Гиполипидемическое действие сесквитерпеновых лактонов при экспериментальной гиперлипидемии Кайдаш Ольга Александровна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1 Обзор литературы 10

1.1 Патогенез и экспериментальные модели дислипидемий 10

1.2. Растительные средства в терапии дислипидемий 17

2 Материалы и методы исследования 26

2.1 Характеристика объектов исследования 26

2.2 Экспериментальные животные и условия эксперимента 26

2.3 Экспериментальные модели гиперлипидемии 29

2.4 Определение содержания триглицеридов в сыворотке крови 32

2.5 Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови 32

2.6 Определение содержания жирных кислот в сыворотке крови 33

2.7 Определение содержания холестерина в липопротеинах низкой плотности в сыворотке крови 33

2.8 Определение содержания холестерина в липопротеинах высокой плотности в сыворотке крови 33

2.9. Определение содержания холестерина и триглицеридов в печени 34

2.10. Определение активности 3-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктазы 34

2.11. Оценка экспрессии генов, участвующих в метаболизме липидов 35

2.12. Модель определения времени опорожнения желудка 38

2.13. Статистическая обработка результатов 39

3. Результаты исследования 40

3.1. Гиполипидемическое действие гроссгемина и людартина при 40

3.2. Влияние гроссгемина и людартина на экспрессию генов, участвующих в метаболизме липидов 56

3.3. Влияние гроссгемина и людартина на активность ГМГ-КоА редуктазы в печени крыс при экспериментальной гиперлипидемии, 65

3.4. Влияние гроссгемина и людартина на степень опорожнения желудка 66

4. Обсуждение результатов 68

Заключение 80

Выводы 83

Список литературы

• Растительные средства в терапии дислипидемий
• Экспериментальные животные и условия эксперимента
• Определение содержания холестерина в липопротеинах высокой плотности в сыворотке крови
• Влияние гроссгемина и людартина на экспрессию генов, участвующих в метаболизме липидов

Введение к работе

Актуальность темы. В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в большинстве развитых стран [Heidenreich P. A., 2011]. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в 2012 г. от сердечно-сосудистых заболеваний умерли 17,5 млн. Из них 7,4 млн умерли от ишемической болезни сердца и 6,7 млн от мозгового инсульта [Reiner Z. et al., 2012]. Наряду с такими факторами риска, как курение, малоподвижный образ жизни, ожирение, сахарный диабет, метаболический синдром, одной из основных причин сердечно-сосудистых заболеваний является атеросклероз [Карпов Ю. А., 2016; Witztum J. L. et al., 2014]. Дислипи-демия, курение и артериальная гипертензия и их комбинации ответственны за более чем 75% случаев сердечно-сосудистых заболеваний, максимальный вклад в их прогрессирование вносит дислипидемия [Воробьева Е. Н. и соавт., 2014; Котюжинская С. Г., 2014]. Многочисленные международные исследования убедительно доказали, что смертность от сердечно-сосудистых заболеваний напрямую зависит от степени дислипидемии. Дислипидемии, вызывающие атеросклероз, диагностируют у 17% населения мира, что позволяет говорить об опасной неинфекционной эпидемии [Catapano A. L. et al., 2016].

Для коррекции дислипидемий применяют гиполипидемические средства с различным влиянием на метаболизм холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ). Основной спектр гиполипидемических средств представлен ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглутарил коэнзим А (ГМГ-КоА) редуктазы (статины), активаторами липопротеинлипазы (никотиновая кислота в больших дозах, фибраты), средствами, тормозящими всасывание ХС в кишечнике (эзетимиб). Терапевтическая эффективность этих средств доказана во многих экспериментальных и клинических исследованиях. Наиболее эффективными средствами являются статины [Карпов Ю. А., 2016; Fulcher J. et al., 2015].

Представляет интерес создание новых эффективных и малотоксичных гиполипидемических средств растительного происхождения. Сесквитерпено-вые лактоны, экстрагированные из растений Сибири и Казахстана, по химическому строению близки статинам, но в отличие от них не повреждают скелетные мышцы, не обладают гепатотоксичностью [Brahmkshatriya P. P., 2013]. При условии достаточной гиполипидемической активности они могут стать заменой статинов при их плохой переносимости или дополнить терапию статинами и другими лекарственными средствами для лечения атеросклероза.

Степень разработанности. Лактоны являются представителями класса терпеноидов. Терпеноиды оказывают гиполипидемическое влияние в экспери-

менте и клинике. Андрографолид и неоандрографолид уменьшают в крови содержание липопротеинов низкой плотности (ЛНП) при экспериментальной дислипидемии [Yang T. et al., 2013]. Экстракты, обогащенные терпеноидами, препятствуют нарушению обмена липидов и прогрессированию атеросклероза у больных [Asgaru S. et al., 2000; Wang M. Y., 2012].

