Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Сверхвысокие разведения и феномен релиз-активности 11
1.2 Молекулярные механизмы антиген-антительных взаимодействий 14
1.3 Рынок противогриппозных препаратов 19
1.4. Биомаркеры как индикаторы физиологических и патологических процессов 23
1.4.1 Классификации биомаркеров 23
1.4.2 Поиск биомаркеров 27
1.5 Роль естественных аутоантител 30
1.5.1 Функции естественных аутоантител 31
1.5.2 Естественные аутоантитела к цитокинам 35
1.6. Заключение 39
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1 Объекты исследования 41
2.2 Препараты и реактивы 43
2.3 Методы исследования 44
2.3.1 Методика ИФА для оценки модифицирующего эффекта препарата релиз-активных антител к интерферону гамма 44
2.3.2 Методика поверхностного плазмонного резонанса 49
2.3.3 Оценка противовирусной активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма в зависимости от дозы 51
2.3.4 Влияние релиз-активной формы антител к интерферону гамма на этапы жизненного цикла вируса гриппа в клетке и зависимость противовирусного эффекта препарата от дозы in vitro 56
2.3.5 Изучение фармакокинетики препарата релиз-активных антител к интерферону гамма на здоровых добровольцах 58
2.3.6 Оптимизация методики ИФА для определения еАт к ИФН и изучение динамики уровня еАт к ИФН у пациентов с ветряной оспой 60
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 64
3.1. Изучение модифицирующей активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма с помощью иммунологических подходов in vitro 64
3.1.1. Оценка модифицирующей активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма методом иммуноферментного анализа 64
3.1.2. Оценка модифицирующей активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма методом поверхностного плазмонного резонанса 73
3.2 Изучение дозозависимого действия препарата РАФ Ат к ИФН на модели экспериментальной гриппозной инфекции 77
3.3. Изучение эффекта препарата РАФ Ат к ИФН на жизненный цикл вируса на клеточной модели 89
3.4. Изучение фармакокинетики препарата РАФ Ат к ИФН на здоровых добровольцах 91
3.5. Оптимизация ИФА для количественного определения естественных аутоантител к ИФН человека 92
3.6. Определение уровня еАт к ИФН в сыворотке крови пациентов с ветряной оспой в качестве биомаркера клинической эффективности применения РАФ Ат к ИФН 97
Заключение 100
Выводы 103
Список сокращений 104
Список литературы 107
Приложения 134
Приложение А 134
Приложение Б 137
Приложение В 141
Приложение Г 144
Приложение Д 146
- Молекулярные механизмы антиген-антительных взаимодействий
- Естественные аутоантитела к цитокинам
- Оценка модифицирующей активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма методом иммуноферментного анализа
- Оптимизация ИФА для количественного определения естественных аутоантител к ИФН человека
Молекулярные механизмы антиген-антительных взаимодействий
Для того, чтобы детально описать процесс взаимодействия антигена и антитела на молекулярном уровне, необходимо обозначить наиболее важные моменты строения антител и антигенов. В последовательности как легких, так и тяжелых цепей, из которых состоит любое антитело, присутствуют как константные (С), так и вариабельные (V) участки (Sela-Culang I. et al., 2013). Наличие последних обеспечивает многообразие антител в живом организме. Однако вариабельность последовательности не распределяется равномерно по всей V-области, а сконцентрирована в определенных сегментах. Было показано, что три наиболее переменных сегмента могут быть идентифицированы в вариабельных доменах как тяжелой, так и легкой цепи. Они определяют гипервариабельные области и обозначаются HV1, HV2 и HV3. В тяжелых цепях данные участки простираются примерно с 30 до 36, от 49 до 65 и от 95 до 103 аминокислотных остатков соответственно, тогда как в легких цепях они расположены примерно на участках 28-35, 49-59 и 92-103 соответственно (Janeway C.A. Jr. et al., 2001). Все 6 гипервариабельных петель – регионы, определяющие комплементарность антитела (CDR). Области между гипервариабельными областями, которые составляют остальную часть V-домена, демонстрируют меньшую изменчивость и называются каркасными областями. В каждом домене V имеется четыре таких региона, обозначенных как FR1, FR2, FR3 и FR4 (Sela-Culang I. et al., 2013). Кроме локализации в определённых сегментах V домена, вариабельность локализована в отдельных регионах на поверхности молекулы: тогда как рамочные регионы -листов обеспечивают структурную основу домена, гипервариабельные последовательности представляют собой 3 петли на внешнем ребре -бочки (Janeway C.A. Jr. et al., 2001; Sela-Culang I. et al., 2013).
