Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1. Нейропротекция 18
1.1.1. Протеинкиназы и протеинфосфатазы: строение, свойства, рецепторы . 21
1.1.2. Митохондрии 28
1.1.3. Окислительный стресс 30
1.1.4. Механизмы гибели нейронов 32
1.2. Заболевания центральной нервной системы и их экспериментальные модели 39
1.2.1. Ишемический инсульт 39
1.2.2. Эпилепсия 42
1.2.3. Депрессия 51
1.2.4. Болезнь Паркинсона 60
1.3. Ботаническая характеристика, биологически активные вещества изучаемых лекарственных растений и их фармакологическая активность .64
1.3.1. Астрагал монгольский (Astragal Mongholicus Bunge) 67
1.3.2. Ирис тонколистный (Iris teniufolium Pall.) 70
1.3.3. Аспарагус кохинхинский (Asparagus cochinchinensis (Lour) Merr) 72
1.3.4. Чистотел большой (Chelidonium majus L.) 74
Глава 2. Материал и методы исследования 79
Глава 3. Результаты исследований и обсуждение 127
3.1. Изучение фармакологической активности извлечений из корней астрагала монгольского 127
3.1.1. Изучение антидепрессивного действия суммы полисахаридов из корней астрагала монгольского 128
3.1.2. Влияние суммы полисахаридов астрагала монгольского на ориентировочно-исследовательское поведение крыс в тесте открытого поля 130
3.1.3. Сравнительное исследование влияния суммы полисахаридов астрагала монгольского на поведение крыс в условиях конфликтной ситуации 132
3.1.4. Изучение анксиолитического действия суммы полисахаридов астрагала монгольского в зависимости от вводимой дозы 135
3.1.5. Влияние суммы полисахаридов астрагала монгольского на функции памяти 137
3.1.6. Влияние суммы полисахаридов астрагала монгольского на агрессивность белых крыс 139
3.1.7. Влияние суммы полисахаридов астрагала монгольского на физическую работоспособность крыс 141
3.1.8. Изучение миорелаксантного действия суммы полисахаридов астрагала монгольского 142
3.1.9. Влияние суммы полисахаридов астрагала монгольского на биоэлектрическую активность головного мозга крыс 143
3.1.10. Изучение противосудорожного действия суммы полисахаридов астрагала монгольского . 145
3.2. Исследование фармакологической активности суммы сапонинов из корней астрагала монгольского 149
3.2.1. Влияние суммы сапонинов из корней астрагала монгольского на ориентировочно-исследовательское поведение крыс в тесте открытое поле 149
3.2.2. Влияние суммы сапонинов астрагала монгольского на уровень тревожности крыс . 150
3.2.3. Изучение нейропротекторного действия извлечений астрагала монгольского in vitro 151
3.2.4. Изучение ингибирующего действия экстрактов корней и надземной части астрагала монгольского на повреждающее действие гидроксильных и липидных радикалов 151
3.2.5. Исследование нейропротекторного действия экстракта корней астрагала монгольского при митохондриальной дисфункции 153
3.2.6. Сравнительное изучение антиэпилептического действия суммы сапонинов и полисахаридов астрагала монгольского 157
3.2.7. Влияние суммы сапонинов и суммы полисахаридов астрагала монгольского на кинжлинг, вызванный пентилентетразолом (ПТЗ) 158
3.2.8. Влияние суммы сапонинов из корней астрагала монгольского на амнезию, вызванную пентилентетразолом в условиях УРАИ (Shutle Box) 161
3.2.9. Влияние ПТЗ киндлинга и суммы сапонинов астрагала монгольского на митохондриальную функцию 163
3.3. Изучение фармакологической активности суммы флавоноидов корней ириса тонколистного 169
3.3.1. Исследование нейропротекторного действия суммы флавоноидов ириса тонколистного при нейрональной дисфункции in vitro 171
3.3.2. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на выживаемость нейронов при эксайтотоксичности, вызванной перекисью водорода 171
3.3.3. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на сигнальные пути MAPK/Erk12 и PI3K/Akt . 173
3.3.4. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на активацию нейротрофных белков BDNF, bFGF, Bcl2 . 176
3.3.5. Изучение действия суммы флавоноидов ириса тонколистного на активацию белка тирозинфосфатазы Shp2 178
3.3.6. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на ишемию головного мозга животных in vivo 181
3.3.7. Изучение анксиолитической активности суммы флавоноидов ириса тонколистного . 182
3.3.8. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистого на двигательную активность крыс 183
