Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 12
1.1. Фармакология ноотропных средств. 12
1.1.1. Общая характеристика и классификация ноотропных средств. 12
1.1.2. Фармакологические свойства ноотропных препаратов. 16
1.1.3 Клиническое применение ноотропных препаратов. 19
1.1.4. Механизмы действия ноотропов. 22
1.1.5. Фармакологические свойства пирацетама. 23
1.1.6. Фармакологические свойства ноопепта. 30
1.1.7. Фармакологические свойства пантогама. 34
1.1.8. Фармакологические свойства бемитила. 39
1.2. Межлинейные поведенческие отличия линий мышей Balb/c и С57Black/6. 44
1.3. Рецепторные системы. 47
1.3.1. NMDA-рецепторы. 47
1.3.2. Бензодиазепиновые рецепторы. 51
1.3.3. Межлинейные нейрорецепторные различия линий мышей Balb/c и С57Black/6 56
Глава 2. Материалы и методы. 58
2.1. Материалы. 58
2.1.1. Животные. 58
2.1.2. Вещества. 58
2.2. Методы. 60
2.2.1. Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте . 60
2.2.2. Радиолигандный анализ. 62
2.2.2.1. Радиолигандный анализ NMDA рецепторов. 62
2.2.2.2. Радиолигандный анализ бензодиазепиновых рецепторов. 64
2.2.2.3. Определение концентрации белка методом Лоури.
2.2.2.4. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. Результаты 6 7
3.1. Изучение поведения мышей Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте. 67
3.1.1. Изучение исследовательской активности, тревожность мышей линий Balb/c и С57Black/6 в закрытом крестообразном лабиринте. 67
3.1.2. Изучение влияния ноотропных препаратов на исследовательскую активность, тревожность мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте. 70
3.1.2.1. Влияние острого введения ноотропных препаратов на поведенческие характеристики мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте . з
3.1.2.2. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на поведенческие характеристики мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте. 73
3.1.2.3. Влияние хронического введения ноотропных препаратов на поведенческие характеристики мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте. 75
3.2.1. Сравнение уровней NMDA- и бензодиазепиновых рецепторов у мышей линий Balb/c и С57Bl/6. 79
3.2.2. Влияние острого введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 c NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo. 81
3.2.3. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo 85
3.2.4. Влияние хронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo . 83
3.2.5. Влияние острого введения ноотропных препаратов на характеристики связывания с бензодиазепиновыми рецепторами коры мозга мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo. 87
3.2.6. Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания с бензодиазепиновыми рецепторами коры мозга мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo. 89
3.2.7. Влияние хронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания с бензодиазепиновыми рецепторами коры мозга мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo. 91
Глава 4. Обсуждение 95
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы
- Фармакологические свойства бемитила.
- Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте
- Влияние острого введения ноотропных препаратов на поведенческие характеристики мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте
- Влияние хронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo
Фармакологические свойства бемитила.
Считают, что одним из основных путей воздействия ноотропов на мозг являться влияние на метаболические и биоэнергетические процессы в нейроне и взаимодействие с нейромедиаторными системами мозга.
В основе терапевтического действия ноотропных средств лежат следующие механизмы: - улучшение энергетического состояния нейронов (усиление синтеза АТФ); - антигипоксический (снижение потребности нейронов в кислороде в условиях гипоксии) [34]; - антиоксидантный (ингибирование образования свободных радикалов и перекисного окисления липидов клеточных мембран) [47]; - нейропротективный (повышение устойчивости нервных клеток к воздействию неблагоприятных факторов различного рода) [38]; - усиление эффективности синаптической передачи в ЦНС [62]; - возрастание скорости утилизации глюкозы (особенно в коре головного мозга, подкорковых ганглиях, гипоталамусе и мозжечке); - активация пластических процессов в ЦНС за счет активации синтеза РНК и белков, улучшения обмена нуклеиновых кислот [99]; - мембраностабилизирующее действие (регуляция синтеза фосфолипидов и белков в нервных клетках, стабилизация и нормализация структуры клеточных мембран) [9].
