Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Рацетамы 11
1.1.1 Пирацетам 12
1.1.2 Оксирацетам 18
1.1.3 Анирацетам 20
1.1.4 Прамирацетам 22
1.1.5 Фенилпирацетам 24
1.1.6. Этирацетам и леветирацетам 27
1.1.7 Селетрацетам и бриварацетам 30
1.1.8 Нефирацетам 31
1.1.9 Фазорацетам 36
1.1.10 Колурацетам 37
1.2 Пептидные аналоги пирацетама 44
1.2.1 Производные пироглутаминовой кислоты 44
1.2.2 Цикло-пролилглицин 45
1.2.3 Ноопепт 48
1.3 Положительные модуляторы AMPA-рецепторов 51
1.3.1 Производные бензотиадиазиндиоксида 52
1.3.2 Производные бензилпиперидина и их аналоги 53
1.3.3 Производные биарилпропилсульфонамида 58
1.4 Взаимодействие глутаматергической системы и мозгового нейротрофического фактора 64
1.5. Обоснование цели исследования 66
Глава 2 Материалы и методы исследования 68
2.1 Экспериментальная химическая часть 68
2.1.1 Исходные вещества и вспомогательные реагенты 68
2.1.2 Аналитические методы 68
2.1.3 Синтез цикло-пролилглицина и его циклических аналогов 70
2.1.4 Синтез ГЗК-111 (этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина) и его аналогов 76
2.2 Экспериментальная биологическая часть 80
2.2.1 Препараты и реагенты 80
2.2.2 Животные 80
2.2.3 Клеточные линии 81
2.2.4 Методы исследования 81
2.2.4.1 Электрофизиологические исследования 81
2.2.4.1.1 Метод локальной фиксации потенциала (patch-clamp) 81
2.2.4.1.2 Метод популяционных ответов на переживающих срезах гиппокампа 82
2.2.4.2 Биохимические исследования 83
2.2.4.2.1 Методика Вестерн-блот анализа 83
2.2.4.2.2 Изучение метаболизма замещенного глипролина 83
2.2.4.3 Методики изучения фармакологической активности in vitro 84
2.2.4.3.1 Модель глутаматной токсичности в культуре клеток гиппокампа мыши линии НТ-22 84
2.2.4.3.2 Моделирование болезни Паркинсона в культуре клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y 84
2.2.4.3.3 Модель окислительного стресса в культуре клеток гиппокампа мыши линии НТ-22 85
2.2.4.3.4 Оценка жизнеспособности нейронов в культуре с помощью MTT-теста 85
2.2.4.4 Изучение фармакологической активность in vivo 85
2.2.4.4.1 Изучение ноотропной активности 86
2.2.4.4.2 Изучение анксиолитической активности 87
2.2.4.4.3 Изучение антигипоксической активности 88
2.2.4.4.4 Исследование нейропротекторной активности in vivo 88
2.2.4.4.5 Исследование анальгетической активности 91
2.2.5 Статистический анализ 92
Глава 3 Основные результаты и их обсуждение 93
3.1 Изучение спектра нейропсихотропных эффектов цикло-пролилглицина, включая их стереоспецифичность 93
3.1.1 Изучение ноотропной активности энантиомеров цикло-пролилглицина 93
3.1.2 Изучение анксиолитической активности энантиомеров цикло-пролилглицина 94
3.1.2.1 Изучение анксиолитической активности энантиомеров цикло-пролилглицина в тесте конфликтной ситуации по Vogel 94
3.1.2.2 Изучение стереоспецифичности анксиолитической активности цикло-пролилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта 96
3.1.3 Изучение антигипоксической активности энантиомеров цикло-пролилглицина 96
3.1.3.1 Изучение антигипоксической активности энантиомеров цикло-пролилглицина на беспородных мышах 97
3.1.3.2 Изучение антигипоксической активности цикло-пролилглицина на мышах линий BALB/c и C57Black/6 98
3.1.3.3 Изучение длительности антигипоксического эффекта цикло-пролилглицина в тесте нормобарической гипоксии с гиперкапнией на беспородных мышах 98
3.1.4 Изучение нейропротекторной активности цикло-пролилглицина 99
3.1.4.1 Изучение нейропротекторной активности энантиомеров цикло-пролилглицина in vitro 99
3.1.4.2 Изучение нейропротекторной активности цикло-пролилглицина in vivo 102
3.1.4.2.1 Изучение нейропротекторной активности цикло-пролилглицина на модели неполной глобальной ишемии мозга у крыс 102
3.1.4.2.2 Изучение нейропротекторной активности цикло-пролилглицина на модели галоперидоловой каталепсии у мышей 105
3.1.5 Изучение анальгетической активности цикло-пролилглицина 106
3.2 Изучение механизма действия цикло-пролилглицина 107
3.2.1 Изучение влияния цикло-пролилглицина на функциональное состояние AMPA-рецепторов 107
3.2.1.1 Изучение влияния цикло-пролилглицина на функциональное состояние AMPA-рецепторов методом популяционных ответов 107
3.2.1.2 Изучение влияния цикло-пролилглицина на функциональное состояние AMPA-рецепторов методом локальной фиксации потенциала 109
3.2.2 Изучение влияния ЦПГ на синтез BDNF в сравнении с пирацетамом 110
3.3 Создание новых фармакологически активных молекул на основе структуры ЦПГ 113
3.3.1 Циклические аналоги цикло-пролилглицина 113
