Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Структура и физико-химические свойства металлокластерных комплексов 15
1.2. Перспективы применения кластерных комплексов рения в биологии и медицине 17
1.2.1. Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве рентгеноконтрастных веществ (РКВ) для функциональной диагностики 17
1.2.2. Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве рентгеноконтрастных добавок в биодеградируемые имплантаты в травматологии 25
1.2.3. Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве контрастирующих агентов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 27
1.2.4. Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии 28
1.2.5. Перспективы использования октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве биомаркера в фундаментальных исследованиях в биологии 32
1.2.6. Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве противоопухолевых агентов 33
1.3. Исследование биологических эффектов металлокластерных комплексов in vitro и in vivo 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Синтез кластерных комплексов рения 37
2.2. Оценка рентгеновской контрастности кластерных комплексов рения 38
2.3. Клеточная культура и культивирование клеток 39
2.4. Исследование цитотоксичности кластерных комплексов рения in vitro 40
2.5. Исследование проникновения кластерных комплексов в клетки Hep-2 in vitro при помощи лазерной сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии 41
2.6. Исследование проникновения кластерных комплексов в клетки Hep-2 in vitro при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 41
2.7. Экспериментальные животные 42
2.8. Определение полулетальной дозы (ЛД50) и исследование острой токсичности при внутривенном введении раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo 43
2.9. Исследование возможности применения раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6]
в качестве сосудистого РКВ 45
Глава 3. Результаты исследования 46
3.1. Оценка рентгеновской контрастности кластерных комплексов рения 46
3.2. Сравнение цитотоксичности кластерных комплексов рения in vitro 48
3.3. Исследование проникновения кластерных комплексов в клетки Hep-2 in vitro при помощи лазерной сканирующей флуоресцентной конфокальной микроскопии 52
3.4. Исследование проникновения кластерных комплексов в клетки Hep-2 in vitro при помощи просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) 54
3.5. Определение полулетальной дозы (ЛД50) при внутривенном введении раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo 56
3.6. Общий и биохимический анализ крови животных через 2 недели после внутривенной инъекции раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] 58
3.7. Морфологический анализ внутренних органов мышей после внутривенной инъекции раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] 65
3.7.1. Морфологический анализ печени 66
3.7.2. Морфологический анализ почек 71
3.7.3. Морфологический анализ сердца 75
3.7.4. Морфологический анализ легких, мозга, селезенки и двенадцатиперстной кишки 77
3.8. Исследование возможности применения раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве сосудистого РКВ 83
Глава 4. Обсуждение результатов 85
Заключение 95
Выводы 97
Список сокращений и условных обозначений 98
Список литературы 99
- Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве рентгеноконтрастных веществ (РКВ) для функциональной диагностики
- Исследование биологических эффектов металлокластерных комплексов in vitro и in vivo
- Морфологический анализ печени
- Морфологический анализ легких, мозга, селезенки и двенадцатиперстной кишки
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Несмотря на большое количество исследований, посвященных
рентгеноконтрастным препаратам для функциональной диагностики [Caltagirone et al., 2015; Cole et al., 2015; Taupin et al., 2015; Nakamura et al., 2016], до сих пор не удалось синтезировать контрастное вещество, которое бы сочетало в себе только положительные качества, то есть обладало высокой гидрофильностью и растворимостью, небольшой вязкостью и низкой осмолярностью, при этом молекулы которого содержали бы большое количество атомов тяжелого элемента, необходимых для получения высокого качества изображения [Andreucci, Solomon, Tasanarong, 2014]. Октаэдрические кластерные комплексы рения способны поглощать рентгеновские лучи за счет высокой локальной концентрации атомов тяжелого элемента в составе кластерного ядра [Ivanov et al., 2014]. Они характеризуются высокой химической и термической устойчивостью [Mironov et al., 2006], демонстрируя тем самым потенциал для применения в медицине в качестве рентгеноконтрастных препаратов. По количеству атомов тяжелого металла кластерные комплексы рения оказываются безусловными лидерами среди всех контрастных веществ, которые применяются в настоящее время, поскольку в их состав входит 6 ковалентно связанных атомов тяжелого металла (Re). Тогда как йогексол (коммерческий рентгеноконтрастный препарат на основе трийодбензола, который широко применяется в сердечно-сосудистой хирургии и функциональной диагностике) содержит всего лишь 3 атома йода, отвечающие за рентгеноконтрастные свойства. Можно предположить, что при равной концентрации тяжелого элемента препарат на основе кластерного комплекса будет значительно превосходить йодные аналоги по качеству контрастного изображения, что позволит снизить концентрацию тяжелого элемента в препарате и приведет к уменьшению частоты побочных эффектов при применении рентгеноконтрастных соединений.