3.3.9. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на социальное поведение животных . 184
3.3.10. Исследование антидепрессивного действия суммы флавоноидов ириса тонколистного . 186
3.3.11. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на болевую чувствительность . 188
3.3.12. Нейропротекторный эффект суммы флавоноидов ириса тонколистного при ишемии мозга, вызванной окклюзией правой сонной артерии (ОСМА) 189
3.3.13. Влияние суммы флавоноидов ириса тонколистного на реакцию цитокинов крови после ишемии мозга у животных 200
3.4. Исследование фармакологической активности суммы сапонинов из аспарагуса кохинхинского 202
3.4.1. Исследование нейропротекторного действия сапонинов аспарагуса кохинхинского на нейрональную дисфункцию in vitro 204
3.4.2. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на выживаемость нейронов при эксайтотоксичности, вызванной перекисью водорода 204
3.4.3. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на сигнальные пути MAPK/ERK1/2 и PI3K/Akt . 206
3.4.4. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на активацию белка тирозинфосфатазы Shp2 209
3.4.5. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на экспрессию нейротрофных белков 215
3.4.6. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на активность глюкокортикоидов и минералокортикоидов . 217
3.4.7. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на поведение животных и ишемию головного мозга 218
3.4.8. Изучение анксиолитической активности суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского 219
3.4.9. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на социальное взаимодействие животных . 219
3.4.10. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на ориентировочно-исследовательское поведение животных в тесте открытое поле . 221
3.4.11. Исследование антидепрессивного действия суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского 222
3.4.12. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на болевую чувствительность 224
3.4.13. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на ишемию мозга, вызванную окклюзией правой сонной артерии 225
3.4.14. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на содержание астроцитов в мозге животных после ишемии 227
3.4.15. Влияние суммы сапонинов аспарагуса кохинхинского на реакцию цитокинов в крови животных после ишемии мозга 228
3.5. Изучение фармакологической активности суммы алкалоидов чистотела большого . 231
3.5.1. Исследование нейропротекторного действия суммы алкалоидов чистотела большого in vitro 232
3.5.2. Изучение ингибирующего действия суммы алкалоидов чистотела большого против гидроксильных и липидных радикалов 233
3.5.3. Исследование нейропротекторного действия суммы алкалоидов чистотела большого на нарушение уровня активности митохондриальных дыхательных комплексов I,II и MDH, вызванных МДА 234
3.5.4. Влияние суммы алкалоидов чистотела большого на дисфункцию мембранного потенциала митохондрий (МПМ) и формирование активных форм кислорода 236
3.5.5. Влияние суммы алкалоидов чистотела большого на выживаемость нейронов при эксайтотоксичности, вызванной перекисью водорода 237
3.5.6. Влияние суммы алкалоидов чистотела большого на снижение уровня активности синаптического протеинасинаптофизина, вызванного перекисью водорода 238
3.5.7. Изучение действия суммы алкалоидов чистотела большого на антиоксидант-респонсивный элемент (ARE)-ависимую экспрессию люциферазы в нейронах 241
3.5.8. Изучение нейропротективного действия суммы алкалоидов чистотела большого на поведенческую активность на модели Drosophila melanogaster 243
Заключение 249
Выводы 257
Список литературы 261
- Протеинкиназы и протеинфосфатазы: строение, свойства, рецепторы
- Чистотел большой (Chelidonium majus L.)
- Исследование нейропротекторного действия экстракта корней астрагала монгольского при митохондриальной дисфункции
- Изучение нейропротективного действия суммы алкалоидов чистотела большого на поведенческую активность на модели Drosophila melanogaster
Протеинкиназы и протеинфосфатазы: строение, свойства, рецепторы
Фосфорилирование и дефосфорилирование белков - один из главных механизмов регуляции большинства внутриклеточных процессов.
