Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология грибковых заболеваний 11
1.2. Основные успехи и проблемы противогрибковой фармакотерапии 13
1.3. Основные фармакологические мишени действия противогрибковых лекарственных соединений 19
1.4. Практика создания новых противогрибковых лекарственных средств 25
1.5. Фармакологические эффекты карбазольных соединений 30
1.6. Соединения ряда ксеномицинов 32
2. Материалы и методы исследования 34
2.1 Материалы 34
2.1.1 Исследуемые соединения и готовые лекарственные формы 34
2.1.2 Использованные штаммы 35
2.1.3 Клеточные культуры 36
2.1.4 Общая характеристика экспериментальных животных 36
2.1.5 Реактивы 36
2.2 Исследования специфической фармакологической активности 36
2.2.1 Скрининговое исследование противогрибковой активности in vitro 39
2.2.2 Исследование противогрибковой активности соединений in vivo 40
2.2.2.1Исследование активности CBL0100 на модели трихофитии морских свинок 40
2.2.2.2Исследование активности PLX01107 на модели аспергиллза лгких у мышей 42
2.3 Генотоксикологические исследования 43
2.3.1 Предварительная оценка цитотоксичности соединений 43
2.3.2 Тест на индукцию генных мутаций in vitro (тест Эймса) 45
2.3.3 Оценка кластогенной активности в тесте по учту хромосомных аберраций
2.3.3.1 В культуре клеток крови человека 46
2.3.3.2 В клетках костного мозга мышей in vivo 46
2.3.4 Оценка кластогенной активности методом учта микроядер с цитокинетическим блоком в культуре клеток крови человека 47
2.3.5 Оценка ДНК-повреждающей активности методом ДНК-комет 48
2.3.5.1 В культуре клеток крови человека 48
2.3.5.2 В органах и тканях мышей
2.4 Исследования острой токсичности 49
2.5 Исследование фармакокинетики и биораспределения CBL0100
2.5.1 Нанесение препаратов, отбор крови, органов и тканей 49
2.5.2 Приготовление растворов CBL0100 для построения калибровочных кривых 50
2.5.3 Приготовление гомогенатов органов и тканей 50
2.5.4 Приготовление образцов. 50
2.5.5 Определение связывания CBL0100 с клеточными компонентами крови 50
2.5.6 Хроматографический анализ 51
2.5.7 Фармакокинетические параметры 52
2.6 Статистическая обработка результатов исследований 53
3. Результаты исследования 54
3.1 Скрининговые иследования in vitro 54
3.1.1 Специфическая фармакологическая активность соединений CBL0-группы in vitro 54
3.1.2 Оценка мутагенной активности соединений в тесте Эймса
3.1.2.1 Ксеномицины CBL0159, CBL0100 и CBL0253 55
3.1.2.2 Ксеномицины PLX01107 и PLX01008 58
3.2 Исследования цитотоксического и генотоксического потенциала соединений в
эукариотических тестах 63
3.2.1 Соединение CBL0100 63
3.2.1.1 Оценка ДНК-повреждающей активности CBL0100 в культуре клеток крови человека 63
3.2.1.2 Оценка кластогенной активности CBL0100 методом учта хромосомных аберраций в культуре клеток крови человека 64
3.2.1.3 Оценка ДНК-повреждающей активности CBL0100 методом ДНК-комет в органах и тканях мышей in vivo 66
3.2.1.4 Оценка кластогенной активности CBL0100 методом учта хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей in vivo 68
3.2.2 Соединения PLX01008 и PLX01107 69
3.2.2.1 Оценка кластогенной активности PLX01008 и PLX01107 методом учта микроядер с цитокинетическим блоком в культуре клеток крови человека 69
3.2.2.2 Оценка цитогенетической активности PLX01008 и PLX01107 в тесте по учту хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей in vivo 71
3.3 Исследования острой токсичности 73
3.3.1 Ксеномицин CBL0100 74
3.3.2 Ксеномицин PLX01107 75
3.4 Специфическая фармакологическая активность 77
3.4.1 Исследование активности CBL0100 в отношении T. mentagrophytes in vitro 77
3.4.2 Исследование активности CBL0100 на модели трихофитии морских свинок 77
3.4.3 Исследование активности PLX01107 на модели аспергиллза лгких у мышей 83
3.5 Исследование фармакокинетики и биораспределения CBL0100 в плазме крови и органах и тканях морских свинок 89
3.5.1 Исследование связывания с клеточными компонентами крови 89
3.5.2 Исследование фармакокинетики CBL0100 в плазме крови 89
3.5.3 Исследование биораспределения CBL0100 в органах и тканях
4. Обсуждение 94
5. Выводы 107
6. Практические рекомендации 108
7. Список литературы 109
8. Благодарности
- Основные фармакологические мишени действия противогрибковых лекарственных соединений
- Исследования специфической фармакологической активности
- Оценка мутагенной активности соединений в тесте Эймса
- Исследование фармакокинетики и биораспределения CBL0100 в плазме крови и органах и тканях морских свинок
Введение к работе
Актуальность темы исследования.
Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения, грибковые заболевания диагностируются в течение жизни у 20 – 70 % населения. В последние десятилетия отмечается значительный рост как поверхностных, так и тяжелых инвазивных грибковых заболеваний, характеризующихся высокой летальностью, достигающей 90 % (Н.В. Васильева, Н.Н. Климко, В.А. Цинзерлинг // Вестник Северо–Западного государственного медицинского университета имени И.И. Мечникова. 2010. Т. 2. № 4. С. 5–18; Н.Н. Климко, Я.И. Козлова, С.Н. Хостелиди и соавт. // Проблемы медицинской микологии. 2014. – Т. 16. №1. C. 3–8).