Эффекты некоторых ноотропов может опосредоваться через нейромедиаторные системы головного мозга, среди которых наиболее важные: - моноаминергическая: пирацетам вызывает повышение содержания в мозге дофамина и норадреналина, меклофеноксат и нооглютил облегчает секрецию дофамина при микродиализе стриатума крыс [62]; - холинергическая: нефирацетам и анирацетам потенцируют 42 подтипы никотиновых рецепторов [269], оксирацетам ускоряет высвобождение ацетилхолина из срезов гиппокампа крыс; - глутаматергическая: пирацетам способен проявлять свойства агониста ауторецепторов квисквалатного подтипа [61], увеличивать места связывания для глутамата [200] и для АМРА, анирацетам увеличивает проводимость ионов NMDА-рецепторов через связывание с глициновым сайтом [25, 116, 220]. - ГАМКергическая:
Известно, что ноотропы активируют синтез аденилатциклазы, увеличивая е концентрацию в нервных клетках. В свою очередь, повышенный уровень циклического АМФ (каскадом мало изученных на сегодня внутриклеточных реакций) ведт через изменение потока внутриклеточных ионов K+ и Са2+ к ускоренному высвобождению медиаторов (в том числе серотонина) из сенсорного нейрона. Помимо этого, активированная аденилатциклаза поддерживает стабильность образования в клетке АТФ без участия кислорода, что важно при различных уровнях гипоксии. Коррекция ноотропными препаратами нарушенной функции мозга, в первую очередь памяти, активацией интегративных функций нужна, с одной стороны, для повышения умственной активности человека в пожилом возрасте и в старости, а с другой – для восстановления задержки интеллектуального развития детей.
За многие годы исследований в области молекулярной биологии, нейрохимии, экспериментальной, а также клинической фармакологии появилось большое число публикаций и научных работ, позволяющих по новому взглянуть на возможные механизмы действия и области применения ноотропных препаратов. Особенно много работ посвящено изучению пирацетама. Пирацетам (2-оксо-1-пирродинил-ацетамид) — давно известный препарат, положивший начало всему классу ноотропов. История применения пирацетама в клинике насчитывает уже четыре десятилетия. Изначально препарат использовался для лечения морской болезни. Впервые он появился на рынке в 1972 году под названием «Ноотропил», как препарат для лечения нарушений памяти и равновесия, выпущенный бельгийской компанией UCB Pharma [2].
Несмотря на то, что по своей химической структуре пирацетам можно рассматривать как циклическое производное ГАМК, согласно данным фармакокинетического исследования препарата, циклическая часть его молекулы не подвергается размыканию с образованием ГАМК [2]. Таким образом, пирацетам не рассматривается как значимый агонист (прямой активатор) или ингибитор синаптического действия основных нейротрансмиттеров [113].
Препарат уменьшает содержание свободных жирных кислот, которые в избытке выделяются при ишемии и являются причиной повышения проницаемости мембран и усиления проведения нервных импульсов, что приводит к смягчения симптоматики [59]. Основной механизм действия пирацетама, как и многих других ноотропов, связан с изменением метаболизма и биоэнергетических процессов нервной клетке, активацией синтеза белка и повышением скорости обмена информационных макромолекул. Это находит отражение в результатах множества исследований, проведенных в последние десятилетия. [2, 113]
Тест исследовательского поведения в закрытом крестообразном лабиринте
а) Выделение плазматических мембран гиппокампа Выделение плазматических мембран гиппокампа проводили по модифицированным методам [203, 270]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при -850С. В день эксперимента гиппокампы размельчали в гомогенизаторе Поттера «тефлон-стекло» в 10 объемах буфера №1 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, 0.32 M Сахароза, рН 7.6). Гомогенат разбавляли 50 объемами буфера №2 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, рН 7.6) и центрифугировали при 1000g 10 минут на ультрацентрифуге «Optima L-70K» (Beckman Coulter). Супернатант сливали и вновь центрифугировали при 25000g 20 мин. Для увеличения выхода белка эту операцию проводили дважды. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объмах буфера №2 и центрифугировали при 8000g 20 мин. Супернатант и верхний коричневый осадочный слой сливали и центрифугировали при 25000g 20 мин. Осадок ресуспендировали в 50 объмах буфера №3 (5mМ НЕРЕS, 4.5 mM Tris, 1 mM Na4EDTA, рН 7.6) и троекратно центрифугировали при 25000g 20 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 50 объмах буфера №2 и однократно центрифугировали при 25000g 20 мин. Конечный осадок сохраняли в 5 объмах буфера №2 и замораживали в криопробирках в жидком азоте. В день анализа ткань размораживали, разбавляли в 10 объмах буфера №2, центрифугировали при 25000g 20 мин. Осадок ресуспендировали в необходимом количестве буфера №2. Концентрация белка в образцах мембран составляла 2-3 мг/мл.
