крыс с дефицитом холинергической системы, вызванным длительным введением и отменой скополамина
- Влияние соединений на поведение и состояние животных на модели ишемического инсульта, вызванного фототромбозом
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время с увеличением продолжительности жизни населения, ухудшением экологической обстановки отмечается рост больных с патологиями, сопровождающимися нейродегенеративными процессами, такими как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона, синдром Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, инсульты, различные деменции, тяжелые депрессивные расстройства и др. Прогресс в определении механизмов нейродегенераций способствует расширению сфер поиска новых эффективных лекарственных средств. Для большинства нейродегенеративных заболеваний не разработано терапевтических методов и схем, позволяющих остановить патологический процесс и тем более, излечить. Применяемые медикаментозные и немедикаментозные методы лечения способны лишь замедлить течение этих заболеваний et all. // -2013. -Vol. 138, № 2. - P. 155-175; Boland, B. et al. // Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. - 2015. - Vol. 29, № 2. - P. 127-143).
Прогресс в определении механизмов нейродегенераций способствует выявлению новых фармакологических мишеней для разработки эффективных средств патогенетической фармакотерапии. Один из актуальных подходов к созданию таких препаратов базируется на современных представлениях о механизмах эндогенного регулирования функций нейронов и их регенерации. Среди известных эндогенных регуляторных белков особое внимание уделяется факторам роста нервной ткани, в частности, нейротрофинам и среди них фактору роста нервов (ФРН, nerve growth factor, NGF). ФРН участвует в росте, созревании и поддержании жизнедеятельности нейронов в центральной и периферической нервной системе, как в норме, так и при патологии et al. // - 2013. - Vol. 31, № 4. - P.115-122).
Известно вовлечение ФРН в патогенез болезней с нейродегенерацией, в частности, БА, инсультов и др. Показано, что БА сопровождается изменениями в содержании ФРН в мозге (кора, гиппокамп, базальные ядра переднего мозга), нарушениями ретроградного транспорта нейротрофина et al. // - 2000. – Vol. 57, № 6. - Р. 846-851) в результате наблюдается уменьшение плотности нервных волокон, снижение холинергической передачи et al. // - 2010. - Vol. 70, № 5. - Р. - 372-383). Применение ФРН у пациентов с БА приводит к частичному восстановлению функций центральной нервной системы et al. // - 2014. - Vol. 11, №1. - P. 27-39). Известно, что при инсультах происходит изменение содержание ФРН в мозге (Lindvall, O. et all. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - № 89. - P. 648-652). В экспериментальных исследованиях показано, что введение NGF в желудочки мозга животных до или после начала экспериментальной ишемии
головного мозга оказывает нейропротективное действие и снижает неврологический дефицит (Yang, J. et al. // Neurol Sci. – 2011. - № 32. – P. 433-441; et al. // – 2011. – Vol. 18, № 5. – P. 338-43). Вместе с тем, терапевтическое использование самого ФРН ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), возможностью иммунной реакции, наличием побочных эффектов за счет его плейотропности. Актуальным подходом к регуляции системы факторов роста нервной ткани в ЦНС является создание (конструирование и синтез) низкомолекулярных миметиков факторов роста, взаимодействующих с соответствующими рецепторами (Obianyo, O. et al. // Biochim. Biophys Acta. - 2013. – Vol. 1834, № 10. - P. 2213-2218).
Степень разработанности проблемы. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова в течение нескольких десятилетий проводятся исследования по созданию и изучению механизмов действия нейропсихотропных лекарственных препаратов, в частности, с нейропротекторной активностью (Воронина, Т.А. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010.-N11. - С.2-5; Середенин, С.Б. и др. // Психиатрия и психофармакотерапия. - 2013. - N1. - С. 59-61). Была сформулирована оригинальная гипотеза о возможности конструирования фармакологически активных дипептидов на основе петлеобразных структур белков, определяющих рецепторное взаимодействие , et al. // – 2015. – V. 22. – P. 106-116). Определено, что фармакофорными участками нейротрофина являются их бета-изгибы (последовательность из четырех аминокислотных остатков с бета-поворотной конформацией) и созданы дипептидные миметики факторов роста (Пат. 2410392 РФ. Дипептидные миметики нейротрофинов NGF и BDNF / Середенин С.Б. и др. 27.01.2011. Бюл. №3). В опытах на животных выявлены нейропротекторные свойства дипептидного миметика 4-й петли фактора роста нервов крысы (Поварнина, П.Ю., и др. // Acta Naturae. – 2013. - Т. 5, № 3(18). - С. 61-68).