Сесквитерпеновые лактоны цинаропикрин, арглабин, леукомизин, косту-нолид проявляют гиполипидемические свойства при различных моделях гипер-липидемии у животных и в клеточной культуре [Роднова Е. А. и соавт., 2013; Pitchai D., 2014; Abderrazak A. et al., 2015; Lin X., 2015; Tabata K. et al., 2015]. Гиполипидемическое влияние гроссгемина и людартина не изучалось. Установление таких эффектов у этих сесквитерпеновых лактонов позволит обосновать их включение в гиполипидемическую терапию.

Цель исследования. Изучить гиполипидемическое действие сесквитер-пеновых лактонов гроссгемина и людартина в сравнении с эффектами розува-статина, никотиновой кислоты и фенофибрата при моделях острой и хронической гиперлипидемии, установить механизмы влияния лактонов на метаболизм липидов.

Задачи исследования

1. Изучить влияние сесквитерпеновых лактонов гроссгемина и людартина в различных дозах на содержание ТГ, общего ХС, липопротеинов (ЛП) и жирных кислот (ЖК) при моделях острой гиперлипидемии.

2. Исследовать гиполипидемическое действие гроссгемина и людартина при модели хронической гиперлипидемии, вызванной длительным питанием кормом с высоким содержанием жиров и ХС.

3. Установить при модели хронической гиперлипидемии влияние гроссгемина и людартина на активность ключевого фермента синтеза ХС ГМГ-КоА ре-дуктазы и экспрессию генов, контролирующих синтез и активность рецепторов и ферментов метаболизма липидов в печени.

4. Изучить в эксперименте влияние гроссгемина и людартина на эвакуаторную функцию желудка.

5. Сравнить гиполипидемическое действие гроссгемина и людартина с влиянием референтных лекарственных средств – розувастатина, никотиновой кислоты и фенофибрата.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что сесквитерпеновые лактоны гроссгемин и людартин оказывают в эксперименте гиполипидемиче-ское действие. При моделях острой гиперлипидемии, вызванной введением этанола и тритона WR 1339, они эффективно снижают в сыворотке крови содержание ТГ, ЖК и общего ХС. Эти вещества обладают выраженным терапев-

тическим действием в дозе 10 мг/кг. При модели хронической гиперлипидемии, вызванной диетой с высоким содержанием животного жира (40% от калорийности), гроссгемин и людартин изменяют экспрессию генов.

Гроссгемин у животных, получавших пищу с высоким содержанием жира, повышает в печени экспрессию мРНК генов холестерин-7-гидроксилазы, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1, ГМГ-КоА редуктазы, рецептора ЛНП, уменьшает экспрессию мРНК гена ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы и ингибирует ГМГ-КоА редуктазу.

Людартин на фоне атерогенной диеты снижает в печени крыс экспрессию мРНК гена ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы, повышает экспрессию мРНК генов холестерин-7-гидроксилазы, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1, карнитин-пальмитоилтрансферазы 2, не влияет на активность ГМГ-КоА редук-тазы. Людартин также задерживает эвакуацию содержимого желудка, что может тормозить всасывание ТГ в тонком кишечнике.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены экспериментальные данные о гиполипидемической активности сесквитерпеновых лактонов гроссгемина и людартина. Гроссгемин и людартин не слабее известных гиполипидемических средств – розувастатина, никотиновой кислоты и фенофибрата улучшают метаболизм липидов – уменьшают количество атерогенных фракций липидов, тормозят их утилизацию в печени и всасывание в кишечнике. Гроссгемин и людартин перспективны в качестве потенциальных лекарственных средств для применения в комплексной терапии атеросклеротической дислипидемии. По материалам исследований получен патент № 255309 «Гиполипидемическое фитосредство».

Методология и методы исследования. В диссертации использованы современные высокоинформативные методологические подходы. Исследования выполняли в сертифицированных лабораториях фармацевтической технологии, биологических моделей и центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России. Эксперименты проводили на аутбред-ных белых крысах самцах с адекватными моделями гиперлипидемии, вызванными введением в желудок этанола (5 г/кг), тритона WR 1339 (200 мг/кг), оливкового масла (5 мл/кг) и атерогенной диетой. Эффекты сесквитерпеновых лак-тонов сравнивали с действием широко применяемых гиполипидемических средств с доказанной эффективностью и различными механизмами лечебного эффекта – розувастатина, никотиновой кислоты и фенофибрата. В диссертации применены методы биохимической фармакологии, рекомендованные для аналогичных исследований «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2013). Результаты обрабатывали с помощью

непараметрических критериев Манна-Уитни и Вилкоксона для независимых и зависимых выборок.

Основные положения, выносимые на защиту

6. Сесквитерпеновые лактоны гроссгемин и людартин не слабее никотиновой кислоты и фенофибрата при моделях острой гиперлипидемии уменьшают в печени содержание ТГ и общего ХС, в сыворотке крови – количество ТГ, ХС, ЖК, ЛНП.