б) Выделение плазматических мембран коры мозга
В эксперименте использовали модифицированный метод на основе методик [151, 165, 235]. После декапитации ткань немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в низкотемпературном холодильнике при -850С. В день эксперимента кору больших полушарий мозга гомогенизировали в 10 объемах ледяного буфера (Hepes, 50 mM; NaCl, 118 mM; CaCl2 , 2.5 mM; KCl, 4.8 mM; MgSO4 1.2 mM; pH 7.4) в гомогенизаторе стекло-тефлон. Гомогенат центрифугировали в ультрацентрифуге «Optima L-70K» (Beckman Coulter) в течение 30 минут при 17.500 g. Полученный осадок суспендировали в 20 объемах холодной дистиллированной воды и оставляли для гидролиза на час. Взвесь центрифугировали 30 минут при 17.500 g. Полученный осадок ресуспендировали в буфере и повторно откручивали в том же режиме. Итоговый осадок суспендировали в буфере до конечной концентрации 4-6 мг исходной ткани на 1 мл буфера.
с) Радиолигандный анализ NMDA рецепторов
В эксперименте использовали меченный тритием МК-801(+), с удельной активностью 210 Кюри/ммоль. Реакционная смесь (конечный объем 0.5 мл) содержала 200 мкл буфера№2, 50 мкл меченного лиганда (в диапазоне концентраций от 0.1 до 30 нМ) и 250 мкл белкового раствора. Неспецифическое связывание определяли в присутствии 50 мкл немеченого лиганда (+)МК-801 (1М), которое составляло 12-14% от общего. Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman), предварительно смоченные в 0.3% полиэтиленимине в течение 2 часов при 4С. Каждую пробирку промывали один раз холодным буфером №2, затем фильтры промывали три раза тем же объемом буфера. Фильтры просушивали на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы. Фильтры заливали 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе толуола (4 г PPO, 0.2 г POPOP на 1 л толуола).
а) Выделение плазматических мембран коры. Сразу после поведенческого теста мышей декапитировали, извлекали головной мозг и выделяли кору, которую гомогенизировали в 16 мл ледяного (0-4С) 50 mM Tris-HCl буфера (рН 7,4) используя гомогенизатор «тефлон-стекло». Полученную суспензию центрифугировали при 42 000 g в течение 25 мин в ультрацентрифуге. После центрифугирования супернатант сливали, осадок ресуспендировали повторной гомогенизацией в том же объеме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный осадок ресуспендировали в 20 мл Tris-HCl буфера и использовали по 250 мкл в процедуре связывания [3Н] Флунитразепама.
б) Радиолигандный анализ. Мембранную фракцию головного мозга инкубировали с [3Н]-Флунитразепамом (NEN, удельная активность 67,4 Ки/ммоль) в течение 30 мин при температуре 0-4С. Неспецифическое связывание определяли в присутствии избытка немеченого диазепама (20 мкМ). Специфическое связывание рассчитывали как разницу между общим и неспецифическим связыванием. Процесс связывания останавливали путем добавления ледяного буфера и быстрой фильтрации через стекловолоконные фильтры типа GF/B (Whatman) с последующей двукратной промывкой ледяным буфером общим объемом 8 мл. Фильтры высушивались в течение 12 часов при комнатной температуре, затем помещались в сцинтилляционную жидкость (реактив Брея) объемом 5 мл и использовались для сцинтилляционного счета. Радиоактивность каждой пробы измеряли в течение 2 мин на сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 2900TR (PerkinElmer). Эффективность счета составляла 45%. Неспецифическое связывание составляло не более 10% от общего.
Концентрацию белка измеряли по стандартной методике Лоури. Показатель количества мест связывания (Вmax, фмоль/мг белка) и константу диссоциации лиганд-рецепторных комплексов (Кd, нМ) рассчитывали с помощью программы Graphpad Prism 5 Demo.