Фосфорилирование является одним из самых распространенных посттрансляционных модификаций белков, влияющих на их третичную структуру и функции. Оно представляет собой процесс переноса остатка фосфорной кислоты от фосфорилирующего агента-донора к субстрату. Дефосфорилирование, соответственно, является противоположным процессом. Фосфорилирование катализируется протеинкиназами (фосфотрансферазами), которые используют в качестве субстратов фосфатную группу АТФ (или ГТФ) и спиртовые группы серина/треонина или фенольную группу тирозина в белках для образования фосфомоноэфиров. В настоящее время в литературе описано около 200 представителей протеинкиназ. Предполагается, что в геноме млекопитающих содержится около 1000 генов, кодирующих различные протеинкиназы. Это составляет около 1 % всех генов. Таким образом, протеинкиназы образуют многочисленное семейство внутриклеточных белков. Протеинкиназы относятся к группе сложно устроенных ферментов. Протеинкиназы должны иметь специальный центр связывания АТФ или других нуклеозидтрифосфатов, которые используются в качестве доноров остатков фосфата, а также специальный центр связывания белка-субстрата, на который осуществляется перенос фосфатной группы. Протеинкиназы имеют в своей стуктуре специальные регуляторные элементы. Также, в структуре большинства протеинкиназ есть специальные участки, которые могут фосфорилироваться. В некоторых случаях протеинкиназа может катализировать свое собственное фосфорилирование и, тем самым, регулировать собственную активность.
Каталитический домен - это участок молекулы белка, обеспечивающий перенос фосфата с АТФ на белок. Каталитический домен большинства протеинкиназ состоит из двух долей, соединенных гибким шарниром. N-концевая доля содержит в своем составе пять антипараллельных -структурных участков (характерных элементов укладки полипептидной цепи белка). Помимо этого, в состав N-концевой доли входит от одной до трех относительно коротких -спиралей (характерная укладка полипептидной цепи). Эта N-концевая часть молекулы белка отвечает за связывание АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата) и его правильную ориентацию относительно каталитического белоксвязывающего центров. С-концевая часть каталитического домена содержит пять относительно длинных -спиральных участков, которые формируют своеобразный фундамент для всего каталитического домена. Катализ становится возможным только в том случае, если участки связывания АТФ, каталитический центр, центр связывания ионов магния и центр связывания белка-субстрата будут правильным образом ориентированы относительно друг другу [Roskoski R., 2005]. Протеинкиназы разделены на пять больших классов в зависимости от того, на какие группы в структуре белка переносится остаток фосфата. Протеинкиназы первого класса переносят фосфат на спиртовые группы серина и треонина. Протеинкиназы второго класса переносят фосфат на спиртовые группы тирозина. Протеинкиназы третьего класса образуют фосфоамидные связи, перенося остаток фосфата на атомы азота гистидина, лизина или аргинина. Протеинкиназы четвертого класса фосфорилируют остатки цистина в структуре белка. Протеинкиназы пятого класса способны фосфорилировать остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот [Roskoski R., 2005]. Протеинфосфатазы (proteinphosphatases, франц.) – ферменты, катализирующие дефосфорилирование белков. Дефосфорилирование отщепление остатка фосфорной кислоты от молекулы фосфорсодержащего соединения. Подразделяются на семейства преимущественно на основе способности дефосфорилировать одновременно серин/треонин или только треониновые остатки. Имеются также протеинфосфатазы, которые дефосфорилируют остатки аспарагина. Существует огромная группа мало изученных протеинфосфатаз, осуществляющих процесс дефосфорилирования субстратов и разностронне влияющих на функциональную активность других ферментных систем и функцию клеток.
Таким образом, протеинкиназы и фосфатазы образуют две группы ферментов антагонистов, способных осуществлять обратную ковалентную модификацию белков-мишеней и, тем самым, регулировать их активность. Протейнкиназы совместно с протеинфосфатазами контролируют разнообразные клеточные процессы, включая клеточный цикл, сигнальные пути факторов роста, транскрипцию ряда генов. Эти ферменты служат мишенями для многих медицинских препаратов и участвуют в цепях передачи внутриклеточного сигнала.
