Исследование механизмов антиаритмического действия некоторых производных диметилфенилацетамида Яхья Мохамед Хамед Салем

Содержание к диссертации

Введение

Современные представления о механизмах фармакологического действия и мембранной проницаемости антиаритмических средств

1.1 Фармакология миокардиальных натриевых каналов .

1.2 Фармакологическая характеристика кальциевых каналов кардиомиоцитов 26

1.3 Фармакологические агенты, взаимодействующие с калиевыми каналами в сердце 29

1.4 Фармакологические аспекты мембранной проницаемости антиаритмиков – производных местных анестетиков 34

2 Материалы и методы исследования 43

2.1 Биологический материал, экспериментальные животные и основные требования к их содержанию 44

2.2 Фармакологическая характеристика исследуемых веществ и эталонных препаратов 47

2.3 Методы изучения влияния производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на функциональную активность симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы 50

2.4 Методические подходы к оценке функционального состояния цитоплазматической мембраны кардиомиоцитов и её проницаемости для производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 56

2.5 Методы изучения воздействия соединений ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 на трансмембранные ионные токи и влияния веществ на некоторые элементы потенциала действия 59

2.6 Методы изучения некоторых показателей метаболического гомеостаза сердечной мышцы на фоне введения производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 62

2.7 Используемые в работе методы верификации полученных результатов и их статистико-математического анализа 64

3 Исследование холинолитического и адренергического свойств третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 65

3.1 Влияние производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на течение ацетилхолиновой предсердной аритмии 65

3.2 Влияние третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на развитие адреналинового повреждения миокарда у мышей 70

3.3 Влияние третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на содержание адреналина и норадреналина в миокарде крыс 73

4 Особенности функционального состояния цитоплазматической мембраны кардиомиоцитов и её проницаемости для третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 77

4.1 Исследование механизмов мембранной проницаемости производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 78

4.2 Изменение прооксидантного-антиоксидантного потенциала миокарда под действием производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 82

4.3 Влияние производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на некоторые показатели внутриклеточного гомеостаза кардиомиоцитов 86

5 Влияние третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на некоторые параметры потенциала действия и ионное проведение 89

5.1 Влияние производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на некоторые параметры потенциала действия папиллярных мышц крысы 89

5.2 Влияние производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на функцию натриевых каналов, находящихся под действием нитрата аконитина 92

5.3 Изучение активности калиевых каналов задержанного выпрямления под действием производных диметилфенилацетамида (лидокаина) 94

6 Заключение 97

6.1 Итоги выполнения диссертационного исследования 104

6.2 Практические рекомендации 105

6.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 105

Выводы 106

Библиографический список 107

Список сокращений и условных обозначений

• Фармакологическая характеристика кальциевых каналов кардиомиоцитов
• Методические подходы к оценке функционального состояния цитоплазматической мембраны кардиомиоцитов и её проницаемости для производных диметилфенилацетамида (лидокаина)
• Влияние третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на развитие адреналинового повреждения миокарда у мышей
• Изменение прооксидантного-антиоксидантного потенциала миокарда под действием производных диметилфенилацетамида (лидокаина)

Введение к работе

Актуальность работы

Несмотря на многочисленные ограничения и нежелательные эффекты антиаритмические лекарственные средства вот уже более 100 лет применяются для профилактики и лечения нарушений ритма сердечной деятельности и до сих пор продолжают оставаться основой современного лечения аритмий во всем мире (Castro et al., 2015), вдохновляя исследователей на поиск более привлекательных молекул.

Краеугольным камнем, определяющим и терапевтическую активность, и профиль безопасности антиаритмического лекарственного средства, является механизм его действия – совокупность функциональных изменений внутриклеточного гомеостаза и межклеточного взаимодействия, влекущая развитие фармакологических эффектов.

В начале 2000-х годов в нашей стране была синтезирована серия молекул, представляющая собой производные диметилфенилацетамида (лидокаина) (Сернов Л.Н. и соавт., 2004). Главным мотивом начала работ в данном направлении послужила невысокая продолжительность фармакологического действия препарата, и, как следствие, невозможность его применения с профилактической целью в рамках курсового приема твердой лекарственной формы (Collins-worth et al., 1974).

Причем, химическая модификация известного антиаритмического и ме-стноанестезирующего лекарственного средства осуществлялась сразу в двух основных направлениях. Первое – наиболее простое с точки зрения технологии химического синтеза и менее затратное – направление привело к получению третичных производных диметилфенилацетамида (лидокаина), в которых при неизменном основании менялся анионный фрагмент молекулы на остаток ами-но- или карбоновой кислоты (Сернов Л.Н. и соавт., 2005). Второе направление, подразумевавшее более сложный процесс синтеза, было реализовано направленно на основании компьютерного прогнозирования соотношений в рядах «структура – токсичность» и «структура – активность» (Блинов Д.С. и соавт., 2005).

Представители обоих направлений химической модификации диметил-фенилацетамида (лидокаина) в течение ряда лет изучались учеными Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ, где они и были синтезированы, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва, Тверского государственного медицинского университета (Сернов Л.Н. и соавт., 2004, 2005; Блинов Д.С. и соавт., 2005, 2014; Блинова Е.В. и соавт., 2015, 2016; Лебедев А.Б., 2005; Марасанов С.Б. и соавт., 2013).