Спектр лекарств, используемых для терапии грибковых заболеваний, весьма невелик и на
практике ограничен полиеновыми антибиотиками, производными имидазола, триазола,
аллиламинами и эхинокандинами. Несмотря на определенные достижения, достигнутые в
фармакотерапии микозов, в частности, появление новых лекарственных форм Амфотерицина В и
азолов нового поколения, позволившее улучшить клинические исходы некоторых грибковых
заболеваний, данные антимикотики обладают рядом существенных недостатков в силу своей
низкой эффективности, узкого спектра активности, неоптимальной вариабельной
фармакокинетики и специфической токсичности, в частности, нефро- и гепатотоксичности, при долгосрочном применении (Castelli M.V., Derita M.G., Lpez S.N. // Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2016. Nov 29:1–12; W. Hope, G.L. Drusano, J.H. Rex. // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2016. Vol. 71. No 11. P. 3008–3019). Помимо этого, развитие резистентности грибов-патогенов к существующим антимикотикам обуславливает необходимость исследования ранее неизвестных мишеней и разработки новых классов противогрибковых лекарственных средств с новыми уникальными механизмами направленного селективного действия (J.E. Nett, D.R. Andes. // Infectious Disease Clinics of North America. 2015. Vol. 30. Issue 1. P. 51–83).
Таким образом, поиск и всестороннее исследование фармакологических,
токсикологических и фармакокинетических свойств новых оригинальных соединений, обладающих активностью в отношении широкого спектра возбудителей инфекционных заболеваний, приемлемым профилем безопасности, благоприятными фармакокинетическими характеристиками и оптимальной биодоступностью, являются актуальными.
Степень разработанности темы диссертационного исследования.
Фармакологические механизмы действия существующих антимикотиков заключаются в ингибировании биосинтеза компонентов клеточной стенки (-1,3-глюкана, -1,6-глюкана, хитина и маннопротеинов) и мембраны гриба (эргостерина, сфинголипидов). На различных этапах
разработки находятся также соединения, действующие в отношении внутриклеточных мишеней, модулирующих синтез ДНК и белков (N-миристоилтрансфераза, аминоацил-тРНК синтетаза, компонент коплекса FACT и др.), и мишеней сигнальной трансдукции (кальциневрин, Hsp90 и др.) (T. Roemer, D.J. Krysan. // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2014. Vol. 4. a019703).
Хроматин-реструктурирующий белковый комплекс FACT (Facilitates Chromatin
Transcription Complex) участвует в активации транскрипции и репликации хроматина, регулирует
транскрипцию генов, контролирующих клеточный рост, и поддерживает стабильность генома у
эукариот. Ранее было показано, что специфичные N-концевые аминокислотные
последовательности компонентов SPT16 и Pob3 комплекса FACT различных грибков не имеют гомологии ни с одним белком человека и могут быть использованы в качестве мишени для создания нового класса антимикотиков (Богданов К.В., Игнатьев С.М. // Проблемы медицинской микологии. 2008. Т. 10. № 3. C. 3-8.; Singer R.A., Johnston G.B. // Biochemistry and Cell Biology. 2004. Vol. 82. Issue 4. P. 419-427). Ингибирование функции FACT было выявлено у ряда оригинальных замещнных карбазолов (ксеномицины групп CBL0- и PLX0-), синтезированных в ходе оптимизации ядра молекулы CBL0100 и его заместителей (Gurova K., Rydkina E., Wade W. Патент на изобретение PCT/RU2013/000683), что обусловливало их перспективность для фармакологической разработки противогрибкового средства на их основе (Gasparian A.V., Burkhart C.A., Purmal A.A. et. al. // Science Translational Medicine. 2011. Vol. 3.Issue 95. P. 95ra74).
Цель исследования.
В экспериментах in vitro и in vivo оценить противогрибковую активность, токсичность и фармакокинетику ряда оригинальных производных карбазола.
Задачи исследования.
-
Оценить противогрибковую активность оригинальных замещенных карбазолов в скрининговых и разврнутых исследованиях in vitro и/или in vivo в отношении микокультур Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus fumigatus, Microsporum canis, Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans.
-
Выявить способность фармакологически активных замещенных карбазолов к индукции генных мутаций в тесте Эймса.
-
Оценить цитотоксический и генотоксический потенциал соединения CBL0100 в широком диапазоне доз и концентраций в тестах по учту хромосомных аберраций in vitro и in vivo, а также тестах на индукцию ДНК-повреждений in vitro и in vivo (методом ДНК-комет).
-
Оценить способность инъекционных форм PLX01107 и PLX01008 индуцировать хромосомные повреждения в тесте по учту микроядер с цитокинетическим блоком в клетках
периферической крови человека in vitro и тесте по учту хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей in vivo.
-
Определить среднелетальные дозы соединений CBL0100 и PLX01107 в виде субстанции или готовых лекарственных форм при разных путях введения.
-
Оценить параметры фармакокинетики и профиль биораспределения CBL0100 в виде двух ГЛФ различного состава после однократного накожного применения.
Научная новизна.
Впервые показана противогрибковая активность карбазольного соединения CBL0100 в широком диапазоне концентраций in vitro в отношении T. mentagrophytes, M. canis, T. rubrum, T. tonsurans, которая подтверждена in vivo при его использовании в составе двух мягких лекарственных форм для накожного применения на экспериментальной модели трихофитии морских свинок.
В экспериментах на прокариотических и эукариотических организмах установлены генотоксические эффекты карбазольных производных и показано, что их проявление зависит не только от дозы и структуры исследованного соединения, но также различно в разных тест-системах.