3.3.1.1 Синтез цикло-L-пролилглицина и его циклических аналогов 113
3.3.1.2 Изучение ноотропной активности циклических аналогов цикло-пролилглицина в тесте УРПИ 115
3.3.1.3 Изучение анксиолитической активности циклических аналогов цикло-пролилглицина в тесте ПКЛ 116
3.3.1.4 Изучение антигипоксической активности циклических аналогов цикло-пролилглицина в тесте нормобарической гипоксии с гиперкапнией на мышах 118
3.3.1.5 Изучение нейропротекторной активности циклических аналогов цикло-пролилглицина 119
3.3.1.6 Связь структуры и нейропсихотропной активности в ряду циклических аналогов ЦПГ 120
3.3.2 Линейные замещенные глипролины 121
3.3.2.1 Синтез линейных замещенных глипролинов 122
3.3.2.2 Изучение метаболизма ГЗК-111 in vitro 123
3.3.2.3 Сравнительная оценка спектра фармакологической активности ГЗК-111 и цикло-пролилглицина 124
3.3.2.3.1 Изучение ноотропного действия энантиомеров этилового эфира N-фенилацетилглицил-пролина в сравнении с ЦПГ 124
3.3.2.3.2 Изучение анксиолитического действия энантиомеров этилового эфира N-фенилацетилглицил-пролина в сравнении с ЦПГ 124
3.3.2.3.3 Изучение антигипоксического действия энантиомеров этилового эфира N-фенилацетилглицил-пролина в сравнении с ЦПГ 125
3.3.2.3.4 Изучение нейропротекторного действия этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина in vitro 126
3.3.2.3.5 Изучение нейропротекторного действия этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина in vivo 127
3.3.2.3.6 Изучение антидепрессивного действия этилового эфира N-фенилацетилглицил-L-пролина 128
3.3.2.4 Изучение связи структуры и активности в ряду аналогов ГЗК-111 129
Заключение 132
Выводы 135
Практические рекомендации 136
Список литературы 137
- Пирацетам
- Производные биарилпропилсульфонамида
- Исследование нейропротекторной активности in vivo
- Изучение связи структуры и активности в ряду аналогов ГЗК-111
Введение к работе
Актуальность. В связи с увеличением продолжительности жизни сегодня приобретает актуальность проблема возрастного снижения когнитивных способностей. По данным ВОЗ число людей с ее крайними проявлениями - деменцией - в 2015 году составило около 48 миллионов и может достичь 135 миллионов к 2050 году. Серьезными факторами риска развития когнитивных нарушений являются депрессия (Gotlib I.H., Joormann J. //Аппи. Rev. Clin. Psychol. 2010. Vol. 6. P. 285-312), тревожные расстройства (Robinson O.J. et al. // Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 2011. Vol. 11, № 2. P. 217-227), а также нарушения мозгового кровообращения (Sun J.-H. et al. // Ann. Transl. Med. 2014. Vol. 2, №8. 80), распространение которых в современном обществе затрагивает все возрастные категории. Таким образом, актуальность разработки препаратов, эффективных в терапии и профилактике когнитивных нарушений различной этиологии не вызывает сомнений.
Для лечения когнитивных расстройств часто применяются ноотропы, которые составляют особую группу нейропсихотропных веществ, способных специфически улучшать процессы обучения и памяти, интеллектуальные функции как у здоровых лиц, так и, в особенности, у лиц с когнитивными нарушениями. Некоторые ноотропы обладают ценной способностью сочетать избирательность действия на когнитивные процессы с нейропротекторными, анксиолитическими и антидепрессивными свойствами. К таким ноотропам относятся рацетамы - производные пирролидона, родоначальником которых является пирацетам (М-карбамидометилпирролидон-2).
Известно, что пирацетам способен положительно модулировать глутаматные АМРА рецепторы (Ahmed АЛ. et al. // J. Med. Chem. 2010. Vol. 53, № 5. P. 2197-2203), что, как известно (Jourdi H. et al. // J. Neurosci. 2009. Vol. 29, № 27. P. 8688-8697) приводит к активизации синтеза нейротрофина BDNF, опосредующего жизнеспособность нейронов, стимуляцию нейрогенеза во взрослом мозге, регуляцию синаптогенеза и синаптической пластичности - процессы, лежащие в основе памяти и обучения (Autry А.Е. et al. // Pharmacol. Rev. 2012. Vol. 64, № 2. P. 238-258). Развитие ампакинов - положительных модуляторов АМРА-рецепторов в качестве когнитивных усилителей, обладающих комплексом эффектов, характерных для BDNF, в настоящее время стало многообещающим направлением в фармакологии. Однако ни один из этих ампакинов не смог успешно пройти клинические испытания из-за наличия серьезных побочных эффектов, вызванных их ксеногенностью. В связи с этим актуальным представляется поиск эндогенных ампакинов и создание ноотропных препаратов на их основе.