Было установлено, что модификация анионного фрагмента молекулы ди-метилфенилацетамида ведет к снижению острой токсичности получаемого вещества при парентеральных путях введения и, при сохранении исходной антиаритмической активности лидокаина, увеличивается продолжительность фармакологического эффекта.

В частности, подобные выводы были сделаны при исследовании производных, содержащих в качестве анионного фрагмента остатки L-глутаминовой, N-ацетил-L-глутаминовой, янтарной кислот (Блинов Д.С. и соавт., 2014). Также было отмечено, что увеличение продолжительности действия сопровождается оптимизацией гемодинамического профиля молекул – их внутривенное струйное введение не приводило к формированию гипотонии, тахикардии, что наблюдалось на фоне лидокаина, вводимого в том же режиме (Балашов В.П., Блинов Д.С., 2004). В то же время, некоторые вещества, в частности, с остатками аргинина, ацетил-цистеина и др., не имели никаких преимуществ перед структурным аналогом, более того, теряли антиаритмическую активность. Ква-тернизация молекулы диметилфенилацетамида (лидокаина) осуществлялась в отношении азота алифатической части молекулы и была проведена по аналогии с созданием отечественного антиаритмика кватернидина, представляющего собой четвертичное аллилморфолиновое производное тримекаина (Балашов В.П. и соавт., 2005). Конкурентными преимуществами новой молекулы стало расширение спектра терапевтического действия, увеличение длительности эффекта, но, при этом, она стала более токсичной, чем диметилфенилацетамид (Блинов Д.С. и соавт., 2005).

Несмотря на то, что параллельно с изучением эффектов соединений, выдвигались различные суждения о возможных механизмах их антиаритмического действия, законченного и логично выстроенного исследования на этот счет проведено не было, что и обусловило актуальность выполнения настоящего диссертационного проекта.

Степень разработанности проблемы

Исследование и разработка новых отечественных химических структур, обладающих антиаритмическим, или шире, кардиотропным, действием, является приоритетным направлением научных исследований представителей фармакологической школы ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва». В альянсе с химиками-технологами АО «ВНЦ БАВ» были созданы две генерации активных субстанций, представляющих собой производные диметилфенилацетамида (лидо-каина) (Сернов Л.Н. и соавт., 2004, 2005). Произведенная химическая модификация анионного фрагмента, кватернизация алифатической части молекулы основания диметилфенилацетамида, привели к изменению токсикологического профиля полученных веществ и спектра их фармакологической активности (Блинов Д.С. и соавт., 2014). Совокупность терапевтических эффектов веществ была широко изучена и нашла отражение в научной периодике. Одним из наиболее ценных эффектов соединений является антиаритмический. При этом, соединения, превосходя по длительности действия лидокаин, приобрели ряд новых, не свойственных структурному предшественнику, качеств (Балашов В.П. и соавт., 2009), механизм формирования которых остается неизвестным.

Цель работы

Провести комплексное фармакологическое исследование некоторых механизмов антиаритмического действия третичного, аминокислот-содержащего, и четвертичного, аллилморфолинового, производных диметилфенилацетамида.

Задачи исследования

1. Оценить холинолитическое и антиадренергическое свойства третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина), их влияние на содержание биогенных аминов в миокарде.

2. Исследовать механизмы мембранной проницаемости третичного (ЛХТ-3-00) и четвертичного (ЛХТ-12-02) производных диметилфенилацетамида (ли-докаина).

3. Изучить влияние третичного и четвертичного производных диметил-фенилацетамида (лидокаина) на состояние свободнорадикальных процессов, а также окислительно-восстановительные реакции в миокарде животных.

4. Исследовать изменения основных параметров потенциала действия папиллярных мышц крысы под действием третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина).

5. Изучить влияние третичного и четвертичного производных диметил-фенилацетамида (лидокаина) на функциональную активность потенциал-зависимых калиевых Kv4.3-каналов задержанного выпрямления.

Научная новизна

Впервые проведено экспериментальное исследование механизмов антиаритмического действия третичного (L-глутаминат 2-диэтиламино-2¹,6¹-диметилфенилацетамида) и четвертичного (N-аллил-N-[2,6-диметилфенил-аминокарбонилметил] морфолиния бромид) производных диметилфенилацета-мида. Установлено, что замещение анионного фрагмента молекулы диметилфе-нилацетамида на остаток L-глутаминовой кислоты (ЛХТ-3-00), также как и ква-тернизация азота алифатической части молекулы и введение его в циклическую структуру аллилморфолина (ЛХТ-12-02), не приводит к появлению холиноли-тических свойств у получаемых молекул. Соединения при профилактическом введении в терапевтических дозах ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 не оказывают влияние на концентрацию адреналина в миокарде крыс, в то время как третичное производное диметилфенилацетамида сдерживает рост уровня норадреналина в зоне ишемической альтерации миокарда, что, наряду со способностью вещества к ограничению катехоламинового повреждения миокарда мышей, может быть расценено как проявление антиадренергических свойств.