7. Гроссгемин и людартин при экспериментальной хронической гиперлипиде-мии, вызванной атерогенной диетой, снижают в сыворотке крови содержание ТГ, ЖК, общего ХС, ХС-ЛНП, в печени – количество ТГ и ХС. Грос-сгемин ингибирует ГМГ-КоА редуктазу печени.

8. Гроссгемин и людартин при экспериментальной терапии хронической ги-перлипидемии повышают экспрессию генов холестерин-7-гидроксилазы, карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2 и тормозят экспрессию гена ацил-КоА: холестерин ацилтрансферазы.

9. Гиполипидемической действие гроссгемина и людартина обусловлено модификацией экспрессии генов, кодирующих ферменты и рецепторы, участвующие в метаболизме липидов. Гроссгемин ингибирует ГМГ-КоА редук-тазу печени, людартин замедляет эвакуацию содержимого желудка и уменьшает уровень ТГ в постпрандиальном периоде.

Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности результатов подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов биохимической фармакологии и адекватных критериев для статистической обработки результатов.

Материалы настоящего исследования докладывались и обсуждались на IV Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2014), международной научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития фитохимии» (Караганда, 2015), XXII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2015), международной научно-практической конференции «Современное общество, образование и наука» (Тамбов, 2015), конференциях сотрудников кафедры фармакологии Сибирского государственного медицинского университета.

Работа выполнена на основе НИР «Поиск перспективных источников ги-полипидемических средств на основе сесквитерпеновых лактонов и их производных» (договор на выполнение научно-исследовательских работ № 216 от 25.10.2012 г.) и «Поиск и изучение гиполипидемических средств на основе се-

сквитерпеновых лактонов, флавоноидов и их производных» (договор на выполнение научно-исследовательских работ № 77/99 от 19.05.2015 г.) между АО Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия» (г. Караганда, Казахстан) и ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 научных статьях и материалах конференций, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, определенных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Личное участие автора. Совместно с научным руководителем автор участвовала в разработке концепции научной работы, постановке цели и задач исследования. Экспериментальная часть работы (создание моделей гиперлипи-демии, введение лекарственных средств, проведение биохимических исследований), статистическая обработка и анализ данных выполнены лично автором.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками. Работа состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель содержит 215 источников литературы, из них 30 отечественных и 185 зарубежных публикаций.

Растительные средства в терапии дислипидемий

Несмотря на широкий арсенал лекарственных средств, используемых для лечения атеросклероза и его осложнений, проблема противоатеросклеротиче-ской терапии еще полностью не решена. В настоящее время к липидкорриги-рующим медикаментозным средствам относят ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины), фибраты, никотиновую кислоту и е производные, средства, уменьшающие всасывание ХС (эзетимиб), средства с другими механизмами действия (-3 полиненасыщенные ЖК, антиоксиданты) [31, 92].

На современном этапе развития медицины основным классом лекарственных средств для коррекции дислипидемии являются статины, имеющие существенную доказательную базу [89, 90]. По химической структуре статины относятся к лактонам [113]. Статины обладают высокой эффективностью, но не лишены побочных эффектов (миотоксичность, гепатотоксичность, нейротоксич-ность, нефротоксичность, гипергликемия) [12, 113, 189] и стоят дорого. Фибра-ты также оказывают побочное действие – вызывают гастроинтестинальные проблемы, нарушают обмен жирорастворимых витаминов. Фибраты абсолютно противопоказаны при недостаточной функции почек и печени, желчнокаменной болезни, беременности и лактации [166, 183]. Наиболее значительный побочный эффект никотиновой кислоты – развитие печеночной недостаточности. Относительными противопоказаниями к назначению никотиновой кислоты являются артериальная гипотензия, подагра, сахарный диабет 2-го типа [92, 160].

Принимая во внимание побочные эффекты и высокий ценовой диапазон гиполипидемических средств, существует необходимость поиска новых веществ этой группы с высокой эффективностью в сочетании с хорошей переносимостью и достаточно низкой стоимостью.

Перспективными источниками гиполипидемических средств являются вещества растительного происхождения. Они отличаются низкой токсичностью, комплексным влиянием на организм, доступностью и дешевизной [38]. Гипо-липидемическое и противоатеросклеротическое действие лекарственных растений определяется содержанием в них биологически активных веществ: флаво-ноидов, фосфолипидов, стероидных сапонинов, терпеноидов, витаминов, микроэлементов, аминокислот, гормоноподобных веществ и ферментов [54].

Водный экстракт лопуха большого, содержащий лигнановые гликозиды, при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете крыс уменьшает концентрацию ТГ, ХС, ХС-ЛНП и восстанавливает до нормы концентрацию ЛВП в крови [45, 93].

Нормализации липидного состава крови при различных моделях гипер-липидемии способствуют водный и спиртовой экстракты крапивы двудомной. При экспериментальном сахарном диабете у крыс экстракты снижали содержание ХС. У мышей, получавших диету с высоким содержанием ХС, экстракты крапивы уменьшали концентрацию ЛНП, но повышали количество ЛВП в сыворотке крови. Эти эффекты крапивы двудомной обусловлены активацией ядерных -рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом (PPAR) [188].

