Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 19
1.1. Роль тромбоцитов в развитии атеротромботических осложнений 19
1.2. Метаболизм клопидогрела, методы прогнозирования антиагрегантного
действия клопидогрела: генотипирование и фенотипирование 20
1.3. Высокая остаточная реактивность тромбоцитов: ассоциация с развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых событий 24
1.4. Негенетические факторы развития высокой остаточной реактивности тромбоцитов 31
1.5. Роль изменения активности изофермента CYP3А4 в вариабельности ответа на клопидогрел 33
1.6. Генетические факторы, ответственные за вариабельность ответа на клопидогрел: полиморфизм генов ABCB1 и CYP2C19 37
1.7. Этнические особенности распространенности клинически значимых полиморфизмов генов CYP2C19 и ABCB1 45
1.8. Интерпретация результатов фармакогенетического тестирования и рекомендации по тактике ведения пациентов 49
ГЛАВА 2. Материалы и методы 54
2.1. Характеристика больных включенных в клиническую часть исследования з
2.2. Характеристика здоровых добровольцев включенных в популяционную часть исследования 62
2.3. Методика измерение остаточной реактивности тромбоцитов оптической детекцией агглютинации тромбоцитов (прибор VerifyNow) 64
2.4. Определение полиморфизма rs4244285 гена CYP2C19 и 66
rs1045642 гена ABCB1 66
2.5. Методика определения метаболической активности изофермента CYP3A4 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 71
2.6. Статистическая обработка результатов 74
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 76
3.1. Оценка ассоциации носительства генотипов по CYP2C19 и ABCB1 с остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства 76
3.2. Изучение взаимосвязи между активностью изофермента CYP3A4 (оцененную по отношению концентрации кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче) и остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства 87
3.3. Изучение частоты носительства генотипов по CYP2C19 ассоциированных с высокой остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела в трех этнических группах, проживающих в Республике Дагестан (лакцы, аварцы и даргинцы), в сравнении с русскими Московского региона 92
3.4. Перспективы использования генотипирования и фенотипирования изоферментов цитохрома Р-450 для прогнозирования антиагрегантного действия клопидогрела 96
Заключение 99
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список сокращений и условных обозначений: 106
Список литературы
- Негенетические факторы развития высокой остаточной реактивности тромбоцитов
- Этнические особенности распространенности клинически значимых полиморфизмов генов CYP2C19 и ABCB1
- Методика измерение остаточной реактивности тромбоцитов оптической детекцией агглютинации тромбоцитов (прибор VerifyNow)
- Изучение взаимосвязи между активностью изофермента CYP3A4 (оцененную по отношению концентрации кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче) и остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
В настоящее время, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности населения во всем мире (Picker SM, 2013). В 2014 году в России от ССЗ скончалось 963440 человек, в том числе 509717 от осложнений ишемической болезни сердца (ИБС) (Росстат, 2014). В основе развития острого коронарного синдрома (ОКС), чаще всего, лежат разрыв или эрозия атеросклеротической бляшки, что сопровождается тромбообразованием и дистальной эмболизацией и окклюзией коронарной артерии (П. Либби, 2013). Тромбоциты, в свою очередь, играют ключевую роль в патогенезе атеротромбоза и развитии его клинических последствий: инфаркта миокарда (ИМ), инсульта и окклюзии периферических артерий (П. Либби, 2013; Eikelboom JW, 2012; Dav G, 2007).
Одной из основных проблем в эффективной профилактике
тромботических осложнений ИМ, является проблема вариабельности
фармакологического ответа на антиагрегантные препараты, и прежде всего, на
клопидогрел - антиагрегант из группы тиенопиридинов второго поколения,
блокирующий P2Y12-рецепторы тромбоцитов (Brunton LL, 2011; Gurbel PA,
2003). Распространенными причинами вариабельности фармакологического
ответа на клопидогрел являются индивидуальные различия в скорости
биотрансформации на уровне изоферментов цитохрома Р-450 (CYP2C19,
CYP3A4) и абсорбции из кишечника (ABCB1), влияющие на
фармакокинетические параметры и приводящие к изменениям
фармакодинамики и клинической эффективности (Кукес ВГ, 2008; Сычев ДА,
2007). Основную роль в двухступенчатой биотрансформации клопидогрела с
образованием активного метаболита - R-130964 играют изоферменты CYP2C19
(44,9% на первом и 20,6% на втором) и CYP3A4 (39,8% на втором) (Kazui M,
2010; Pereillo JM, 2002). Аллельные варианты гена CYP2C19 (кодирующего
одноименный изофермент цитохрома Р-450), ассоциированные с
вариабельностью ответа на клопидогрел, характеризуются выраженными межрасовыми и межэтническими различиями (CYP2C19*2 - до 30% европеоидной, 40% негроидной и 55% монголоидной расы (Desta Z, 2002)); CYP2C19*17 - до 5% монголоидной и до 25% европеоидной и негроидной расы (Li-Wan-Po A, 2010) и недостаточно изучены среди малых народов, компактно проживающих в различных многонациональных регионах. Важную роль в нарушении антиагрегантного эффекта клопидогрела может играть и
индивидуальная вариабельность активности этого изофермента CYP3А4, вследствие генетического полиморфизма и индукции или ингибирования активности изофермента эндо- и экзогенными субстратами, в том числе лекарственными препаратами (ЛС) (Lau WC, 2004, X. Luo X, 2009; Arrhen YM 2012; El Desoky ES, 2005; S. Micuda 2007).