В современной ортопедической практике активно используют биодеградируемые полимеры благодаря их гипоаллергентности и биосовместимости, а также возможности изменять их физические свойства [Doppalapudi et al., 2014; Gavasane, Pawar, 2014]. Недостатком, затрудняющим работу с этими полимерами, является невозможность отследить процесс деградации имплантата, поскольку с помощью рентгена полимеры не выявляются. Решением этой проблемы может стать добавление в состав полимера рентгеноконтрастных соединений. Для этой цели подходят кластерные комплексы рения, поскольку они обладают высокой рентгеноконтрастностью и лабильностью лигандного окружения, что может обеспечить их связывание с полимерной матрицей имплантата.
Октаэдрические кластерные комплексы рения проявляют яркую долгоживущую люминесценцию в области от ~500 до ~1000 нм. Соединения, проявляющие фотолюминесценцию именно в данном диапазоне длин волн, очень привлекательны для использования в биоимиджинге, поскольку в этой области наблюдается минимум абсорбции и низкая интенсивность автофлуоресценции биологических тканей [Day,
Davidson, 2009; Wu et al., 2015]. Люминесцентные свойства кластерных комплексов рения определяют возможность их использования в качестве биомаркера в фундаментальных и прикладных исследованиях на культурах клеток с использованием конфокальной микроскопии. Люминесцентные свойства кластерных комплексов могут быть также использованы для диагностики опухолей, а также для визуализации их регрессии во время лечения [Echeverra et al., 2012].
Еще одной областью применения кластерных комплексов рения может стать противоопухолевая фотодинамическая терапия, поскольку кластерные комплексы рения способны генерировать синглетный кислород под действием УФ-излучения [Brylev et al., 2009; Kirakci et al., 2013; Shestopalov et al., 2007; Shestopalov et al., 2014].
Благодаря своим рентгеноконтрастным, люминесцентным свойствам, а также способности генерировать синглетный кислород октаэдрические кластерные комплексы рения могут найти применение в таких активно развивающихся и высокотехнологичных областях медицины, как лучевая диагностика, фотодинамическая терапия, ортопедия и травматология, а также в области фундаментальных биологических исследований [Sokolov et al. 2011; Kirakci et al 2012; Gandubert et al. 2013; Cordier et al. 2014; Ledneva et al. 2014]. Однако, в настоящее время практически не изучено их влияние на живые организмы. Таким образом, исследование влияния кластерных комплексов рения на клетки в культуре и на организм животных in vivo, сравнение степени их безопасности и рентгеноконтрастных свойств является важной и актуальной задачей.
Степень разработанности темы исследования
Несмотря на то, что химические и физические свойства октаэдрических кластерных комплексов рения достаточно хорошо изучены, на момент планирования диссертационного исследования было опубликовано всего две работы, посвященные изучению влияния кластерных комплексов рения на клетки в культуре [Choi et al. 2008; Echeverrґa et al. 2012], а публикации, описывающие влияние комплексов на живые организмы in vivo, отсутствовали. Не было известно, влияет ли характер внутреннего лиганда на биологические эффекты кластерных комплексов, и не было проведено сравнения рентгеноконтрастных свойств комплексов как между собой, так и с используемыми в настоящее время в клинической практике сосудистыми рентгеноконтрастными препаратами. В связи с этим были сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования
Изучить рентгеноконтрастные свойства октаэдрических халькоцианидных кластерных комплексов рения и выбрать наиболее эффективное и безопасное соединение для разработки на его основе диагностических люминесцентных и рентгеноконтрастных препаратов.