В ряде случаев дефосфорилирование возвращает белки обратно в состояние покоя. Существует ряд белков (например, гликогенсинтаза, Src, c Jun, p56, NF-AT) которые фосфорилированы в состоянии покоя, а в активное состояние переходят после процесса дефосфорилирования. В частности, фактор транскрипции c-Jun требует как дефосфорилирования серин/треониновых аминкислотных остатков вблизи участка, связывающего ДНК, так и фосфорилирование серинов в N-концевом участке для перехода полностью в активное состояние. Протеинтирозинфосфатазы (PTPs) относятся к семейству мультидоменных белков, имеющих значительные различия в структуре, что обеспечивает их многообразие. Их можно подразделить на две группы: трансмембранные рецептороподобные PTPазы (PTPRF- Proteintyrosinephosphatase, receptortype, F) и цитозольные PTPазы (NRPTPs- Proteintyrosinephosphatase, receptortype, F). Если RPTPs существуют в плазме мембран, то NRPTPs находятся во внутриклеточном компартменте [Stoker A.W., 2005].
Трансмембранные рецептороподобные фосфатазы классифицируются по содержанию различных экстраклеточных доменов, которые могут состоять как из очень коротких, так и разветвленных цепей. Фосфорилирование по остаткам тирозина является ключевым событием в активации тирозинкиназных рецепторов (RTK). При стимуляции фактором роста эти рецепторы димеризуются и автофосфорилируются, в результате чего становятся активными [Andrae J. et al., 2008].
Цитозольные фосфатазы также классифицируются согласно их доменной структуре. Их субстратами являются белки ядра и цитоскелета. Важный подкласс составляют SHP-1 и SHP-2, обладающие SH2 доменами. Другие характеризуются присутствием последовательностей PEST (Pro Glu/Asp-Ser/Thr) С-концевой половине молекулы. Также существуют подклассы фосфатаз двойной специфичности, которые могут дефосфорилировать как тирозиновые, так и серин/треониновые остатки. Фосфатазы могут обнаруживать положительные или отрицательные реакции в передаче сигнала. Например, SHP-2 (фосфатаза-2, гомологичная Src, изначально названная SH-PTPили Syp) участвует в активации рецепторной тирозиновой киназы Raf и это предполагает, что фосфатаза обеспечивает передачу положительного сигнала при активации рецепторой тирозиновой киназы. Фосфатаза MAP-киназы, MKP-1 в течение непродолжительного периода активирует MAP-киназы. Сигнальный путь МАРК/ERK1/2
Митоген-актвированный протеинкиназный (MAPK – mitogen activated proteinkinases) путь регулирует различные клеточные программы, включая эмбриогенез, пролиферацию, размер клеток и их дифференциацию или выживание [McKay M.M., 2007]. После фосфорилирования адапторного белка Shс образует комплекс с SH2/SH3-доменами адаптерного белка Grb2. SH3 домен имеет сродство к пролину и связывается с богатым пролином участком обменного фактора SOS, активирующего Ras белок. SOS является обменным фактором гуаниновых нуклеотидов (GEF) для малой ГТФ-азы белка Ras. Мембран-связанный Ras (через С-концевое фарнезилирование) взаимодействует с SOS, что приводит к обмену ГДФ на ГТФ и, тем самым, поддерживает Ras в активном состоянии. ГТФ-связанный Ras имеет повышенное сродство к нескольким субстратам, в том числе PI3K или киназе Raf. Связывание активного Ras с Ser/Thr-специфичной киназой Raf позволяет Raf активировать другие белки – следующие повторяющиеся циклы фосфорилирования и де-фосфорилирования и разнообразные белок-белковые взаимодействия, которые не до конца изучены [McKay М.М., 2007]. После активации Raf киназа фосфорилирует и активирует МЕК1/2 киназу. Активированный МЕК1/2 затем фосфорилирует внеклеточные сигнал-регулируемые киназы (ERK1/2), так называемые MAPKs по остаткам серина и тирозина в их цикле активации.
Сигнальный путь PI3K/Akt/
Фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) являются одним из важнейших регуляторных белков, находящихся на пересечении различных сигнальных путей и контролирующих ключевые функции клетки. Активация фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и активируемые этим ферментом пути регулируют такие функций клетки, как рост и выживаемоть, старение, опухолевая трансформация [Красильников М.А., 2000; Kane L.Р. et al., 2003]. Фосфатидил-инозитиды, синтезируемые PI-3 киназой, приводят к активации протеинкиназы Akt (протеинкиназа B), важнейшего регулятора сигнализации и одного из самых универсальных и важных белков [Cantley L.C., 2002]. Фосфоинозитид-зависимая протеинкиназа (PDK-1) фосфорилирует Akt по треонину в плазматической мембране. AktPDK-1 обладают плекстрин-гомологичными (Ph) доменами, которые демонстрируют высокое сродство к PI(3,4)P2 и PI(3,4,5)P3.