Степень разработанности проблемы
На настоящий момент продолжается активное изучение роли генетических и негенетических маркеров в прогнозировании антиагрегантного действия клопидогрела. Так исследованиях ELEVATE-TIMI 56 и ADRIE было показано, что около до 30% случаев повышенной остаточной реактивности тромбоцитов не связано с носительством медленных аллелей гена CYP2C19 и требуется поиск дополнительных генотипических и фенотипических маркеров прогнозирования эффективности клопидогрела. Подобным дополнительным маркером может стать оценка активности изофермента CYP3A4, роль которого в реализации антиагрегантного действия клопидогрела недостаточно изучена (Lau WC, 2004; Miuda S, 2007).
Степень разработанности проблемы в России. Влияние полиморфизма
гена CYP2C19 (и в части исследований гена ABCB1) на агрегационную
активность тромбоцитов и клиническую эффективность клопидогрела
изучалась в нескольких российских исследованиях (Комаров А.Л., 2012;
Галявич А.С., 2012; Голухова Е.З., 2013; Мацкеплишвили С.Т., 2013; Кнауэр
Н.Ю., 2013; Мазуров А.В., 2014; Сумарокова А.Б., 2014, Меситсткая Д.Ф.,
2014), где были получены противоречивые результаты. Но вместе с тем, в ранее
проведенных в России исследованиях не изучалась взаимосвязь
метаболической активности изофермента СYP3A4 с остаточной реактивностью
тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом, перенесших
чрескожное коронарное вмешательство, а так же этнические особенности
частоты носительства аллельных вариантов, ассоциированных с
резистентностью, среди народов Республики Дагестан.
Цель исследования
Разработать подход к оптимизации фармакотерапии острого коронарного синдрома путем прогнозирования антиагрегантного действия клопидогрела на основе генотипирования (по CYP2C19 и трансмембранному АВС-переносчику лекарственных средств) и оценки активности изофермента CYP3A4.
Задачи исследования
-
Оценить ассоциацию между носительством генотипов по CYP2C19 и ABCB1 с остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом перенесших чрескожные коронарные вмешательства.
-
Изучить взаимосвязь между активностью изофермента CYP3A4 (оцененную по отношению концентрации кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче) и остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства.
-
Установить частоту носительства генотипов по CYP2C19 ассоциированных с высокой остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела в трех этнических группах, проживающих в Республике Дагестан (лакцы, аварцы и даргинцы) в сравнении с русскими Московского региона.
-
Оценить перспективы использования генотипирования и фенотипирования изоферментов цитохрома Р-450 для прогнозирования антиагрегантного действия клопидогрела
Научная новизна
-
Впервые изучена взаимосвязь активности изофермента СYP3A4, измеренную методом определения концентрации 6-бета-гидроксикортизола и эндогенного кортизола в утренней моче, с остаточной реактивностью тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожное коронарное вмешательство.
-
Впервые выявлена частота носительства различных аллельных вариантов генов CYP2C19 и ABCB1 среди здоровых добровольцев - представителей трех коренных этнических групп, проживающих в Республике Дагестан: лакцев, аварцев и даргинцев и сравнена с популяцией русских Московского региона.
-
Предложены перспективы разработки собственного комплексного алгоритма прогнозирования антиагрегантного действия блокаторов P2Y12-рецепторов с учетом генетических, демографических, этнических и клиническо-лабораторных особенностей пациента.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в исследовании результаты оценки взаимосвязи
метаболической активности изофермента СYP3A4, а так же полиморфизма генов CYP2C19 и ABCB1 с остаточной реактивностью тромбоцитов у больных с ОКС, перенесших ЧКВ, позволят повысить эффективность антиагрегантной терапии у данной категории больных, что приведет к снижению частоты повторных тромботических событий после инфаркта миокарда. Выявленные особенности распространенности клинически значимых полиморфизмов генов, кодирующих белки биотрансформации и транспортеров лекарственных средств, среди различных этнических групп Республики Дагестан будут полезны для оптимизации фармакотерапии социально значимых заболеваний в данном регионе и профилактики ятрогенных поражений внутренних органов, связанных с повышенной этнической чувствительностью к лекарственным препаратам. Результаты исследования могут быть использованы для оптимизации антиагрегантной терапии инфаркта миокарда кардиологических и кардиореанимационных отделениях стационаров, а так же в образовательном процессе в рамках программы подготовки специалистов по профилю клиническая фармакология, кардиология.