Метанольный экстракт, полученный из наземной части шандры обыкновенной, при модели острой гиперлипидемии, вызванной тритоном WR 1339, уменьшал содержание ТГ, ХС, ЛНП в сыворотке крови и ИА. Входящие в состав экстракта флавоноиды в экспериментах in vitro проявляли выраженные антиоксидантные свойства в реакции с дифенилпикрилгидразилом и ингибирова-ли перекисное окисление липидов [94].

При модели хронической гиперлипидемии у крыс, получавших пищу с высоким содержанием жира и ХС, водный экстракт плодов кордии вильчатой снижал в плазме уровень ХС, ЛНП, ЛОНП и ТГ и препятствовал накоплению жира в гепатоцитах, кардиомиоцитах и эпителии почечных канальцев. В печени животных с гиперлипидемией экстракт проявлял антиоксидантное действие: увеличивал активность глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, супероксиддисмутазы и каталазы, а также тормозил продукцию малонового диальдегида. Авторы предполагают, что плоды кордии вильчатой обладают гиполипидемичемическим, антиоксидантным и гепатопротективным действием вследствие содержания в своем составе суммы активных растительных компонентов: полифенолов, флавоноидов, слизи, алкалоидов, рутина, кверцетина, розмариновой кислоты [123].

Водно-этанольный экстракт корней сыти круглой, содержащий флаво-ноиды, способствует снижению уровня липидов в сыворотке крови экспериментальных животных и проявляет выраженную антиоксидантную активность [121]. В экспериментах на изолированных клетках 3Т3-L1 показана способность флавоноидов сыти круглой препятствовать накоплению ТГ на этапе дифферен-цировки клеток в адипоциты [133, 134].

Экстракт виноградных косточек на фоне однократного введения в желудок высокожировой эмульсии препятствовал росту уровня ТГ и ХС в сыворотке крови через 2–6 ч после моделирования гиперлипидемии. Это связано со способностью входящих в состав экстракта олигомерных процианидов ингибиро-вать панкреатическую липазу и холестеринэстеразу. Флавоноиды, входящие в состав экстракта виноградных косточек, препятствуют образованию мицелл ХС и связывают желчные кислоты, в результате чего нарушается всасывание липи-дов [36].

Экспериментальные животные и условия эксперимента

Этанол в дозе 5 мг/кг при однократном введении в желудок экспериментальным животным увеличивал в сыворотке крови уровень ТГ в 1,9 раза и ЖК в 3,2 раза по сравнению с показателями интактной группы. Это свидетельствует о развитии острой гиперлипидемии (табл. 4). Увеличение содержания ТГ в сыворотке крови при введении этанола обусловлено активацией липолиза в жировой ткани под влиянием адреналина и значительным повышением уровня ЖК. ЖК усиленно поглощаются гепатоцитами с помощью активированного этанолом транспортного связывающего белка и включаются в ЛОНП. В печени увеличивается экспрессия мРНК микросомального триглицерид-переносящего белка, необходимого для сборки ЛОНП [132]. Повышение в крови содержания ЖК также связано с замедленным их окислением на фоне избыточного образования восстановленных форм пиридиннуклеотидов (НАДН и НАДФН) в алкогольде-гидрогеназной реакции [152].

В сыворотке крови животных при введении этанола уровень ХС, ХС-ЛВП и ИА достоверно не изменялись, содержание атерогенных ХС-ЛНП возрастало в 1,7 раза (табл. 4). Повышение количества ХС-ЛНП обусловлено интенсивной секрецией печенью их предшественников – ЛОНП. В гомогенате печени экспериментальных животных при введении этанола увеличивалось содержание ХС и ТГ в 1,9–2,2 раза (табл. 4). ТГ и ХС накапливаются в печени в результате поглощения из крови циркулирующих ЛП, уменьшения окисления ЖК, повышения их биосинтеза и продукции ХС и его эфиров [152].

Влияние гроссгемина, людартина и никотиновой кислоты на содержание в сыворотке крови триглицеридов, жирных кислот, холестерина, холестерина липопротеинов низкой и высокой плотности и индекс атерогенности при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной однократным введением этанола (5 г/кг) (М + т)

Индекс атерогенности 0,99±0,11 1Д2І0Д71 0,94±0,05 0,67±0,08и 0,62±0,08u 1,01±0,05 0,62±0,08и 0,68±0,05u 0,81±0,2 Примечание. Различия достоверны при Р 0,05: по сравнению с показателем 1 – интактных животных, 2 – при введении этанола, 3 – при введении никотиновой кислоты. Приведены средние данные 6–8 определений. Гроссгемин и людартин в дозе 5 мг/кг при предварительном курсовом введении в течение 7 дней не снижали в сыворотке крови содержания ТГ, повышенного на фоне острой гиперлипидемии. Гроссгемин и людартин в дозах 10 и 20 мг/кг препятствовали увеличению количества ТГ в сыворотке крови на фоне интоксикации этанолом. Оно становилось меньше в 1,3–1,6 раза. Под влиянием гроссгемина уровень ТГ оставался в 1,4–1,5 раза выше нормы. Людартин нормализовал количество ТГ. Препарат сравнения никотиновая кислота в дозе 25 мг/кг также нормализовала уровень ТГ (табл. 4).