Чистотел большой (Chelidonium majus L.)
Чистотел большой (Chelidonium majus L.) - многолетнее травянистое растение, принадлежащее семейству маковых (Papaveraceae) [Губанов И.А. и др., 2000]. Корень стержневой, ветвистый, с коротким многоглавным корневищем. Внутри корень желтый, снаружи – красно-бурый. Стебли слегка ребристые, светло-зеленого цвета, в междоузлиях полые, слабоопушенные, прямостоячие, ветвистые, длиной до 60 см. Листья очередные, черешковые, в очертании широкоэпилептические, пластинки непарноперисторассеченные с 3-4 парами городчатолопастных сегментов зеленые, снизу сизоватые. Верхние листья – сидячие, нижние – на длинных черешках. Бутоны обратнояйцевидные, с двумя опушенными чашелистиками, опадающими при распускании цветка. Цветки ярко-желтые на длинных цветоножках, собранные по 4-8 в пазушных зонтиковидных соцветиях на цветоносах, удлиняющихся в период плодоношения. Лепестки округлые, венчик правильный, из 4 обратнояйцевидных лепестков, тычинок много. Плод – продолговатая, стручковидная, двустворчатая коробочка длиной 3-6 см, шириной 2-3 мм серовато-зеленого цвета. Семена мелкие, темно-коричневые, блестящие, яйцевидные с ямчатой поверхностью, с мясистым белым придатком, расположены в коробочке в два ряда, цвет - от бураватого до черного.
Чистотел встречается по влажным и тенистым каменистым местам, часто как сорное растение. Растет на осыпях, склонах скал, на галечниках в долинах рек и по берегам ручьев, в кустарниках, вдоль дорог в разреженных лесах, нередко заселяет вырубки и гари, поселяется вблизи жилья, в садах, огородах, на пустырях, по выгонам и как сорное растение. Растет обычно небольшими куртинами, заросли на значительных площадях образует редко.
Химический состав
Трава чистотела большого содержит алкалоиды, флавоноиды, сапонины, витамины, органические кислоты и эфирное масло [Maji A.K., Banerji P., 2015]. Млечный сок содержит около 1-4 % изохинолиновых алкалоидов (в траве чистотела и сухих корнях содержание алкалоидов гораздо ниже). Алкалоиды хелидонин, хелетрин, ,,-гомохелидонин, сангвинарин, хелидоксантин, оксихелидонин, хелирубин считаются идентичными берберлину, все связаны с хелидоновой кислотой. Суммы алкалоидов в пересчете на хелодинин не менее 0,2% [Губанов И.А. и др., 2000]. Применение чистотела большого в традиционной медицине
Готовые формы чистотела большого обладают противовоспалительным, противогистаминным, противосудорожным, противомикробным, желчегонным, мочегонным, анальгезирующим, ранозаживляющим и прижигающим свойствами. Хелидонин, гомохелидонин обладают болеутоляющим, успокаивающим действием, не имеют наркотического эффекта морфина. Сангвинарин возбуждает перистальтику кишечника и активирует секрецию слюны. Млечный сок чистотела действует как болеутоляющее средство при заболеваниях печени и желчного пузыря, при катаре желудка, заболеваниях кишечника, поносах, при нарушениях пищеварения, оказывает спазмолитическое действие при всех перечисленных выше заболеваниях. Водный и спиртовый настойки из свежего растения и назначаются при острых и хронических заболеваниях печени и желчного пузыря, кожных болезнях, ревматоидных состояниях и заболеваниях женской половой сферы. Млечный сок чистотела применяется при водянке, золотухе, сифилисе, малярии, болезнях печени, при желтухе. Экстракт чистотела большого обладает антиоксидантным и антипролиферативным действием. Алкалоиды и флавоноиды чистотела большого, благодаря своим антиоксидантным свойствам, могут оказать цитотоксическое действие, вызывая апоптоз [Nadova S. et al., 2008]. Чистотел большой обладает противоопухолевым и антимутагенным действием [Biswas S.J. et al., 2008], уменьшает число поврежденных клеток и подавляет активность аминотрансферазы, вызванной p-DAB [Biswas S.J., Khuda-Bukhsh A.R., 2002].
Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что патогенез значительной части нейропсихических расстройств, занимающих лидирующие позиции в структуре потерь работоспособности в результате нарушений функций центральной нервной системы, в основе своего патогенеза имеют нейродегенеративные процессы, реализующиеся через ряд механизмов, включая оксидативный стресс, митохондриальную дисфункцию, эксайтотоксичность, дисфункцию миелина и апоптоз. Наиболее распространенным фактором повреждения нейрональных структур выступает оксидативный стресс, основу которого составляет свободнорадикальное окисление жирных кислот, гипоксические состояния различной природы.
В лечении нейродегенеративных заболеваний используются значительное число препаратов – ноотропов, холинергических средств, антагонистов и агонистов различных рецепторов, в первую очередь NMDA, а также и других препаратов, влияющих на метаболизм тканей мозга и сигнальную трансдукцию. Несмотря на это, эффективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний на сегодняшний день нет. Существует значительное число точек приложения для воздействия нейропротекторных средств, способных повлиять на функциональное состояние мозга. Кроме вмешательства в функцию сигнальных молекул и модуляцию активности медиаторных систем, важнейшими средствами оптимизации работы мозга и его защиты являются контроль оксидативного стресса, улучшение функций митохондрий, оптимизация процессов микроциркуляции, ограничение эксайтотоксичности и др.
Большое значение имеют защитные механизмы, предохраняющие клетки мозга от воздействия внешних экстремальных факторов и ксенобиотиков. Регуляция защитных систем основана на танскрипционной активации генов, кодирующих ферменты и белковые факторы, участвующие в инактивации ксенобиотиков и электрофильных соединений. Для нормальной деятельности мозга исключительное значение имеет осуществление функций митохондрий большого потребления нейронами энергии, поэтому здесь велика роль окислительного фосфорилирования и защита соответствующих ферментных систем. Нарушение мозговых функций во многом зависит от вовлечения механизмов гибели нейронов.
Большое внимание исследователями в этом плане уделяется апоптозу – регулируемому процессу программируемой гибели, основной функцией которого является уничтожение дефектных клеток. Важную роль в поддержании активности мозга играет трофическая поддержка его функций, регуляция которых осуществляется с участием многочисленных нейротрофинов и их рецепторов. Известно также ключевое значение глюкокортикоидов и минералокортикоидов, а также провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.
Для разработки современных средств нейропротекции важной задачей является полное и достоверное представление механизмов развития основных нозологических форм патологии. Как для изучения патогенеза, так и для разработки нейропротекторов, насущную потребность составляют проективные модели патологии. Ряд заболеваний, связанных с нарушением функции мозга, играют ключевую роль в общей структуре патологии: к таким следует отнести ишемию головного мозга, эпилепсию, депрессивные и посттравматические стрессовые расстройства (ПТСР), болезнь Паркинсона.
Существенное внимание исследователей, занимающихся разработкой средств для лечения нейродегенеративных заболеваний, уделяется в последние годы веществам, выделенным из лекарственных растений. Это вызвано, прежде всего, тем, что растения могут являться, во-первых, источником новых оригинальных соединений. Во-вторых, будучи участниками метаболических и защитных систем живых организмов – растений – со значительной долей вероятности являются более безопасными агентами по сравнению с чистыми ксенобиотиками. Такими веществами, в первую очередь, могут быть биофлавоноиды, сапонины, полисахариды, алкалоиды и др. В этом отношении растения Монголии представляют большой интерес, поскольку могут быть использованы в качестве таких источников, но до настоящего времени они изучены мало.
Интерес в качестве источников таких биологических веществ представляют астрагал монгольский (Astragalus mongholicus Bunge), ирис (касатик) тонколистный (Iris Teniufolium Pall.), аспарагус кохинхинский (Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.), чистотел большой (Chelidonium majus L.).
Исследование нейропротекторного действия экстракта корней астрагала монгольского при митохондриальной дисфункции
Окислительный стресс ведет к митохондриальным дисфункциям. При нарушении функции митохондрий блокируется дыхательный комплекс I электронно-транспортной цепи, снижая синтез АТФ. Способность лекарственных растений уменьшать оксидативные повреждения клетки напрямую связаны с их антиоксидантными свойствами. Мы оценили способность экстракта астрагала монгольского защищать активность митохондриальных энзимов, ослабленных малоновым диальдегидом (МДА) в изолированных митохондриях мозга.