Положения, выносимые на защиту
-
Установлена ассоциация полиморфизма гена CYP2C19 в виде носительства аллельного варианта CYP2C19*2 с нарушением антиагрегантного ответа на клопидогрел у пациентов с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства, что позволяет использовать фармакогенетическое тестирование по CYP2C19 для прогнозирования эффективности клопидогрела с целью персонализации антитромбоцитарной терапии острого коронарного синдрома.
-
Доказано отсутствие ассоциации между носительством генотипов по ABCB1 и высокой остаточной реактивностью тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства, что подтверждает нецелесообразность использования данного генетического маркера для прогнозирования фармакодинамического ответа на клопидогрел с целью персонализации антиагрегантной терапии острого коронарного синдрома.
-
Доказано отсутствие взаимосвязи между активностью изофермента CYP3A4, оцененную по отношению концентрации 6-бета-гидроксикортизола к
кортизолу в моче, и антиагрегантным действием клопидогрела, у пациентов
с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные
вмешательства, что подтверждает нецелесообразность использования
данного фенотипического метода для прогнозирования антиагрегантного
действия клопидогрела с целью персонализации антиагрегантной терапии
острого коронарного синдрома.
4. Выявлены различия в частотах генотипов, ассоциированных с
резистентностью к клопидогрелу в этнических группах Республики Дагестан, что доказывает необходимость изучения межэтнических различий в частоте носительства данных генотипов для решения вопроса о приоритетности внедрения в клиническую практику фармакогенетического тестирования по CYP2C19 с целью оптимизации фармакотерапии острого коронарного синдрома в определенных этнических группах.
Внедрение в практику
Результаты диссертационного исследования, а именно:
фармакогенетическое тестирование для персонализации терапии
клопидогрелом внедрено в клинике ГБОУ ДПО РМАПО.
Личный вклад соискателя
Автору принадлежит ведущая роль на всех этапах исследования: анализ литературы, набор больных после оценки соответствия критериям включения/исключения, набор биоматериала и проведение генотипирования по CYP2C19 и ABCB1, набор биоматериала для фенотипирования по CYP3A4, статистическая обработка результатов, написание статей и всех глав диссертации.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов подтверждается тем, что результаты проведенного исследования получены на сертифицированном оборудовании, имеющем соответствующую правилам инструкции по эксплуатации приборов калибровку: 1) носительство полиморфных маркеров генов CYP2C19 и ABCB1 определялось с помощью приборов CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA, 2013) и Applied Biosystems StepOne (Life Technologies, USA, 2010); 2) измерение остаточной реактивности тромбоцитов проводилось с использованием портативного прикроватного агрегометра «VerifyNow» (Accumetrics, USA, 2013); 3) содержание 6-бета-гидроксикортизола и кортизола в утренней моче
определялось методом хромато-масс-спектрометрического анализа на
высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent G1978B Multimode
Sourse for 6410 Triple Quade LC/MS (Agilent Technologies, Inc., USA)).
Использованы современные методики сбора и обработки исходной
информации, подбора размеров групп с обоснованием выбора объекта
исследования. Методы исследования соответствуют целям и задачам
диссертационного исследования. Обработка полученных данных проведена
адекватными методами математической статистики. Научные положения,
выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, обоснованы достоверными результатами исследования. Достоверность подтверждается так же актом проверки первичного материала (от 16.02.2016 г.).
Результаты диссертационного исследования были представлены в виде устного доклада на: IX Национальном конгрессе терапевтов (12-14 ноября 2014г, Москва), VII Всероссийской конференции с международным участием по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (29-31 января 2015 г, Москва), 12-ом Конгрессе Европейского общества клинических фармакологов и терапевтов (12-th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (27-30 June 2015, Madrid, Spain)), Российском национальном конгрессе кардиологов 2015 (22-25 сентября 2015, Москва), VIII Всероссийском форуме «Вопросы неотложной кардиологии 2015» (25-27 ноября 2015, Москва).
Публикации по теме диссертации: опубликовано 9 полнотекстовых
статей в научных журналах, из них: 2 статьи в иностранных журналах (J
Pharmacogenomics Pharmacoproteomics 2014, Journal of Pharmacy and
Pharmacology 2014) 7 статей в рецензируемых научных изданиях,
рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве
образования и науки Российской Федерации.
Апробация состоялась на расширенном заседании Научно-
исследовательского центра ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России (протокол № 12 от «28» декабря 2015 г.)