Установлено, что по показателям острой токсичности фармакологически активные производные карбазола относятся к умеренно токсичным веществам.
На экспериментальной модели инвазивного аспергиллза лгких у мышей не были подтверждены протигрибковые эффекты PLX01107, ранее установленные в независимых исследованиях in vitro.
Впервые определены параметры фармакокинетики и биораспределения нового замещнного карбазола CBL0100 при соответствующем планируемому клиническому пути введения. Показано, что при нанесении на кожу морским свинкам в составе мягких лекарственных форм карбазольное соединение способно проникать в системный кровоток. В модельных экспериментах in vitro показано, что соединение CBL0100 связывается с форменными элементами крови.
Научно-практическая значимость работы.
Фармако-токсикологические характеристики, установленные в ходе комплексных
исследований 13 оригинальных производных карбазола, найдут использование при дальнейшем
поиске фармакологически активных соединений в ряду производных карбазола и разработке на их
основе лекарственных препаратов. Выявленная генотоксическая активность и высокая
цитотоксичность карбазольных соединений определяют интерес фармакологического
исследования использованных замещенных карбазолов как потенциальных противоопухолевых средств. В целях дальнейшего развития фармакологии карбазолов принципиально отметить способность производного карбазола к трансдермальному проникновению в системный кровоток и связыванию с клеточными компонентами крови.
Методология и методы исследования.
В работе использованы современные валидированные методы оценки противогрибковой активности фармакологических соединений, учта генотоксических поражений, определения параметров острой токсичности, а также аналитические методики анализа содержания соединений в биоматериалах в рамках фармакокинетического исследования. Дизайн экспериментов позволял оценить дозовую зависимость эффекта и включал использование контрольных групп и маркеров релевантности животных моделей. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программного обеспечения (Statistica for Windows, Microsoft Excel, Phoenix WinNonlin) и соответствующих для каждого эксперимента тестов (Стьюдента, Фишера и др.).
Положения, выносимые на защиту:
1) Соединение CBL0100 в концентрациях 3,14 – 25 мкг/мл in vitro проявляет противогрибковую
активность в отношении патогенных микокультур Microsporum canis, Trichophyton rubrum,
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, а также in vivo на модели трихофитии
морских свинок при использовании в составе мягких накожных лекарственных форм, содержащих
0,02 % соединения.
2) Производные карбазола гетерогенны по проявлению генотоксической активности. Среди
трех отобранных фармакологически активных соединений CBL0100 не проявляет мутагенной
активности, PLX01008 проявляет мутагенную активность в про- и эукариотических тест-системах,
а соединение PLX01107 мутагенно только в эукариотических тестах.
-
Фармакологически активное производное карбазола PLX01107 относится к 3 классу токсичности. При накожной аппликации самцам и самкам мышей четырех мягких лекарственных форм CBL0100, различающихся по составу и содержанию активного вещества (0,2 и 1 % масс.), их среднелетальные дозы составили 8 14,5 мл/кг.
-
При нанесении на кожу морским свинкам в составе мягких лекарственных форм CBL0100 проникает в системный кровоток и частично депонируется в селезнке. Отклонения от линейной фармакокинетической зависимости коррелируют со связыванием соединения с форменными элементами крови in vitro.
Степень достоверности.
Степень достоверности определяется соответствием дизайнов исследований действующим методическим рекомендациям (Миронов А.Н., 2012), в частности, выбором верифицированных in vivo и in vitro токсикологических и фармакологических моделей, рандомизацией и использованием достаточного количества лабораторных животных, формированием групп позитивных и негативных контролей в каждом эксперименте, валидированными аналитическими методиками, корректными методами статистической обработки полученных данных.
Апробация результатов.
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены Первой Всероссийской научной конференции «Токсикология и радиобиология XXI века» (Санкт-Петербург, 17-19 мая 2017 г.), 18-й Международной научно-практической конференции «Тенденции и инновации современной науки» (Краснодар, 27 октября 2016 г.), «24th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases» (Барселона, 10-13 мая 2014 г.), на заседании межлабораторной конференции ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова».
Личный вклад автора.
Автором теоретически проработана проблема разработки новых антимикотических средств, разработан дизайн исследований, поставлены цель и задачи работы, освоены и использованы методы оценки специфической фармакологической и токсической активности, а также фармакокинетики, обобщены, статистически обработаны и научно интерпретированы полученные экспериментальные результаты, внесен определяющий вклад в подготовку научных публикаций и научных докладов.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 статей, в том числе 5 – в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и 1 – в зарубежном журнале, входящем в базу Scopus, а также 3 тезисах докладов в материалах российских и международной конференций.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 137 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 31 таблицей и 23 рисунками. Библиографический указатель включает 77 отечественных и 156 иностранных источников.
Основные фармакологические мишени действия противогрибковых лекарственных соединений
Антимикотики класса полиенов (макролидные антибиотики), среди которых препарат – стандарт лечения ряда системных микозов Амфотерицин В, продуцируемый Streptomyces nodosus, являются одними из первых разработанных противогрибковых препаратов. Механизм их фунгицидного действия заключается в необратимом связывании с эргостеролом, специфическим мембранным стеролом грибов, что приводит к нарушению проницаемости и целостности мембраны.