Уменьшение содержания ЖК в сыворотке крови лежит в основе гиполипи-демического эффекта никотиновой кислоты и обусловлено торможением липо-лиза в жировой ткани, синтеза ТГ и ЛОНП в печени [59, 168]. Уровень ЖК в сыворотке крови животных, получавших сесквитерпеновые лактоны в дозе 5 мг/кг и этанол, уменьшался в 1,8–1,9 раза, при введении лактонов в дозах 10–20 мг/кг – регистрировался таким же, как у интактных животных. На фоне введения никотиновой кислоты содержание ЖК становилось в 2,1–2,3 раза меньше, чем при введении этанола, оставаясь в 1,4 раза выше показателя нормы (табл. 4).

Содержание общего ХС в крови животных при введении гроссгемина и людартина в дозах 10 и 20 мг/кг на фоне гиперлипидемии снижалось в 1,2–1,3 раза, что сопоставимо с действием никотиновой кислоты. Людартин в дозе 5 мг/кг способствовал уменьшению количества общего ХС в 1,2 раза. Гроссгемин в этой же дозе не оказывал влияния на данный показатель. При курсовом введении на фоне острой гиперлипидемии сесквитерпеновых лактонов в дозах 5– 20 мг/кг и никотиновой кислоты содержание ХС-ЛВП в сыворотке крови достоверно не изменялось. Гроссгемин и людартин в дозе 5 мг/кг на фоне интоксикации этанолом не изменяли повышенный уровень ХС-ЛНП, в дозе 10 мг/кг уменьшали его в 1,2–1,3 раза, в дозе 20 мг/кг – в 1,4–1,6 раза (табл. 4).

Влияние гроссгемина, людартина и никотиновой кислоты на содержание триглицеридов и общего холестерина в печени крыс при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной однократным введением этанола

ТГ, мг/г печени 4,61±0,43 \Q,26±Q,A2l 7,56±0,37u 7,16±0,4612 6,92±0,4112 7,08±0,39и 5,83±0,36 -3 5,71±0,32 -3 6,71±0,39и

ХС, мг/г печени 1,87±0,08 3,63±0,25 3,47±0Д6 3,23±0Д4 ЗДІІ0Д41 3,25±0Д9 2,97±0Д7и 2,81±0,34и 2,96±0Д9 Примечание. Различия достоверны при Р 0,05: по сравнению с показателем 1 – интактных животных, 2 – при введении этанола, 3 – при введении никотиновой кислоты. Приведены средние данные 6–8 определений. Никотиновая кислота снижала содержание ХС-ЛНП в 1,3 раза. На фоне острой гиперлипидемии ИА уменьшался в 1,8–2 раза при предварительном введении сесквитерпеновых лактонов в дозах 10 и 20 мг/кг и не изменялся при применении фитопрепаратов в дозе 5 мг/кг (табл. 4).

При курсовом введении гроссгемина и людартина в дозе 5 мг/кг на фоне острой гиперлипидемии содержание ТГ в гомогенате печени уменьшалось в 1,4 раза. Лактоны в дозах 10–20 мг/кг тормозили накопление в клетках печени ТГ в большей степени. При их введении содержание ТГ становилось меньше в 1,4– 1,8 раза (табл. 5). При этом людартин в дозах 5, 10 и 20 мг/кг более выраженно, чем гроссгемин, снижал уровень ТГ.

Введение гроссгемина животным во всех исследуемых дозах не способствовало уменьшению уровня ХС в печени. Людартин был неэффективен в дозе 5 мг/кг, но в дозах 10 и 20 мг/кг уменьшал содержание ХС в 1,2–1,3 раза. Никотиновая кислота в дозе 25 мг/кг снижала уровень ТГ в 1,5 раза и ХС – в 1,2 раза (табл. 5).

Людартин в дозах 10 и 20 мг/кг при интоксикации этанолом оказывал выраженное гиполипидемическое действие, сопоставимое с эффектами никотиновой кислоты. Гроссгемин в этих же дозах проявлял менее выраженную гиполи-пидемическую активность, не уменьшал уровень ХС в печени экспериментальных животных. Исследуемые сесквитерпеновые лактоны в дозах 10 и 20 мг/кг в большей степени, чем никотиновая кислота, изменяли в сторону нормы количество ТГ, ЖК и ЛНП в сыворотке крови животных (табл. 4).

Определение содержания холестерина в липопротеинах высокой плотности в сыворотке крови

Фенофибрат повышал экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 в 8,5 раза и гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 - в 3,3 раза, их экспрессия составляла 6,1 ± 0,77 усл. ед. и 2,46 ± 0,26 усл. ед. соответственно (р 0,05).