Объем и структура диссертации
Негенетические факторы развития высокой остаточной реактивности тромбоцитов
Смертность от осложнений ИБС занимает ведущее место среди причин смертности населения Российской Федерации и составляет 509717 человек на 2014 год (Росстат, 2014). В основе развития ИМ, как одной из основных форм ИБС с фатальным осложнениями, лежит разрыв или эрозия атеросклеротической бляшки, что сопровождается тромбообразованием, дистальной эмболизацией и окклюзией коронарной артерии (Либби П, 2013). При этом, тромбоцитарное звено гемостаза играет ключевую роль в патогенезе атеротромбоза и развитии его осложнений: инфаркта миокарда (ИМ), ишемического инсульта и окклюзии периферических артерий (Ruggeri ZM, 2002; Dav G, 2007). Соответственно, адекватное подавление активности тромбоцитов занимает центральное место в профилактике тромботических осложнений атеросклеротического поражения сосудов (Eikelboom JW, 2012).
Золотым стандартом лечения больных ОКС (инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST, инфаркт миокарда без подъема сегмента ST, нестабильная стенокардия) независимо от стратегии вмешательства на первом этапе (медикаментозное ведение или чрескожное коронарное вмешательство ЧКВ) является двойная антитромбоцитарная терапия (ДАТ), включающая ацетилсалициловую кислоту и один из блокаторов P2Y12-рецептора (Roffi М, 2015; Steg PG, 2012; Hamm CW, 2011). В случае стабильной ИБС и непереносимости ацетилсалициловой кислоты предпочтение отдается монотерапии клопидогрелом (Montalescot G, 2013).
Развитие резистентности к антитромбоцитарным препаратам является одной из основных проблем при подборе рациональной антиагрегантной терапии (Gurbel PA, 2003). При этом, частота тромботических осложнений на фоне ДАТ в стандартных дозах у больных с ОКС может составлять от 1,3 до 6% в течение первого года (Wallentin L, 2009). Проблема развития резистентности к антиагрегантной терапии и ее осложнений имеет наибольшую актуальность при фармакотерапии клопидогрелом и причиной тому служат следующие факторы: низкая распространенность истиной «аспирин-резистентности, сомнительная связь результатов ЦОГ(циклооксигеназа)-специфичных методов агрегометрии с развитием сердечно-сосудистых событий (Capodanno D, 2011; Pettersen AА, 2012), более выраженное антиагрегантное действие нового поколения блокаторов P2Y12-рецепторов (тикагрелор, прасугрел) (Wallentin L, 2009). При этом, не смотря на вариабельность ответа на фармакотерапию и развитие резистентности почти у трети пациентов, клопидогрел остается наиболее часто применяемым блокатором P2Y12-рецепторов в мире (Clinton P, 2013), в связи с высокой стоимостью и большим риском геморрагических осложнений при назначении новых блокаторов P2Y12-рецепторов (Cannon CP, 2010, Wallentin L, 2009), а так же присутствием на фармацевтическом рынке недорогих воспроизведенных препаратов (дженериков) клопидогрела.
Клопидогрел - антиагрегант из группы тиенопиридинов второго поколения блокирующий P2Y12-рецепторы тромбоцитов. В результате этого развивается необратимое ингибирование связывания фибриногена с GP IIb/IIIa-рецепторами и снижение АДФ-зависимой агрегации тромбоцитов (Brunton LL, 2011). Однако, будучи пролекарством, для проявления антиагрегантного эффекта, ему требуется биоактивация в организме человека при участии ферментов системы цитохрома P450 (Brunton LL, 2011; Кукес ВГ, 2015; Белоусов ЮБ, 2014). После всасывания, до 85% клопидогрела превращается в неактивный метаболит - SR26334, под действием карбоксилэстеразы-1 (Kazui M, 2010) (Рисунок 1). А сам процесс всасывание клопидогрела регулируется кишечным транспортером – P-гликопротеином (Taubert D, 2006). Оставшиеся 15% препарата подвергаются двухступенчатой биоактивации с образованием 2-оксо-клопидогрела на первом, и активного метаболита – R-130964 на втором этапе (Kazui M, 2010; Pereillo JM, 2002). При этом, основную роль в образовании активного метаболита играет изофермент - CYP2C19 (44,9% на первом и 20,6% на втором), меньшее значение имеют: CYP2B6, CYP1A2, CYP3A4, CYP3A5 и CYP2C9 (Kazui M, 2010). Однако, на втором этапе существенную роль играет так же изофермент CYP3A4 (39,8%).
Таким образом, данные о метаболизме клопидогрела и участвующих в этом процессе ферментах, свидетельствуют о том, что изоферментам CYP2C19 и CYP3A4 отводится ведущая роль в образовании активного метаболита клопидогрела. Соответственно, изменение функциональной активности данных изоферментов, связанное с генетическим полиморфизмом, индукцией или ингибированием другими лекарственными препаратами, ксенобиотиками, а так же эндогенными субстратами может влиять на концентрацию активного метаболита в плазме крови, остаточную активность тромбоцитов и, конечном итоге, на клиническую эффективность антиагрегантной терапии (Mega JL, 2010).