Концентрацию белка в образцах определяли по стандартной методике. К аликвоте образца, содержащего белок (5 - 50l объемом) прибавляли 0.8ml 0.1N р-ра NaOH. Смесь выдерживали при комнатной температуре не менее 12 часов или нагревают до 50 - 60С в течение 10 минут. Прибавляли 2ml свежеприготовленного р-ра Лоури (К 250мл 0.1н р-ра NaOH при помешивании добавляют 5г карбоната натрия. После растворения отнимают 5мл. Навеску K+,Na+-тартрата в 60мг растворяют в 3мл дист. воды. Навеску CuSO4 в 30мг растворяют в 3мл дист. воды. К р-ру карбоната натрия в 0.1н NaOH добавляют по 2.5мл р-ров CuSO4 и K+, Na+-тартрата.) и инкубировали 10 минут. Добавляли 0.2ml 1N реактива Фолина (Реактив Фолина разбавляют водой в отношении 1:1) и немедленно встряхивали, инкубация 30 минут. Измеряли адсорбцию при 750 нм.
Для получения калибровочной кривой на аналитических весах взвешивали 4мг бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) и растворяли это количество в 4 мл дистиллированной воды. Готовили 15 пробирок (пять по три): первая триада не содержала альбумина (blank), во вторую добавляли 10l р-ра BSA и т. д. Проводили реакцию Лоури и спектрофотометрировали калибровочные пробы. 2.2.2.4. Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью программы Statistika 6.0. При обработке полученных результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики (t-тест Стьюдента, -квадрат, F-критерий Фишера) согласно «Методическим рекомендациям по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2000). На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего (mean±S.E.M). Обозначения уровней значимости: - р 0.05, - р 0.01, - р 0.001. Для обработки результатов радиолигандного связывания использовали программу GraphPad Prism 4 Demo. Результаты представлены в виде «mean±S.E.M».
Влияние острого введения ноотропных препаратов на поведенческие характеристики мышей линий Balb/c и C57Bl/6 в закрытом крестообразном лабиринте
Для понимания модулирующего характера действия ноотропных препаратов представлялось актуальным изучить влияние введения ноотропных препаратов на основные характеристики радиолигандного связывания [3H]-MK-801 – неконкурентного антагониста NMDA – рецепторов гиппокампа и характеристики радиолигандного связывания для [3H]-Флунитразепама с бензодиазепиновыми рецепторами коры.
При определении концентрации мест связывания для [G-3H]-MK-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа впервые было установлено, что у мышей линии C57Bl/6 Вmax (2654±40,96 фмоль/мг) больше, чем в популяции линии Balb/c (2063±25,88 фмоль/мг) p 0.01 согласно t-критерию Стьюдента (Рис 3.9.а). Величины Kd в мембранах гиппокампа линий не различаются статистически значимо.
При определении концентрации мест связывания для [3H]-Флунитразепама с бензодиазепиновыми рецепторами коры установлено, что у мышей линии C57Bl/6 Вmax (3613±102,7 фмоль/мг) больше, чем в популяции линии Balb/c (3016±28,83 фмоль/мг) p 0.01 согласно t-критерию Стьюдента (Рис 3.9.б). Сходные различия у мышей данных линий были получены ранее в исследованиях радиолигандного связывания в амигдале [187].
Надо отметить, что величины Kd в мембранах структур мозга обеих линий мышей практически не различались при выбранных режимах введения препаратов, что указывает на неизменяемость степени сродства мест связывания к лигандам при различных режимах воздействия препаратов.
Концентрация [3H]- Flunitrazepam [nM] Рис. 3.9. Различия в плотности NMDA-рецепторов (а) и бензодиазепиновых рецепторов (б) мышей линии C57Bl/6 и Balb/c. Пояснения в тексте. Результаты экспериментов ex vivo оценивали с помощью рассчитанных величин Kd и Bmax, отражающих степень сродства рецептора к лиганду (нМ) и количество мест связывания лиганда (фмоль/мг белка), соответственно. Величины, полученные для контрольной (физ. раствор) и опытных (ноопепт 1мг/кг; пирацетам-200 мг/кг; пантогам-200 мг/кг; бемитил-25 мг/кг; острое, недельное и 2-х недельное введение, в/б) групп, были обработаны статистически и протестированы на достоверность различий с помощью программ Statistica 6.0 и GraphPad 5.0 Prism. Все полученные величины Kd и Bmax, отражены в таблице 3.7-8.