Биологическая функция антител заключается в связывании с патогенами и их продуктами и для облегчения их удаления из организма. Структура, распознаваемая антителом, называется антигенной детерминантой или эпитопом. Некоторые из наиболее важных патогенов имеют полисахаридные оболочки, однако во многих случаях антигены, которые провоцируют иммунный ответ, представляют собой белки. При этом структуры, распознаваемые антителом, расположены на поверхности белка и состоят из аминокислот из разных частей полипептидной цепи, которые были собраны вместе при сворачивании белка (Галактионов В.Г., 1998). Антигенные детерминанты такого типа известны как конформационные ортогональные эпитопы, потому что распознанная структура состоит из сегментов белка, которые прерываются в аминокислотной последовательности антигена, но объединены в трехмерную структуру. Напротив, эпитоп, состоящий из одного сегмента полипептидной цепи, называется сплошным или линейным эпитопом (Forsstrm B. et al., 2015). Хотя большинство антител, выращенных против нативных белков, распознают конформационные эпитопы, некоторые из них могут связываться с пептидными фрагментами белка. И наоборот, антитела, выращенные против пептидов белка или синтетических пептидов, соответствующих части его последовательности, могут связываться с нативным белком (Janeway C.A. Jr. et al., 2001).
Взаимодействие между антителом и его антигеном может быть разрушено высокими концентрациями солей, экстремальными значениями рН, детергентами и т.д., поэтому такое связывание является обратимым нековалентным взаимодействием (Reverberi R., Reverberi L., 2007). Несколько типов связей участвуют в формировании подобного взаимодействия (Janeway C.A. Jr. et al., 2001). Силы Ван-дер-Ваальса являются самыми слабыми, но они способны привлекать все виды молекул. Ионные связи требуют противоположно заряженных атомов. Водородные связи основаны на совместном «использовании» водорода электроотрицательными атомами. Такие связи очень важны в водных растворах, потому что вода легко образует сильные водородные связи. «Гидрофобные» же связи по факту являются просто результатом исключения из молекул воды других молекул, которые не могут участвовать в хороших водородных связях. Эти молекулы называются «неполярными», поскольку их атомы не образуют электрические диполи (Reverberi R., Reverberi L., 2007). Для стабильного связывания одновременно должно присутствовать несколько слабых связей, и для этого требуется стерическая комплементар-ность между молекулами (Watson J.D. et al., 2004).
В специфическое связывание эпитопа и паратопа вовлечены немного молекул, чаще – несколько аминокислот поверхности. При этом площадь соприкосновения составляет всего 0,4-8 нм2 (Van Oss C.J., 1995). При этом сначала эпитоп и паратоп подходят на расстояние нескольких нанометров, притягиваясь длиннодей-ствующими силами (ионные и водородные). После того как силы притяжения преодолевают энергию гидратации, выталкивая воду, молекулы приближаются еще сильнее. На таком близком расстоянии главными становятся Ван-дер-Ваальсовы силы (с небольшой помощью ионных). Чем лучше поверхности подходят по форме друг другу и чем больше площадь контакта, тем сильнее связывание (Reverberi R., Reverberi L., 2007).
Реакция антиген-антительного взаимодействия широко используется в лабораторной практике. Это обратимая реакция, которую можно описать уравнением (1): антиген + антитело антиген-антительный комплекс (1) В соответствии с законом действующих масс можно вычислить константу равновесия такой реакции (2): [комплекс]/([антиген]x[антитело]) = ka/kd = Keq (2), где kа - константа скорости ассоциации, kd - константа скорости диссоциации, Keq - константа равновесия. Из уравнения (2) очевидно, что для того, чтобы улучшить детектирование антител, соотношение между связанным и свободным Аг следует увеличить либо увеличивая константу равновесия, либо повышая концентрацию антител (Reverberi R., Re-verberi L., 2007). Так же очевидно, что чем связывание сильнее, тем константа равновесия выше. При этом на нее оказывают влияние такие факторы, как температура, рН, ионная сила и наличие ферментов. Концентрация же антигена и антитела, длительность инкубации и отмывка влияния на константу равновесия не оказывают (Hughes-Jones N.C., 1975; Moore B.P.L., 1982).
Взаимодействие интерферона гамма и антител к нему
Изучение конформационных взаимодействий между антителами и антигенами не теряет своей актуальности по мере роста количества мишеней антительных препаратов, при этом, учитывая практически бесконечное разнообразие клонов мо-ноклональных антител, даже для многих давно известных мишеней данные по участкам связывания с конкретными антителами отсутствуют. Одной из таких популярных и важных антительных мишеней является цитокин интерферон гамма. Он продуцируется в основном Т-клетками и естественными киллерами под действием воспалительных и иммунных стимулов (Zuber B. et al., 2016). Молекула имеет ряд важных биологических функций, таких как иммунорегуляция, ингиби-рование клеточного роста и противовирусная активность, а нарушение концентрации ИФН в организме ассоциируют с аутоиммунными и аутовоспалительными заболеваниями (Trinchieri G., Perussia B., 1985; Andersson A. et al., 1998). Поэтому, нейтрализующие и модифицирующие активности антител к ИФН являются перспективными терапевтическими агентами (Reinisch W. et al., 2010; Hatterer E. et al., 2012), а знание биологических функций различных участков белка может пригодиться при производстве моноклональных антител с теми или иными свойствами.