Задачи исследования
1. Сравнить рентгеновскую контрастность октаэдрических кластерных
комплексов рения с различными внутренними лигандами (S, Se, Te) между собой и с коммерческим рентгеноконтрастным препаратом на основе трийодбензола;
-
Сравнить при помощи МТТ-теста цитотоксичность соединений Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6], Na4[{Re6Te8}(CN)6] на культурах опухолевых (Hep-2) и диплоидных (MRC-5) клеток человека in vitro;
-
На культуре клеток Hep-2 оценить способность данных кластерных комплексов рения проникать внутрь клеток in vitro и установить их внутриклеточную локализацию;
-
Определить полулетальную дозу (ЛД50) и исследовать острую токсичность in vivo при внутривенном введении наиболее рентгеноконтрастного и безопасного для клеток в культуре кластерного комплекса;
5. Оценить возможность использования октаэдрических кластерных комплексов
рения в качестве сосудистого рентгеноконтрастного препарата.
Научная новизна
Впервые при сравнительном изучении октаэдрических кластерных комплексов
рения обнаружено, что по уровню рентгеновской контрастности данные соединения в
несколько раз превосходят коммерческий рентгеноконтрастный препарат на основе
трийодбензола. При исследовании цитотоксичности халькоцианидных комплексов рения
(Na4[{Re6S8}(CN)6], Na4[{Re6Se8}(CN)6] и Na4[{Re6Te8}(CN)6]) с помощью МТТ-теста и
оценке их способности проникать внутрь клеток in vitro показано, что комплекс
Na4[{Re6Te8}(CN)6] наиболее перспективен для биомедицинского применения. Для
данного соединения была определена полулетальная доза и исследована острая
токсичность на мышах линии Balb/C. Показана высокая степень безопасности при
однократном внутривенном введении в дозах до 300 мг(Re)/кг. При проведении
ангиографии с использованием Na4[{Re6Te8}(CN)6] в качестве сосудистого
рентгеноконтрастного препарата получены высоко контрастные снимки, на которых хорошо визуализируются сосуды животного. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о перспективности использования октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве основы для разработки новых диагностических препаратов.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования получены новые фундаментальные
знания о влиянии характера внутреннего лиганда на уровень безопасности
октаэдрических кластерных комплексов рения и степень их рентгеноконтрастности.
Выявлено, что кластерный комплекс на основе кластерного ядра {Re6Te8} не только
наиболее рентгеноконтрастен, но и наиболее безопасен для клеток в культуре. Все три
исследованных соединения рения способны проникать в клетки in vitro и диффузно
распределяться по цитоплазме клеток. При исследовании острой токсичности комплекса
Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo показна высокая степень безопасности для животных при
внутривенном введении в дозах до 300 мг(Re)/кг, что делает данный комплекс наиболее
перспективным для дальнейшей разработки на его основе препаратов для
фотодинамической терапии, рентгеноконтрастных добавок в биодеградируемые
имплантаты, контрастирующих реагентов для просвечивающей электронной
микроскопии, а также биомаркеров.
Методология и методы исследования
В соответствии с поставленными задачами были выбраны современные
высокоинформативные методические подходы. Диссертационная работа представляет
собой экспериментальное исследование, выполненное на двух культурах клеток (Hep-2 и
MRC-5) и 82 животных (мышах линии Balb/C и самцах крыс породы Wistar). Для
сравнения рентгеноконтрастных свойств кластерных комплексов использовали
компьютерный томограф Brivo CT325 (GE Healthcare, Великобритания) и рентгеновский
аппарат типа С-дуга GE 9800-Cardio (General Electric, США). Клеточные линии были
получены из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», цитотоксичность исследовали при
помощи МТТ-теста, значение оптической плотности измеряли при помощи
микропланшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Scientific, США). Исследование
способности комплексов проникать в клетки в культуре проводили при помощи
лазерного сканирующего конфокального флуоресцентного микроскопа Zeiss LSM 510
(Zeiss, Германия) и просвечивающего электронного микроскопа Libra 120 (Zeiss,
Германия). Расчет значения ЛД50 в остром эксперименте in vivo при внутривенном
введении проводили при помощи пакета MS Excel. Биохимический анализ крови
осуществляли при помощи автоматического биохимического анализатора AU 480
(Becman Coulter, США), общий анализ крови – при помощи автоматического
гемоанализатора XT-4000i (Sysmex, Япония). Гистологические препараты исследовали с
использованием оптического микроскопа AxioStar plus (Zeiss, Германия).
Культивирование клеток и пробоподготовку клеточных культур и образцов внутренних органов животных для микроскопических исследований проводили по стандартным методикам. Полученные результаты были обработаны статистически при помощи пакета программ Statistica 10 Enterprise (StatSoft).