В первой части исследования изучалось влияние экстракта астрагала монгольского на нарушенный уровень активности митохондриального дыхательного комплекса I, II и MDH, вызванное МДА. Митохондрии мозга крыс подвергали интоксикации 0,001 М МДА, что приводило к уменьшению уровня активности комплекса I и II по сравнению с препаратами митохондрий мозга, не обработанными МДА. После добавления экстракта астрагала монгольского в различных концентрациях (18-37 мг/мл) к смеси митохондрий с малоновым диальдегидом ослабленный уровень активности комплекса I повышался. Экстракт астрагала монгольского в концентрации 18 мг/кг максимально увеличивал уровень активности комплекса I, который был поврежден МДА. Хотя экстракт астрагала монгольского в высокой концентрации 72 мг/мл не смог восстановить поврежденную активность комплекса I. Экстракт астрагала монгольского в концентрации 18-37 мг/кг достоверно увеличивал на 16-39% уровень активности комплекса II, который был поврежден МДА. Максимальная активация комплекса II была обнаружена при концентрации 36 мг/мл экстракта астрагала монгольского. Мы также изучили эффекты экстракта астрагала монгольского на ослабленный МДА уровень активации MDH. Уменьшенный МДА уровень активности MDH был статистически значимо восстановлен экстрактом астрагала монгольского в концентрации 18-36 мг/мл (Рисунок 10 А).
В следующей части эксперимента изучено влияние экстракта астрагала монгольского на нарушение уровня мембранного потенциала покоя (МПП) и на формирование активных форм кислорода. Для тестирования влияния экстракта астрагала монгольского на МПП, образцы гомогената окрашивали с флюорохромом JC-I, который вызывает потенциал-зависимое скопление молекул в митохондриях.
Митохондриальное накопление флюорохрома JC-I увеличивало уровень соотношения флуоресценции в диапазоне спектра между красным и зеленым участками. Экстракт астрагала монгольского оказывал защитное действие в соотношении интенсивности флуоресценции в концентрации в 9-36 мг/мл (Рисунок 10 Б).
Изучено влияние экстракта астрагала монгольского на образование активных форм кислорода (ROS) в митохондриях мозга по методу FACS. В митохондриях мозга, подвергнутых воздействию МДА, был достоверно увеличен уровень образования активных форм кислорода (DCF флуоресценции) по сравнению с уровнем контроля. Экстракт астрагала монгольского в концентрации 18 и 37 мг/мл не влиял на повышенный МДА уровень интенсивности DCF флуоресценции (Рисунок 11 В).
Изучение нейропротективного действия суммы алкалоидов чистотела большого на поведенческую активность на модели Drosophila melanogaster
Исследовано влияние на показатели продолжительности жизни и двигательную реакцию на внешний раздражитель (стук по пробирке) лабораторной линии трансгенных по -синуклеину мух в сравнении с дрозофилами дикого типа UAS-wildype (отрицательный контроль) и трансгенных по -синуклеину мух (положительный контроль). По три группы мух-самок и самцов получали алкалоиды чистотела с кормом и дозировка зависела от концентрации алкалоидов в питательном субстрате.
Показатели двигательной активности и выживаемости мух регистрировались и оценивались на протяжении всей жизни с первого дня после вылета и по 96 день, когда умерли последние мухи. Однако графики, построенные на основании всего массива данных, оказались малопригодными для демонстрации различий между группами. Наиболее значимые в статистическом отношении различия отмечались в течение короткого промежутка времени: 1) с 18 по 36 сут для двигательной активности и 2) с 36 по 72 сут для выживаемости насекомых. Наибольшие отличия были отмечены на 24 сут по двигательной активности и на 54 сут по выживаемости.
Как видно на рисунках, двигательная активность самцов дрозофил в указанный период была существенно меньше, чем у трансгенных насекомых. При этом, алкалоиды во всех изучаемых дозах повышали подвижность насекомых во всех исследованных дозах, доводя ее практически до уровня наблюдаемого у животных интактного контроля – мух дикого типа (Рисунок 56). Тот факт, что в начальный и конечный периоды наблюдения не отмечалось повышенной активности мух под влиянием алкалоидов чистотела, говорит, скорее всего, о том, что алкалоиды не обладают способностью усиливать двигательную активность насекомых, а вмешиваются в патогенез болезни Паркинсона.