Молекула мономера ИФН состоит из 143 аминокислот (плюс сигнальный пептид из дополнительных 23 аминокислот) с двумя сайтами гликозилирования (база данных Uniprot, http://www.uniprot.org/uniprot/P01579), но в физиологических условиях мономер самоорганизуется в гомодимер. Методом рентгеновской кристаллографии было показано, что каждый из мономеров состоит из 6 альфа-спиралей (A-F), соединенные короткими петлями (Ealick S.E. et al., 1991; Walter M.R. et al., 1995). Димер формируется, когда С-концевые спирали (E и F) одной цепи связываются с N-концевыми спиралями A, B, C, D другой цепи. Спиральные регионы A и B и их соединительная петля, а также петля F, взаимодействуют с рецептором ИФНg (Lundell D.L., Narula S.K., 1994; Thiel D.J. et al., 2000). Консервативные часть С-конца (CT) также была замечена в рецепторном взаимодействии, но из-за ее гибкой природы методами кристаллографии это подтвердить не удалось (Lundell D.L., Narula S.K., 1994).
Несмотря на то, что цитокин интерферон гамма достаточно изучен, информация об эпитопах, с которыми связываются конкретные моноклональные антитела, лимитирована, хотя общие тенденции выделить можно. Так, B. Zuber с коллегами (Zuber B. et al., 2016), протестировав 12 различных моноклональных антител и используя различные химерные варианты интерферона гамма, показали, что большинство антител связываются с участками двух кластеров эпитопов: либо на спирали А, либо на спирали Е. Участок Е включает в себя выделенные ранее функциональные эпитопы Е1 (соответствует области 84-94 амк (Zu X.W., Jay F.T., 1991), Е2, Е3 (Kwok A.Y. et al., 1993). Антитела, связывающиеся с Е регионом, обладают гораздо большей нейтрализующей активностью (т.е. подавляют противовирусную активность цитокина) по сравнению с антителами А кластера. Ранее при изучении M.J. Alfa и F.T. Jay (1988) 21 нейтрализующих мАт к ИФН антитела также сгруппировались в два кластера, один из которых впоследствии был соотнесен с Е регионом силами X.W.Zu и F.T. Jay (1991).
Естественные аутоантитела к цитокинам
Среди всего многообразия естественных аутоантител в организме многие исследователи уделяют особое внимание еАт к цитокинам, которые представляют собой группу внутриклеточных сигнальных пептидов, регулирующих рост и развитие различных клеток, а также воспалительные процессы, обеспечивая коммуникацию между клетками, иммунной системой и остальными органами (Graudal N.A., 2002; Avrameas S., 2013). Большинство цитокинов (некоторые интерлейкины, факторы некроза опухоли, интерфероны) являются важными медиаторами воспаления, поэтому еАт к ним признаны важными биологически-активными веществами, регулирующими иммунный ответ in vivo (Vani J. et al., 2008; Schwartz-Albiez R., 2009). Непрерывные иммунные процессы, происходящие в организме даже здоровых индивидуумов, сопровождаются возникновением в сыворотке таких еАт. Однако гораздо более высокие значения еАт к цитокинам обнаруживают в крови больных различными инфекционными и аутоиммунными заболеваниями, а также с опухолями (Hansen M.V., 1991; Takemura H., 1992; Tiberio L., 1993; Bendtzen K., 1994; Ross C. 1994; Menetrier-Caux C., 1996; Meager A., 2003; Quintana F.G., 2004; Matejuk A., 2009; Kaveri S.V., 2012).
Ряд исследователей предполагает, что во время заболевания возникает тесная взаимосвязь между выработкой специфического цитокина и образованием к нему еАт (Sauerborn M., 2011). Так, еАт к цитокину интерферону гамма, играющему важную роль при контроле вирусной репликации, были обнаружены в сыворотке крови пациентов с различными вирусными заболеваниями, с туберкулезом, а также здоровых добровольцев (Dffinger R., 2004; Hoflich C., 2004; Kampmann B., 2005; Patel S.Y., 2005; Tanaka Y., 2007; Baerlecken N., 2009; Koya T., 2009). Ряд исследователей показали наличие еАт к ИФН при внутриклеточной инфекции, здоровых в остальном, индивидуумов (Chi C.Y., 2013; Czaja C.A., 2014; Nishimura T., 2015). Предполагают, что такие антитела не оказывают ингибирующее действие на противовирусный и антипролиферативный эффект ИФН, не мешая его связыванию со специфическими клеточными рецепторами, но могут вместо этого ингиби-ровать экспрессию HLA-DR антигенов, индуцируемых ИФН на некоторых клетках (Caruso A., 1997). Эксперименты на животных моделях позволяют предположить, что еАт к ИФН могут играть определенную роль в процессе иммунорегуля-ции, ограничивая интенсивность и длительность иммунного ответа.