Положения, выносимые на защиту
1. Уровень рентгеновской контрастности халькоцианидных октаэдрических
кластерных комплексов рения превосходит рентгеноконтрастность коммерческого
органического йодсодержащего препарата при сравнении в равных молярных
концентрациях;
2. Наиболее безопасным комплексом для клеток in vitro является
Na4[{Re6Te8}(CN)6];
3. Все три исследуемых кластерных комплекса способны проникать в клетки in
vitro и диффузно распределяться в цитоплазме;
4. Показана высокая степень безопасности внутривенного введения различных доз
Na4[{Re6Te8}(CN)6] in vivo;
5. Внутривенное введение октаэдрического кластерного комплекса рения
Na4[{Re6Te8}(CN)6] позволяет получить четкие изображения сосудистого русла
экспериментального животного при ангиографическом исследовании.
Степень достоверности и апробация результатов диссертации
Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала и использованием современных
методов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены экспериментальным материалом, анализом литературы, точностью статистической обработки полученных результатов.
Материалы диссертации были представлены на 2-м международном форуме «Инновации в медицине: основные проблемы и пути их решения. Высокотехнологичная медицина как элемент инновационной экономики» (Новосибирск, 2013), на 51-й и 53-й международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2013 и 2015), на международной научно-практической конференции «Наука в современном информационном обществе» (Москва, 2013), на школе-конференции молодых ученых "Неорганические соединения и функциональные материалы", посвященная памяти профессора С.В. Земского (Новосибирск, 2013), на 4-м международном семинаре по кластерам переходных металлов (IWTMC–IV) (Новосибирск, 2014), на 8-м международном симпозиуме по технецию и рению (Ла Боль, Франция, 2014), на 24-й международной Чугаевской конференции по координационной химии (Казань, 2014), на 16-м международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке: Достижения и перспективы современной российской и мировой науки» (Москва, 2014), на 18-ой международной медико-биологической конференции молодых исследователей, посвященная двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ (Санкт-Петербург, 2015), на 9-й международной конференции молодых ученых по химии «Менделеев 2015» (Санкт-Петербург, 2015), на 2-й международной конференции по современному применению нанотехнологий (Минск, Беларусь, 2015), на городской научно-практической конференции «Успешные проекты молодых ученых для города Новосибирска» (Новосибирск, 2015), на русско-корейской конференции по медицинской химии (МедХем-2015) (Новосибирск, 2015), на 45-м всемирном химическом конгрессе (IUPAC-2015) (Пусан, Республика Корея, 2015), на XII международной конференции, посвященной 25-летию Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии «Лимфология: от фундаментальных исследований к медицинским технологиям» (Новосибирск, 2016), на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук» (Томск, 2016), на Международном семинаре «CLUSPOM-Алтай» по кластерам металлов и полиоксометаллатам (Алтайский край, 2016), на Международной конференции CLUSPOM-1 (Рейн, Франция), на 42-ой Международной конференции по координационной химии (Брест, Франция, 2016) и на V молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии (Санкт-Петербург, 2016).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 2 статьи в международных изданиях, включенных в систему цитирования Web of Science, 1 статья в рецензируемом журнале из перечня ВАК Минобрнауки России, рекомендованном для публикации основных результатов кандидатских и докторских диссертаций, а также 30 тезисных работ в материалах региональных, всероссийских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения и заключения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в котором содержится 191 источник, из них 8 отечественных и 183 иностранных. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 32 рисунка.