При изучении механизмов мембранной проницаемости производных ди-метилфенилацетамида (лидокаина) впервые установлено, что третичное производное ЛХТ-3-00 проникает через мембрану кардиомиоцита в ионизированном виде, поскольку скорость изменения рефрактерности полоски миокарда сердца крысы на фоне ее перфузии раствором, содержащим соединение, соответствует скорости экстракции вещества в системе октанол-вода. Для четвертичного производного диметилфенилацетамида (лидокаина) впервые расчетным методом был обоснован механизм мембранной проницаемости в электронейтральном виде (в виде ионных пар).

Как и эталонный препарат лидокаин его третичное и четвертичное производные сдерживают рост свободнорадикальной активности в миокарде, индуцированной ишемическим повреждением, при этом третичное соединение ЛХТ-3-00 активирует антиоксидантный потенциал миокарда крыс, препятству-

ет формированию ацидоза и оптимизирует парциальное напряжение кислорода и углекислого газа в крови коронарного венозного синуса кошек с острым инфарктом миокарда.

Впервые показано, что третичное и четвертичное производные диметил-фенилацетамида (лидокаина) снижают амплитуду и скорость нарастания переднего фронта потенциала действия, регистрируемого на полосках папиллярных мышц крысы, являющихся функцией натриевого тока. Что в совокупности с их эффективностью на модели аконитиновой предсердной аритмии доказывает наличие в механизме антиаритмического действия натрий-блокирующего компонента.

В опытах на изолированных клетках окологлоточного нервного ганглия моллюска, содержащих только Кv4.3-каналы, впервые показано отсутствие у обоих производных диметилфенилацетамида способности подавлять калиевый ток как в конфигурации «whole cell», так и в конфигурациях «inside-out» и «sin-gle attached cell».

Теоретическая и практическая значимость работы

Представленные в диссертационной работе данные о механизмах антиаритмического действия третичного аминокислот-содержащего и четвертичного аллилморфолинового производных диметилфенилацетамида (лидокаина) существенно пополняют имеющиеся сведения об особенностях фармакологии антиаритмических лекарственных средств первого класса по действующей классификации, производных антиаритмических и местноанестезирующих лекарственных препаратов.

Представленное исследование является основанием для прогнозирования структура – активность при проведении поиска новых лекарственных средств, спектра терапевтического действия веществ данного химического класса, возможных нежелательных эффектов.

Методология и методы исследования

При написании диссертационного исследования использовали следующие методологические принципы современного научного поиска: принцип объективности; принцип учёта непрерывного изменения, развития исследуемых явлений; принцип единства логического и исторического; принцип системности изучения процесса с учетом всех его требований; принцип восхождения от абстрактного к конкретному и от конкретного к абстрактному.

Холинотропное и адренотропное действие производных диметилфенил-ацетамида изучили на основе двух методических подходов: первого – на основе моделирования патологического процесса, вызванного введением токсических доз нейромедиатора, и оценки эффективности фармакологичских агентов; второго – на основе изучения влияния фармакологического агента на концентрацию нейромедиатора в сердечной ткани на фоне развивающегося патологического процесса.

Мембранную проницаемость для третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) также исследовали, используя два методических приема. В первом случае осуществляли сопоставление скорости изменения рефрактерности миокарда изолированных полосок папиллярных

мышц со скоростью экстракции фармакологического агента в системе октанол-вода. Во втором случае использовали современный математический аппарат для построения модели и проведения расчетных вычислений прохождения через мембрану заряженного вещества.

Использовали хемилюминисцентный метод для определения активности ПОЛ, регистрацию окислительно-восстановительных реакций крови, ёмкости её буферных систем и концентрации газов проводили с помощью газового анализатора.

Влияние производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на ионное проведение и параметры потенциала действия исследовали с использованием современных микроэлектродных методов на изолированных тканях и клетках.

Связь диссертации с основными научными темами университета

Настоящий диссертационный проект выполнен при финансовой поддержке и под эгидой темы №2859 базовой части государственного задания ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» «Обоснование фармакологических возможностей повышения эффективности и безопасности регуляции деятельности сердца при патологических воздействиях ишемической и стрессовой природы» (номер государственной регистрации 114112440238), гранта РФФИ мол_а №14-04-31104 «Изучение механизмов взаимодействия клеточных мембран с молекулами лекарственных веществ – как основа создания эффективных антиаритми-ков» (номер государственной регистрации 01201457255).

Основные научные результаты, полученные при выполнении настоящей диссертационной работы, внедрены в программу научно-исследовательского семинара и используются при чтении лекций в рамках программы подготовки кадров высшей квалификации в аспирантуре по научному направлению «Фундаментальная медицина» и профилю 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология на кафедрах фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии; амбулаторно-поликлинической терапии; используются в исследовательском процессе лабораторий лекарственной токсикологии, специфической активности лекарственных средств и фармакокине-тики и таргетной фармакотерапии Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Положения, выносимые на защиту

6. Антиаритмическое действие третичного L-глутаминового и четвертичного аллилморфолинового производных диметилфенилацетамида (лидокаина) реализуется за счет подавления амплитуды и скорости нарастания переднего фронта (фаза 0) потенциала действия кардиомиоцитов, что связано с блокадой входящего натриевого тока. Соединения ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 не обладают способностью блокировать Кv4.3-каналы.