Розувастатин менее выраженно, чем фенофибрат, в 3,2 раза, до 3,17 ± 0,37 усл. ед., увеличивал экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансфераза 1 и в 1,6 раза, до 1,61 ± 0,16 усл. ед., гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (табл. 11) (рис. 6, 7).

Таким образом, сесквитерпеновые лактоны гроссгемин и людартин оказывали гиполипидемическое действие не слабее препаратов сравнения розувастатина и фенофибрата при модели хронической гиперлипидемии, вызванной у крыс атерогенной диетой. Механизм терапевтического эффекта сесквитерпено-вых лактонов может быть обусловлен ингибированием редуктазы ГМГ-КоА в печени, так как, подобно розувастатину, они увеличивают экспрессию мРНК этого фермента.

Влияние гроссгемина, людартина, розувастатина и фенофиб-рата на экспрессию мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 2 (Cpt2) в печени крыс при атерогенной диете, М ± m Примечание: экспрессия мРНК гена Cpt2 выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери -актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК гена Cpt2 в контроле принята за единицу. Приведены средние данные 6-8 определений. - статистическая значимость по сравнению с контролем, р 0,05; - статистическая значимость по сравнению с атерогенной диетой, р 0,05; + - статистическая значимость по сравнению с розувастатином, р 0,05; - статистическая значимость по сравнению с фенофибратом, р 0,05. Судя по росту экспрессии генов, дополнительными механизмами гиполи пидемического действия гроссгемина и людартина являются активация холе стерин-7-гидроксилазы, что усиливает синтез желчных кислот из ХС и спо собствует его выведению преимущественно с желчью. Лактоны улучшают окисление ЖК в митохондриях, катализируемое карнитин пальмитоилтрансферазой 1 и 2. Уменьшение экспрессии гена ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы нарушает этерификацию ХС в его транспортную форму и, как следствие, препятствует сборке ЛП, содержащих апо В-100. 3.3 Влияние гроссгемина и людартина на активность ГМГ-КоА редуктазы в печени крыс при экспериментальной гиперлипидемии, вызванной атерогенной диетой

ГМГ-КоА редуктаза катализирует синтез мевалоновой кислоты – лимитирующую стадию метаболического пути биосинтеза ХС и других изопреноидов. Статины ловастатин и симвастатин содержат лактоновое кольцо, которое раскрывается с образованием оксикислоты, блокирующей активный центр редук-тазы ГМГ-КоА. Сесквитерпеновые лактоны также способны преобразовываться в соединения с оксикислотой. Поэтому было исследовано влияние гроссгемина и людартина на активность ГМГ-КоА редуктазы.

На фоне атерогенной диеты активность ГМГ-КоА редуктазы в микросомах печени возрастала в 1,6 раза, с 223,7 ± 7,9 до 356,9 ± 11,4 пмоль ГМГ-КоА/минмг белка (рис. 8).

Влияние гроссгемина, людартина и розувастатина на активность ГМГ-КоА редуктазы в микросомах печени крыс при атерогенной диете, М ± m Примечание: 1 – интактные животные, 2 – атерогенная диета, 3 – атерогенная диета + гроссгемин, 4 – атерогенная диета + людартин, 5 – атерогенная диета + розувастатин. Приведены средние данные 6–8 определений. – статистическая значимость по сравнению с контролем, р 0,05; # – статистическая значимость по сравнению с атерогенной диетой, р 0,05. При введении крысам гроссгемина в дозе 10 мг/кг активность ГМГ-КоА редуктазы в печени ингибировалась на 26%, до 263,6 ± 9,5 пмоль ГМГ-КоА/минмг белка (р 0,05). Людартин действовал слабее и уменьшал актив 66 ность фермента только на 8%, до 327,8 ± 10,1 пмоль ГМГ-КоА/минмг белка (р 0,05) (рис. 8).

Препарат сравнения розувастатин при введении крысам в течение 14 дней в дозе 10 мг/кг на фоне атерогенной диеты снижал активность ГМГ-КоА редук-тазы на 31%, до 245,8 ± 8,7 пмоль ГМГ-КоА/минмг белка (р 0,05).

Таким образом, гиполипидемическое действие гроссгемина на фоне атеро-генной диеты обусловлено ингибированием ГМГ-КоА редуктазы в гепатоци-тах. Гиполипидемическое действие людартина не связано с ингибированием активности данного фермента.

В результате эксперимента установлено, что сразу после однократного введения 1,5 мл раствора фенолового красного (100 мкг/мл) его содержание в желудке составляло 143,1 ± 7,7 мкг.