Этнические особенности распространенности клинически значимых полиморфизмов генов CYP2C19 и ABCB1
Эти изменения приводят к образованию усеченного белка и, как следствие, неактивного фермента. У носителей CYP2C19 17 наблюдается замена нуклеотидного основания С на Т в 5-концевом участке, в результате чего образуется фермент с повышенной активностью. Наиболее распространенными и хорошо изученными однонуклеотидными полиморфизмами данного гена являются CYP2C19 2 (до 30% европеоидной, 40% негроидной и 55% монголоидной расы (Desta Z, 2002), CYP2C19 3 (до 5% монголоидной , 0,04% европеоидной и 0,4% негроидной расы (Xie HG, 200)), которые ассоциированы с продукцией изофермента с низкой каталитической активностью, и CYP2C19 17 (до 5% монголоидной и до 25% европеоидной и негроидной (Li-Wan-Po, 2010)), связанный с усилением экспрессии гена и образованием изофермента с высокой каталитической активностью (Beitelshees AL, 2011). Другие аллельные варианты (CYP2C19 4, 5, 6, 7, и 8) встречаются гораздо реже (менее 1% (Scott SA, 2013)), а их клиническое значение требует дополнительного изучения.
Влияние полиморфизма гена CYP2C19 как непосредственно на плазменную концентрацию активного метаболита клопидогрела и активность тромбоцитов, так и в целом на клиническую эффективность и безопасность фармакотерапии, была доказана в нескольких крупных исследованиях (Trenk D, 2008; Shuldiner AR, 2009; Sibbing D, 2009; Collet JP, 2009). В исследованиях JT Brand с соавт., и J Mega c соавт., была продемонстрирована ассоциация медленных аллельных вариантов гена CYP2C19 ( 2 и 3) с более низким уровнем плазменной концентрации активного метаболита клопидогрела и недостаточным подавлением активности тромбоцитов. При этом носительство по крайней мере одной медленной аллели CYP2C19 приводило к снижению концентрации активного метаболита на 32% и максимальной агрегации тромбоцитов на 9 % по сравнению с пациентами без данных аллей (Brand JT, 2007; Mega J, 2009). Начиная с 2009 года, накапливаются данные о влиянии медленных аллелей гена CYP2C19 ( 2 и 3) на клинические исходы у больных с ОКС и ЧКВ получающих клопидогрел. В исследовании TRITON TIMI 38 J. Mega c cоавт., с включением 1477 пациентов с ОКС, перенесших ЧКВ, пациенты с аллельным вариантом CYP2C19 2 имели в полтора раза выше риск сердечно-сосудистой смерти, ИМ и инсульта (ОШ=1,53, 95% ДИ:1,07–2,19) и в 3 раза выше риск тромбоза стента ОШ=3,09, 95% ДИ:1,19–8,0) по сравнению с пациентами не имеющими данный аллельный вариант. Аналогичные данные получены в исследовании JP Collet и соавт., где CYP2C19 2 оказался сильным независимым предиктором неблагоприятных сердечно-сосудистых событий (ОР = 4,04, 95% ДИ:1,81-9,02, р=0,0006). Наиболее выраженное влияние CYP2C19 2 оказывает на риск развития тромбоза стента (JP Collet (ОШ=6,02, 95% ДИ:1,81-20,04, р=0,0009), B Giusti (ОР = 5,79, 95% ДИ:1.04-39.01), D Sibbing (ОШ=3,81, 95% ДИ:1,45-10,02, р=0,006)). Данные многочисленных исследований подвержены и в нескольких мета-анализах. В мета-анализе Mega и соавт., с включением 9685 пациентов преимущественно перенесших ЧКВ (91% с ЧКВ из них 55% имели ОКС) продемонстрировано значительное повышение риска комбинированной конечной точки в виде сердечно-сосудистой смерти, инфаркта миокарда или инсульта у носителей одной (ОШ=1,55; 95% ДИ: 1,11-2,27; р=0,01) или двух (ОШ=1,76; 95% ДИ:1,24-2,50; р=0,002) аллелей CYP2C19 со сниженной функциональной активностью по сравнению с неносителями (Mega JL, 2010). Кроме того, отмечалось значительное повышение риска тромбоза стента у носителей, одной (ОШ=2,67; 95% ДИ 1,69-4,22; р 0,0001) или двух (ОШ = 3,97; 95% ДИ, 1.75-9.02; p=0,001) аллелей со сниженной функциональной активностью. В другом мета-анализе, с включением 42016 пациентов, Holmes M.V. с соавт. [20] пришли к выводу, что нет значимой связи между носительством функционально дефектных аллелей и генотипов CYP2C19 и неблагоприятными сердечно-сосудистыми событиями (ССС) у пациентов, принимающих клопидогрел. Однако, нужно отметить, что проведенный мета-анализ имеет некоторые ограничения. Во-первых, не проведена оценка гетерогенности популяции, что может привести к смещению полученных результатов. Во-вторых, мета-анализ включает в себя большое количество пациентов со стабильной ИБС и пациентов, которым не проводились ЧКВ.