7. Третичное аминокислот-содержащее производное диметилфенилаце-тамида (лидокаина) обладает антиадренергическим действием, оптимизирует состояние ПОЛ и окислительно-восстановительных процессов в миокарде. Третичное и четвертичное производные не обладают холинолитическим действием.

3. И третичное, и четвертичное производные диметилфенилацетамида (лидокаина) проникают через цитоплазматическую мембрану кардиомиоцитов, первое – в ионизированном виде, второе – в электронейтральной форме.

Степень достоверности результатов исследования

Представленные в диссертационном исследовании результаты получены с использованием общепринятых экспериментальных и лабораторных методов фармакологического исследования, лабораторных животных, имеющих ветеринарные сертификаты и содержащихся в условиях, отвечающих требованиям российского законодательства к лабораторной практике. В работе применялись фармакологические субстанции, химические реактивы, биологические агенты и лекарственные препараты с учётом сроков годности и условий их хранения. Количество животных в экспериментальных сериях обеспечивало получение репрезентативных результатов. Выводы основаны на применении современных методов вариационной статистики: сбора, сводки и группировки результатов, расчета относительных и средних величин, дисперсионного анализа, параметрических и непараметрических критериев оценки достоверности различий сравниваемых величин.

Апробация результатов работы

Апробация результатов диссертационного исследования проведена на совместном расширенном заседании кафедр фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии, амбулаторно-поликлинической терапии, гистологии, цитологии, эмбриологии с курсом медицинской биологии и молекулярной биологии клетки, нормальной и патологической физиологии, анестезиологии и реаниматологии, педиатрии, факультетской хирургии, лабораторий Центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва», протокол №9 от 20.10.2016 г.

Результаты исследований докладывались на конгрессе «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» XV-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей с международным участием (Санкт-Петербург, 2015), Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Алмазовские чтения-2014-2015» (Санкт-Петербург, 2014-2015), XVI и XVII Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2015, Екатеринбург, 2016), XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство-2016» (Москва, 2016), ежегодных научной конференции Мордовского госуниверситета «Огаревские чтения» (Саранск, 2012-2015), конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва (Саранск, 2013-2016).

Личный вклад автора

Лично осуществлял реферирование отечественных и зарубежных литературных источников и написание обзора литературы. Поставлены все эксперименты на животных по изучению антихолинергического и антиадренергическо-го действия соединений. Лично проведены исследования на изолированных полосках миокарда сердца крысы, а также опыты на изолированных гигантских

клетках окологлоточного ганглия моллюска. Выдвинута гипотеза, проведено построение алгоритма модели и осуществлены математические расчеты мембранной проницаемости для четвертичного производного диметилфенилацета-мида. Самостоятельно осуществлена статистическая обработка полученных экспериментальных данных, принимал непосредственное участие в подготовке и написании всех публикаций по теме диссертационного исследования. Подготовлена рукопись настоящего исследования и его автореферата.

Публикации по теме диссертационной работы

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 научных работ, из них 5 статей – в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объём и структура работы

Диссертационная работа построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературных источников (глава 1), главы «Материалы и методы исследования» (глава 2), трёх глав (главы 3-5) с описанием результатов собственных исследований, заключения с практическими рекомендациями (глава 6) и выводов.

Диссертация изложена на 127 станицах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами. Библиографический список содержит 201 работу, из которых 28 – отечественных и 173 – зарубежных авторов.

Фармакологическая характеристика кальциевых каналов кардиомиоцитов

Некоторые представители I класса антиаритмиков, такие как хинидин и флекаинид, способны ингибировать Ito ток с сопоставимым эффектом как в человеческом сердце, так и у представителей млекопитающих, эффективно контролируя ФП. Однако, в силу большого числа нежелательных эффектов, появления более современных и безопасных лекарственных средств, хинидин сейчас используется лишь для лечения вагус-зависимой ФП.

Блокаторы калиевого IKur тока. Препараты I и III классов антиаритмических средств обладают доказанной антиаритмической активностью при широком спектре нарушений ритма, однако их клиническое применение лимитировано ургентными состояниями, вследствие высокого риска возникновения фатальных аритмий на фоне их длительного использования. Исследования показывают, что подобное нежелательное действие препаратов обусловлено мозаичностью из влияния на различные типы ионных каналов в разных отделах сердца. Следовательно, преимущественное воздействие на ионные каналы, расположенные в ткани предсердий, более перспективны в клиническом плане для предотвращения и купирования сердечных аритмий.