Амфотерицин В на настоящий момент остается противогрибковым средством с одним из самых широких спектров действия и большим опытом клинического применения [25, 158, 183]. Ключевой причиной, ограничивающей его использование, служат проблемы, связанные стоксическими побочными эффектами, в частности, нефротоксическое действие [77], тяжлые инфузионные реакции, электролитные нарушения, проявления со стороны центральной нервной системы [14]. Несмотря на то, что с момента открытия Амфотерицина В за более чем 50 лет в ходе попыток оптимизации молекулы с целью снижения токсических эффектов было синтезировано несколько сотен различных полиенов, ограничения, связанные с растворимостью, стабильностью, биодоступностью и переносимостью, позволили ввести в практику небольшое число препаратов для системного применения, которые включают собственно Амфотерицин В и его липосомальные (Амбизом) и липидные (Амфолип) лекарственные формы [69, 155]. Стоит отметить попытки повышения терапевтического индекса Амфотерицина В путем создания препарата на основе таргетной доставки активного соединения с помощью наночастиц различной природы [81, 220]. Создание подобных формуляций было нацелено на улучшение переносимости антимикотика за счет снижения нефротоксичности препарата при сохранении широты спектра его действия, что и было частично достигнуто, но тем не менее не позволило занять лидирующие позиции при терапии пациентов с нарушениями функций почек и тем более полиорганной недостаточностью, а также в несколько десятков раз повысило стоимость терапии и, как следствие, сузило регион применения препарата. К настоящему времени для большинства случаев инвазивных микозов препаратами выбора стали азолы и эхинокандины [14, 15, 183].
Азолы
Азолы, в частности, флуконазол, вориконазол и позаконазол, в настоящее время являются наиболее широко используемыми противогрибковыми препаратами благодаря их высокому терапевтическому индексу [14, 66]. Фунгистатический механизм действия всех азолов связан с конкурентным ингибированием ланостерол 14-деметилазы (CYP51; КФ 1.14.13.70), важнейшего фермента биосинтеза мембранного белка грибов эргостерола. Кетоконазол, флуконазол и итраконазол по времени своего появления, а также клинико-фармакологическим особенностям относят к первому поколению азолов. Флуконазол часто предпочитают в качестве препарата первой линии терапии при лечении инвазивных грибковых инфекций, вызванных дрожжеподобными грибами Candida spp. и Cryptococcus, вследствие низкой токсичности, однако, возникает достаточно много резистентных к нему штаммов, к тому же он неактивен в отношении Aspergillus spp. Итраконазол обладает более широким спектром действия и лучше переносится пациентами, но его применение лимитируется вариабельными характеристиками всасывания при пероральном применении и низкой биодоступностью [66]. Для азолов второго поколения – вориконазола, позаконазола – частично была решена эта проблема: они эффективны в отношении широкого ряда патогенов, включая Aspergillus, и обладают улучшенной фармакокинетикой. Вориконазол в настоящее время считается препаратом выбора при терапии большинства форм инфекций, вызванных грибами рода Aspergillus [183].
Несмотря на хорошую переносимость, азолы способны влиять на метаболизм других лекарств и демонстрировать вариабельность фармакокинетики вследствие способности ингибирования печеночных ферментов. Например, совместное применение азолов (или эхинокандинов) с потенциальными стимуляторами первой или второй фаз метаболизма может привести к существенному снижению концентрации антимикотика в крови и неэффективности лечения. Гепатотоксический эффект азолов связывают с координационной связью азота азольного кольца с железом гема многих цитохромов P450 [194]. Стоит также упомянуть, что способность азолов, в частности, триазолов, ингибировать ряд цитохромов приводит к различным показателям клиренса вследствие полиморфизма генов, кодирующих цитохромы печени, у различных популяций пациентов [155]. Таким образом, применение азолов в клинической практике рекомендуется проводить под контролем активности аминотрансфераз и щелочной фосфатазы [51].
Кроме того, реально существующей проблемой азолов служат вариабельные, но имеющие тенденцию к постоянному росту показатели вторичной резистентности возбудителей, возникающей в результате длительного приема препаратов, а также кросс-резистентности [14, 34, 140]. Для преодоления данной проблемы предлагается с одной стороны, применение комплексной противогрибковой терапии, в том числе иммунотерапии, с другой – создание новых антимикотиков с фунгицидным механизмом действия [79, 179].
Эхинокандины
Эхинокандины представляют собой недавно появившийся класс антимикотиков ряда полусинтетических липопептидов, первый из которых, каспофунгин, введен в клиническую практику около 10 лет назад. Их механизм действия связан со специфичным неконкурентным ингибированием ферментов 1,3- и 1,6--D-глюкансинтет (КФ 2.4.1.34), ответственных за синтез -D-глюкана, обеспечивающего структуру и целостность клеточной стенки грибков. Поскольку данный фермент отсутствует в клетках человека, эхинокандины хорошо переносятся пациентами, включая низкую нефро- и гепатотоксичность [77]. Кроме того, для них характерна низкая вероятность возникновения кросс-резистентности, хотя вторичная резистентность вследствие мутации в FKS-гене, кодирующем ферменты – мишени эхинокадинов, приводит к снижению чувствительности патогена к препарату [179].
Эхинокандины обладают фунгицидной активностью в отношении грибов рода Candida, включая резистентные к флуконазолу штаммы; в отношении грибов рода Aspergillus эхинокандины оказывают фунгистатическое действие.
Основными недостатками эхинокандинов являются низкая растворимость, поэтому для улучшения фармакокинетического профиля препараты данного класса применяют только путем внутривенных инъекций. Как отмечалась выше, они способны, наряду с азолами, вызывать межлекарственные взаимодействия и повышать активность печеночных трансфераз, что обусловливает целесообразность мониторинга функции печени [51]. Помимо этого, они крайне дорогостоящи вследствие сложной комплексной структуры [45, 66].