Новый низкомолекулярный димерный дипептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина), ГК-2h, в исследованиях in vitro проявил нейропротективные свойства (Антипова, Т.А. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2014. - Т. 77, № 2. – С. 8-11).
Целью исследования явилось изучение нейропсихотропных свойств димерного дипептидного миметика фактора роста нервов человека гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина), ГК-2h в опытах на животных. Основные задачи исследования:
1. Изучить эффект димерного дипептидного миметика фактора роста нервов человека ГК-2h на модели болезни Альцгеймера, вызванной интрацеребровентрикулярным введением амилоида (25-35) в сравнении с мемантином.
-
Изучить эффект ГК-2h на модели болезни Альцгеймера, вызванной длительным введением и отменой скополамина в сравнении с мемантином.
-
Изучить активность соединения ГК-2h на модели геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой (гибель животных, неврологический дефицит, ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле и приподнятом крестообразном лабиринте, обучение и память) в сравнении с димерным дипептидным миметиком фактора роста нервов крысы гексаметилендиамидом бис (N-моносукцинил-глутамил-лизина) ГК-2, гимантаном и мемантином.
-
Изучить нейропротекторное действие ГК-2h на модели геморрагического инсульта (ГИ), вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой (ИПГ), с проведением морфометрических исследований.
-
Изучить нейропротекторное и антиамнестическое действие ГК-2h у крыс с двусторонней фокальной фотоиндуцированной ишемией префронтальной коры головного мозга.
-
Изучить общий спектр фармакологической активности ГК-2h.
Научная новизна.
Впервые изучен спектр нейропсихотропной активности нового соединения
гексаметилендиамид бис (N-моносукцинил-глицил-лизина), димерного дипептидного миметика 4-ой петли фактора роста нервов человека ГК-2h на экспериментальных моделях in vivo. Показано, что ГК-2h, при системном, внутрибрюшинном введении обладает протекторными свойствами на моделях БА, геморрагического и ишемического инсультов у крыс. На модели БА, вызванной амилоидом (25-35), ГК-2h в дозе 0,1 мг/кг при 5-ти дневном ведении ослабляет нарушения пространственной ориентации и памяти. На модели холинергического дефицита, вызванного повторным введением и отменой скополамина, ГК-2h восстанавливает формирование условного рефлекса активного избегания. На модели геморрагического инсульта ГК-2h уменьшает гибель животных, ослабляет неврологический дефицит, нормализует ориентировочно-исследовательское поведение и память, а у крыс с ишемическим инсультом ГК-2h улучшает воспроизведение памятного следа. Нейропротекторная активность ГК-2h на обеих моделях инсульта подтверждена морфометрически: ГК-2h увеличивает плотность выживших нейронов в мозге крыс после геморрагического инсульта и уменьшает (в 2 раза) общий объем повреждения мозга у животных с ишемией в сенсомоторной области коры.
Изучение общего спектра фармакологической активности показало, что ГК-2h в диапазоне доз 0,1-2,0 мг/кг, проявляет антиамнестические свойства на модели амнезии УРПИ, вызванной максимальным электрошоком, скополамином или кетамином. ГК-2h (1,0 мг/кг/ 5дней) оказывает противогипоксическое действие на модели гипоксии с гиперкапнией в
гермообъеме. В используемых дозах ГК-2h не влияет на поведение крыс в открытом поле и приподнятом крестообразном лабиринте.
На моделях БА в сравнении с мемантином эффект ГК-2h выявляется в меньших дозах.
Эффективность ГК-2h на модели геморрагического инсульта сопоставима с активностью
димерным дипептидным миметиком 4-ой петли фактора роста нервов крысы, ГК-2, и
мемантином, превосходит гимантан.
Научно-практическая значимость. Полученные результаты о нейропротекторной
активности ГК-2h на моделях БА и инсультов открывают перспективу для дальнейшего
доклинического изучения соединения с целью разработки эффективного нейропротектора на
основе замещенного димерного дипептида, миметика ФРН. Разработанный методологический
подход, позволивший определить спектр нейропсихотропного эффекта ГК-2h, может быть
применен для исследования новых дипептидных соединений с предполагаемой
нейропсихотропной активностью.