Носительство аллельного варианта CYP2C19 17 приводит к усилению биотрансформации и повышению антиагрегантного действия клопидогрела, что потенциально может привести развитию кровотечений (Harmsze AM, 2012). Снижение риска ишемических осложнений и повышение риска кровотечения подтверждают результаты 2 независимых мета-анализов Li Y с соавт., и Zabalza M c соавт. (Li Y, 2012; Zabalza M, 2012). Тем не менее, клиническое значение CYP2C19 17,на сегодняшний день, остается спорным, и ряд исследований подтверждают отсутствие независимого влияния данного полиморфизма на метаболизм клопидогрела (Lewis JP, 2013). А усиление антиагрегантного действия клопидогрела при высокой частоте носительства CYP2C19 17, авторы связывают с, часто сопутствующим этому, отсутствием или уменьшением частоты носительства CYP2C19 2 (Lewis JP, 2013).
Влияние носительства полиморфизма rs1045642 гена ABCB1 на фармакологически ответ клопидогрела. Ген ABCB1, расположенный на хромосоме 7q21.12, кодирует эфлюксный транспортер лекарственных средств P-гликопротеин, который располагаясь на мембранах клеток кишечной стенки и гистогематических барьеров, выполняет защитную функцию (Brinkmann U, 2001). При этом концентрация препарата в клетках уменьшается путем активного выкачивания обратно в кровеносное русло и выделительную систему (Brinkmann U, 2001). Кроме того, с гиперэкспрессией данного транспортера связано развитие устойчивости злокачественных опухолей к химиотерапии (Longley DB, 2005). P-гликопротеин, принадлежащий к суперсемейству транспортеров ABC и подсемейству B (Sharom FJ, 2008) был впервые обнаружен в 1970 году Biedler др., при изучении явления множественной лекарственной устойчивости (Biedler JL, 1970). В предыдущих исследованиях, было описано влияние полиморфизма гена ABCB1, на экспрессию P-гликопротеина (Owen, 2005), и, соответственно, на эффектность и безопасность терапии большим количеством препаратов, являющихся субстратами P-гликопротеина (Aszalos A, 2007; Fromm MF, 2002; Marzolini C, 2004; Leschziner GD, 2007). Наиболее распространенными полиморфизмами гена ABCB1, связанными с нарушением ответа на ЛС, являются: rs1128503 (1236T C, Gly412Gly), rs2032582 (2677T G/A, Ser893Ala/Thr), и rs1045642 (3435T C, Ile1145Ile) (Wang D, 2005).
В исследованиях М Karaniewicz-ada и Spiewak M, продемонстрировано, что носительство аллельного варианта Т гена АВСВ1 может оказывать влияние на плазменную концентрацию и антиагрегантное действие клопидогрела (Spiewak M, 2009) за счет уменьшения абсорбции в кишечнике (Karaniewicz-ada M, 2014). Аналогичные данные получены в исследованиях других авторов (Taubert, 2006; Hoffmeyer, 2000). Связь между носительством аллельного варианта С3435Т гена ABCB1 и неблагоприятными клиническими исходами у пациентов, получающих клопидогрел была впервые описана T. Simon: у носителей генотипа ТТ отмечалась более высокая частота тромботических осложнений по сравнению с носителями генотипа CC (Simon T, 2009). В генетическом суб-анализе многоцентрового рандомизированного клинического исследования TRITOM TIMI 38, где изучалось влияние полиморфизма генов ABCB1 и CYP2C19 на эффективность клопидогрела среди 1471 пациентов с ОКС и ЧКВ было обнаружено, что генотип ТT значимо ассоциирован с повышением риска сердечнососудистой смерти, ИМ и ишемического инсульта (ОШ =172, 95% ДИ: 1,22–2,44, p=0,002). Однако, в ряде других исследований получены отрицательные результаты относительно влияния полиморфизма АВСВ1 на эффективность клопидогрела (Wallentin L, 2010 Braun OO, 2013).
Методика измерение остаточной реактивности тромбоцитов оптической детекцией агглютинации тромбоцитов (прибор VerifyNow)
В целом частота данного аллельного варианта среди аварцев (12,7%) и лакцев (14,5%) близка к частоте среди русских Московского региона (14 %) и к описываемой ранее частоте носительства среди европеоидного населения, но ниже чем среди монголоидного. Относительно низкую частоту аллельного варианта CYP2C19 2 среди даргинцев (5%) по сравнению с другими изучаемыми этническим группами можно объяснить не выявлением в текущем исследовании в данной этнической группе гомозиготных носителей, а так же небольшими размерами выборки. Различий в частоте выявления различных генотипов по ABCB1 С3435Т между лакцами, даргинцами и аварцами не обнаружено (Таблица 27). Частота носительства аллельного варианта Т среди данных этнических групп (63,05%, 63% и 53,3% соответственно) выше по сравнению с ранее описанной частотой среди европеоидного населения (Santos, 2011).