Количество аутоантител к ИФН в крови больных с различными вирусными заболеваниями растет во время острой фазы заболевания и снижается по мере выздоровления (Bendtzen K., 1994), однако конкретные показатели зависят от множества факторов, таких как тип инфекции, возраст, иммунный статус и т.д. Показано, что цитокины интерфероны альфа и гамма обнаруживаются в ходе острой фазы ветряной оспы в сыворотке крови в значительных количествах, а ИФН выделяется Т-клетками, выделенными у индивидуумов в ходе первичной in vivo сенситизации и стимулировании антигенами вируса ветряной оспы in vitro (Arvin A.M., 1986; Bergen R.E., 1990).
Методы определения естественных аутоантител к цитокинам С самого момента их открытия сложность обнаружения ЕатЦ является главным препятствием на пути их изучения. Как правило, выбор метода количественного анализа ЕатЦ в сыворотке отвечает за трактовку результатов. По этой причине сопоставление результатов разных лабораторий делается практически невозможным. Ряд исследователей, изучавших ЕатЦ в сыворотке здоровых добровольцев, получили результаты, свидетельствующие об очень низком содержании или даже об отсутствии Еат к цитокинам в таких сыворотках. Однако не следует упускать из виду то, что эти антитела могли находиться в крови в связанной с антиидиотипи-ческими антителами форме, или в комплексе с соответствующими им цитокинами. Образование таких комплексов может приводить к ложноположительным результатам, что делает сложным их выявление с помощью обычного иммуносорбент-ного анализа. Кроме того, потенциальные нейтрализующие аутоантитела, связанные с образованными эндогенно цитокинами, также трудно обнаружить в биологических пробах. На сегодняшний день все используемые методы определения относятся либо к иммунохимическим (иммунопреципитация, аффинная хроматография, ИФА, ра-диоиммуноанализ (РИА), различные методики иммуноблоттинга, связывание ци-токина с рецептором), либо к биологическим (оценка нейтрализующей активности антител при заражении вирусами, другие биоанализы для цитокинов) (Hansen M.B. et al., 1996; Bendtzen K., et al., 2000). При этом абсолютное большинство исследований сообщают об использовании для определения ЕатЦ в качестве основного метода либо радиоиммунный анализ, либо ИФА. Перед тестированием антитела из сыворотки, как правило, подвергают аффинной очистке, некоторые исследователи дополнительно оценивают их нейтрализующую активность или проводят другие подходящие тесты. Часто это связано с относительностью иммунологических методов в связи с отсутствием положительного контроля – сыворотки, содержащей известное количество естественных антител. Например, L. Madariaga после проведения стандартного твердофазного ИФА для подтверждения специфичности проводил также Вестерн-блот (Madariaga L. et al., 1998).
РИА был одним из первых методов, позволивших определить ЕатЦ в человеческой сыворотке. С помощью РИА A. Caruso удалось выявить высокий титр антител к ИФНg в сыворотке ВИЧ-инфицированных пациентов, никогда не лечившихся экзогенным ИФНg, и в сыворотке здоровых лиц (Caruso A. et al., 1989; Caruso A. et al., 1990; Caruso A. et al., 1997). На покрытые ИФНg планшеты вносили тестируемую сыворотку и козьи антитела к иммуноглобулинам человека, меченные 125I, после чего измеряли остаточную радиоактивность в лунках. Для подтверждения специфичности к сывороточному и рекомбинантному ИФНg A. Caruso использовал метод иммуноблоттинга, а также исследовал нейтрализующую активность этих антител. По данным автора Еат к ИФНg присутствуют в сыворотке 100 % здоровых добровольцев, хотя и в небольших количествах.
Метод РИА в своих исследованиях также использовали M. Svenson, M.B. Hansen, H. Suzuki и другие (Svenson M. et al., 1989; Hansen M.B. et al., 1991; Suzuki H. et al., 1991; Hansen M.B. et al., 1994). Многие исследователи изучали антитела методом твердофазного (ТВ) ИФА. Интересно, что некоторые производители наборов для проведения ТВИФА позиционируют свою продукцию, как наборы, позволяющие определить, в частности ЕатЦ в тестируемых образцах (Bender MedSystems GmbH, Human anti-IFN-a ELISA BMS217 and BMS217TEN; Iblinter-national GMBH, Enzyme immunoassay for the quantitative determination of human anti-Interferon-g (anti-IFN-g) in cell culture supernatant, serum, plasma and urine (cat. N BE51051)). Однако большинство исследователей предпочитают использовать самостоятельно разработанные наборы для ИФА. Например, C.J. Capini сажал на планшет рекомбинантный аффинно-очищенный человеческий фактор некроза опухоли альфа (ФНО-), и, согласно его данным, аутоантитела к этому цитокину в детектируемых количествах присутствовали во всех пробах от здоровых добровольцев (Capini C.J. et al., 2001), в то время как у R. Doffinger, покрывавшего планшеты ИФНg, интерлейкином 12 (ИЛ-12) или ФНО-, ЕатЦ в аналогичных сыворотках либо полностью отсутствовали, либо показывали незначительный титр (Doffinger R. et al., 2001). С помощью ИФА ЕатЦ также определяли A. Meager, R.A. Elkarim, T.L. Bonfield, A. Balsari и другие (Balsari A., Caruso A., 1997; Meager A., 1997; Elkarim R.A. et al., 1998; Bonfield T.L. et al., 2002; Meager A. et al., 2003).