Степень разработанности проблемы. Многолетние фундаментальные исследования в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова привели к открытию эндогенного пептида цикло-
пролилглицина (ЦПГ) – предполагаемого пептидного прообраза пирацетама (Gudasheva T.A. et al. // FEBS Letters. 1996. Vol. 391. P. 149-152). Этот нейропептид является мощным регулятором памяти и тревоги (Гудашева Т.А. и др. // Бюл. эксп. биол. мед. 1999. Т.116, №10. С. 411-413; Середенин С.Б. и др. // Бюл. эксп. биол. мед. 2002. Т. 133, №4. С. 417-419). Можно предположить, что механизм ноотропного действия ЦПГ связан, как и в случае пирацетама, со стимуляцией синтеза BDNF, а сам ЦПГ является эндогенным ампакином. Поэтому представляет интерес создание новой группы ноотропов для лечения когнитивных расстройств разной этиологии на основе как аналогов ЦПГ, так и пептидов, способных метаболизироваться с образованием ЦПГ.
Ранее в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН был создан оригинальный ноотропный препарат ноопепт – этиловый эфир N-фенилацетил-L-пролилглицина (ГВС-111) (Островская Р.У. и др. // Экспер. клин. фармакол. 2002. Т. 65, № 5. С. 66-72). В качестве основного метаболита для ГВС-111 в крови и мозге крыс был обнаружен ЦПГ, который образуется при энзиматическом отщеплении фенилацетильного радикала с последующей внутримолекулярной циклизацией (Gudasheva T.A. et al. // Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics. 1997. Vol. 22, № 3. P. 245-252). Хорошо известно, что такая циклизация легче происходит при наличии цисоидной пептидной связи, которая предпочтительнее в дипептиде структуры Gly-Pro, чем Pro-Gly (имидная связь). Таким образом, структура Gly-Pro может рассматриваться как основа для новой группы пептидных ноотропов.
Целью работы является изучение механизма действия ЦПГ и создание на этой основе новых молекул потенциальных ноотропов с ЦПГ-подобным механизмом действия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Изучение спектра фармакологических эффектов ЦПГ с учетом стереоспецифичности и сопоставление его со спектром фармакологических эффектов пирацетама.
-
Изучение модуляторного влияния ЦПГ на АМРА-рецепторы с помощью электрофизиологических методов.
-
Изучение влияния ЦПГ на синтез BDNF in vitro.
-
Синтез и изучение связи структуры и нейропсихотропной активности в рядах циклических аналогов цикло-пролилглицина и линейных замещенных глипролинов.
-
Выбор наиболее перспективного кандидата в качестве потенциального лекарственного препарата с ЦПГ-подобным механизмом действия и изучение его ноотропных, антигипоксических, нейропротекторных, анксиолитических и антидепрессивных свойств.
Научная новизна. Впервые показано модуляторное влияние ЦПГ на глутаматные АМРА-рецепторы. Впервые показано стимулирующее влияние ЦПГ на синтез мозгового
нейротрофического фактора (BDNF). Впервые обнаружен антигипоксический эффект ЦПГ. Впервые выявлена стереоспецифичность его антигипоксического и нейропротекторного эффектов. Впервые получены замещенные глипролины, способные метаболизироваться до ЦПГ и обладающие всеми фармакологическими эффектами последнего.
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые высказано предположение и получены экспериментальные данные в пользу того, что ЦПГ является эндогенным ампакином. Получены новые фармакологически активные линейные и циклические дипептиды, которые могут стать основой для создания оригинальных нейропсихотропных лекарственных препаратов (патент РФ).
Методология и методы исследования. В настоящей работе использована химико-фармакологическая методология с применением химических, фармакологических, биохимических и электрофизиологических методов исследования.
Связь темы диссертации с научными планами института. Диссертация выполнена
в рамках НИР ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов
эндо- и экзогенной регуляции функций центральной нервной системы. Разработка новых
оригинальных нейропсихотропных средств» Рег. № 01201169192 и проекта РФФИ № 15-04-
04485 «Дизайн и синтез новых активных аналогов нейропептида цикло-пролилглицина и
выявление фармакофоров, определяющих его ноотропный, анксиолитический,
антигипоксический и нейропротективный эффекты».
Положения, выносимые на защиту.
-
Цикло-пролилглицин подобен пирацетаму по спектру нейропсихотропной активности, модуляторному действию на AMPA-рецепторы и влиянию на синтез BDNF и является его эндогенным прообразом.
-
Нейропсихотропные эффекты цикло-пролилглицина стереоспецифичны.
-
Получен новый фармакологически активный циклодипептид, бензиловый эфир цикло-L-пролил-L-аспарагиновой кислоты, который может являться производным нового эндогенного циклического дипептида с ноотропной, анксиолитической и антигипоксической активностями.