Методология и методы исследования. Методологический подход включал исследование нейропсихотропной активности нового дипептидного соединения на двух моделях инсульта, ишемического и геморрагического, и двух моделях болезни Альцгеймера, что позволило получить результаты, воспроизведенные в нескольких методиках. Полученные в поведенческих методиках на двух моделях инсульта данные о нейропротекторной активности соединения, подтверждены морфометрически.
Спектр нейропсихотропной активности нового соединения определен с использованием батареи валидированных методов, позволивших получить объективные данные об антиамнестической, противогипоксической активности нового соединения.
Связь темы диссертации с научными планами института. Диссертация выполнена в рамках НИР ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» Рег. № 01201169192.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Пептидный миметик 4-й петли фактора роста нервов человека ГК-2h проявляет нейропротекторные свойства на модели болезни Альцгеймера, вызванной введением в желудочки мозга амилоида (25-35).
-
ГК-2h оказывает антиамнестическое действие на модели холинергического дефицита, вызванного длительным введением и отменой скополамина.
-
ГК-2h проявляет нейропротекторные и антиамнестические свойства на моделях геморрагического инсульта, вызванного интрацеребральной посттравматической гематомой и ишемического инсульта, вызванного фотоиндуцированным тромбозом сосудов коры головного мозга.
-
ГК-2h проявляет антиамнестические свойства на моделях амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, скополамином или кетамином, умеренными противогопоксическим, противосудорожным эффектами.
-
ГК-2h повторяет эффекты, характерные для целого белка ФРН (нейропротективный, когнитивнопозитивный).
Степень достоверности. Исследование выполнено на большом экспериментальном материале с использованием адекватных методов исследования; статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием современных методов математической статистики.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены
на 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной
чувствительности к психотропным средствам» (Московская область, 2010), 3-ем Всероссийском
научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты
экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), IV съезде фармакологов России «Иновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 28 Всемирном конгрессе Нейропсихофармакологии (Стокгольм, 2012), Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция», посвященной 90-летию Отдела нейрофармакологии им. С.В. Анничкова ИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2013), 5-ом Международном конгрессе по психофармакологии и Международном симпозиуме по детской и подростковой психофармакологии (Анталия, Турция, 2013), Всероссийской конференции молодых ученых с Международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 2015), 6-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Московская область, 2015).
Личный вклад автора. Автором лично проведен обзор и анализ литературы по теме диссертации, выполнены эксперименты на моделях болезни Альцгеймера и геморрагического инсульта, оценка общей фармакологической активности ГК-2h. При включенном участии автора выполнены исследования на модели ишемического инсульта, вызванного фототромбозом, а также морфометрические исследования. Автором лично проведена обработка
полученных результатов, сформулированы выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 11 тезисов и 1 патент.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах печатного
текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
трех глав собственного исследования, заключения, выводов, научно-практических
рекомендаций и списка литературы, включающего 48 отечественных и 183 зарубежных источников. Работа содержит 32 таблицы и 24 рисунка.
Модель болезни Альцгеймера, вызванная внутрижелудочковым введением амилоида (25-35)
На болезнь Альцгеймера приходится примерно 60-70 % деменций, т.е. около 500000 человек страдающих этим заболеванием в Европе и 5,4 млн. человек в США, что составляет приблизительно 1-2 % населения. Согласно исследованиям, проведенным Центром психического здоровья Российской академии медицинских наук, распространенность болезни Альцгеймера в нашей стране примерно такая же, как на Западе. После 70 лет старческим слабоумием страдают 4,6 % людей, после 80 лет — 16–18 %. Связанные с этим расходы в настоящее время оцениваются приблизительно в 15 миллиардов фунтов стерлингов в год в Великобритании и 183 млрд. долларов в США. Факторы риска заболевания включают преклонный возраст, сахарный диабет и ожирение; учитывая рост доли пожилых людей в населении планеты, а также число людей страдающих ожирением и