Тем не менее, ни один из этих методов определения ЕатЦ нельзя назвать универсальным, каждый имеет свои особенности и недостатки. Например, многие иммунологические методы определения ЕатЦ основаны или на фиксировании связывания антигена, или на связывании сывороточных аутоантител цитокинами, иммобилизованными в ячейках планшетов для микротитрования, с последующей инкубацией с вторичными антителами, маркированными ферментами против константных областей аутоантител. Этими методами можно обнаружить только «свободные» аутоантитела, которые могут быть меньшей частью общего количества ауто-антител.
Кроме того, помешать правильной оценке результатов могут такие факторы, как растворимость рецепторов, природный уровень цитокинов и другие факторы, которые могут оказывать влияние на результаты (Bendtzen K., et al., 2000). In vitro антитела могут связываться с денатурированными цитокинами совсем не таким путем, как если бы они взаимодействовали непосредственно в организме (in vivo). Так как антитела связываются как с целыми белками определенной конформации, так и с эпитопами белка с ограниченными последовательностями, методами иммуно-анализов и иммуноблоттинга, использующими более или менее денатурированные цитокины, не всегда возможно обнаружить антитела именно к природной конфор-мации антигена/цитокина. Более того, чувствительные техники иммуноблотинга могут детектировать неспецифичное связывание антител при относительно низкой аффинности. Причиной ложноположительных результатов также может стать использование гликозилированных цитокинов, полученных из эукариотических клеток, из-за присутствия в сыворотке людей и высших приматов антител к полисахаридам (Bendtzen K., 1998). Проблемой иммунологических анализов порой служит отсутствие положительного контроля (сыворотки, содержащей известное количество естественных антител), поэтому часто данный метод позволяет оценить количество еАт к цитокинам в сыворотке больных пациентов по отношению к сыворотке здоровых пациентов или по отношению к серонегативным контролям в принципе (Capini C.J. et al., 2001).
Выбор наиболее подходящего метода определения ЕатЦ позволит сделать шаг вперед на пути изучения потенциальных ролей системы ЕатЦ, поскольку уже сейчас ясно, что ЕатЦ могут быть использованы в качестве маркеров различных заболеваний. В этом контексте велик потенциал ЕатЦ при использовании в качестве мишени различных лекарственных препаратов.
Оценка модифицирующей активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма методом иммуноферментного анализа
Ранее было показано, что препараты на основе РАФ Ат к ИФНу могут оказывать влияние на связывание Аг-Ат (Эпштейн О.И., 2013). Поэтому для оценки модифицирующей активности таких препаратов было решено использовать методику, основанную на данном принципе. Наиболее приемлемой с точки зрения простоты, результативности, стоимости оказалась методика иммуноферментного анализа. На первом этапе были опробованы непрямая и конкурентная схема анализа с использованием общих подходов к разработке метода (посадка Аг на лунки планшета, добавление первичных мАт к ИФНу, добавление вторичных Ат, меченных ферментной меткой и оценка сигнала) (рисунок 1). Обе схемы анализа подтвердили применимость метода и позволили сделать дальнейшие предположения о механизме активности препарата релиз-активных антител к интерферону гамма. Непрямая схема анализа с использованием преинкубации мАт с РАФ Ат к ИФНу (что, тем не менее, представляет собой в определенной степени конкуренцию) была ис пользована в дальнейшем при оптимизации и валидации методики.
Поскольку разработка методики представляет собой огромный массив экспериментов, было решено не включать ее в содержание данной работы. Однако, представляется целесообразным описать несколько экспериментов, помогающих прояснить суть тестирования модифицирующей активности РАФ Ат к ИФН.
Для успешного изучения активности РАФ Ат к ИФН in vitro необходимо было подтвердить специфичность методики. Поэтому было принято решение об использовании ряда контрольных образцов (плацебо), приготовленных по точно такой же технологии, что и релиз-активные препараты, с той лишь разницей, что вместо исходной субстанции используется вода или фосфатно-солевой буфер, Специфичность метода была протестирована с использованием специфического (РАФ фосфатно-солевого буфера) и неспецифического (РАФ Ат к мозгоспецифическому белку S-100) контролей. Полученные статистически значимые отличия от данных контролей позволили утверждать, что разработанная методика способна специфически определять именно активность РАФ Ат к ИФН. В качестве основной характеристики активности препарата было выбрано отличие потенциала связывания препарата от потенциала связывания соответствующего контроля, выраженное в условных единицах (УЕ).