Фторпиримидины
К фторпиримидинам относится единственный препарат – флуцитозин (5-фторцитозин, 5-ФЦ). Механизм действия 5-ФЦ связан с подавлением синтеза рибонуклеиновых кислот за счет конкурентного ингибирования тимидилатсинтетазы (КФ 2.1.1.148), участвующей в синтезе тимидина, что приводит к нарушению синтеза ДНК микромицетов, ослаблению процессов роста и деления клеток и, в конечном счете, их гибели [45, 62]. Препарат используется в качестве монотерапии для лечения хромобластомикозов, в сочетании с амфотерицином В – тяжлых инвазивных микозов, в том числе кандидозов и резистентного к монотерапии аспергиллза. 5-ФЦ обладает узким спектром действия и быстрым формированием вторичной резистентности, кроме того, соединение крайне токсично и вызывает серьзные побочные эффекты (таблица 1) [23].
Исследования специфической фармакологической активности
Наиболее частый подход к выявлению противогрибковых низкомолекулярных соединений заключается в скрининге больших библиотек синтетических малых молекул или соединений природного происхождения в отношении их способности ингибировать рост выбранного грибка. Наиболее широко использующимися методами выявления противогрибковых низкомолекулярных соединений являются традиционные методы разведений или микроразведений в жидких средах, основанные на оценке ингибирования роста посредством измерения оптической плотности культуры [58]. С появлением высокопроизводительного скрининга как инструмента обнаружения лекарств и биологических исследований наблюдается появление огромного количества коммерчески доступных библиотек синтетических низкомолекулярных соединений. Подавляющее большинство молекул в пределах этих библиотек были разработаны с использованием анализа связи структура-эффект и других критериев «подобия лекарству».
Поскольку два из трех основных классов используемых в настоящее время противогрибковых препаратов природного происхождения (полиены и эхинокандины), ведется активный поиск противогрибковых средств среди соединений, выделяемых из бактерий и грибов, а также растений [43, 95, 187, 197]. Однако, сложность структур таких соединений ограничивает создание их аналогов [194].
Кроме вышеперечисленного, известна концепция перепрофилирования (re-purposing), когда открывается противогрибковая активность уже известного препарата, применяющегося в других нозологиях, и его терапевтический потенциал расширяется как в качестве монотерапии, так и в качестве ко-терапии в комбинации с другими противогрибковыми препаратами [91, 156]. Первыми примерами такого подхода являются ингибиторы кальциневрина, TOR-киназы и Hsp90, которые способны значительно усиливать активность флуконазола in vitro и in vivo, а также эноксацин, фторхинолоновый антибиотик, показавший активность на модели диссеминированного кандидоза у мышей [95]. Помимо этого стоит отметить стимулирующую противогрибковую активность противоопухолевого препарата гентамицина [183].
Для подтверждения активности выявленных в процессе скрининга соединений используют животные модели грибковых заболеваний. Морские свинки наиболее часто используются в качестве животной модели для оценки эффективности противогрибковых соединений против дерматофитов, в то время как мыши оказываются предпочтительнее для создания иммунокомпрометированных моделей аспергиллза лгких и кандидозов [96, 15].
По своему механизму действия, фунгицидные соединения более предпочтительны по сравнению с фунгистатическими, поскольку большинство пациентов, страдающих инвазивными грибковыми инфекциями, иммунокомпрометированы и, таким образом, в большей степени зависят от того, чтобы противогрибковый препарат позволил полностью избавиться от патогена и избежать рецидива заболевания. Применение большинства доступных антимикотиков с фунгистатическим механизмом действия часто приводит к развитию устойчивости патогенных грибков к данным лекарствам и неблагоприятному исходу лечения, что впоследствии приводит к появлению множественной лекарственной резистентности [97, 179]. Таким образом, в ходе доклинической оценки противогрибкового препарата необходимо на ранних этапах оценивать потенциальный механизм действия соединения и принципиальную возможность и скорость возникновения приобретенной устойчивости патогенных грибковых культур к лекарственному кандидату [118]. Чаще всего при этом применяют диско-диффузионный метод, метод серийных разведений и Е-тест [34].
Данные по острой токсичности позволяют оценить способность соединения вызывать летальные эффекты, выяснить закономерности их проявления и степень выраженности. Они, в совокупности с результатами изучения специфической фармакологической активности, позволяют оценить терапевтическую широту препарата и/или отсеять заведомо ядовитые соединения или соединения, непригодные по критерию «терапевтическая широта». Кроме того, в отсутствие сведений об острой токсичности существенно затруднено определение доз, превышающих эффективные, в дальнейших доклинических исследованиях по оценке хронической токсичности и специфических видов токсичности.
Сведения о мутагенных свойствах позволяют прогнозировать возможную канцерогенность и репродуктивную токсичность, а также формирование резистентных к антибиотику штаммов возбудителя. Cтандартная батарея испытаний генотоксической активности лекарственных средств включает испытания in vivo и in vitro на культурах бактериальных и эукариотических клеток.
Хотя генотоксический и даже канцерогенный потенциал был обнаружен у ряда хорошо известных коммерческих противоинфекционных препаратов [92, 93, 173, 202], современные нормативные руководства настоятельно рекомендуют избегать потенциально генотоксичных молекул для любых препаратов. Таким образом, доклинические исследования безопасности начинают с испытания острой токсичности и генотоксичности лекарства-кандидата [185, 192].
Помимо профиля фармакологической активности и безопасности, фармакокинетические свойства антимикотика часто представляют наиболее важный вопрос при выборе терапии, и, соответственно требуют особого внимания на ранних этапах разработки антимикотика [44]. Это обусловлено тем, что, во-первых, ослабленная функция желудочно-кишечного тракта или сниженный печеночный или почечный клиренс могут серьзно влиять на эффективность и безопасность противогрибковой терапии. Во-вторых, грибковые инфекции, поражающие центральную нервную систему, в которым относится, в частности, аспергиллз, поддаются лечению только при условии проникновения антимикотика через гемато-энцефалический барьер, таким образом, соединения с высокой молекулярной массой или большим коэффициентом связывания с белками плазмы крови часто не способны достигать терапевтических концентраций [50, 154].