-
Получен новый потенциальный ноотропный препарат, этиловый эфир N-фенилацетилглил-L-пролина, с ЦПГ-ергическим механизмом действия.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов исследований обусловлена использованием адекватных методов статистической обработки, а также повторами серий опытов.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности и
психотропным средствам» (Москва, 2010), 11-м Региональном Конгрессе Европейской коллегии по психофармакологии (Санкт-Петербург, 2011), 22-м Международном симпозиуме по медицинской химии (Берлин, 2012), 4-м съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), 1-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013), 6-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), 33-м Европейском пептидном симпозиуме (София, 2014), 7-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Новосибирск, 2015), Всероссийской конференции молодых ученых с Международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 2015), 6-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности и психотропным средствам» (Москва, 2015), 34-м Европейском пептидном симпозиуме (Лейпциг, 2016), 8-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Москва, 2017).
Публикации. По теме диссертации опубликована 21 работа, из них 7 статей в центральных рецензируемых научных журналах, один патент РФ и 13 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Личный вклад. Автор работы является основным исполнителем проведенного исследования на всех этапах: анализе данных литературы по теме диссертационной работы, проведении экспериментальной части исследования и анализе полученных результатов, проведении статистической обработки, формулировании выводов. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 344 источника. Работа изложена на 170 страницах компьютерного текста, содержит 45 рисунков и 25 таблиц.
Пирацетам
Пирацетам (2-оксо-1-пирролидинилацетамид) (рисунок 1) был запатентован в 1963 г бельгийской фирмой UCB и с 1972 года существует как коммерческий препарат Ноотропил [134]. Внедрение пирацетама в клиническую практику привело к возникновению нового класса лекарственных средств – ноотропных препаратов (веществ, оказывающих специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, улучшающих память и облегчающих процесс обучения). Несмотря на то, что в настоящее время существует ряд более активных структурных аналогов пирацетама (оксирацетам, анирацетам и др.), сходных с ним по действию, он до сих пор активно используется в клинической практике как в нашей стране, так и за рубежом [14, 145, 338].
Пирацетам обладает, кроме ноотропной, антигипоксической, нейропротекторной, анксиолитической, антидепрессивной и анальгетической активностями.
Ноотропная активность пирацетама изучена наиболее подробно. Она исследована на грызунах с использованием различных методик (условные рефлексы пассивного (УРПИ) и активного (УРАИ) избегания, а также лабиринтные методики) и подтверждена многолетней клинической практикой. Показано, что препарат наиболее эффективен при длительном применении в больших дозах, но положительный эффект отмечен и в случае курсового применения в малых дозах [66]. В работах Gurgea и соавторов было показано, что на моделях амнезии, вызванной электрошоком или гипоксией, пирацетам при однократном введении в дозе 100 мг/кг в/б проявляет высокое антиамнестическое действие в случае введения за 1 ч до обучения УРПИ, и, в меньшей степени, при введении сразу после обучения [134]. Пирацетам в дозе 100 мг/кг в/б был эффективен и в случае амнезии, вызванной введением м-холиноблокатора скополамина (3 мг/кг в/б) [269]. Изучение влияния пирацетама на формирование УРПИ при разных режимах введения показало, что он положительно влияет на ввод информации, слабо влияет на консолидацию и не влияет на воспроизведение не только в случае ретроградной амнезии УРПИ, вызванной электросудорожным шоком, но и в случае УРПИ [27, 54]. Пирацетам при субхроническом введении (600 мг/кг/сутки, p.o., введение в течение 5 дней до обучения) устранял тормозное влияние на формирование УРПИ таких агентов, как агонист альфа-адренорецепторов клонидин (0,1 мг/кг в/б) и ингибитор дофамин-бета-гидроксилазы диэтилдитиокарбамат (300 мг/кг в/б) [131].
Пирацетам в дозе 100 мг/кг при остром [195] и субхроническом [62] внутрибрюшинном введении ускорял выработку рефлекса активного избегания в челночной камере у мышей. В ряде других исследований [132, 202] показано, что пирацетам (600 мг/кг/сутки, p.o., введение в течение 5 дней до и 5 дней после обучения) не влияет на показатели реакции избегания в челночной камере у крыс. Однако он эффективно противодействовал тормозному влиянию агониста альфа-адренорецепторов клонидина (0,1 мг/кг в/б) на формирование УРАИ [202]. В работе [292] показано, что пирацетам в дозе 300 мг/кг (6 недель, интрагастрально) улучшал формирование УРАИ в челночной камере в большей степени у старых (24 мес.), чем у молодых крыс.
В 8-лучевом водном лабиринте пирацетам улучшал обучение крыс в дозе 100 мг/кг в/б [174]. Пирацетам в дозе 45 мг/кг при субхроническом внутрибрюшинном введении улучшал обучение в водном лабиринте у старых крыс (около 12 мес.). В больших дозах (400 мг/кг/сутки, 15 дней) пирацетам улучшал выработку пищедобывательного пространственного навыка в 8-лучевом радиальном лабиринте у старых крыс (16 мес.) с нарушенной обучаемостью, но не у 2-месячных животных [105].
Для пирацетама также показано, что он увеличивает общую амплитуду транскаллозальных вызванных потенциалов, оказывая положительное влияние на межполушарную передачу информации [134, 50].