Кроме того, была обнаружена необходимость использования предварительной инкубации образцов с участниками Аг-Ат взаимодействия – специфическими Ат к ИФН. Такая инкубация в течение определенного времени под воздействием температуры и перемешивания позволяет препарату релиз-активных антител к интерферону гамма проявлять свой эффект максимальным образом. При выборе схемы преинкубации различные параметры были оценены и подобранны: скорость перемешивания, температура, время, соотношение образец: преинкубированный агент.
Эксперимент, результаты которого представлены на рисунке 2, был выполнен двумя способами. В первом случае образцы в РА форме вначале смешивали с растворами интерферона гамма разной концентрации, а затем через 40 мин инкубации добавляли моноклональные антитела. Во втором случае наоборот, образцы в РА форме вначале смешивали с моноклональными антителами, а затем через 40 мин к смеси добавляли растворы интерферона гамма различных концентраций. Как видно из рисунка 2А, очерёдность смешивания исследуемых образцов РА формы с интерфероном гамма или с моноклональными антителами не повлияла на полученный результат. В обоих случаях в присутствии РАФ Ат концентрация свободных мАт к интерферону гамма в их смесях с антигеном, т.е. концентрация антител, не заблокированных интерфероном гамма, была несколько ниже, чем в контрольных образцах (F23/56=28,l; р 0,0001 для каждого из сравнений), тогда как между собой указанные образцы практически не отличались (р=0,2).
Вычисленные описанным выше способом константы аффинности мАт к интерферону гамма были равны 3,86 108 М-1 для контроля и 5,56 108 М-1 или 5,92 108 М"1 для упомянутых выше образцов мАт в присутствии РАФ Ат к ИФНу. Следовательно, если предположить, что РАФ Ат к ИФНу влияют только на свойства мАт и совершенно не влияют на свойства интерферона гамма, тогда на основании полученных результатов следовало было бы сделать вывод, что в их присутствии несколько увеличивается (примерно в полтора раза) аффинность мАт к ИФНу. С другой стороны, более существенным может оказаться влияние РАФ Ат к ИФН не на аффинность мышиных мАт, а на конформацию молекул интерферона гамма. Если предположить, что благодаря молекулярной динамике молекулы интерферона гамма в растворе находятся в разных конформационных состояниях, причём только в некоторых из этих состояний антигенные детерминанты интерферона гамма являются комплементарными молекулам мАт, тогда любое влияние, индуцирующее сдвиг в направлении увеличения или уменьшения части молекул интерферона гамма, обладающих комплементарностью, приведёт, соответственно, к усилению или ослаблению их взаимодействия с антителами. Логично предположить, что комплементарные к ИФН молекулы, которыми являются кроличьи антитела к интерферону гамма, способны индуцировать сдвиг в сторону увеличения части молекул, способных связываться с мАт. Поэтому, более вероятным, по-видимому, является то, что влияние специфичных к человеческому интерферону РА форм кроличьих антител более выражено в направлении изменения конформации молекул интерферона гамма, а не изменения конформации мАт, и именно это влияние может являться главной причиной изменения параметров взаимодействия между мАт и интерфероном гамма.
Если представленные выше рассуждения верны, тогда наблюдаемый в эксперименте сдвиг влево полученных кривых связывания мАт с антигеном (рисунок 2А) может быть также связан с кажущимся увеличением концентрации интерферона гамма в образцах, где он находится в смеси с РАФ Ат к ИФН. Это происходит, по-видимому, в связи с тем, что концентрация молекул интерферона гамма, имеющих конформацию, благодаря которым они обладают комплиментарностью к мАт, увеличивается благодаря релиз-активности РА форм кроличьих антител.
Отметим также, что если подобное кажущееся увеличение концентрации интерферона гамма (а на самом деле увеличение части молекул, имеющих конформа-цию, обеспечивающую комплиментарность с мАт) является близким к постоянному для данного образца РАФ Ат к ИФН и мало зависит от концентрации интерферона гамма в образцах, тогда очевидно, что при малых концентрациях интерферона гамма это увеличение будет намного более заметным, чем при высоких концентрациях. В связи с этим именно при малых концентрациях антигена должны наблюдаться более заметные различия между контрольными образцами и образцами с РА формой кроличьих антител, тогда как при высоких концентрациях интерферона гамма эти различия будут практически незаметными. Действительно, именно такую зависимость наблюдали в подобных экспериментах.
Так как было показано, что методика ИФА может эффективно использоваться для оценки активности РАФ Ат к ИФН как при преинкубации с ИФН, так и при преинкубации с мАт, и было принято решение использовать для преинкуба-ции пару мАт к ИФН:РАФ Ат к ИФН. При работе по стандартной непрямой схеме непрямого анализа результаты исследований влияния РАФ Ат к ИФН на взаимодействие мАт с ИФН в значительной степени зависели от того, какую концентрацию ИФН использовали при сорбции в лунках планшета. Было обнаружено, что в зависимости от условий эксперимента, РАФ Ат в большей или меньшей степени ингибировала связывание мАт с сорбированным на планшетах ИФН, причем степень ингибирования процесса связывания мАт с указанным Аг была тем выше, чем меньшая концентрация ИФН была сорбирована (рисунок 3), что также является подтверждением дозозависимого эффекта РАФ Ат к ИФН.