Кроме того, предсказуемый фармакокинетический профиль позволит оценить вероятность развития побочных токсических эффектов и подобрать соответствующую корригирующую терапию без проведения дорогостоящего лекарственного мониторинга. Например, широко применяемый флуконазол обладает хорошей пероральной биодоступностью, предсказуемой линейной фармакокинетикой с распределением во многие ткани, включая спинно-мозговую жидкость, низкий риск межлекарственного взаимодействия и сниженной по сравнению с предыдущими азолами токсичностью [3].
Создание новых противогрибковых препаратов для системного применения чаще всего ведется сразу для нескольких предполагаемых клинических путей введения, для чего разрабатываются несколько видов лекарственных форм. Это связано с тем, что тяжесть течения системной инфекции и жизнеугрожающее состояние пациента могут определить выбор парентерального пути введения, который позволит быстро достичь терапевтической концентрации в пораженном органе. В то же время при хроническом течении инфекции и формах течения, не угрожающих жизни пациента, допустимы пероральные формы приема препарата [155].
Суммируя вышесказанное, можно отметить следующие условия, которым должен отвечать антимикотик, перспективный к практической разработке [130, 155, 183, 194]: 1) должен быть эффективным и высокоселективным в отношении специфичной для грибка-патогена мишени; 2) предпочтительнее по своему механизму действия должен обладать фунгицидным по сравнению фунгистатическим воздействием; 3) должен быть хорошо растворимым и подходящим для создания на его основе формуляций для перорального и внутривенного (в случае системных микозов) или иных соответствующих путей введения; 4) должен обладать приемлемыми фармакокинетическими характеристиками.
Оценка мутагенной активности соединений в тесте Эймса
Из представленных данных следует, что только три соединения (CBL0100, CBL0159, CBL0253) оказались активными в отношении всех протестированных культур дерматомицетов. Соединения CBL0137 и CBL0175 не проявили активность в отношении ни одного из использованных штаммов, поэтому данные по ним не представлены на рисунке; соединения CBL0174, CBL0176, CBL0207 и CBL0211 проявили активность в отношении только одной культуры, CBL0252 - двух, CBL0212 - трех.
Таким образом, были отобраны три соединения, CBL0100 (рисунок 4, МИК 3,14-25 мкг/мл), CBL0159 и CBL0253 (МИК 12,5-100 мкг/мл), обладающие наибольшей фунгистатической активностью in vitro. Минимальные фунгицидные концентрации для этих соединений находятся в пределах 3,14-25 мкг/мл для CBL0100, 12,5-100 мкг/мл для CBL0159 и для CBL0253 в отношении патогенных микромицетов T. mentagrophytes, M. canis, T. rubrum, T. tonsurans. Полученные результаты опубликованы в статье [31].
Первичный тест для проверки мутагенной активности лекарственных кандидатов – тест Эймса – был выбран в соответствии с рекомендациями Руководства по доклиническим исследованиям [58, 59] и международной практикой генотоксикологических исследований [135]. Тест Эймса широко используется в экспертных и научных исследованиях мутагенности синтетических и природных соединений как в качестве скринингового теста, так и в стандартной батарее исследований специфических видов токсичности. Тест предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов S.typhimurium и E.coli. Тестерные штаммы подвергают воздействию различных концентраций исследуемого образца и выращивают на среде, не содержащей гистидин или триптофан. Мутагенный потенциал оценивают по индукции ревертантов от ауксотрофности по гистидину или триптофану к прототрофности, способных к выживанию и росту на безгистидиновой или безтриптофановой среде. Штаммы S.typhimurium ТА100, ТА1535 и штаммы E.coli позволяют регистрировать индукцию мутаций по типу замены пар оснований, штаммы S.typhimurium ТА98 и ТА1537 – мутаций по типу сдвига рамки считывания. Индукция обратных мутаций по типу замены оснований на штаммах S.typhimurium происходит по паре GC, тогда как на штаммах E.coli – по паре AT, что позволяет детектировать мутагены, реализующие свой эффект путем окислительной модификации или за счет образования сшивок.
В результате предварительной оценки цитотоксичности соединений CBL0100, CBL0159 и CBL0253 было установлено, что при 90-минутной экспозиции тестируемые соединения не проявляют признаков цитотоксического действия на культуру штамма Salmonella typhimurium ТА98: для всех трех соединений не было выявлено значимого снижения показателя OD600.
Во всех экспериментах количество ревертантов в контроле с растворителем (2 % ДМСО) в вариантах с МА (+S9) и без таковой (-S9) было в пределах колебаний спонтанного уровня для представленных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены также был в пределах обычных уровней [113].
В таблице 7 представлены результаты тестирования соединения CBL0253. На штамме ТА98 для CBL0253 выявлен мутагенный эффект в условиях без МА в концентрациях 0,0016 и 0,008 мг/мл, в условиях с МА – в концентрациях 0,008 и 0,04 мг/мл. В более высоких концентрациях наблюдали цитотоксический эффект, свидетельством которого являлось отсутствие лунок с ревертантами. В эксперименте на штамме ТА100 без МА мутагенный эффект выявлен только в концентрации 0,0016 мг/мл, для остальных концентраций наблюдали цитотоксический эффект. В условиях с МА значимое увеличение количества лунок c ревертантами выявлено при использовании CBL0253 в концентрации 0,04 мг/мл, в более высоких концентрациях наблюдали цитотоксический эффект. При тестировании CBL0253 на штамме ТА1537 без МА не выявлено значимых различий по сравнению с уровнем НК, в условиях с МА соединение проявило выраженное мутагенное действие в концентрациях 0,0016, 0,008 и 0,04 мг/мл. В более высоких концентрациях соединение оказалось токсичным для бактерий.