В этом аспекте изучение эффектов некоторых блокаторов КV1.5-каналов показало, что эти соединения не нарушают процессов реполяризации ПД, не увеличивают длительность интервала QT и восстанавливают синусовый ритм при ФП [89]. Было также показано, что терапевтический эффект пропафенона (IС подкласс антиаритмиков) при купировании пароксизмальных форм ФП могут быть обусловлен как раз его способностью блокировать КV1.5-каналы [90, 91]. Оба типа мутаций (ведущих к обретению функций и выпадению таковых) КV1.5-каналов были обнаружены у пациентов, страдающих ранними одиночными пароксизмами ФП, что служит еще одним доказательством ранее упомянутой гипотезы об участии IKur тока в формировании ФП [92, 93]. А, поскольку до сих пор не было синтезировано ни одного активатора КV1.5-каналов, использование блокаторов данного типа калиевых каналов представляется клинически весьма перспективным.

Блокаторы калиевого IKr тока. Ген 1 специфических калиевых каналов человека (The human Ether-a-go-go Related Gene 1, hERG1) кодирует 6 трансмембранных -субъединиц, состоящих из 1159 аминокислот, образующих тетрамер на поверхности мембраны некоторых кардиальных клеток, называемый потенциал-зависимым КV11.1-каналом. Их активность играет фундаментальную роль в формировании процесса реполяризации мембраны кардиомиоцита (фаза 3 ПД).

Метан-сульфонанилидные группы представителей III класса антиаритмиков блокируют указанные каналы, связываясь с ними преимущественно в то время, когда канал открыт [94, 95]. Следовательно, препараты данного подкласса вызывают удлинение фазы реполяризации (фаза 3 ПД) и увеличивают продолжительность периода рефрактерности сердечных клеток. В то же время, указанные препараты обладают и некоторыми другими эффектами на ионные каналы [96]. Однако, несмотря на значительные различия в интимном механизме действия, блокаторы КV11.1-каналов в настоящее время наиболее используемые лекарственные средства в аритмологической клинике.

Так, амиодарон является препаратом выбора для профилактики ФП, особенно после проведенных кардиохирургических вмешательств [97, 98]. При этом, несмотря на блокаду КV11.1-каналов у амиодарона крайне редко наблюдается индукция ФЖ по сравнению с другими представителями данного класса антиаритмиков. Ученые склонны связывать этот феномен со способностью препарата ингибировать активность кальциевых каналов, что, в некоторой степени компенсирует эффект амиодарона на фазу реполяризации ПД [99].

В то же время блокада кальциевых каналов ассоциируется в случае с амиодароном с довольно высокой частотой развития брадикардии [100, 101, 102]. Препарат обладает широким спектром нежелательных эффектов, не обязательно связанных с ингибированием калиевых каналов, в частности, легочная токсичность, гепатотоксичность, влияние на орган зрения, атаксия, неблагоприятное воздействие на желудочно-кишечный тракт и сексуальную сферу [103].

«Чистым» антиаритмиком третьего класса является дофетилид, блокирующий проницаемость для ионов калия КV11.1-каналы и применяющийся при этом для терапии ФП [104]. И, хотя риск возникновения ФЖ на его фоне выше, чем на фоне амиодарона, тем не менее он значительно менее существенен, чем в случае использования препаратов первого С класса [105].

Многие фармакотерапевтические агенты, используемые для терапии соматических заболеваний, таких как аллергии, гастроэнтерологические заболевания, а также психических расстройств, были изъяты из продаж вследствие тяжелых последствий блокады КV11.1-каналов, имеющих своим последствием формирование приобретенного синдрома удлиненного интервала QT 2 типа (acquired-LQT2, aLQT2). Та же форма синдрома может быть индуцирована противоэпилептическими препаратами фенитоином и триметадионом [106].

Наряду с этим, многие нежелательные эффекты антиаритмиков – блокаторов калиевых каналов – могут быть обусловлены экстракардиальной локализацией рецепторов. Так антиаритмик третьего класса алмокалант обладает рецептор-ассоциированной тератогенностью [107, 108]. Напротив, стимуляция КV11.1-каналов ингибирует пролиферацию опухолевых клеток при раке молочной железы [109, 110].

Активаторы IKr тока. Проведение скрининговых исследований пациентов с LQT2 синдромом выявили по крайней мере 290 мутаций hERD1 гена, сопровождающихся потерей функций КV11.1-каналов и лишь 1 мутацию, активирующую функцию канала [111]. И, несмотря на то, что до сих пор не совсем понятна взаимосвязь мутаций гена hERD1 с фармакологической активностью веществ, воздействующих на соответствующую субпопуляцию калиевых каналов, совершенно очевидно, что активаторы КV11.1-каналов могут обладать высокой потенциальной ценностью в качестве антиаритмических агентов.

Первый активатор КV11.1-каналов был разработан группой исследователей под руководством David Rampe. Авторы сообщали [112], что вещество RPR260243 значительно замедляет дезактивацию КV11.1-каналов, в результате чего наблюдается избыточный выходящий поток ионов калия в фазу 3 ПД, существенно ускоряя реполяризацию мембраны кардиомиоцитов. С тех пор стали известны и другие активаторы выходящего калиевого тока с различными механизмами действия. Так, NS1643 [113, 114] подавляет Kv11.1-ток, ингибируя инактивацию каналов.