Полученные результаты приводят к мысли о том, что для успешного выявления РА методом ИФА важно, чтобы количество сорбированного Аг было достаточно низким. Вероятно, это связано с дискретностью активности РАФ Ат к ИФН, которые в одной и той же дозе могут изменить одинаковое количество молекул ИФН. При этом, при низкой концентрации ИФН, общий процент подвергнувшихся влиянию РАФ Ат белков будет выше, соответственно, выявить активность РАФ Ат к ИФН, будет проще. Если же количество Аг, связанного с планшетом, возрастает, то эффект РАФ Ат становится менее выраженным вплоть до его полного исчезновения (рисунок 3). Вместе с тем нельзя исключить того, что эффект РАФ Ат на реакцию мАт с сорбированным ИФН связан не только с конкуренцией РАФ Ат с мАт за связывание последних с Аг, но и с непосредственным воздействием РАФ Ат как на свойства ИФН, так и на свойства моноклональных антител, что также могло бы повлиять на способность мАт связываться с Аг. Ранее полученные данные подтверждают существование такой возможности (Эпштейн О.И., 2013).
Оптимизация ИФА для количественного определения естественных аутоантител к ИФН человека
Поскольку разрешающая способность разработанной методики ИФА оказалась не достаточна для прямого определения активности препарата РАФ Ат к ИФНу in vivo в сыворотке крови пациентов, принимавших препарат, было принято решение в рамках системы живого организма изучить влияние препарата РАФ Ат к ИФН на взаимодействие молекулы ИФН с анти-ИФН антителами, присутствующими у любого человека – естественными аутоантителами к ИФН. Опираясь на данные доклинических исследований in vivo и клинических исследований, подтверждающих эффективность препарата на основе РАФ Ат к ИФН, а также на полученные ранее данные о соответствии позитивных терапевтических эффектов РАФ Ат и нормализации уровня еАт к различным молекулам организма, была рассмотрена возможность использования естественных аутоантител к ИФН в качестве биомаркера эффективности препарата РАФ Ат к ИФН. ЕАт к различным молекулам на протяжении последнего десятилетия выделяют в качестве одного из новых, но уже очень перспективных классов соединений, которые могут служить биомаркерами (Carasevici E., 2013; Dumstrei K. et al., 2016). Среди всего многообразия таких аутоантител в организме можно выделить еАт к цитокинам (еАтЦ), которые составляют обширную группу внутриклеточных сигнальных пептидов, регулирующих рост и развитие различных клеток, а также воспалительные процессы, обеспечивая коммуникацию между клетками, иммунной системой и остальными органами (Graudal N. et al., 2002). На сегодняшний день еАт к ИФН и другим цитоки-нам признаны важными биологически активными веществами, регулирующими иммунный ответ in vivo (Matejuk A. et al., 2009; Kaveri S.V., 2012). Уже никого не удивляет, наличие таких еАт в сыворотке крови здоровых лиц, однако гораздо более высокие концентрации еАтЦ обнаруживают в крови больных различными инфекционными и аутоиммунными заболеваниями. Ряд исследователей предполагает, что во время заболевания возникает тесная взаимосвязь между выработкой специфического цитокина и образованием к нему еАт (Sauerborn M. et al., 2011). Количество еАт к ИФН в крови больных с различными инфекционными заболеваниями растет во время острой фазы заболевания и снижается по мере выздоровления (Bendtzen K. et al., 1994), поэтому было принято решение изучить динамику еАт к ИФН в образцах сыворотки крови пациентов с ветряной оспой, получавших либо препарат РАФ Ат к ИФН, либо плацебо и образцах здоровых добровольцев той же возрастной группы.
Одним из самых острых вопросов при оценке уровня еАт и биомаркеров в принципе является вопрос стандартизации используемой методики оценки измеряемого параметра. Так, с самого момента их открытия сложность обнаружения еАтЦ является главным препятствием на пути их изучения. Как правило, выбор метода количественного анализа таких еАт в сыворотке отвечает за трактовку результатов. На сегодняшний день ни один из этих методов определения еАт нельзя назвать универсальным, каждый имеет свои преимущества и недостатки, и поиск нового подхода, который позволит преодолеть имеющиеся сложности, остается важной и приоритетной задачей современной науки. Модифицированная коммерческая методика ИФА СТ801 («U-Cytech bioscience», Нидерланды) для определения еАт к ИФН является примером такого подхода.