Перспективы применения октаэдрических кластерных комплексов рения в качестве рентгеноконтрастных веществ (РКВ) для функциональной диагностики
Рентген был открыт в 1895 г. W.C. Roentgen и уже через несколько лет начал применяться в медицинской практике для визуализации плотных тканей организма [Glasser, 1995; McClennan, 2014]. В настоящее время рентгеновское излучение широко используется для диагностики заболеваний органов грудной клетки, опорно-двигательного аппарата, молочных желез и черепно-мозговой области [Huang, Schweitzer, 2014]. Чаще всего применяется во время скрининга на наличие туберкулеза, онкологических заболеваний и новообразований в легких пациента, так как дает достаточно точные диагностические данные [Piccazzo, Paparo, Garlaschi, 2014; Tanaka, 2016; Ye et al., 2015]. Кроме того, диагностика с использованием рентгеновского излучения широко применяются в ортопедии (визуализация вывихов, переломов, металлических имплантов) [Kloth et al., 2014; Yousefifard et al., 2016]. Принцип работы большинства рентгеновских установок (проекционные рентгенографы, флюорографы, аппараты для компьютерной томографии) заключается в фотографировании видимого изображения, которое образуется благодаря прохождению рентгеновских лучей сквозь тело пациента [Илясова и др., 2013]. Эти лучи поглощаются органами и тканями неравномерно в зависимости от плотности самой ткани. Поскольку мягкие ткани организма не поглощают рентгеновское излучение, невозможно провести исследование кровеносного русла, моче- и желчевыводящего тракта, органов женской половой системы без использования специальных рентгеноконтрастных веществ (РКВ), в состав которых входят атомы тяжелых металлов, такие как йод, висмут, барий, серебро и т.п. [Frenzel et al., 2015; Pomara et al., 2015; Yu, Watson, 1999].
Интересно, что уже в 1896 году В.М. Бехтерев предсказал открытие ангиографии. Выдающийся русский невролог заметил: «Раз стало известно, что некоторые растворы не пропускают лучи Рентгена, то сосуды мозга могут быть заполнены ими и сфотографированы in situ» [Витько Н.К. и др., 2012]. Однако использование РКВ в клинической практике началось гораздо позже. В 1923 г. Berberich и Hirsch сделали первую в истории прижизненную ангиограмму артерий и вен руки с помощью бромида стронция. В 1924 г. Brooks, используя йодистый натрий, впервые выполнил ангиограмму артерий нижней конечности, а в 1929 г. Renaldo dos Santos и коллеги провели первую прижизненную брюшную аортографию с помощью йодистого натрия. Вышеперечисленные исследования выполнялись с помощью солей тяжелых металлов и неорганических солей йода. Крайне высокая токсичность этих веществ ограничивала дальнейшее развитие ангиографии, ввиду большого числа осложнений [Chen, Rogalski, Anker, 2012].
Самое первое использование контрастного агента на основе бария для визуализации желудочно-кишечного тракта можно датировать 1910 годом [Chen, Rogalski, Anker, 2012]. В настоящее время в США, выполняется порядка 5 млн исследований ЖКТ в год с помощью недорогих препаратов BaSО4 [Callahan et al., 2016]. За последние 90 лет произошли существенные изменения их состава, что улучшило их переносимость и характеристики покрытия слизистой оболочки [Chatu et al., 2012; Cody, 2014; Wang et al., 2015].
Контрастная рентгенография применяется во многих областях медицины (Таблица 1). Данный метод позволяет оценить состояние внутреннего рельефа полых органов, распространённость свищевых ходов, выявить начальные стадии опухоли, заболевания сердечнососудистой системы, поражения паренхиматозных органов, желчекаменную болезнь, а также оценить функциональное состояние почек и проходимость маточных труб [Шимановский, 2009; Roos de, Higgins, 2014; Bosniak, 2012; Castillo, 2014; O Connor et al., 2013]. Рентгенологическое исследование с помощью РКВ позволяет уточнить форму внутренних органов, их положение, тонус, перистальтику, состояние рельефа слизистой оболочки.
Кроме того, в последние годы в мире происходит значительный рост количества рентгенохирургических вмешательств, большую часть из которых составляют операции на сердце и сосудах [Mikolich, 2012; Clinical applications of cardiac CT, 2013]. Для адекватной визуализации состояния сосудистого русла и проведения эндоваскулярных операций необходимо выполнение ангиографических исследований с введением РКВ [Versteylen et al., 2013]. В современных условиях рентгенохирургические вмешательства зачастую выполняются у пожилых пациентов с различными сопутствующими заболеваниями (сахарный диабет, артериальная гипертензия, сердечная недостаточность, заболевания почек и др.) [Витько и др., 2012; Davenport и др., 2013]. Эндоваскулярные операции становятся более сложными, многоэтапными и выполняются с применением значительного объема РКВ, что объясняет высокие требования к характеристикам и уровню безопасности данных препаратов.
Большой интерес представляет так называемая функциональная визуализация (исследование кровеносного русла при помощи специальных ангиографических установок), которая может значительно расширить наши представления о развитии патологии и биохимических процессах in situ [Albrecht et al., 2016; Chen, Rogalski, Anker, 2012; Ermacora et al., 2015; Feng et al., 2014].