У трансгенных мух-самок в указанный период наблюдения также отмечалось снижение двигательной активности. Однако в популяции трансгенных самок не наблюдалось восстановления улучшения двигательной активности в ответ на внешний раздражитель.
Оценка продолжительности жизни насекомых показывает, что у трансгенных мух-самцов с болезнью Паркинсона продолжительность жизни меньше, чем у контрольных мух дикого типа без болезни Паркинсона (Рисунок 57).
Продолжительность жизни самцов-дрозофил, потреблявших алкалоиды чистотела, в зависимости от дозы оказалась еще ниже, чем у трансгенных мух-самцов дрозофил с болезнью Паркинсона (дозы 10 и 20 мг/100 г). А алкалоиды в дозе 40 мг/100 г не влияли на выживаемость мух с болезнью Паркинсона. У самок трансгенных мух дрозофил во всех трех дозах алкалоиды не повлияли на продолжительность жизни: значения показателя во всех трех дозах не отличались статистически значимо ни от показателя интактного контроля (дикий тип), ни от такового у трансгенных мух.
Подводя итог сказанному, можно заключить, что сумма алкалоидов чистотела большого улучшает двигательные реакции мух дрозофил с экспериментальной болезнью Паркинсона, однако при этом их действие отрицательно сказывается на продолжительности жизни. Данный факт, вероятно, связан с тем, что реакции на внешние раздражители тесно связаны с функционированием дофаминергической системы. Нарушение функции этой системы является ключевым звеном болезни Паркинсона. Видимо алкалоиды чистотела оказывают стимулирующее действие на функции дофаминергической системы, что увеличивает нагрузку на нее и способствует прогрессированию заболевания.
Несмотря на свою популярность и явное наличие нейротропных эффектов, влияние веществ чистотела большого на нервную систему изучено мало. В проведенном исследовании объектом изучения были алкалоиды растения. В экспериментах in vitro, методом электронного спинового резонанса было показано наличие ингибирующего действия алкалоидов чистотела большого против гидроксильных и липидных радикалов, которые проявляют выраженную активность против липидных радикалов и слабо влияют на гидроксильные.
Показано, что нейропротекторный эффект алкалоидов чистотела связан с его способностью уменьшать окислительные повреждения тканей, защищая митохондриальные дыхательные комплексы I, II и MDH, повреждения которых вызываются малоновым диальдегидом. Особенно эффективной оказывается защита комплекса I.
При этом алкалоиды чистотела проявляют тенденцию усугублять токсическое действие МДА на митохондриальную дисфункцию, снижая мембранный потенциал митохондрий, не влияют на образование активных форм кислорода в митохондриях и усиливают подавление сукцинатдегидрогеназы.
Сумма алкалоидов в концентрации 0,005 мг/мл не оказывает влияние на гибель нейронов коры и стриатума, вызанную H2O2. Однако в более высоких дозах (0,05 и 0,5 мг/мл) алкалоиды оказывают защитное действие на корковые нейроны и нейроны стриатума.
Действие перекиси водорода на нейроны сопровождается снижением активности синаптофизина – специфического белка, участвующего в синаптической передаче. Алкалоиды чистотела, будучи введенными в культуру в концентрации 0,05 мг/мл, обеспечивают защиту синаптофизина от токсического действия H2O2.
При изучении действия суммы алкалоидов чистотела большого на ARE (антиоксидант-респонсивный элемент) зависимую экспрессию люциферазы в нейронах, изучена активность Keap1/Nrf/ARE-сигнальной системы, являющейся регулятором внутреннего гомеостаза при апоптоз индуцирующих и стрессовых воздействиях. Влияние алкалоидов чистотела сравнивалось с мощным антиоксидантом tBHQ. Показано, что действие алкалоидов имеет прямое отношение к антиоксидантному эффекту сигнальной системы Nrf2/Keap1/ARE.
В экспериментах на трансгенных мухах дрозофилах с болезнью Паркинсона алкалоиды чистотела проявляют свою активность только на самцах. При этом, они, улучшая реакцию избегания в первой половине заболевания, снижают продолжительность жизни во второй его половине.