В обзоре Аведисовой и др. [1] представлены сводные данные о проведенных клинических исследованиях пирацетама с указанием применяемых доз и длительности терапии. В него вошли только те зарубежные исследования, в которых при лечении пирацетамом достоверно обнаруживался положительный эффект по сравнению с плацебо или контрольной группой. Диапазон используемых доз пирацетама, применявшихся разными исследователями при сходных расстройствах, колеблется в широких пределах (от 1 до 45 г в сутки), однако средний диапазон дозировок составляет от 1,2 до 9,6 г/сут. По мнению авторов статьи, такой выбор доз пирацетама обусловлен концепцией U-зависимости эффективности ноотропных препаратов от их дозы, где каждому ноотропному препарату свойственно ограниченное «терапевтическое окно», при котором наиболее эффективными являются средние дозировки, а малые и высокие – малоактивны.
Также описывается методика выбора доз пирацетама, основанная на концепции, что приоритетное значение имеет не суточная, а курсовая доза препарата. В обзоре [126] описано, что эффективность препарата зависит в большей степени от курсовой дозы, чем от длительности курсового применения. Такой подход к определению эффективных дозировок препарата позволил сократить его суточную дозу до 1-2 г/сут.
Анксиолитическая активность пирацетама выявлена File и Hyde в тесте социального обследывания (social interaction test) при введении препарата крысам (100 мг/кг в/б) за 30 мин до опыта. Показано, что при введении такой дозы в течение 5 дней действие препарата близко к действию хлордиазепоксида [125]. Сходные данные были получены при субхроническом и хроническом пероральном введении пирацетама (250 и 500 мг/кг, 7 и 14 дней), когда снижение уровня тревожности наблюдали в тестах открытого поля, ПКЛ и в тесте кофликтной ситуации по Vogel для крыс [97]. В работе [13] показано, что пирацетам проявляет анксиолитическую активность на крысах в тесте Vogel в интервале доз 400-1000 мг/кг при однократном введении. Однако в работе [117] показано, что однократное внутрибрюшинное введение пирацетама в дозах 250, 500 и 1000 мг/кг за 30 мин до тестирования в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) не оказывало значимого влияния на число переходов мышей в открытые рукава и время пребывания в них.
Антидепрессивная активность пирацетама показана в тесте выученной беспомощности на крысах в дозах 100 и 200 мг/кг при введении препарата после обучения, но не в случае введения его перед обучением [106]. Авторами [136] антидепрессивный эффект пирацетама выявлен при субхроническом пероральном введении на мышах в тесте подвешивания за хвост (300, 400, 500, 750 и 1000 мг/кг, 7 дней) и на крысах в тесте неизбегаемого плавания (500, 750 и 1000 мг/кг, 7 дней). В работе [77] антидепрессивный эффект пирацетама показан в тесте неизбегаемого плавания в дозе 37,5 мг/кг подкожно.
Нейропротекторная активность пирацетама достаточно подробно изучена как на клеточных культурах, так и в различных моделях ишемии на грызунах [140]. Показано [196], что в случае окислительного стресса обработка клеточной культуры РС12 пирацетамом в концентрациях 100-1000 мкМ повышает устойчивость митохондриальных мембран и увеличивает синтез АТФ. В обзоре [326] представлен сравнительный анализ статей, посвященных изучению влияния пирацетама и других ноотропных препаратов на разных моделях фокальной ишемии мозга на грызунах. Нейропротекторная активность показана для всех доз пирацетама выше 750 мг/кг. Препарат активно используется в клинической практике при терапии ишемического инсульта [140]. По данным некоторых клинических исследований пирацетам эффективен при терапии ишемического инсульта только в течение первых 7 ч, а введение препарата через 12 ч после инсульта не приводит к улучшению неврологического или функционального статуса пациентов [119].
Производные биарилпропилсульфонамида
В эту группу входят соединения, разрабатываемые компанией «Eli Lilly and Company». Наиболее изученные производные биарилсульфонамида, разработанные Lilly (LY392098, LY404187 и LY451395) представлены на рисунке 21. Эти соединения обладают антидепрессивной и ноотропной активностью. Соединение LY451395 дошло до II фазы клинических испытаний, но не показало свою эффективность в терапии когнитивных нарушений при болезни Альцгеймера [321]. Различные производные биарилсульфонамида как потенциальные положительные модуляторы АМРА-рецепторов также разрабатываются компаниями «GlaxoSmithKline» и «Pfizer» [270].
Ноотропная активность ампакинов этой группы была изучена на животных, одно из соединений дошло до клинических испытаний. Так, соединение LY404187 в дозе 0,1 мг/кг при пероральном применении проявляло ноотропную активность в водном лабиринте и тесте УРПИ [276]. Ампакин LY451395 (0,2 и 1,0 мг, 4 и 8 недель) дошел до клинических испытаний как возможное средство для терапии когнитивного дефицита при болезни Альцгеймера, однако двойное слепое плацебоконтролируемое исследование не показало отличия от плацебо [107].