сахарным диабетом, можно ожидать, что распространенность БА возрастет в течение следующего десятилетия. У людей страдающих БА наблюдается прогрессирующее снижение психических функций, проявляются нарушения памяти и других когнитивных процессов, часто отмечаются трудности с языком. Обследование с помощью МРТ пациентов, не имеющих клинической симптоматики БА, показало изменения в базальных отделах переднего мозга и энторинальной коре ещё за четыре года до появления первых симптомов [112]. Позже, в процессе прогрессирования заболевания, истончаются корковые мантии и увеличиваются желудочки, проявляется большая потеря нейронов в специфических отделах мозга, таких как гиппокамп, кора [183]. Серьезные изменения претерпевает холинергическая система. Показано, что функция холинергической системы в мозге, которая измерялась, как поглощение холина, синтез ацетилхолина и ацетилхолинтрансферазная (ChAT) активность у пациентов на раннем этапе БА уменьшена примерно на треть от нормальной [69,196]. В среднем, у больных, как правило, диагностируемые симптомы БА проявляются после 70 лет или позже. Большинство случаев БА имеют многофакторную природу (факторы риска генетического и экологического происхождения) и являются спорадическими. Семейные (наследственные) формы БА с ранним началом (familial cases of AD, FAD), характеризуются аутосомно-доминантным наследованием. Симптоматика и картина нейропатологии наследственной формы БА аналогична той, которая наблюдается при спорадической форме, однако, как правило, проявляется намного раньше. Существует три гена, связанных с наследственной БА, ген кодирующий белок-предшественник бета-амилоида (APP) на 21-й хромосоме, а также PSEN1 и PSEN2, которые кодируют пресенилин 1 и пресенилин 2. Эти гены расположены на 14 и 1 хромосомах соответственно. При наследственной форме БА в большинстве случаев деменция развивается уже к 40 годам. Предполагается, что причиной этого является наличие дополнительных копий гена APP, что приводит к увеличению образования A. Особенностью мутаций в трех генах, приводящих к наследственной БА, является увеличенное образование общего A или увеличение образования A в соотношении 42:40 [67]. Эти мутации были использованы для получения трансгенных животных, у которых проявляются ряд симптомов БА [120]. Амилоидная гипотеза БА [106, 115], в которой все патологии и симптомы БА основываются на эффектах A, предполагает, что избыточное присутствие внеклеточных депозитов пептида A ("амилоидных бляшек") является основной причиной образования нейрофибриллярных клубков (комплекты парных спиральных волокон тау -белка в нейронах) и внеклеточных депозитов пептида A ("амилоидных бляшек") [114]. Пептид A является производным от гораздо большего амилоидного белка-предшественника (APP) [185] и, как правило, состоит из 40 или 42 аминокислот. В большинстве случаев нейрофибриллярные патологии появляются вначале в энторинальной коре, продвигаясь затем к гиппокампу и позже - в различные части неокортекса и этот патологический процесс напрямую коррелирует со стадиями деменции [70]. На схеме представлено краткое описание нейропатологических процессов, которые происходят в мозге при БА, и возможные терапевтические мишени (рисунок 6).
Рисунок 6 - Упрощенная схема патологических процессов при БА и возможные терапевтические мишени для лечения [53]
Патология: белок предшественник амилоида (APP) расщепляется в основном (приблизительно 95% времени) альфа-секретазой (ADAMs (disintegrin и metalloprotease) ферментом семейства секретаз либо ADAM9, 10 и 17). Это инициирует не амилоидогенный путь, при котором образуется C-r концевой пептид, из 83 аминокислот. При расщеплении белка предшественника (APP) бета-секретазой (преимущественно BACE1-фермент расщепления бета-сайта APP), образуется С-концевой пептид из 99 аминокислот. Гамма-секретаза (состоящая из четырех белков, в том числе пресенилина, PS1) расщепляет C83 до образования p3 (3 кда протеин). Также она расщепляет C99 до образования 4 кда протеина (A) и внутриклеточного домена белка предшественника амилоида APP (AICD). Длина A обычно составляет 40 аминокислот (A40), он достаточно растворим, чтобы попасть в кровеносные сосуды, где может откладываться. При формировании A42, который фибрилизуется довольно быстро, образуются амилоидные бляшки. Эта форма считается более токсичной, особенно внутри нейронов, так как вызывает продукцию активных форм кислорода, которые дестабилизируют мембрану и образуют токсичные продукты. Амилоидные бляшки стимулируют продукцию воспалительных цитокинов, которые вызывают дальнейшее повреждение нейронов. Тау, который обычно связан с микротрубочками, гиперфосфорилируется киназой (например, гликоген-синтазакиназой 3; GSK3), при этом считается, что это вызывает его отделение от микротрубочек и образование клубков.