При этом стоит отметить, что по некоторым оценкам в США уже тридцать лет назад проводилось порядка 300 млн диагностических процедур в год [Sunshine, Mabry, Bansal, 1991]. Даже при возрастающем количестве исследований при помощи МРТ и УЗ, 75-80% всех диагностических процедур выполняются при помощи рентгеновского излучения [Lell et al., 2015]. Эти данные свидетельствуют о большой востребованности различных классов РКВ, и именно этим можно объяснить огромное количество работ по разработке новых и улучшению существующих РКВ. Например, разрабатываются контрастные соединения, которые могут функционально связываться с антителами, аптамерами и другими молекулярными участками распознавания для нацеливания на молекулы, экспрессируемые на поверхности специфических клеток и тканей. Одной из важных целей данных исследований является разработка контрастного агента, «помечающего» опухоль [Caltagirone et al., 2015; Chen, Rogalski, Anker, 2012; Wang et al., 2015].
Используемые в настоящее время РКВ на основе йода и гадолиния характеризуются следующими необходимыми свойствами [Bussi, Morisetti, 2005]: не метаболизируются в организме, имеют высокую скорость выведения из организма, биологически инертны. Наличие указанных свойств позволяет вводить РКВ в сосудистое русло в очень высоких дозах, объемах и концентрациях, необходимых для диагностических процедур. Однако данные препараты обладают рядом недостатков. Например, препараты на основе йода не рекомендуется применять при заболеваниях щитовидной железы, печеночной и/или почечной недостаточности, сахарном диабете [Andreucci, Solomon, Tasanarong, 2014; Gleeson, Bulugahapitiya, 2004; Goldenberg, Matetzky, 2005; Lee et al., 2015; Leung, Braverman, 2012; Parfrey et al., 1989; Thomsen, Morcos, 2006]. При этом по статистике распространенность гипертиреоза в общей популяции составляет около 1,3% (но нужно заметить, что у женщин в 5 раз чаще, чем у мужчин), а у женщин старше 48 лет гипертиреоз встречается уже у 3–5% популяции. В то же время, по данным ВОЗ у людей старше 60 лет симптомы гипертиреоза развиваются уже у 15% населения.
В тех случаях, когда пациенту противопоказано применение РКВ на основе йода, чаще всего в качестве альтернативы применяют контрастные препараты на основе хелатных комплексов гадолиния [Mitsuba et al., 2012; Nakamura et al., 2016; Pradubpongsa et al., 2013]. Несмотря на то, что для применения данных агентов абсолютных противопоказаний не выявлено, эти препараты отличает высокая стоимость, а также менее четкое и контрастное изображение, чем получаемое с применением йодных РКВ [Swanberg et al., 2015; Thomsen, 2014]. Ухудшение качества изображения в некоторой степени объясняется достаточно низкой предельно допустимой дозой введения хелатных комплексов гадолиния, которая равна 0,3 ммоль/кг массы тела пациента (что приблизительно равно 47,2 мг/кг массы тела). Такая доза, в свою очередь, объясняется возможностью диссоциации хелатных комплексов с высвобождением и накоплением в тканях свободных ионов металла [Puttagunta, Gibby, Puttagunta, 1996]. Комплекс образован только одним атомом металла, что также приводит к сравнительно низкой рентгеноконтрастности (в случае современных йодных РКВ, например, большинство комплексов образовано тремя атомами йода, что приводит к большей итоговой концентрации контрастного элемента в препарате) [Racadio et al., 2013]. Кроме того, осмолярность ряда препаратов гадолиния более чем в 5 раз превышает осмолярность плазмы крови, что также является существенным недостатком [Laurent, Elst, Muller, 2006].
Исследование биологических эффектов металлокластерных комплексов in vitro и in vivo
Несмотря на то, что октаэдрические кластерные комплексы рения имеют множество разнообразных потенциальных областей применения в биологии и медицине, до сих пор практически не изучены их биологические эффекты. Возможное практическое применение этих комплексов зависит от результатов детального исследования их цитотоксичности, возможности проникновения в клетку, внутриклеточной локализации in vitro, а также исследования их острой и хронической токсичности in vivo.