Антидепрессивная активность положительных модуляторов AMPA рецепторов этого ряда изучена достаточно подробно. Так, для соединения LY392098 в дозах 0,5 и 1,0 мг/кг при внутрибрюшинном введении было показано антидепрессивное действие в тесте неизбегаемого плавания на мышах C57Black/6 и на крысах, и в дозах 5 – 20 мг/кг в тесте подвешивания за хвост на мышах [208], однако оно не проявляло активность в тестах закапывания шариков и предпочтения сахарозы [124]. Соединение LY404187 в дозе 0,05 мг/кг при пероральном применении проявляло антидепрессивную активность в тесте неизбегаемого плавания на мышах, а в дозах 0,025 и 0,05 мг/кг – на крысах [276].
Нейропротекторная активность соединения LY404187 показана в дозе 10 мг/кг при хроническом внутрибрюшинном введении на модели постнатального повреждения мозга путем центрального введения антагониста NMDA-рецепторов иботеновой кислоты у мышей [121].
Заключение. На основании литературных данных можно сделать вывод, что ампакины в силу своей избирательности к AMPA-рецепторам и влиянию на синтез нейротрофинов, в частности BDNF, обладают нейротрофино-подобной активностью, проявляя по большей части ноотропный, нейропротекторный и антидепрессивный эффекты (см. таблицу 3). Также для них описано анальгетическое действие, характерное для этого нейротрофина. К сожалению, ни одно из этих соединений не дошло до клинической практики. Интересно отметить, что последние разработки сосредоточены на поиске не только ноотропов и нейропротекторов, но и антидепрессантов и средств, влияющих на вентиляционную функцию легких.
В последнее время взаимная регуляция глутаматергической системы и BDNF рассматривается как важный фактор, влияющий на клеточную и синаптическую пластичность [139]. Дисбаланс в работе этих систем приводит к возникновению нейродегенеративных заболеваний, депрессии и других психических расстройств [32].
Глутаминовая кислота является основным возбуждающим нейромедиатором у млекопитающих, также известно о ее участии в процессах нейро- и синаптогенеза. Существуют как ионотропные, так и метаботропные глутаматные рецепторы [327]. Известны 3 группы ионотропных – AMPA- (AMPAR, субъединицы GluR1–GluR4), каинатные (субъединицы GluR5–GluR7, KA1, KA2) и NMDA-рецепторы (NMDAR, субъединицы NR1–NR3), и 3 группы метаботропных, сопряженных с G-белками – I (субъединицы mGluR1, mGluR5), II (субъединицы mGluR2, mGluR3) и III (субъединицы mGluR4, mGluR6 – mGluR8) группы. Ионотропные глутаматные рецепторы взаимно влияют друг на друга – быстрый синаптический ответ, опосредуемый AMPA- или каинатными рецепторами приводит к деполяризации мембраны и активации NMDA-рецепторов [337].
Мозговой нейротрофический фактор – представитель семейства нейротрофинов, белок, играющий важную роль в развитии нервной системы и поддержании ее функционирования во взрослом состоянии [235]. BDNF связывается с двумя типами рецепторов – высокоафинными тирозинкиназными рецепторами TrkB и низкоаффинными рецепторами p75. Взаимодействие с TrkB-рецепторами приводит к активации PI3/Akt-киназного сигнального пути и MAP/Erk-киназного пути, а также фосфолипазы C [98]. Эти каскады вовлечены в такие процессы, как нейропротекция, дифференцировка, синаптическая пластичность и нейрогенез. Внутриклеточные каскады p75-рецептора влияют на апоптоз и жизнеспособность клеток.
Взаимосвязь глутаматергической системы и BDNF активно изучается на протяжении последних нескольких десятилетий. Стимулирующее влияние глутамата на экспрессию BDNF показано около 30 лет назад [336]. Первые работы, подтверждающие взаимное влияние глутаматных рецепторов и BDNF были опубликованы в конце XX века. Так, в работе [168] с помощью метода patch-clamp показано модулирующее влияние BDNF на NMDA-рецептор и высказано предположение, что это связано с возможным влиянием на его глициновый сайт. Другие авторы [201] наблюдали дозозависимое повышение экспрессии BDNF в гиппокампальных и кортикальных нейронах под действием положительных модуляторов AMPA-рецепторов CX546 и CX614. Антагонист AMPA-рецепторов CNQX блокировал этот эффект. Позднее этот эффект был выявлен и для других положительных модуляторов AMPA-рецепторов [208].
Найденное в начале 2000-х гг. у антагониста NMDA-рецепторов кетамина антидепрессивное действие [91] и изучение причин возникновения этого эффекта внесло существенный вклад в понимание взаимодействия BDNF и глутаматергической системы. Было показано, что блокада NMDA-рецепторов кетамином приводит к увеличению концентрации глутамата, что, в свою очередь повышает уровень BDNF и активирует AMPA-рецепторы. Антидепрессивный эффект препарата в тесте неизбегаемого плавания устранялся блокатором этих рецепторов NBQX [189]. Данные об участии сигнальных путей BDNF в реализации действия кетамина в настоящее время противоречивы. В различных работах показано как наличие [163, 207], так и отсутствие [83] влияния mTOR-сигналинга на антидепрессивное действие препарата. Авторы [334] исследовали эффекты энантиомеров кетамина на модели хронического стресса у мышей C57Bl/6 с использованием ингибиторов mTOR-сигналинга (рапамицина и AZD8055) и Erk-киназы (SL327) и показали, что mTOR-сигналинг вовлечен в антидепрессивное действие только S-энантиомера, в то время как антидепрессивный эффект R-кетамина реализуется через Erk-киназный путь.