Ноопепт. По плотности NMDA-рецепторов в мембранах гиппокампа мозга мыши линии С57Bl/6 превосходили линию Balb/c на 29%. В субпопуляции мышей линии Balb/c после острого введения не наблюдалось статистически значимого снижения величины Bmax для [3H]-MK-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа по сравнению с контрольной группой (2271±35 и 2068±291,5 фмоль/мг, соответственно), в то время как у линии С57Bl/6 наблюдалось увеличение величины Bmax (2659±270 и 3339±91 фмоль/мг, соответственно) (p 0.01, согласно t-критерию Стьюдента) (Рис.3.10).
Пирацетам. Под влиянием препарата изменению подвергалась лишь величина Bmax: введение препарата увеличило величину Bmax у линии Balb/c по сравнению с контролем (1974±35 и 2461±56 фмоль/мг, соответственно) (p 0.01, согласно t-критерию Стьюдента) (Рис.3.10) и не оказало влияния на линию С57Bl/6.
Концентрация [G-3H ]МК-801, нM Рис. 3.10. Влияние препаратов при остром введении на NMDA-рецепторы в мозге мышей Balb/c и C57Bl/6.
Примечание: p 0,05 статистически значимое отличие от контрольной группы (t-критерий Стьюдента). Бемитил. Увеличение NMDA-рецепторов обнаружено при остром ведении у мышей Balb/c с 2271±35 до 3098±157 фмоль/мг(p 0.01, согласно t-критерию Стьюдента) (Рис.3.10). Однако, у линии С57Bl/6 эффект препарата на данный тип рецептора отсутствовал.
Влияние субхронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex_vivo. Ноопепт. Под влиянием 7-кратного введения препарата величина Bmax изменялась у линии мышей Balb/c, причем количество мест связывания [3H]-MK-801 возрастало с 2051±49 до 2386±62 фмоль/мг, по сравнению с контролем (p 0.05, согласно t-критерию Стьюдента) (Рис.3.11), в то время как у линии С57BL/6 эффект отсутствовал. Пирацетам. Субхроническое введение препарата приводило к увеличению мест связывания Bmax для [3H]-MK-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c по сравнению с контролем (2051±49 и 2546±115 фмоль/мг, соответственно) (p 0.01, согласно t-критерию Стьюдента) (Рис.3.11), на линию С57Bl/6 влияние пирацетама выявлено не было. Пантогам. Влияние 7-дневного введения препарата на изменение рецепторного статуса обеих линий не наблюдалось (Рис.3.11). Бемитил. Эффектов воздействия препарата на исследуемых животных при данном режиме введения также не было выявлено (Рис.3.11).
Влияние хронического введения ноотропных препаратов на характеристики связывания [3H]-МК-801 с NMDA-рецепторами гиппокампа мышей Balb/c и C57Bl/6 ex vivo
По рекомендации ВОЗ к группе ноотропных препаратов отнесены лекарственные средства, способные оказывать прямое активирующее влияние на процессы обучения, улучшать память и умственную деятельность, а также повышать устойчивость мозга к агрессивным воздействиям. Надо отметить, что авторы ноотропной концепции изначально указывали также на обязательность отсутствия у ноотропов проявлений седации или стимуляции в психофармакологических тестах, равно как и на их инертность в отношении нейромедиаторных систем организма [176, 251].
Однако, последующие представления о терапевтических, фармакологических и нейрохимических паттернах пирацетама были существенно скорректированы. Во-первых, было установлено, что в спектре фармакологической активности пирацетама присутствуют т.н. «неспецифические» компоненты, в частности, анксиолитический и стимулирующий [74]. Кроме того, эти «неспецифические» эффекты ноотропов характеризовались быстротой проявления, тогда как «специфический» ноотропный развивался относительно медленно [87, 89]. Так, рамки канонических психофармакологических свойств пирацетама были расширены за счт анксиолитического и стимулирующего эффектов, что нашло подтверждение и в экспериментальной фармакологии [87].