На данный момент существует лишь небольшое число исследований, посвященных воздействию кластерных комплексов рения на клетки in vitro. Первое исследование, посвященное изучению биологических эффектов октаэдрических кластерных комплексов рения, было опубликовано в 2008 году [Choi et al., 2008]. В проведенной работе авторы оценивали цитотоксичность и пути проникновения в клетки культуры аденокарциномы шейки матки человека (HeLa) соединений состава K4[{Re6S8}(OH)6] 8H2O (1) и K4[{Re6Se8}(OH)6] 8H2O (2). Было показано, что комплекс (1) не проникает в клетку, в то время как комплекс (2) проникает путем энергозависимого эндоцитоза. При этом конъюгация комплекса (1) с амфифильным сополимером MPEG550-CH2CONH– GlyPheLeuGlyPheLeu–COO– позволяет соединению проникать в клетки. Исследование цитотоксичности при помощи МТТ-теста показало, что все исследуемые соединения не проявляют выраженного воздействия на метаболизм клеток в концентрации до 50мкМ [Choi et al., 2008].
Как уже упоминалось выше, при исследовании кластерного комплекса [Re6Se8I6]3– in vitro было показано, что цитотоксичность была высокой для опухолегенной клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы Hep G2 и низкой для нормальных клеток эндотелия пупочной вены человека HUVEC [Echeverra et al., 2012]. В продолжение своей работы авторы опубликовали исследование влияния данного комплекса на морфологию эритроцитов человека in vitro [Rojas-Mancilla et al., 2015]. Полученные результаты показывают, что кластерный комплекс [Re6Se8I6]3– не оказывает гемолитического действия и только в высоких дозах вызывает морфологические изменения эритроцитов, которые можно предотвратить путем коинкубации клеток с альбумином. Исходя из полученных результатов, авторы делают вывод о том, что комплекс [Re6Se8I6]3– можно в терапевтических дозах вводить животным внутривенно для исследований in vivo. При исследовании цитотоксического эффекта кластерных комплексов K4[{Re6(3-S)8}(BTA)6]3.5EtOH4H2O и K2.75H1.25[{Re6(3 Se)8}(BTA)6]3EtOH7H2O (BTA – бензотриазолат ион) на культуре клеток аденокарциномы гортани человека Hep-2 было выявлено, что ИК50 для этих комплексов равны 123,7 ± 0,8 и 122,6 ± 2,1 M, соответственно. При этом в концентрациях до 50 M не наблюдается влияния растворов комплексов на жизнеспособность клеток в культуре. Кроме того, было показано, что исследуемые комплексы проникают внутрь клеток и локализуются в цитоплазме [Shestopalov et al., 2014].
Еще более немногочисленные данные касаются токсичности кластерных комплексов рения in vivo. Например, было проведено исследование калиевой соли тиоцианидного комплекса состава K4[Re6S8(CN)6] [Брылев и др. 2013]. Было показано, что данный кластерный комплекс накапливается в печени, почках и селезенке крыс, и полулетальная доза (ЛД50) для данного соединения при внутрибрюшинном введении составляет 380 мг/кг.
Анализ опубликованных работ показывает, что, во-первых, интерес к изучению биологических эффектов кластерных комплексов рения у исследователей возник совсем недавно. Во-вторых, в настоящее время в исследовании этой области отсутствует системный подход, что пока не позволяет делать какие-либо обобщающие выводы. Исходя из этого, в данной работе была сделана попытка определить, влияет ли состав кластерного ядра на биологические эффекты кластерных комплексов in vitro и in vivo. В том случае, если такое влияние имеется, необходимо было выяснить на основе какого ядра {Re6S8}, {Re6Se8} или {Re6Te8} кластерные комплексы являются наиболее перспективными для медико-биологического применения.
Морфологический анализ печени
У животных из групп с введением наибольших доз препарата (500, 650 и 750 мг(Re)/кг), погибших в течение первых суток после введения, наблюдались значительные патологические изменения печени. Данные изменения отмечены во всех трех группах, степень их выраженности зависела от времени, прошедшего с момента инъекции до гибели животного. У погибших животных в печени наблюдались плазмо- и геморрагии как следствие разрушения стенок сосудов (Рисунок 3.14); очаги повышенного кровенаполнения крупных вен и синусоидных капилляров (Рисунок 3.15); диффузный некроз гепатоцитов, а также участки, в которых уцелевшие клетки находились в состоянии выраженной баллонной дистрофии (Рисунок 3.16). Балочно-радиарное строение долек было нарушено на фоне выраженных патологических изменений.