Исследование нейропротекторной активности in vivo
Нейропротекторную активность соединений изучали с помощью моделей локальной и глобальной ишемии мозга, а также с использованием модели галоперидоловой каталепсии.
Модель локальной ишемии мозга (ишемического инсульта)
Ишемический инсульт моделировали внутрисосудистым перекрытием среднемозговой артерии нитью [211]. Все хирургические манипуляции осуществляли с помощью титановых микрохирургических инструментов. Крыс вводили в наркоз 5%-м раствором хлоральгидрата (350 мг/кг, в/б). Выполняли срединный разрез в области шеи и выделяли с правой стороны шеи сонный треугольник, образованный сверху двубрюшной мышцей, латерально – грудино-ключично-сосцевидной мышцей и медиально – грудино подъязычной мышцей. В сонном треугольнике выделяли сонный сосудисто-нервный пучок, образованный общей сонной артерией и блуждающим нервом. Осторожно отделяли блуждающий нерв и накладывали микрохирургическую сосудистую титановую клипсу на общую сонную артерию на 1,5 см ниже ее бифуркации. Аккуратно выделяли из спаек наружную и внутреннюю сонные артерии. На внешнюю сонную артерию накладывали хлопчатобумажную нить, плотно затягивали. На внутреннюю сонную артерию накладывали викриловую нить, затягивали неплотно, после чего перерезали внешнюю сонную артерию проксимальнее наложения нити. Гепаринизированную нейлоновую нить диаметром 0,25 мм вводили через культю внешней сонной артерии во внутреннюю сонную артерию на глубину 19-20 мм (до перекрытия средней мозговой артерию) и фиксировали микрососудистой клипсой. Перекрытие кровотока осуществляли в течение 60 мин, после чего нить извлекали из сосуда, восстанавливая кровоснабжение в бассейне средней мозговой артерии. После извлечения нити культю внешней сонной артерии закрывали коагуляцией электрокаутером до полной герметичности.
Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением перерезания сосудов и введения нити. Срединный разрез шеи зашивали хлопчатобумажными нитями и обрабатывали стрептоцидом.
Модель неполной глобальной ишемии головного мозга у крыс Хроническую неполную глобальную церебральную ишемию создавали необратимой двусторонней окклюзией общих сонных артерий [33]. Животное под наркозом (60 мг/кг нембутала, в/б) нежестко закрепляли спиной вниз, в области шеи делали небольшой надрез кожи, аккуратно раздвигали мышцы шеи и находили сонные артерии. Каждую артерию тщательно отделяли от соединительной ткани и нервных тяжей. На каждую освобожденную таким образом артерию накладывали по две лигатуры на расстоянии 2-3 мм друг от друга. Все манипуляции проводили с помощью стеклянных инструментов. Разрез на коже зашивали и присыпали стрептоцидом. Крысы были случайным образом разделены на группы «ложная операция», «ишемия» и «ишемия+вещество». Группа ложнооперированных животных была подвергнута тем же манипуляциям, что и оперированные животные, за исключением наложения лигатур на освобожденные от соединительной ткани и нервных тяжей сонные артерии.
Исследуемое вещество в водном растворе или дистиллированную воду вводили в/б через 4 ч поле операции и затем раз в сутки в течение 7 дней (всего 8 инъекций). Для выявления церебропротекторного действия вещества использовали тесты, позволяющие оценить неврологический статус животных: тест стимулирования конечностей проводили на 3-и и 7-е сутки и оценку спонтанной двигательной и исследовательской активности в открытом поле проводили на 8-е сутки. В течение всего эксперимента регистрировали гибель животных [209].
Оценка объема инфаркта мозга
Оценку объема инфаркта мозга проводили согласно [90]. На 7-е сутки животных декапитировали под глубоким наркозом (хлоральгидрат, 350 мг/кг, в/б). Головной мозг извлекали и помещали, чтобы отмыть от крови, на 1 мин в емкость с физиологическим раствором. Затем мозг замораживали при –20С в течение 12 мин и с помощью специальной формы с пазами для точной резки и микротомных лезвий разрезали на 5 фронтальных срезов толщиной 1,7 мм. Срезы мозга помещали в чашку Петри с 2% раствором ТТХ в фосфатно-солевом буфере и инкубировали в течение 15 мин при 37С. Затем срезы переворачивали и инкубировали еще 15 мин при 37С, после чего фиксировали в 10%-ном формалине в течение 30 мин. Затем срезы помещали на предметные стекла и сканировали с двух сторон с помощью планшетного сканера с разрешением 2400 dpi в режиме цветного изображения. С помощью свободно распространяемой программы «Image J» (National Institutes of Health, США) измеряли площадь инфаркта (неокрашенная область) и площадь всего среза.