Через 15 мин после введения фенолового красного животным, не получавшим сесквитерпеновые лактоны или атропин, содержание красителя в же 67 лудке составляло 47,1 ± 1,7 мкг, степень опорожнения желудка – 67,8 ± 1,8%. (рис. 9). Гроссгемин в дозе 10 мг/кг не влиял, в дозе 50 мг/кг препятствовал эвакуации фенолового красного. Содержание красителя в желудке составляло 53,6 ± 10,4 мкг и 71,1 ± 5,10 мкг соответственно (рис. 9 А, Б). Степень опорожнения желудка уменьшалась до 63,4 ± 5,5% (10 мг/кг) и 50,0 ± 3,8 % (50 мг/кг).

Людартин нарушал эвакуаторную функцию желудка во всех исследуемых дозах. При введении людартина в дозе 10 мг/кг количество фенолового красного в желудке составляло 82,2 ± 5,9 мкг, степень опорожнения желудка уменьшалась до 41,4 ± 5,7%, после введения людартина в дозе 50 мг/кг эти показатели составляли 113,2 ±5 ,3 мкг и 19,8 ± 5,6%.

При предварительном подкожном введении атропина сульфата эвакуация фенолового красного из желудка значительно задерживалась. Количество красителя в желудке животных через 15 мин оставалось таким же, как сразу после введения и составляло 132,8 ± 7,6 мкг, поэтому степень опорожнения составляла 7,2 ± 1,3%) (р 0,05) (рис. 9). Низкая степень опорожнения желудка на фоне применения атропина сульфата связана с тем, что он, блокируя м3-холинорецепторы, расслабляет гладкие мышцы желудка и кишечника.

Таким образом, гиполипидемической действие гроссгемина обусловлено не влиянием на скорость опрожнения желудка и снижением уровня постпран-диальных ТГ, а связано со способностью лактона ингибировать активнось ГМГ-КоА редуктазы и уменьшать экспрессию генов, участвующих в метаболизме липидов. Напротив, людартин не ингибирует ГМГ-КоА редуктазу, при этом замедляет эвакуаторную функцию желудка и понижает уровень ТГ в постпрандиальном периоде.

Влияние гроссгемина и людартина на экспрессию генов, участвующих в метаболизме липидов

Перспективными для поиска новых гиполипидемических веществ являются растения, содержащие большое количество биологически активных компонентов. На сегодняшний день по данным Всемирной Организации Здравоохранения 80% населения мира используют лекарственные растения для терапии. Преимуществами лекарственных средств растительного происхождения являются эффективность, безопасность и доступность. Многие из них повышают биологическую активность синтетических соединений и могут использоваться в комплексной терапии [38, 53].

Эффективность растительных экстрактов и индивидуальных веществ, полученных из растений, доказана во многих исследованиях. Так, при модели острой гиперлипидемии, вызванной введением тритона WR 1339, сухой мета-нольный экстракт фикуса снижал в сыворотке крови уровень ТГ, ХС и ХС-ЛНП и повышал содержание ХС-ЛВП. Авторы предполагают, что гиполипидемиче-ский эффект фикуса связан с ингибированием биосинтеза ХС и повышением экскреции желчных кислот с калом [46]. Этанольный экстракт эклипты белой при этой же модели у хомяков проявлял гиполипидемическое действие, снижая содержание атерогенных фракций липидов в сыворотке крови [80]. Водный экстракт базилика душистого через 24 ч после введения на фоне острой гипер-липидемии, вызванной тритоном WR 1339, уменьшал в сыворотке крови содержание ХС, ТГ и ХС-ЛНП на 56–68%, но не изменял количество ХС-ЛВП. Терапевтический эффект экстракта базилика душистого превосходил действие фенофибрата [120]. При модели острой гиперлипидемии, вызванной этанолом, метанольный экстракт барбариса уменьшал содержание ТГ и ХС в сыворотке крови. При экспериментальной острой гиперлипидемии, вызванной однократным введением внутрь оливкового масла, экстракт барбариса препятствовал повышению содержания ТГ и всех фракций ХС в сыворотке крови. Этанольный экстракт, хлороформная фракция и водное извлечение сельдерея пахучего, в состав которых входят терпеноиды, алкалоиды, таннины, флавоноиды, при этой же модели острой гиперлипидемии проявляли дозозависимое гиполипидемиче-ской действие: снижали в сыворотке крови количество ТГ, ХС, ХС-ЛНП и значительно увеличивали содержание ХС-ЛВП [138].

При модели хронической гиперлипидемии метанольный экстракт моринги масличной уменьшал в сыворотке крови содержание ТГ, ХС, ЛНП, ЛОНП и повышал количество ЛВП. Экстракт моринги масличной также повышал экскрецию ХС с калом [122]. Экстракт расторопши пятнистой, содержащий сили-марин (смесь флавонолигнанов), оказывает гепатопротективное и антиокси-дантное действие, уменьшая содержание ХС в сыворотке крови за счет ингиби-рования его синтеза в печени [112, 202].