В ходе тестирования разработанной на предварительном этапе методики было показано, что для количественного определения еАт к ИФН человека методом ИФА эти антитела нужно активизировать за счет нагревания в течение 20 минут при 75С образцов сыворотки или плазмы, так как свежая плазма и сыворотка содержат компоненты, которые могут мешать проведению ИФА. Однако, в дальнейшем было обнаружено, что нагревание при 75С приводит к значительной денатурации белка IgG, что может привести к недооценке фактического уровня еАт. В ходе данной работы очищенный на белке А IgG человека и кроличьи антитела к ИФН, очищенные на белке А, подвергались воздействию различных температур, а именно 37С, 56С, 65С и 75С и было выявлено, что при нагревании при 56C наблюдается гораздо меньшее снижение активности поликлональных Ат к ИФН человека, нежели при нагревании при 75C (примерно, в 3 раза).
Одним из возможных объяснений активации еАт при помощи высокой температуры является окисление кислорода (McIntyre J.A. et al., 2005). Было предположено, что окисление может участвовать в проявлении активности поликлональ-ных Ат к ИФН in vitro. Если это так, то восстановители должны препятствовать обнаружению этого эффекта, вызванного высокими температурами. Глутатион (Глт) является мощным восстановителем, обнаруживаемым в больших количествах в эритроцитах. Для того чтобы изучить эту возможность, к плазме крови добавляли восстановленный глутатион во время нагревания при 75C, что привело к более 85%-ному снижение активности еАт к ИФН. Исходя из этого, можно предположить, что гипотеза верна и основная часть поликлональных Ат к ИФН человека активируется при окислении. Поскольку нагревание до 75С обусловило выраженную денатурацию белков IgG, альтернативным методом активации поликлональ-ных Ат к ИФНу человека стало добавление окислителя, не нарушающего целостность белков IgG. Следовательно, на следующей фазе данного исследования образцы плазмы и/ или очищенные на белке A IgG человека подвергали воздействию различных веществ с высокой или низкой окислительной способностью.
Воздействуя на плазму и очищенные на белке A IgG человека сильными и слабыми окислителями при температуре 56С, обеспечивающей отсутствие денатурации, было продемонстрировано, что сильные окислители, в частности, FeCb и KMN04, активировали еАт ИФНу человека до уровней, превышающих аналогичный показатель при нагревании при 75С (рисунок 14). Так, добавление FeCb привело к практически 6-кратному повышению активности поликлональных Ат к ИФНу человека по сравнению с образцами, не обработанными FeCb, и, примерно, 2-кратное по сравнению с контрольным образцом, нагретом при 75С. Было обнаружено, что обработка плазмы FeCb обусловливает максимально высокую активность поликлональных Ат к ИФНу (225%) по сравнению с обработкой FeCb (186%), CuCb (20%) и KMnO4 (195%). Наиболее оптимальная концентрация FeCl3, необходимая для получения максимально высокой концентрации поликлональных Ат к ИФН человека была подобрана и составила, примерно 1,8 мM.
До сих пор неясен механизм активации еАт к ИФН человека при окислении. Одно из возможных объяснений заключается в следующем: окисление обусловливает изменение важных аминокислотных остатков на сайтах связывания еАт. Эту теорию поддерживают ученые, которые уже описали существование еАт, регулируемых посредством окислительно-восстановительной системы (McIntyre J.A. et al., 2005). Эти исследователи высказали гипотезу о том, что окислительно-восстановительные реакции вызывают нитросилацию тирозиновых остатков в вариабельном участке антитела и вокруг него. Изменение нитрации может вызвать конфор-мационные изменения на сайтах связывания антител, и, как следствие, происходит активация (дезактивация) еАт.
В ходе дальнейшего подбора условий был разработан инновационный метод активации образцов плазмы и сыворотки, предусматривающий обработку 1,8 мM FeCl3 и нагревание при 56C в течение 40 минут. Используя этот новый метод, можно выделить в 2,5 раза больше еАТ к ИФН человека, чем в образцах, просто нагретых при 75C, причем целостность белка IgG не страдает. Также было продемонстрировано, что еАт отличались высокой воспроизводимостью и специфичностью по отношению к ИФН человека, поскольку они не вступили в реакцию с ре-комбинантным ФНО и эритропоэтином человека. Полностью результаты по оценке воспроизводимости и специфичности представлены в приложении Д.
Для подтверждения способности определять именно аутоантитела, выделяли образцы аутоантител к ИФН человека из очищенных (аффинная хроматография на белке А) препаратов IgG человека. Данные аутоантитела характеризовали (молекулярная масса, характеристики связывания, нейтрализующая способность и специфичность) и сравнивали с IgG человека, очищенным на белке А, а также с мышиными моноклональными и кроличьими поликлональными антителами к ИФН человека. Из-за большого объема данные не включены в данную работу.
Таким образом, в данной работе было впервые установлено, что для перехода еАт к ИФН человека, не проявляющих связывающую активность, в активное состояние, позволяющее им специфически связываться с иммобилизованным ИФН in vitro требуется окислительно-восстановительная реакция. Следующим этапом стал анализ образцов крови пациентов с острыми инфекционными заболеваниями (включая пациентов, перенесших инфекционные заболевания) и здоровых людей, включенных в группу контроля, для определения истинного значения уровня активированных еАт к ИФН человека.