Таким образом, распространенность аллельного варианта CYP2C19 2 среди лакцев (12,7%) и аварцев (14,5%) близка к частоте среди русских Московского региона (14%) и соответствует средним показателям среди европеоидного населения (Меga, 2010). При этом частота среди трех этнических групп Дагестана близка к частоте, описанной среди других кавказских народов: чеченцы - 13%, ингуши – 8%, (Кантемирова, 2011) карачаевцы - 14%, черкесы – 19% (Ромадановский, 2010), Частота аллельного варианта Т гена АВСВ1 среди аварцев, даргинцев и лакцев (63,05%, 63% и 53,3% соответственно) выше по сравнению с частотой описываемой ранее среди европеоидного населения (Santos, 2011), и близка к частоте некоторых северных народов РФ (Игнатьев, 2005). Статистически значимые различия по частоте аллельного варианта Т гена АВСВ1 между исследуемыми группами не обнаружены.
Проблема прогнозирования антиагрегантного эффекта клопидогрела, с учетом генетического полиморфизма и каталитической активности изоферментов, клинических, лабораторных и демографических особенностей пациента сохраняет свою актуальность в настоящее время. Перспективным направлением решения данной проблемы является разработка комплексных алгоритмов с объединением результатов генотипирования, фенотипирования, индивидуальных особенностей пациента, что позволяет сделать шаг к более полной адаптации и персонализации антиагрегантной терапии по сравнению традиционной практикой изолированной оценки факторов нарушения фармакологического ответа на клопидогрел. В настоящее время идет активная разработка подобных алгоритмов прогнозирования и изучение возможности их применения у пациентов различных этнических групп и расовой принадлежности. Фактором, стимулирующим разработки различных алгоритмов прогнозирования антиагрегантного действия, является так же, набирающее все больше доказательств, концепция «терапевтического окна» для применения блокаторов P2Y12-рецепторов (Malhotra N, 2015). G. Miura и соавт., в 2014 году предложен алгоритм прогнозирования фармакодинамического действия клопидогрела, рассчитанный с применением информационного критерия Акаике выбора лучшей модели.
В исследование было включено 114 японских пациентов, перенесших стентирование и принимающие аспирин (100 мг / сут) и клопидогрел (50 мг или 75 мг / сут) более одного месяца. Формула при этом учитывает клинические, лабораторные и генетические данные пациента, показавшие наибольшее влияние на активность тромбоцитов. Не смотря на то, что в исследовании G. Miura получена корреляция между прогнозируемой по формуле и реальной активностью тромбоцитов (r=0,475), при проверке формулы прогнозирования антиагрегантной активности клопидогрела по данным пациентов, включенных в текущее диссертационное исследование, не выявлено значимой связи между рассчитанным и реальным PRU (r=0,0004; p=0,997). Данное обстоятельство, подтверждает существенную роль расово-этнической принадлежности прогнозировании антиагрегантного действия клопидогрела и необходимость адаптации подобных, а так же разработки новых алгоритмов с учетом многонационального состава населения Российской Федерации. При этом, в текущем диссертационном исследовании, выявление носительства CYP2C19 2 с чувствительностью 36,8 % и специфичностью 90,3% прогнозирует наличие ВОРТ на фоне применения клопидогрела у пациентов с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства: прогностическая ценность положительного результата (PPV) - 53,9%, прогностическая ценность отрицательного результата (NPV) - 82,4% (ОШ=5,4 95% ДИ:1,55-16,12; р=0,009). Алгоритм, разработанный Y.B. Saab позволяет непосредственно рассчитать наиболее оптимальную дозу клопидогрела, и учитывает кроме полиморфизма генов, ответственных за нарушение ответа на клопидогрел, еще и сопутствующую фармакотерапию (Saab YB, 2015).
Таким образом, учитывая этническое многообразие населения Российской Федерации, имеются определенные ограничения при экстраполяции результатов изучения и внедрения подобных алгоритмов, подобранных для представителей других рас и этнических групп, на население нашей страны. В связи с этим перспективным направлением является разработка и внедрение алгоритмов прогнозирования действия блокаторов P2Y12-рецепторов с учетом различных особенностей российских пациентов.
Изучение взаимосвязи между активностью изофермента CYP3A4 (оцененную по отношению концентрации кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче) и остаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела у пациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожные коронарные вмешательства
Актуальность проблем фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний обусловлена местом, занимаемом данной группой заболеваний в смертности населения всего мира. Развитие резистентности к антиагрегантной терапии может стать причиной фатальных тромботических осложнений у больных с инфарктом миокарда, инсультом, окклюзией периферических артерий.