Примечательно, что описанные активаторы практически не действуют на здоровые сердца животных, тогда как на фоне использования блокаторов КV11.1-каналов соединения укорачивают продолжительность интервала QT. Более того, нестероидные противовоспалительные средства, такие как нифлумовая и флуфенамовая кислоты (гомологичные по химической структуре с соединением NS1643), не влияют на сердечную функцию даже несмотря на то, что активируют КV11.1-каналы [113]. Все это открывает широкие перспективы для активаторов калиевых каналов, в частности, как средств для лечения синдрома удлиненного интервала QT.

Методические подходы к оценке функционального состояния цитоплазматической мембраны кардиомиоцитов и её проницаемости для производных диметилфенилацетамида (лидокаина)

Интенсивность процессов свободнорадикальной липопероксидации регистрировали с использованием фотометра «EL-1105» производства фирмы «Emilite» (США).

Оценка эффективности, достоверность полученных результатов. Оценивали следующие показатели: интенсивность световспышки в ткани миокарда зоны ишемии и удаленной от ишемического процесса зоны. Достоверность различий при сравнении с интактным контролем или группой контроля животных с острой ишемией, но без фармакологического воздействия проводили с помощью одномерного дисперсионного анализа, при подтверждении нормальности распределения признака в исследуемых группах использовали критерий Ньюмена-Кейлса.

Поскольку четвертичные аммониевые производные являются постоянно заряженными соединениями, плохо проникающими через липидные мембраны, вопрос о механизме их проникновения внутрь клетки является чрезвычайно важным. Если не предполагать существование каких-либо переносчиков, то можно думать, что четвертичные аммониевые соединения могут проходить через мембрану в виде положительно заряженных ионов по градиенту концентрации и потенциала, либо в электронейтральном виде вместе с анионами. Чтобы оценить реальность подобных механизмов нами были для третичного и четвертичных производных диметилфенилацетамида (лидокаина) в виде ионов. Проницаемость БЛМ для исследуемых веществ в виде ионных пар (нейтральных соединений) оценивалась теоретически – на основе предположения о том, что, так же как и для неэлектролитов, проницаемость липидного бислоя определяется гидрофобностью соединения. О проницаемости судили по изменению рефрактерности изолированных препаратов сердечной ткани правого желудочка крыс-самцов. Проницаемость липидной мембраны для ионов – третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) – определялась по величине тока короткого замыкания, возникающего в ответ на добавление соединения с одной стороны мембраны. Значение коэффициента проницаемости Р+ вычислялось по формуле: Р+=I/(FSC), где I – ток короткого замыкания, F – число Фарадея, S – площадь мембраны, C – концентрация соединения, добавленного в раствор с цис-стороны мембраны.

Бислойные липидные мембраны формировались из раствора липидов мозга быка в гептане на отверстии 0,8 мм в тефлоновом стаканчике. Измерение рефрактерности проводилось на сердечной ткани крыс, помещенной эндокардом вверх в камеру для перфузии. Перфузия проводилась оксигенированным карбогеном раствором Тироде. Препараты стимулировались с периодом 500 мс прямоугольными импульсами тока. В качестве величины рефрактерности (R) принимался минимальный период стимулирования, когда в ответ на каждый стимул возникала распространенная волна возбуждения. Коэффициент экстракции исследуемых соединений в двухфазной среде октанол-вода, принятый за меру гидрофобности, определялся по равновесному распределению соединений между двумя фазами при комнатной температуре.

Протокол эксперимента. Папиллярные мышцы выделяли из правого желудочка сердца крысы (использовали животных обоего пола весом 180-220 г, полученных из питомника «Столбовая» филиала ФГБУ НЦБМТ ФМБА). Папиллярные мышцы имели диаметр 0,3-0,1 мм и длину от 0,5 до 5 мм. Препарат помещали в камеру, выполненную из оргстекла, для стимуляции оригинальной конструкции и перфузировали раствором Тироде следующего состава (в мМ): хлорид натрия – 145; хлорид калия – 4; хлорид кальция – 1,8; хлорид магния – 1; трис – 5; глюкоза – 10; pH раствора доводили соляной кислотой до значения 7,2-7,4. Раствор насыщали чистым кислородом при температуре 380 С, температура в камере составляла 350 С, время полной смены раствора – около 100 с. Препарат стимулировали короткими (1 мс) стимулами с выхода стимулятора ЭСУ-1 через изоблок. Стимулы подавались на препарат через хлорированные серебряные электроды, помещенные в обе половинки камеры. В начале опыта силу тока подбирали равной примерно 1,5 пороговым значениям с тем, чтобы латентность составляла 5-10 мс. В ходе уменьшения максимальной скорости деполяризации (Vmax) под действием исследуемых веществ силу стимула увеличивали настолько, чтобы латентность и пороговый уровень регенеративной деполяризации оставались примерно на исходном уровне.

Для регистрации во всех опытах использовали стеклянные микроэлектроды, наполненные 2,5 М раствором KCl. Сопротивление микроэлектродов равнялось 10-20 МОм. Был использован метод так называемого "плавающего" микроэлектрода, т.к. он менее чувствителен к сокращениям препарата. Как правило, электрод удавалось поддерживать в одной и той же клетке на протяжении опыта. Записывали потенциал на мембране и его первую производную (линейный выход до 500 В/с). Длительность потенциала действия измеряли графическим способом. Оценка эффективности, достоверность полученных результатов.