Основными действующими веществами корней и корневищ частухи восточной являются тритерпены. В эксперименте на мышах при хронической ги-перлипидемии лечение корнями частухи снижало содержание ХС в сыворотке крови и печени, количество циркулирующих в крови ТГ и повышало содержание ЛВП. Эти эффекты обусловлены ингибированием синтеза ХС в гепатоци-тах. У крыс при экспериментальной неалкогольной жировой болезни печени метанольный экстракт корней частухи препятствовал окислительному стрессу, уменьшал перекисное окисление липидов за счет повышения активности ферментов антирадикальной защиты и уменьшал содержание липидов в печени и сыворотке крови [124, 176]. Водный экстракт плодов боярышника с удаленными углеводами, оказывая гиполипидемическое действие, снижал уровень липи-дов за счет активации рецепторов PPAR. При модели хронической гиперлипи-демии, вызванной у крыс диетой с высоким содержанием жиров и ХС, экстракт плодов боярышника препятствовал развитию атеросклеротического поражения сосудов, уменьшал количество воспалительных цитокинов. Плоды боярышника богаты терпеновыми кислотами и полифенолами. Олеаноловая и урсоловая кислоты из группы терпенов в экспериментах на животных уменьшают содержание в плазме ЛОНП и ХС-ЛНП в результате ингибирования кишечной ацил-КоА: холестерин ацилтрансферазы [83, 84, 144]. Таким образом, лечебные свойства экстрактов растений обусловлены входящими в их состав сапонинами, алкалоидами, флавоноидами, терпиноидами, сесквитерпеновыми лактонами. Механизмы их гиполипидемического действия различны. Фитопрепараты препятствуют поступлению эндогенного ХС как ингибиторы липазы поджелудочной железы и холестеринтрансферазы, связывают желчные кислоты и стимулируют их выведение с калом, замедляют опорожнение желудка [36, 47]. Помимо этого, входящие в растения вещества ингибиру-ют ГМГ-КоА редуктазу, активируют рецепторы PPAR, увеличивают экспрессию генов, регулирующих окисление ЖК и катаболизм ХС [80, 188]. Они инги-бируют перекисное окисление липидов, активируют антиоксидантную систему глутатиона, уменьшают количество макрофагов [49, 94, 123].

Сесквитерпеновые лактоны растительного происхождения гроссгемин и людартин оказывали гиполипидемическое действие на моделях острой и хронической гиперлипидемии. При моделях острой гиперлипидемии гроссгемин и людартин дозозависимо снижали в сыворотке крови содержание ТГ, ЖК, ХС, ЛНП, ЛВП. При модели острой постпрандиальной гиперлипидемии, вызванной введением оливкового масла, гроссгемин, в отличие от людартина, не оказывал терапевтического эффекта. При модели хронической гиперлипидемии оба исследуемых лактона проявляли гиполипидемическое действие.

При исследовании экспрессии генов, участвующих в метаболизме липи-дов, гроссгемин значительно повышал экспрессию гена холестерин-7-гидроксилазы, что увеличивает синтез желчных кислот из ХС и выведение его с желчью (рис. 11).

Кроме того, гроссгемин повышал окисление длинноцепочечных ЖК (увеличивалась экспрессия мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2) и тормозил образование эфиров ХС (уменьшалась экспрессия гена ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы). Это нарушает сборку содержащих апо В-100 ЛП. Гроссгемин ингибирует ГМГ-КоА редуктазу, активированную на фоне атеро-генной диеты.

Влияние гроссгемина на экспрессию мРНК генов метаболизма липидов в печени крыс при атерогенной диете Примечание: - атерогенная диета; –- атерогенная диета + гроссгемин; экспрессия мРНК генов выражена в усл. ед. и нормализована по гену-рефери -актину (Actb) и контролю (стандартная диета). Относительная экспрессия мРНК генов в контроле принята за единицу. Приведены средние данные 6-8 определений. - статистическая значимость по сравнению с контролем, р 0,05; # - статистической значимости по сравнению с атерогенной диетой, р 0,05; Обозначение геновіЬЛг - ген рецептора ЛНП; Hmgcr - ген З-гидрокси-3-метилглутарил КоА редуктазы; Soatl - ген ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы; Сур7а1 - ген холесте-рин-7-гидроксилазы; Cptla - ген карнитин-пальмитоилтрансферазы 1; Cpt2 - ген карни-тин-пальмитоилтрансферазы 2.

Людартин на фоне атерогенной диеты в печени крыс стимулировал катаболизм ЖК в гепатоцитах (увеличивалась экспрессия мРНК гена карнитин-пальмитоилтрансферазы 1 и 2), а также повышал выведение ХС с желчью (увеличивалась экспрессия мРНК гена холестерин-7-гидроксилазы) (рис. 12). Снижение экспрессии гена ацилКоА: холестерин ацилтрансферазы при приеме людартина может приводить к уменьшению содержания эфиров ХС и секреции ЛОНП.

Людартин не оказывал влияния на активность ГМГ-КоА редуктазы, но проявлял терапевтическое действие при модели острой гиперлипидемии, индуцированной оливковым маслом. В последующем эксперименте нами было установлено, что людартин задерживал эвакуацию содержимого желудка, что препятствует развитию постпрандиальной гиперлипидемии.