Обозначения: HK и ПК - негативный и позитивный контроли; п - количество повторностей; х - среднее количество лунок с ревертантами; х 0Гх к - отношение среднего количества лунок с ревертантами в опыте (х 0) к таковому в НК (х к) (кратность превьпнения нулевой линии); р - уровень значимости по сравнению с НК; серым цветом выделен цитотоксический эффект. Результат рассматривается как позитивный при р 0,01 (непарный односторонний ґ-тест Стьюдента) и при кратности превьпнения нулевой линии 2
Принимая во внимание, что CBL0253 в высших тестируемых концентрациях (0,2, 1 и 5 мг/мг) оказалось цитотоксичным для бактерий, для тестирования соединений CBL0100 и CBL0159 в качестве высшей была выбрана концентрация 40 мкг/мл.
Обозначения: НК и ПК - негативный и позитивный контроли; п - количество повторностей; х - ср еднее кол ичество лунок с ревертантами; х 01х к - отношение среднего количества лунок с ревертантами в опыте (х 0) к таковому в НК (х к) (кратность превьшения нулевой линии); р - уровень значимости по сравнению с НК; серым цветом выделен нитотоксический эффект. Результат рассматривается как позитивный при р 0,01 (непарный односторонний ґ-тест Стьюдента) и при кратности превьшения нулевой линии 2 Исследуемое соединение во всех тестируемых концентрациях не продемонстрировало мутагенного эффекта на штаммах ТА98, ТА100 и ТА1537 в вариантах с МА и без таковой. Вместе с тем, в зависимости от штамма и варианта проведения тестирования, соединение проявляло цитотоксическое действие в концентрациях выше 5 мкг/мл.
В таблице 8 также представлены результаты тестирования соединения CBL0159. Практически во всех вариантах постановки эксперимента, кроме штамма TA1537 с МА, соединение проявляло цитотоксический эффект в концентрациях 10, 20 и 40 мкг/мл. На штамме ТА98 в условиях без МА для CBL0159 в концентрациях 1,25 и 2,5 мкг/мл выявлен мутагенный эффект. На том же штамме в условиях с МА, а также на штамме ТА100 в варианте с МА и без таковой исследуемое соединение не проявило мутагенного эффекта. В эксперименте на штамме ТА1537 в условиях без МА для соединения CBL0159 выявлен мутагенный эффект в концентрации 1,25 мкг/мл, в условиях с МА исследуемое соединение проявило выраженную мутагенную активность в концентрациях 1,25 20 мкг/мл. В высшей тестируемой концентрации соединение оказалось цитотоксичным для бактерий.
Таким образом, было установлено, что соединение CBL0253 проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98 и ТА100 с МА и без таковой и на штамме ТА1537 в условиях с МА. Соединение CBL0100 во всех тестируемых концентрациях не проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98, ТА100 и ТА1537 в вариантах с МА и без таковой. Соединение под шифром CBL0159 проявляет мутагенную активность при тестировании на штаммах ТА98 без МА и на штамме ТА1537 в вариантах с МА и без таковой.
Полученные результаты опубликованы в статье [31].
Отсутствие мутагенной активности и достаточная in vitro и in vivo фармакологическая активность позволило выбрать соединение CBL0100 основным для осуществления процесса оптимизации молекулы с целью поиска более активных, но менее токсичных лекарственных кандидатов. В результате на основании многопараметрического матричного сравнения активности in vitro, селективности действия, токсичности in vivo, патентной чистоты и сложности химического синтеза группы соединений, созданных на основании структуры-прототипа CBL0100, были выбраны два соединения PLX0-группы под шифрами PLX01008 и PLX01107 [127, неопубликованные данные разработчиков].
Исследование фармакокинетики и биораспределения CBL0100 в плазме крови и органах и тканях морских свинок
При микроскопии материала из очага поражения через 6 суток после заражения культурой гриба у всех животных наблюдали большое количество мицелия гриба в кожных чешуйках (рисунок 12); поражение волос (нити септированного мицелия и споры гриба по типу эндотрикс) отмечали у всех животных с интенсивностью 3 балла; при посеве на агар DTM был получен обильный рост T. mentagrophytes во всех точках посева (6 баллов) (рисунок 14). Суммарный показатель ИГП для животных во всех группах составил 12 баллов. ИГП животных контрольных групп существенно не менялись на 13-й и 20-й дни после заражения. У животных, получавших лечение ГЛФ с концентрацией 0,2 % CBL0100, к 7 дню лечения отмечали уменьшение грибковой пораженности патологического материала по сравнению с группами без лечения и плацебо. На 14 день лечения ИГП в группе 0,2 % CBL0100 (ЭМ) (к этому сроку погибли два животных из группы) составляло 5,3±1,0, что меньше такового показателя в группе без лечения, но не отличалось от контроля плацебо; при микроскопии в кожных чешуйках наблюдали единичные нити мицелия гриба, волосы у двух животных имели признаки грибкового поражения; у всех животных из группы получен рост культуры T. mentagrophytes на среде DTM-агар (4-6 баллов). В группе 0,2 % CBL0100 (ПЭГ) (к этому сроку погибло одно животное) к 14 дню лечения ИГП резко уменьшилось и составило 3,6±0,9; при микроскопии в кожных чешуйках наблюдали единичные нити мицелия гриба, волосы не имели признаков грибкового поражения; у всех животных из группы получен рост культуры при посеве на агар (4 балла).