Терапевтические мишени: T1: CEI - ингибиторы холинестеразы; T2: ингибиторы BACE1; T3: вакцины, для растворения агрегированного A; T4: ингибиторы гамма-секретаз; T5: деагрегаторы Тау или ингибиторы киназ (например, ингибиторы GSK3); T6: белки NGF, BDNF или небольшие молекулы-агонисты/модуляторы нейротрофинов; T7: нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), T8: активаторы синтеза ApoE [89]; T9: агенты, уменьшающие митохондриальной стресс; T10 стимуляция гиппокампальных путей глубокой стимуляцией головного мозга; T11: антибиотики для профилактики инфекции, которая приводит к активации глии и высвобождению TNF.
Амнезия условной реакции пассивного избегания, вызванная максимальным электрошоком (МЭШ)
Одним из направлений по созданию эффективных препаратов на основе NGF является поиск малых молекул миметиков нейротрофина [192]. Так, в 2000 году были синтезированы и опробированы димерные миметики петли NGF, связанной с TrkA рецептором [228]. Эти соединения оказывали нейротрофическое действие при исследованиях in vitro и активировали ERK (extracellular signal-regulated kinase) and Akt. Затем были разработаны и другие аналогичные миметики NGF с нейротрофической активностью [176, 229]. Позже с помощью скрининг-тестов были определены малые молекулы агонисты TrkA. К ним относится амид Gambogic (содержащийся в смоле дерева Garcinia hanburryi), который взаимодействует в ближайшем к мембране домене с TrkA рецептором и индуцирует димеризацию рецепторов, фосфорилирование и сигнализацию. В опытах in vitro была показана его способность предотвращать глутамат-индуцированную гибель нейронов, а также инициировать рост нейритов в PC12 клетках. Применение Gambogic кислоты уменьшало размер инфаркта, полученного на модели инсульта путем окклюзии транзиторных церебральных артерий, а также снижало гибель нейронов, наблюдемую при их повреждении каиновой кислотой в опытах на мышах [125]. Позже были описаны малые молекулы агонистов NGF, которые в наномолярных концентрациях обладали сродством к TrkA рецептору [190]. Самая сильная реакция фосфорилирования определялась на остаток Tyr490, в то время как у других остатков тирозина, т.е. 674/5 и 785 такого эффекта не отмечалось. Эти результаты послужили основанием для формирования двух направлений исследования, которые могли бы объяснить, почему трофические функции, такие, как выживание клеток PC12 в условиях сывороточного голодания и поддержание культивированных клеток гиппокампа крысы с недостаточностью NGF, на фоне этих соединений оказались сильнее, а реакции дифференцирования, например, рост нейритов, оказались у этих животных слабыми. Это направление исследований в настоящее время рассматривается как одно перспективных для разработки лекарственных препаратов [190].
Известно, что p75NTR может быть связан с некрозом клеток ChBF нейронов и некоторых клеток гиппокампа, которые гибнут при БА. Группа Фрэнка Лонго исследовала малые молекулы [133,148,149] LM11A-24, производные кофеина, и LM11A-31, производные изолейцина, которые в наномолярных дозах являются антагонистами p75NTR. Эти молекулы были получены in silico (компьютерное моделирование) при скрининге фармакофора нейротрофинов (петля 1)-p75NTR взаимодействующий домен [153]. Как было показано, LM11A-24 способствовал выживанию нейронов гиппокампа и защищал олигодендроциты от proNGF-индуцированного апоптоза через p75NTR. LM11A-24 предотвращал p75NTR-зависимый некроз мотонейронов у мышей линии SOD-1G93A [175]. Далее было показано, что эти соединения подавляют дистрофию нейронов, вызванную A и гибель пирамидальных нейронов в культуре клеток гиппокампа, ингибируют киназы (cdk5 и GSK3), участвующие в патогенезе БА. Это приводит к снижению Тау-фосфорилирования и предотвращению инактивации AKT и CREB. Соединение LM11A-31 блокировал A-индуцированный дефицит гиппокампальной LTP (Longerm potentiation) [224].
