Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Фармакогностические свойства, химический состав, фармакология, методы анализа основных действующих веществ, фитопрепараты топинамбура (обзор итературы) 14
1.1.Краткая фармакогностическая характеристика топинамбура 14
1.2. Химический состав топинамбура 15
1.3. Топинамбур как средство фитотерапии 18
1.4.Физико - химические свойства, методы анализа основных действующих веществ топинамбура
1.4.1. Анализ углеводов в лекарственном растительном сырье 20
1.4.1.1 Полисахариды 21
1.4.2. Анализ аминокислот в растительном лекарственном сырье и фитопрепаратах 24
1.4.3. Дубильные вещества и их анализ 25
1.4.4. Методы определения аскорбиновой кислоты 28
1.4.5. Определение сапонинов в сырье и фитопрепаратах
1.5. Способы получения инулина, пектина, биологически активных добавок и медицинских препаратов на основе травы и клубней топинамбура 32
1.6. Вспомогательные вещества, используемые для гранулирования сухих экстрактов 38
Выводы к главе 1 41
ГЛАВА. 2. Объект и методы исследования 42
2.1. Объекты исследования. 42
2.2. Методы исследования
2.2.1. Анализ аминокислотного состава 42
2.2.2. Анализ углеводного состава 43
2.2.3. Качественный и количественный анализ аскорбиновой кислоты .. 44
2.2.4. Определение сапонинов 45
2.2.5. Определение инулина и фруктозидов и фруктозанов 45
2.2.6. Дубильные вещества 51
2.2.7. Экстрактивные вещества з
2.2.8. Морфолого – анатомическое исследование 51
2.2.9. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Микроскопическое, фитохимическое исследование и разработка нормативной документации клубней топинамбура 52
3.1. Изучение анатомо-диагностических признаков клубней топинамбура 52
3.2. Фитохимическое исследование клубней топинамбура
3.2.1. Качественный состав и количественное содержание аминокислот в клубнях топинамбура 59
3.2.2. Определение качественного аминокислотного состава. 59
3.2.3. Определение содержание аминокислот в клубнях топинамбура с помощью аминокислотного анализатора 62
3.3. Исследование углеводов в клубнях топинамбура 64
3.3.1. Качественное определение углеводов методом ТСХ 64
3.3.2. Качественный и количественный анализ углеводов клубней топинамбура методом ВЭЖ 3.4. Количественное определение аскорбиновой кислоты в клубнях топинамбура 71
3.4.1. Определение аскорбиновой кислоты методом ВЭЖХ 72
3.5. Определение содержания дубильных веществ 76
3.6. Подбор условий и разработка методик определения сапонинов в клубнях топинамбура 3.6.1. Идентификация сапонинов в клубнях топинамбура 78
3.6.2. Разработка методики количественного определения сапонинов в клубнях топинамбура 79
3.7. Определение сумма полисахариды (фруктозанов и фруктозидов) в
клубнях топинамбура 84
3.7.1. Качественное определение инулина и фруктози 84
3.7.2. Количественное определение полисахариды (фруктозидов и фруктозанов) 87
3.8. Разработка нормативной документации на сухое сырье клубни
топинамбура 91
Выводы к главе 3 95
Глава 4. Получение и стандартизация гомеопатической матричной настойки из свежих клубней топинамбура 97
4.1. Разработка показателей качества и стандартизация свежих клубней топинамбура 97
4.2. Получение гомеопатической матричной настойки 103
Выводы к главе 4 109
Глава 5. Разработка технологии сухого экстракта из высушунных клубней топинамбура 110
5.1 Разработка технологии экстрагировании из клубней топинамбура...110
5.2. Разработка технологии экстракции клубней топинамбура водой очищенной 119
5.3. Технология получения извлечения из клубней топинамбура с помощью раствора спирта этилового 20 % как экстрагента 125
Выводы к главе 5 133
Глава 6. Разработка состава и технологии капсулирования сухого экстракта клубней топинамбура 134
6.1. Выбор вспомогательных веществ при гранулировании 135
6.2. Разработка технологии получения капсул с сухим экстрактом клубней топинамбура 145
6.3. Оценка качества твердых желатиновых капсул с гранулятом 146
6.4. Разработка методики определения показателя «Растворение» 148
6.5. Упаковка твердых желатиновых капсул 153
6.6. Изучение гипогликемического действия сухого экстракта клубней топинамбура при глюкозной нагрузке 153
Выводы к главе 156
Общие выводы 157
Список литературы 159
- Анализ углеводов в лекарственном растительном сырье
- Качественный и количественный анализ аскорбиновой кислоты
- Качественный состав и количественное содержание аминокислот в клубнях топинамбура
- Получение гомеопатической матричной настойки
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Перед фармацевтической наукой поставлена задача наиболее полного обеспечения населения эффективными лекарственными средствами, для чего необходимо совершенствовать существующие и создавать новые препараты, обладающие высокой фармацевтической активностью, малой токсичностью. Традиционно растения являются одним из основных источников получения лекарственных средств с такими преимуществами, как малая токсичность, низкая частота побочных эффектов, высокая эффективность, доступность и др.