В текущем диссертационном исследовании изучалась роль фенотипирования и генотипирования изоферментов системы цитохрома Р-450 в прогнозировании наиболее часто применяемого блокатора P2Y12-рецепторов клопидогрела. Для оценки генетического полиморфизма изоферментов цитохрома Р-450 применялась полимеразно-цепная реакция в реальном времени по генам CYP2C19 и ABCB1. Для изучения роли каталитической активности изоферментов применялось фармакокинетическое исследование: измерение высокоэффективной жидкостной хроматографией концентраций субстрата/метаболита изофермента CYP3A4. Фармакодинамический эффект клопидогрела и влияние различных факторов на него изучалось с использованием прикроватного агрегометра VeriFyNow. В результате логистического регрессионного анализа было выявлено значимое повышение риска развития ВОРТ у пациентов-носителей полиморфного маркера CYP2C19 2, а так же наблюдалась тенденция к повышению риска ВОРТ среди пациентов принимающих блокаторы медленных кальциевых каналов и имеющих различные виды нарушения ритма сердца. Носительство аллельного варианта, ответственного за сниженный метаболизм клопидогрела (CYP2C19 2) независимо повышало риск развития ВОРТ (ОШ=4,3; 95% ДИ: 1,3–17,6; р=0,022).
Статистически значимых различий в уровне остаточной активности тромбоцитов между генотипами СС, СТ и ТТ гена ABCB1 по результатам однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) не выявлено. По результатам линейного регрессионного анализа, достоверного влияния уровня 6-бета-гидроксикортизола, кортизола, а так же их соотношения на ВОРТ не обнаружено. При сравнении средний значений показателя 6-бета гидроксикортизол/кортизол в утренней моче (маркер активности CYP3A4) между пациентами с нормальной и повышенной остаточной реактивностью тромбоцитов не наблюдалось так же значимых различий: 3,4±2,8 в группе PRU 208 и 3,2±3,0 в группе PRU 208 (p=0,8). При корреляционном анализе, не выявлено статистически значимой корреляции между активностью тромбоцитов и отношением 6-бета-гидроксикортизол/кортизол (r=-0,231; р = 0,849).
Таким образом, по результатам исследования, статистически значимой ассоциации между активностью изофермента CYP3A4 и остаточной реактивностью тромбоцитов не обнаружено. Причиной этого может послужить определенные ограничения, характерные для методик оценки метаболической активности CYP3A4 приименном в нашем исследовании (Hu ZY, 2009) из-за значительной суточной вариабельности секреции и соответственно и уровня кортизола и его метаболитов в моче, а так же относительно небольшое число пациентов, включенных в исследование.
Распространенность аллельного варианта CYP2C19 2 среди лакцев (12,7%) и аварцев (14,5%) близка к частоте среди русских Московского региона (14%) и соответствует средним показателям среди европеоидного населения (Меga, 2010). При этом частота среди трех этнических групп Дагестана близка к частоте описанной среди других кавказских народов: чеченцы - 13%, ингуши – 8%, (Кантемирова, 2011) карачаевцы - 14%, черкесы – 19% (Ромадановский, 2010). Статистически значимые различия в частоте выявления различных генотипов по CYP2C19 G981A обнаружены только между даргинцами и русскими Московского региона (р=0,03). Относительно низкую частоту аллельного варианта CYP2C19 2 среди даргинцев (5%) по сравнению с другими изучаемыми этническими группами можно объяснить не выявлением в данной этнической группе гомозиготных носителей, а так же небольшими размерами выборки
Частота аллельного варианта Т гена АВСВ1 среди аварцев, даргинцев и лакцев (63,05, 63 и 53,3%) выше по сравнению с частотой описываемой ранее среди европеоидного населения (Santos, 2011), и близка к частоте некоторых северных народов РФ (Игнатьев, 2005). Статистически значимые различия по частоте аллельного варианта Т гена АВСВ1 между исследуемыми группами не обнаружены.
Полученные в диссертационном исследовании результаты будут полезны для повышения эффективности и безопасности антиагрегантной терапии у пациентов с острым коронарным синдромом, перенесших чрескожное коронарное вмешательство находящихся в кардиологических, рентгенхирургических, терапевтических отделениях стационаров. Особенности распространенности клинически значимых полиморфизмов генов, кодирующих белки биотрансформации и транспортеров лекарственных средств, среди различных этнических групп Республики Дагестан будут полезны для оптимизации фармакотерапии социально значимых заболеваний в данном регионе и профилактики ятрогенных поражений внутренних органов, связанных с повышенной этнической чувствительностью к лекарственным препаратам. Данные, полученные в клинической и популяционной части исследования, используются при подборе рациональной антиагрегантной терапии в Клинике Российской медицинской академии последипломного образования (РМАПО) Минздрава России, а так же в образовательном процессе на кафедре клинической фармакологии и терапии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России.
Перспективы дальнейшего изучения. Для более полной оценки роли цитохромов Р-450 необходимо провести проспективные исследования, где будет оцениваться не только фармакодинамика и фармакокинетика клопидогрела, но клинические исходы. Для дальнейшего изучения значения полиморфизма генов, кодирующих ферменты биотрансформации и транспортеры лекарственных средств среди этнических групп Дагестана, необходимо исследовать влияния носительства различных аллелей на эффективность терапии ЛС-субстратами данных ферментов.