В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» в отделе химии сконструированы и получены димерные дипептидные миметики 4-ой петли NGF крыс (ГК-2, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-глутамил-лизина) и NGF человека (ГК-2h, гексаметилендиамид бис-(N-моносукцинил-глицил-лизина) [12]. Димерный дипептид ГК-2 (гексаметилендиамид бис-(М-моносукцинил-глутамил-лизина)) (рисунок 8): Тпл =120-128С; []25D=-44.0 град (с 0.1; вода); Rf-0,41 (ТСХ проводили на пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системе растворителей хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода, 15:10:2:3); Rf-0,20 (ТСХ проводили на пластинах Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системе растворителей н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода, 15:10:3:6) [34].
В экспериментальных исследованиях показано, что ГК-2 в концентрациях 10-5 -10-8 М, введенный при посеве культуры иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии HT-22, и каждые 24 часа в течение 10 дней, улучшл жизнеспособность нейронов при отсутствии каких-либо повреждающих факторов [34]. В тех же концентрациях ГК-2, в культуре клеток линии HT-22, демонстрировал нейропротективные свойства, улучшая выживаемость нейронов [3]. В концентрации 10-5 М ГК-2 проявлял нейропротективные свойства на первичной культуре нейронов среднего мозга и гиппокампа 18-ти дневных эмбрионов. В условиях клеточной модели болезни Паркинсона защитный эффект ГК-2 проявлялся при внесении соединения одновременно с МРТР в концентрации 10-5М, а при внесении за 24 часа до МФТП действие ГК-2 проявлялось при его использовании в двух концентрациях - 10-5М и 10-8М [3]. В экспериментальных исследованиях было показано, что нейропротекторное действие ГК-2 связано с активацией синтеза белков теплового шока HSP32 и HSP70 и увеличением фосфорилирования TrkA [4,15].
Показана эффективность ГК-2 в опытах in vivo [1,20,36,41]. Так, на модели ишемического инсульта, индуцированного односторонним внутрисосудистым перекрытием ветви средней мозговой артерии у ГК-2 выявлена выраженная антиишемическая активность, которая характеризовалась снижением объема пораженного участка головного мозга, уменьшением у животных неврологического дефицита [36,40,41]. Изучение антипаркинсонической активности ГК-2 показало, что вещество оказывает антикаталептогенное действие, предупреждая экстрапирамидальные нарушения, вызванные галоперидолом и акинезию, вызванную МФТП [35]. Исследование эффектов ГК-2 на экспериментальных модели болезни Альцгеймера (перерезка септо-гипокампального пути) выявило способность соединения предотвращать у крыс нарушения памяти [37]. Противодиабетическая активность соединения была выявлена на модели диабета, вызванного стрептозотоцином [38].
Эффекты веществ у крыс с дефицитом холинергической системы, вызванным длительным введением и отменой скополамина
Начиная с третьего дня обучения в группе пассивного контроля наблюдалось постепенное возрастание количества условных реакций. При этом критерия обученности (пять условных реакций из 8 предъявлений) к пятому дню обучения достигли 70% крыс. Уменьшалось и количество отказов от выполнения адекватных реакций (таблица 3; рисунок 13). Обучение УРАИ животных группы активного контроля (получавших скополамин) проходило значительно медленнее. Так, на протяжении всего времени эксперимента, динамика формирования рефлекса у этих животных сильно отставала от динамики у крыс пассивного контроля, и на пятый день обучения только 30 % животных достигли критерия обученности УРАИ. При этом увеличивалось и число отказов от выполнения адекватных реакций (таблица 3; рисунок 13).
У крыс, получавших ГК-2h в дозе 0,2 мг/кг/10 дней на фоне дефицита холинергической системы, динамика формирования УРАИ практически не отличалась от показателей у животных пассивного контроля. Так, к пятому дню обучения 70% крыс, получавших соединение, достигли критерия обученности, в то время как в группе активного контроля этот показатель составлял только 30% (таблица 3; рисунок 13).