Сахарный диабет среди эндокринных заболеваний имеет широкое распространение во всем мире, особенно в развитых странах. Несмотря на принятие в большинстве стран мира национальных программ по борьбе с сахарным диабетом, его распространённость и заболеваемость имеет тенденцию к неуклонному росту и продолжает увеличиваться не только среди населения старше 40 лет, но и среди подростков, лиц детского возраста. По данные исследования Музафарова М.Х. распространённость данного заболевания в Таджикистане среди взрослого населения составляет 0,1-0,69%, а с нарушенной толерантностью к глюкозе- 0,23-2,35%.
В народной медицине топинамбур издавна применяют при сахарном диабете, атеросклерозе, заболеваниях сердечно – сосудистой системы, желудочно – кишечного тракта. В последние годы из клубней топинамбура получают биологически активные добавки.
В Таджикистане в рамках проекта продовольственной безопасности
подготовленного FAO (Продовольственная и сельскохозяйственная
организация Объединенных Наций (ФАО) одним из рекомендованных в числе среди прочих, топинамбур рассматривается как стратегическое сырье для пищевой и фармацевтической промышленности.
К сожалению, лекарственных препаратов из клубней топинамбура до сего времени ни в Таджикистане, ни в России не создано.
Изложенное выше позволяет сделать заключение, что углубленное фитохимическое исследование данного вида растительного сырья и создание лечебно – профилактических средств на его основе является актуальной задачей.
Степень разработанности темы исследования. Несмотря на то, что о целебных свойствах клубней топинамбура известно много лет, из – за недостаточной изученности химического состава клубней топинамбура и
отсутствия нормативной документации на сырье клубней топинамбура до настоящего времени не был создан ни один лекарственный препарат,
Топинамбур входит в Немецкую гомеопатическую фармакопею, имеется фармакопейная статья на свежее сырье и на настойку гомеопатическую матричную из свежего сырья. В доступных фармакопеях других стран фармакопейной статьи «Клубни топинамбура» обнаружено не было.
Работами ученых Пятигорской фармацевтической академии в 1998 – 2011 годах изучена возможность создания ряда биологически-активных добавок в виде таких лекарственных форм, как таблетки, не дозированные порошки и др. на основе наземной части растения и клубней топинамбура.
В связи с этим фитохимические исследования клубней топинамбура и разработка лечебно – профилактических средств на его основе является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось: изучение анатомо – диагностических признаков клубней топинамбура, фитохимическое исследование клубней топинамбура и создание лечебно – профилактических средств на их основе.
Постановка задач и выбор средств для их решения. Для осуществления постановленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить научные публикации по фармакогностическим признакам,
фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих
веществ клубней топинамбура, оценить его перспективность в качестве
лекарственного растительного сырья.
2. Изучить анатомо – диагностические признаки клубней топинамбура.
3. С помощью современных физико – химических методов провести
фитохимический анализ клубней топинамбура, а именно исследовать состав
свободных и связанных углеводов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, а
также разработать методики идентификации и количественного определения
полисахаридов, сапонинов и дубильных веществ в клубнях топинамбура.
4. Разработать настойку гомеопатическую матричную из свежих клубней
топинамбура. Обосновать показатели качества и методики анализа полученной
настойки, изучить стабильность в процессе хранения и установить срок
годности.
5. Разработать технологию получения сухого экстракта из клубней
топинамбура, оценить качество полученного экстракта.
6. Получить капсулы с гранулированным сухим экстрактом топинамбура,
оценить качество и стабильность лекарственной формы.
7. Разработать нормативную документацию на сырье «Клубни
топинамбура», проекты НД на настойку гомеопатическую матричную и
капсулы с сухим экстрактом топинамбура.
Решение поставленных задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведением экспериментальных исследований.
Научная новизна. В результате проведенных исследований с
использованием физико – химических методов анализа впервые получены новые данные о качественном составе и количественном содержании биологически активных веществ (аминокислот, углеводов, инулина, сапонинов, дубильных веществ и аскорбиновой кислоты) в высушенных клубнях топинамбура.
Впервые разработаны технология и методики стандартизации настойки матричной гомеопатической из свежих клубней топинамбура.