Однако у животных, выживших после введения препарата в течение двух недель эксперимента, выраженных патологических изменений по сравнению с мышами контрольной группы не выявлено. Во всех экспериментальных группах через 2 недели после введения раствора Na4[{Re6Te8}(CN)6] в печени мышей сохраняется четкое балочно-радиарное строение долек. Гепатоциты полигональной формы с зернистого вида цитоплазмой не имели признаков дистрофии. Отмечено нормальное состояние стенок сосудов и отсутствие инфильтрации тканей кровью. Кровенаполнение синусоидных капилляров, центральных вен и вен портальных трактов оставалась в пределах нормы (Рисунок 3.17).
В единичном случае у мыши из 3 группы (доза 150 мг(Re)/мл) в строме дольки по ходу синусоидных капилляров наблюдаются очаги полиморфноклеточной инфильтрации (лимфогистиоцитарная инфильтрация и сегментоядерные нейтрофильные лейкоциты) (Рисунок 3.18). Однако, поскольку подобные изменения не встречаются у мышей, получавших более высокие дозы препарата, это явление, скорее всего, связано с индивидуальными особенностями животного.
Морфологический анализ легких, мозга, селезенки и двенадцатиперстной кишки
Анализ гистологических срезов легких, селезенки, мозга и 12-перстной кишки не выявил изменений в структуре органов всех экспериментальных групп по сравнению с контролем.
На препаратах легких альвеолы имели нормальный вид, признаков эмфиземы не обнаружено. Стенки легочных сосудов были в нормальном состоянии, не обнаружено признаков дистонии или васкулита. Сосуды умеренно кровенаполнены. Состояние межальвеолярных перегородок, альвеол и бронхов в норме. Просветы альвеол и бронхов хорошо просматривались, заполненение экссудатом или отечной жидкостью не отмечено (Рисунок 3.25).
Селезенка также не имела признаков структурных изменений.
Кровенаполнение красной пульпы было равномерным и умеренным. Лимфатические фолликулы среднего размера не имели признаков атрофии, гиперплазии или делимфатизации. Стенки центральных артерий фолликулов не изменены (Рисунок 3.26).
У животных из всех исследуемых групп мягкая мозговая оболочка хорошо сохранена, признаков отека не выявлено, ее сосуды умеренно кровенаполнены. Вещество мозга имело нормальный вид, отсутствовали признаки отека и кровоизлияний. В структуре нейронов на светооптическом уровне изменений по сравнению с контролем не обнаружено (Рисунок 3.27).
Стенка двенадцатиперстной кишки представлена всеми слоями: слизистая оболочка с покровным эпителием, подслизистая основа, мышечная и серозная оболочка. Состояние всех оболочек было нормальным и не отличалось от животных контрольной группы. Отмечалось умеренное кровенаполнение сосудистого русла органа (Рисунок 3.28).
У двух погибших в первые сутки животных, которым вводилась доза 500 мг(Re)/кг и 650мг(Re)/кг, на срезах кишки были обнаружены Пейеровы бляшки (Рисунок 3.27). Поскольку данные лимфатические фолликулы сохранили нормальное строение, это еще раз доказывает, наряду с нормальным состоянием селезенки, что внутривенное введение высоких доз Na4[{Re6Te8}(CN)6] не оказывает влияния на иммунную систему экспериментальных животных.
Лимфатические фолликулы 12-перстной кишки животных, погибших в первые сутки после инъекции высоких доз Na4[{Re6Te8}(CN)6]. А) доза 500 мг(Re)/кг; Б) доза 650 мг(Re)/кг. Окраска Г.-Э.
Таким образом, результаты морфологического анализа показали, что внутривенное введение различных доз Na4[{Re6Te8}(CN)6] не оказывает существенного влияния на морфологию исследованных внутренних органов через 2 недели после инъекции. Однако после введения очень высоких доз препарата (500, 650 и 750 мг(Re)/кг) у животных, погибших в течение первых суток эксперимента, наблюдались серьезные патологические изменения в печени, повышенное кровенаполнение сосудов почек и появление мелких вакуолей в цитоплазме кардиомиоцитов.