Проведенные исследования показали, что ГК-2h (0,2 мг/кг/10 дней, в/б) обладает позитивным эффектом у крыс с дефицитом холинергического системы, корректируя нарушения обучения и памяти, вызванные длительным введении и отменой холиноблокатора скополамина. Эффект вещества характеризовался увеличением безусловных реакций на ранних этапах формирования УРАИ. На смену безусловных реакций нарастало количество условно-рефлекторных избеганий в челночной камере. К концу эксперимента показатели крыс в группах, получавших ГК-2h, не отличались от таковых у животных пассивного контроля, получавших воду, как по показателю реакций избегания, так и по показателю количества животных достигших критерия обученности (таблица 3; рисунок 13). На фоне ГК-2h у животных при выполнении рефлекса отмечалось значительно меньше отказов от выполнения адекватных реакций в сравнении с активным контролем с холинергическим дефицитом. Это свидетельствует о том, что ГК-2h при внутрибрюшинном введении способен оптимизировать процесс обучения УРАИ на модели холинергического дефицита у крыс. Позитивное когнитивное действие ГК-2h по всем регистрируемым показателям не уступает мемантину в дозе 2,0 мг/кг/10 дней (таблица 3; рисунок 13). 3.3 Влияние ГК-2h на брадикинезию у крыс с холинергическим дефицитом
Изучение влияния ГК-2h на брадикинезию у крыс с холинергическим дефицитом, вызванным длительным введением и отменой скополамина, проводили с использованием Pole-теста. Определяли уровень нарушения неврологического статуса, характеризующегося брадикинезией – увеличением времени поворота головы и спуска с шеста при посадке крысы на его вершину.
Установлено, что в Pole-тесте у крыс группы активного контроля, на фоне холинергического дефицита, в сравнении с пассивным контролем отмечалось увеличение времени выполнения рефлекса, поворота головы и спуска животного с шеста, т.е. наблюдалась брадикинезия. ГК-2h в дозе 0,2 мг/кг/10 дней при внутрибрюшинном введении животным с холинергическим дефицитом уменьшал время выполнения Pole-теста по показателю t-спуска до уровня в группе крыс пассивного контроля (рисунок 14), т.е. ослаблял брадикинезию.
Стьюдента) При БА в структурах переднего мозга происходит снижение активности основного фермента синтеза ацетилхолина, холин-ацетилтрансферазы, и повышение активности фермента, разрушающего ацетилхолин, ацетилхолинэстеразы, и, как следствие, уменьшение содержания ацетилхолина. Также при БА наблюдается активная деградация нейронов холинергической системы, тесно связанная со снижением количества в тканях мозга, в особенности гиппокампа, ростовых факторов. Транспорт таких важных факторов осуществляется по нейронам холинергической системы, поэтому деградация этих нейронов влечет за собой развитие дефицита ростовых факторов, а недостаток ростовых факторов провоцирует гибель нейронов холинергической системы.
ГК-2h при внутрибрюшинном введении обладает способностью ослаблять нарушения памяти у животных с холинергическим дефицитом, вызванным длительным введением и отменой скополамина. Эффект вещества, характеризуется значительным улучшением выработки нарушенного у крыс, получавших скополамин, условного рефлекса активного избегания по показателям скорости формирования рефлекса и количества обучившихся крыс. На фоне ГК-2h у животных при выполнении рефлексов отмечалось значительно меньше отказов от выполнения реакций. Кроме позитивного когнитивного действия у крыс с холинергическим дефицитом выявлен эффект ГК-2h характеризующийся ослаблением брадикинезии. ГК-2h в дозе 0,2 мг/кг при внутрибрюшинном введении животным с холинергическим дефицитом уменьшал время выполнения Pole-теста по показателю времени спуска с шеста до уровня пассивного контроля.
Известно, что в лабиринте Морриса рассматриваются две стратегии поведения, за каждую из которых ответственны разные отделы мозга. Стратегию ориентации в воде при поиске платформы определяет септум, а процесс запоминаеия, памяти – гиппокамп и фронтальная кора. После введения A (25-35) у крыс развивались нарушения, как координации, так и памяти. Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что ГК-2h в дозе 1,0 мг/кг улучшает воспроизведение навыка у крыс в сравнении с активным контролем (с A (25-35). Возможно подобное поведение леченых животных определяется протекторными свойствами ГК-2h, вызывающими улучшение функционального состояния в упомянутых выше отделах мозга. Полученные данные опубликованы в работе [26].
Влияние соединений на поведение и состояние животных на модели ишемического инсульта, вызванного фототромбозом
Изучение антиамнестических свойств ГК-2h проводилось на моделях амнезии УРПИ, вызванной МЭШ, скополамином или кетамином. Показано, что МЭШ, скополамин в дозе 0,5 мг/кг или кетамин в дозе 10 мг/кг вызывали у крыс амнезию УРПИ. Это характеризовалось уменьшением латентного времени при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения и уменьшением количества обучившихся крыс (не зашедших в темную «безопасную» камеру) (таблицы 21, 22, 23, рисунок 24).
На модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ показано, что ГК-2h в дозах 0,1; 0,3; 0,6 и 2,0 мг/кг не оказывал влияния на формирование УРПИ, в дозе 1,0 мг/кг увеличивал количество обучившихся рефлексу животных, а в дозе 1,5 мг/кг ГК-2h существенно увеличивал оба показателя поведения крыс -латентное время рефлекса (в 2,1 раза при Р 0,05) и количество обучившихся животных до 100% (в 3 раза при Р 0,05) (таблица 21). Это свидетельствует об антиамнестическом эффекте ГК-2h на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ и куполообразной зависимости этого эффекта от дозы соединения.
Примечание - Достоверность отличий от контроля, # - достоверность отличий от контроля с МЭШ при Р0,05 (критерий Манна-Уитни) ; W - достоверность отличий от контроля, S - достоверность отличий от контроля с МЭШ при Р0,05 (точный критерий Фишера)
На модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином наиболее отчетливо эффект ГК-2h выявлялся при использовании соединения в дозе 0,5 мг/кг, в дозе 0,1 мг/ кг наблюдалась тенденция увеличения латентного времени рефлекса, а в дозе 1,0 мг/кг эффект исчезал. Вместе с тем, при повторном 5-ти дневном предварительном внутрибрюшинном введении крысам ГК-2h в дозе 0,1 мг/кг регистрировался сильный антиамнестический эффект, характеризующийся полным восстановлением памятного следа, нарушенного скополамином и показатели поведения животных на фоне соединения не отличались от таковых в контрольной группе без скополамина (таблица 22).
Примечание - Достоверность отличий от интактных животных, #- достоверность отличий от контрольных животных со скополамином при Р0,05 (критерий Манна-Уитни); W - достоверность отличий от контроля, S - достоверность отличий от контроля со скополамином при Р0,05 (точный критерий Фишера) На модели амнезии УРПИ, вызванной кетамином, антиамнестический эффект ГК-2h выявлялся в дозе 1,0 мг/кг и характеризовался значительным увеличением обоих показателей поведения крыс при воспроизведении рефлекса (таблица 23).
Примечание - Достоверность отличий от интактных животных, # - достоверность отличий от контрольных животных с кетамином при Р0,05 (критерий Манна-Уитни); W -достоверность отличий от интактных животных, S -достоверность отличий от контрольных животных с кетамином при Р0,05 (точный критерий Фишера)
Изучение антидепрессивного эффекта проводилось с использованием методов вынужденного плавания по Порсолт и в тесте подвешивания за хвост. Установлено, что в опытах на мышах в тесте Порсолт ГК-2І1 в дозе ОД мг/кг не оказывал влияния на поведение животных, а в дозе 1,0 мг/кг при предварительном 5-и дневном введении у животных наблюдалась тенденция уменьшения времени иммобилизации (таблица 24).
В тесте подвешивания мышей за хвост, установлено, что в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг при внутрибрюшинном введении ГК-2І1 не влияет на латентный период подтягивания задних конечностей и время иммобилизации животных при наблюдении в течение 6-и минут. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в используемых дозах у ГК-2І1 антидепрессивный эффект не выявлялся (таблица 25).
Изучение противогипоксического действия ГК-2h осуществлялось на моделях гемической гипоксии, вызванной нитритом натрия и гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме в опытах на мышах. Установлено, что на модели гемической гипоксии соединение в дозе 0,1 мг/кг не оказывало влияния на продолжительность жизни животных, при введении ГК-2h в дозе 1,0 мг/кг отмечалась тенденция увеличения продолжительности жизни беспородных мышей (таблица 26). На модели гипоксии с гиперкапнией, противогипоксический эффект ГК-2h выявлялся в дозе 1,0 мг/кг при 5-ти дневном введении в опытах на мышах линии С57Black6 (таблица 27).
Исследование противосудорожных свойств ГК-2h на модели судорожных реакций, вызванных МЭШ в опытах на мышах линии С57Black6 показало, что в дозах 0.1, 0.5, 1.0 и 2.0 мг/кг соединение не способно предупреждать различные проявления судорожных реакций и уменьшать гибель животных. Лишь в дозе 1,5 мг/кг отмечалось статистически достоверное ослабление судорожных реакций и тенденция уменьшения количества погибших мышей (таблица 28).