Влияние третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на развитие адреналинового повреждения миокарда у мышей

Антиадренергическое или, напротив, адренопозитивное, действие фармакологических агентов может реализовываться на различных уровнях обмена биогенных аминов: синтеза, транспорта, продукции, взаимодействия с рецепторами, обратного нейронального захвата, инактивации [170]. Так или иначе, адренотропное влияние лекарственных веществ может сопровождаться изменением концентрации адреналина и норадреналина в ткани сердца как в норме, так и при патологических процессах [171, 172, 173]. Именно поэтому в рамках изучения взаимодействия производных диметилфенилацетамида (лидокаина) с вегетативной нервной системой один из разделов мы посвятили исследованию их влияния на концентрацию биогенных аминов в сердце крысы при острой ишемии миокарда (табл. 3.3).

В соответствии с протоколом исследования уровень катехоламинов в миокарде предсердия, миокарде желудочка определяли иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов диагностикумов EPI ELISA Kit и NorEPI ELISA Kit производства фирмы «Cusabio Biotech» (Китай) и иммуноферментного анализатора «Stat Fax 4200» производства фирмы «Awareness Technology» (США). Результаты измерений представлены в табл. 3.3.

Исследование концентрации биогенных аминов крыс контрольной серии показало, что формирование острой ишемии миокарда у животных сопровождается эскалацией концентрации адреналина в ткани сердца с 0,35+0,08 нмоль/г до 0,96+0,11 нмоль/г. Подобным же образом изменялась и концентрация другого биогенного амина - норадреналина, но, при этом рост был более значительным (табл. 3.5). Полученные нами данные вполне согласуются с результатами, полученными при исследовании концентрации катехоламинов на модели сердечной недостаточности у крыс с острой ишемией сердца, проведенные в 2000 г. Patel et al. [171], а также с данными, полученными J. Kuncova et al. (2005) на крысах с острой ишемией сердца и сахарным диабетом [172].

Как свидетельствуют полученные данные, четвертичное производное диметилфенилацетамида (лидокаина) ЛХТ-12-02 не оказывает статистически достоверного эффекта на содержание адреналина в неповрежденных и поврежденных участках миокарда крыс с экспериментальным инфарктом, однако обнаруживает тенденцию к снижению этого вещества в поврежденной зоне. При этом соединение при профилактическом введении не влияет на концентрацию норадреналина в сердце крыс с инфарктом миокарда.

Третичное производное диметилфенилацетмида (лидокаина) ЛХТ-3-00 при профилактическом внутривенном введении крысам за 10 мин до перевязки коронарной артерии приводит к статистически значимому снижению концентрации адреналина в миокарде зоны повреждения, не оказывая существенного влияния на концентрацию норадреналина в исследуемых участках миокарда крыс.

Проводя детальный анализ результатов иммуноферментного исследования концентрации катехоламинов в ткани сердца крысы в условиях острого ишемического повреждения миокарда позволяет нам сделать следующие обобщения: в результате корректного воспроизведения контрольного опыта были получены релевантные результаты концентрации адреналина и норадреналина в неповрежденных и поврежденных участках сердца, соответствующие имеющимся в опубликованных источниках.

Четвертичное аммониевое производное диметилфенилацетамида (лидокаина) с аллилморфолиновым радикалом не влияет на содержание биогенных аминов адреналина и норадреналина в ткани сердца как удаленной от зоны ишемии, так и в поврежденном участке. Третичное производное диметилфенилацетамида (лидокаина) с глутаминовой кислотой в качестве аниона снижает концентрацию адреналина в зоне повреждения при сравнении с контрольной группой и неповрежденными участками миокарда. Оценивая данные, освещенные в настоящей главе, следует сказать, что исследуемые нами вещества не обладают атропиноподобным эффектом, но и не активируют холинергические влияния на сердце, следовательно, не оказывают заметного влияния на парасимпатическое звено вегетативной регуляции сердечной деятельности.

Менее однозначны взаимоотношения исследуемых производных с парасимпатическими влияниями на сердце. Так в опытах на мышах мы установили, что оба соединения способны предотвращать формирование нарушений ритма, однако только лишь производное ЛХТ-3-00 (третичный дериват диметилфенилацетамида) оказывало влияние на продолжительность жизни животных и экспериментальную летальность.

При изучении влияния соединений на концентрацию катехоламинов именно у третичного производного ЛХТ-3-00 мы установили способность к снижению уровня адреналина в зоне повреждения.

Вместе с тем, следует подчеркнуть, что в условиях патологически измененного гомеостаза обмен биогенных аминов и их патогенетическая роль существенно изменяются. Так, было показано, что на фоне цирротического процесса у крыс повышается продукция оксида азота, что снижает чувствительность миокарда к повреждающему действию адреналина [173]. В исследовании J. Kuncova et al. после внутривенного введения стрептозотоцина наблюдали спонтанное восстановление уровня нейрогенного норадреналина в сердце, что было объяснено фактом синтеза вещества в теле нейрона, а не в его окончании [172]. На фоне ишемически опосредованной сердечной недостаточности также наблюдается повышение концентрации норадреналина, обусловленное снижением чувствительности к нему бета-адренорецепторов поврежденных участков миокарда [171].