Исследовательское поведение лабораторных животных включает в себя разнородные показатели, отражающие, в частности, уровень двигательной активности, когнитивной деятельности и тревожности по отношению к новой обстановке, которые могут использоваться при оценке профиля активности фармакологических средств. Нейрорецепторные показатели такие, как плотность рецепторов и константа диссоциации лиганд-рецепторного комплекса представляют собой следующий этап в оценке параметров эффективности препаратов. При этом индивидуально-типологические особенности животных вносят значительный вклад в выраженность указанных видов поведения, биохимических параметров и чувствительности к фармакологическим средствам [65, 67]. Различия в поведении были установлены на примере мышей инбредных линий Balb/c и C57Bl/6, которые характеризуются различным типом эмоционально-стрессовой реакции и проявляют неодинаковую чувствительность к веществам, обладающим анксиолитическим действием [106, 107]. В дальнейших исследованиях было установлено, что исследовательское поведение лабораторных животных имеет неодинаковую чувствительность и к другим соединениям, в частности, к налоксону и пирацетаму. В отношении пирацетама известно, что его ноотропное действие проявляется в увеличении упорядоченности исследовательского поведения в крестообразном лабиринте, увеличении количества мест связывания для NMDA- рецепторов у аутбредных мышей линии 1CR с низкой эффективностью исследовательского поведения и зависит от выраженности спонтанного дефицита этого поведения [65]. Однако, поскольку указанные эксперименты с пирацетамом были выполнены только на одной линии аутбредных мышей, оставалось неясным, в какой степени влияние пирацетама на когнитивные компоненты исследовательского поведения и рецепторные характеристики может зависеть от индивидуально-типологических различий реакции линейных животных на новую обстановку, связанных с тревожностью, и иных физиологических особенностей.
Аналогичные по смыслу результаты были получены и в экспериментах с использованием традиционных фармакологических тестов – «открытого поля», «приподнятого крестообразного лабиринта», «экстраполяционного избавления», условной реакции пассивного избегания [87]. В тесте «конфликтная ситуация» анксиолитическая активность пирацетама ослаблялась антагонистами ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса – бикукуллином, пикротоксином, флумазенилом, что свидетельствует о вовлечении этих рецепторов в механизм проявления «неспецифического» эффекта пирацетама [82]. Действительно, на снижение количества БДЗ-рецепторов в префронтальной коре мозга больных с паническими расстройствами по сравнению с мозгом здоровых добровольцев было указано с помощью метода нейровизуализации рецепторов in vivo - позитрон-эмиссионной томографии (PET, positron emission tomography) с использованием в качестве радиолиганда антагониста БДЗ-сайта [11C]-флумазенила. Близкие результаты были получены методом SPECT (single photon emission computed tomography) с радиолигандом [123I]-иомазенилом на группе больных с генерализованными тревожными расстройствами, а также при посттравматическом синдроме [212].
Эти данные in vivo пролили свет не только на некоторые из функций БДЗ рецепторов в феномене тревожностных расстройств в клинике, но и совпали с результатами доклинических исследований на линейных животных с различным эмоционально-стрессовым фенотипом. Действительно, в коре мозга линии мышей Balb/c, проявляющих признаки неофобии при исследовании отсеков крестообразного лабиринта, в условиях ex vivo обнаруживается меньше рецепторов [3H]-флунитразепама, чем в мозге "нетревожных" мышей С57BL/6. По-видимому, состоянию повышенной тревожности соответствует сниженная плотность БДЗ-рецепторов в коре мозга.
Хорошо известно, что NMDA-рецепторы играют существенную роль в обучении и памяти, и соответственно, в психопатологии, вовлекающей эти высшие психические функции [159]. Убедительных данных PET и SPECT, описывающих характеристики NMDA-рецепторов в клинических условиях in vivo обнаружить не удалось ввиду того, что разработанные в настоящее время радиолиганды, хорошо зарекомендовавшие себя в условиях in vitro, в условиях in vivo обладают плохой проницаемостью через ГЭБ, быстро метаболизируются и/или проявляют высокую степень неспецифического связывания с рецептором [206].