В группах 0,02 % CBL0100 (ЭМ) и 0,02 % CBL0100 (ПЭГ) к 20 дню после заражения ИГП резко уменьшился по сравнению с 13-м днем (10,2±1,3 и 10,2±0,4, соответственно) и составил 3,7±0,8 и 3,3±1,5, соответственно. В группе 0,02 % CBL0100 (ЭМ) при микроскопии в кожных чешуйках и волосках элементы гриба не обнаружены; при посеве у двух животных получен рост культуры T. mentagrophytes на среде DTM-агар (2-3 балла). I
Рост культуры T.mentagrothytes во всех точках посева материала из очага поражения на DTM-агаре. В группе 0,02 % CBL0100 (ПЭГ) при микроскопии у двух животных наблюдали единичные нити мицелия гриба, волосы с признаками грибкового поражения не обнаружены; при посеве роста культуры не обнаружено. Таким образом, в обеих группах микологическую излеченность отмечали у 4 (67%) животных.
В группе лечения контрольным препаратом через 7 дней лечения выявляли значимые различия в снижении грибкового поражения материала по сравнению с группой без лечения, а к концу эксперимента были микологически излечены 5 животных из шести (83%).
По результатам гистопатологического исследования биоптатов кожи морских свинок можно заключить, что через 6 дней после заражения свинок во всех случаях были обнаружены элементы инфицирования грибами с поражением роговых масс и устьев волосяных фолликулов (рисунок 13). Средний показатель степени поражения грибами при этом составлял 3,1±0,4. Через 20 дней после заражения отмечено отсутствие мицелия грибов во всех слоях кожного покрова во всех группах животных.
Таким образом, при лечении зараженных морских свинок двумя лекарственными формами с активным веществом CBL0100 в двух концентрациях полное излечение животных (доля (%) животных с клиническим и микологическим выздоровлением от общего количества животных, включенных в исследование и пролеченных) не получено. Однако, наблюдали микологическое излечение 67 % животных при использовании 0,02 % CBL0100 в составе обеих лекарственных форм (ЭМ- и ПЭГ-основы), в соответствии с чем посчитали целесообразным охарактеризовать токсикологический и фармакокинетический профили обеих лекарственных форм CBL0100. Результаты этих исследований представлены ниже (Разделы 3.3.1 и 3.5).
Полученные результаты опубликованы в статье с соавторами [30].
Исследование возможности применения CBL0100 для лечения трихофитий с использованием соответствующей модели на морских свинках, результаты которого описаны выше, позволило продемонстрировать валидность тест-системы и оценить активность соединения. Выявленная корреляция активности соединения in vitro и in vivo в отношении Trichophyton mentagrophytes оказалась бесперспективной на фоне выраженного токсического действия соединения, особенно в сравнении с позитивным контролем (Травоген), даже с учтом попытки снижения системного действия за счет применения различных топических ГЛФ. Результаты исследования биораспределения CBL0100 продемонстрировали достаточно высокое трансдермальное проникновение соединения через кожу в системный кровоток (Раздел 3.5). 3.4.3 Исследование активности PLX01107 на модели аспергиллёза лёгких у мышей
В Руководствах по проведению доклинических исследований отсутствуют какие-либо рекомендации по оценке антиаспергиллзной активности соединений in vivo, поэтому на базе НИИ медицинской микологии им. П.Н Кашкина была разработана модель аспергиллза лгких у мышей, развивающегося на фоне иммуносупрессии [9, 11, 71]. Созданная модель является необходимым инструментом для изучения противогрибковой эффективности соединений. До настоящего времени в нашей стране не существовало моделей подобного типа, описанных как в нормативной документации, так и в доступной научной литературе.
В качестве позитивного контроля были выбраны Вориконазол ((R,S)--(lH-l,2,4-Триазол-1-илметил)--(2,4-дифторфенил)--метил--(5-фтор-4-пиримидинил) этанол) и Амфотерицин В ([1R-QR , 3S , 5R , 6R , 9R , 11R , 15S , 16R , 17R , 18S , 19Е, 21Е, 23Е, 25Е, 27Е, 29Е, 31Е, 33R , 35S , 36R , 37S )] - 33-[(3 - Амино - 3,6 - дидезокси - - D -маннопиранозил) окси]-1, 3, 5, 6, 9, 11, 17, 37 - октагидрокси - 15, 16, 18 - триметил - 13 -оксо - 14, 39 -диоксабицикло [33.3.1] нонатриаконта - 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 - гептен - 36 -карбоновая кислота), препараты, являющиеся препаратами первой линии терапии для лечения аспергиллза лгких [8]. Дозы были выбраны на основании литературных данных [123, 167, 195, 201, 205]. МИКи Амфотерицина В и Вориконазола в отношении культуры A. fumigatus лежат в пределах 0,03 - 8 мкг/мл [107], МИК PLX01107 - 1,1 мкг/мл [127].
При исследовании лейкоцитарной формулы до введения соединения были получены результаты, соответствующие реферативным нормам абсолютного количества лейкоцитов и нейтрофилов для мышей: количество лейкоцитов составило 11,8±1,0109/л, нейтрофилов -3,4±0,7109/л [58, 168]. Согласно используемой схеме, лейкопения и нейтропения у мышей развилась уже после первого введения ЦФА. В момент заражения группы мониторинга нейтропении количество лейкоцитов составило 2,0±0,4109/л, нейтрофилов - 0,5±0,1109/л, что согласуется с данными зарубежных разработчиков аналогичных экспериментальных моделей [123, 205]. Состояние лейкопении на фоне нейтропении поддерживали при принятой схеме введения на протяжении всего эксперимента.