Следовательно, антиадренергический элемент может являться одним из звеньев антиаритмического и, в целом, кардиотропного действия производного диметилфенилацетамида ЛХТ-3-00.

Изменение прооксидантного-антиоксидантного потенциала миокарда под действием производных диметилфенилацетамида (лидокаина)

Несмотря на многочисленные ограничения и нежелательные эффекты антиаритмические лекарственные средства вот уже более 100 лет применяются для профилактики и лечения нарушений ритма сердечной деятельности и до сих пор продолжают оставаться основой современного лечения аритмий во всем мире [1], вдохновляя исследователей на поиск более привлекательных молекул.

Целями медикаментозной терапии являются снижение частоты, продолжительности и симптоматической насыщенности эпизодов аритмии, наряду с редукцией возможных последствий её развития [192, 193].

Краеугольным камнем, определяющим и терапевтическую активность, и профиль безопасности антиаритмического лекарственного средства, является механизм его действия – совокупность функциональных изменений внутриклеточного гомеостаза и межклеточного взаимодействия, влекущая развитие фармакологических эффектов. Именно поэтому, говоря о разработке нового подхода к фармакотерапии аритмий, о создании нового фармакологического агента, исследователь в первую очередь должен ставить перед собой вопрос о возможных механизмах реализации эффекта будущего лекарственного препарата.

В начале 2000-х годов в нашей стране была синтезирована серия молекул, представляющая собой производные диметилфенилацетамида (лидокаина) [2]. Главным мотивом начала работ в данном направлении послужила невысокая продолжительность фармакологического действия препарата, и, как следствие, невозможность его применения с профилактической целью в рамках курсового приема твердой лекарственной формы.

Причем, химическая модификация известного антиаритмического и местноанестезирующего лекарственного средства осуществлялась сразу в двух основных направлениях. Первое – наиболее простое с точки зрения технологии химического синтеза и менее затратное – направление привело к получению третичных производных диметилфенилацетамида (лидокаина) в которых при неизменном основании менялся анионный фрагмент молекулы на остаток амино-или карбоновой кислоты [4]. Второе направление, подразумевавшее более сложный процесс синтеза, было реализовано направленно на основании компьютерного прогнозирования соотношений в рядах «структура – токсичность» и «структура-активность» [5].

Представители обоих направлений химической модификации диметилфенилацетамида (лидокаина) в течение ряда лет изучались учеными Всероссийского научного центра по безопасности биологически активных веществ, где они и были синтезированы, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва, Тверского государственного медицинского университета [2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12].

Было установлено, что модификация анионного фрагмента молекулы диметилфенилацетамида ведет к снижению острой токсичности получаемого вещества при парентеральных путях введения и, при сохранении исходной антиаритмической активности лидокаина, увеличивается продолжительность фармакологического эффекта.

В частности, подобные выводы были сделаны при исследовании производных, содержащих в качестве анионного фрагмента остатки L-глутаминовой, N-ацетил-L-глутаминовой, янтарной кислот [7]. Также было отмечено, что увеличение продолжительности действия сопровождается оптимизацией гемодинамического профиля молекул – их внутривенное струйное введение не приводило к формирования гипотонии, тахикардии, что наблюдалось на фоне лидокаина, вводимого в том же режиме [13]. В то же время, некоторые вещества, в частности с остатками аргинина, ацетил-цистеина и др. Не имели никаких преимуществ перед структурным аналогом, более того, теряли антиаритмическую активность.

Кватернизация молекулы диметилфенилацетамида (лидокаина) осуществлялась в отношении азота алифатической части молекулы и была проведена по аналогии с созданием отечественного антиаритмика кватернидина, представляющего собой четвертичное аллилморфолиновое производное тримекаина [14]. Конкурентными преимуществами новой молекулы стало расширение спектра терапевтического действия, увеличение длительности эффекта, но, при этом, она стала более токсичной, чем диметилфенилацетамид [5].

Несмотря на то, что параллельно с изучением эффектов соединений, выдвигались различные суждения о возможных механизмах их антиаритмического действия, законченного и логично выстроенного исследования на этот счет проведено не было, что и послужило основанием для выполнения настоящего диссертационного проекта.

Мы сформулировали цель работы как изучение некоторых аспектов механизма антиаритмического действия третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина).

В рамках обозначенной цели были поставлены несколько задач. Первой из них являлось исследование влияния третичного и четвертичного производных диметилфенилацетамида (лидокаина) на функциональное состояние вегетативной нервной системы на уровне регуляции деятельности сердца.

Как известно, автономная нервная система контролирует состояние автоматии, проводимости по атриовентрикулярному узлу, сократимости миокарда [1]. Таким образом, модуляция вегетативных – симпатических и парасимпатических – влияний на сердце является одним из существенных факторов, определяющих его ритмическую функцию. В частности, блокаторы бета-адренорецепторов составляют класс II антиаритмических лекарственных средств по классификации Е. Vaughan-Williams.