Объем ишемического инфаркта определяли по формуле: V=d Ai / 2, где Ai - сумма площадей области повреждения на срезах мозга с каждой из сторон, d- толщина среза.
Тест стимулирования конечностей
Тест проводили согласно [171]. До начала теста животные были приучены к рукам. Тест заключался в регистрации ответа передних и задних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию и включал 7 различных испытаний для правой и левой стороны тела:
1) Животное ставили передними конечностями на край стола, придерживая туловище. Каждую лапу поочередно сталкивали со стола. В норме крыса сразу же возвращала конечность в исходное положение.
2) Выполнялось так же, как и первое испытание, но голову животного отводили вверх под углом 45 градусов.
3) Крысу размещали на столе параллельно краю и поочередно переднюю и заднюю лапу на стороне тела, обращенной к краю стола, отводили вбок. В норме животное сразу возвращало конечность в исходное положение.
4) Выполняли как предыдущее испытание, но поворачивали крысу другим боком к краю стола.
5) Крысу ставили на стол задом к краю и поочередно каждую заднюю лапу отводили вниз.
6) Крысу размещали головой в сторону края стола и аккуратно подталкивали за туловище по направлению к краю. В норме крыса сопротивлялась толканию, перебирая и упираясь передними лапами.
7) Крысу держали за хвост и медленно опускали на поверхность стола. В норме крыса вытягивала передние лапы по направлению к поверхности стола.
Для оценки неврологических нарушений использовали следующую систему подсчета: 2 балла – крыса полностью и без задержки выполняла испытание; 1 балл – крыса выполняла испытание не полностью и/или с задержкой в более чем 2 с; 0 баллов – крыса не отвечала на стимулирование конечности. Баллы суммировали. Максимально возможное суммарное число баллов для обеих сторон тела – 28.
Открытое поле
Установка представляла собой круглую арену диаметром 90 см из ПВХ, белого цвета, окруженную стенками высотой 40 см. Пол арены был разделен на 25 квадратов примерно одинакового размера. Крысу помещали в центр установки и в течение 5 мин с помощью программы RealTimer (ООО «НПК Открытая наука») регистрировали число пересеченных квадратов и число вертикальных стоек с опорой и без опоры на стенку.
Методика каталепсии, вызванной галоперидолом
Галоперидоловую каталепсию получали внутрибрюшинным введением галоперидола в дозе 1 мг/кг. Исследуемые вещества вводились внутрибрюшинно (в/б) в день эксперимента за 15 мин до введения галоперидола. Контрольные животные получали физиологический раствор. Через 60 мин после введения галоперидола регистрировалась каталепсия: животное помещалось на параллельные перекладины на высоте 4 см таким образом, чтобы спина животного была прямой. Фиксировалось время пребывания мышей в неподвижном состоянии в течение 2 мин [17].
Изучение связи структуры и активности в ряду аналогов ГЗК-111
Для подтверждения того, что активность ГЗК-111 связана с образованием циклического дипептида, нами была изучена связь структуры его аналогов с разным замещением по C-концу (незамещенный амид, замещенный амид, соединение с открытой карбоксильной группой) (рисунок 38) и их антигипоксической активности в тесте нормобарической гипоксии с гиперкапнией (таблица 25). Этот тест был выбран как наименее трудоемкий.
Антигипоксическая активность была обнаружена только у амида N фенилацетилглицил-L-пролина (соединение V). В дозе 1,0 мг/кг соединение достоверно увеличивало продолжительность жизни животных, уступая этиловому эфиру ГЗК-111 как по дозам, так и по выраженности эффекта. Эффекты амида, как и низкоалкильного эфира, являются стереоспецифичными: его D-энантиомер неактивен.
Для активного соединения была выявлена также нейропротекторная активность в экспериментах in vitro на модели 6-оксидофаминовой токсичности с использованием клеток нейробластомы человека линии SH-SY5Y при внесении за 24 ч до повреждения в концентрациях 10-7 – 10-5 М (рисунок 44).
Изучение связи антигипоксической активности соединений I, II и IV – VII и их структуры показало, что эффект наблюдается только для эфира (I) и незамещенного амида (V), но не для соединения со свободной карбоксильной группой (IV) и замещенного амида (VII). Возможное объяснение состоит в том, что после ферментативного деацилирования N-фенилацетильной группы происходит спонтанная циклизация дипептида с образованием дикетопиперазина, которой, как известно, подвергаются только низкоалкильные эфиры и незамещенные амиды [149]. Это связано с влиянием минус-индукционного эффекта алкильного заместителя амидной группы в случае замещенного амида и отрицательного заряда у соединения с открытой карбоксильной группой на величину частичного положительного заряда на карбониле, атакуемом свободной электронной парой аминного азота (рисунок 45). Таким образом, активность проявляется только у соединений, которые, предположительно, способны метаболизироваться с образованием ЦПГ – эфир (ГЗК-111) и незамещенный амид (V). Превращение ГЗК-111 в ЦПГ в плазме крови крысы in vitro ранее было показано экспериментально.