Разработана технология получения сухого экстракта из клубней топинамбура, в том числе метод экстрагирования и условия сушки экстракта, методом влагоактивизированной грануляции получены гранулы сухого экстракта и новая лекарственная форма - твердые капсулы, содержащие гранулированный сухой экстракт топинамбура.
Проведена оценка качества полученных гранулятов и готовой лекарственной формы - твердых желатиновых капсул с гранулированным экстрактом из клубней топинамбура.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Теоретическая значимость заключается в получении подробных сведений о химическом составе клубней топинамбура, их морфологических и микродиагностических признаках.
Практический значимость. Результаты фармакологических исследований могут явиться обоснованием для использования в научной медицине нового вида сырья - клубней топинамбура и разработки на его основе лекарственных средств.
На основании проведенных исследований отработаны оптимальные технологические параметры производственного процесса для экстракции биологически активных веществ из клубней топинамбура. Экспериментальные данные, представленные в работе, могут служить теоретической базой для
создания и исследования лекарственных средств на основе клубней топинамбура. Использование разработанных методик в контрольно – аналитических лабораториях позволит систематизировать контроль качества и стандартизацию клубней топинамбура и фитопрепаратов на его основе.
Основные положения, выносимые на защиту;
результаты фармакогностического изучения топинамбура, интродуцированного на территории Таджикистана;
данные по определению качественного состава биологически активных веществ в клубнях топинамбура, позволяющие рассматривать их как перспективное лекарственное растительное сырье;
методики идентификации и количественного определения полисахаридов, аминокислот, углеводов, дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, сапонинов;
экспериментальная разработка фитопрепаратов лечебного и профилактического действия на основе подземной частей топинамбура (гранулированный сухой экстракт в капсулах, настойка матричная гомеопатическая);
результаты по разработке методик стандартизации и норм качества созданных лекарственных форм;
данные теоретических, экспериментальных, биофармацевтических исследований фармакологической активности биологически активных соединений клубней топинамбура, а также результаты изучения безопасности препаратов на их основе.
Методология и методы исследования.
Методология исследования включает научно обоснованную и
целесообразно организованную последовательность действий, включающую информационно-исследовательский, фитохимический, стандартизационный, морфолого-анатомический, технологический и фармакологический блоки.
При выполнении работы использованы методы хроматографии в тонком
слое сорбента, спектрофотометрии, ВЭЖХ, титрометрии, а также
технологические методы. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли в соответствии с ГФ Х, ОФС 1.1.0013.15. Микроскопический анализ сырья проводили в соответствии с техникой и требованиями, описанными в ГФ Х ОФС 1.5.1.0003.15.
Достоверность научных положений и выводов. Научные положения,
выводы и рекомендации основаны на достаточном количестве
экспериментальных исследований со статистической обработкой результатов с помощью программы «Мicrosoft Exel 2010b Statistica 8,0». Достоверность первичных материалов подтверждена их экспертной оценкой. Научные положения, полученные выводы и практические рекомендации достаточно обоснованы и логически вытекают из результатов исследования. В исследовании использован достаточный объем информационных источников, как отечественных, так и иностранных авторов.
Апробация результатов исследования. Основные результаты работы доложены на: годичной научно-практической конференции ТГМУ им. Абуали ибни Сино (Душанбе, 2013, 2014); научных конференции молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуали ибни Сино с международным участием (Душанбе, 2013, 2014, 2015,); годичной научно - практической конференции «Современные достижения химии» посвященной 50 - летию факультета химии ГПУТ им. С. Айни (Душанбе, 2013). Научной конференции с Международным участием, посвященной 50 - летию Ярославской медицинской академии (Ярославль, 2014).
Диссертация апробирована 25.12.2015 на межкафедральной комиссии по теоретическим медицинским дисциплинам ТГМУ им. Абуали ибни Сино и на межкафедральной конференции ФБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова 29.06.2016.
Личный вклад автора. При непосредственном участии автора
определены цели и задачи работы, разработаны методические подходы к их
выполнению, проведен сбор, обобщение и анализ литературных данных.
Диссертант принимал непосредственное участие при разработке методик
идентификации и количественного определения действующих веществ в
исследуемых объектах и разработке технологии лекарственных форм. Автору
принадлежит ведущая роль при проведении экспериментальных
технологических исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций и нормативной документации. Диссертация и автореферат написаны лично автором.
Внедрение результатов исследования. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены Фармакопейным комитетом Республики Таджикистан ФС на клубнях топинамбура высушенные
«Топинамбура клубни» (ФС РТ – 23 – 0004 – 15 от 17 апреля 2015 г), «Сухой экстракт из клубней топинамбура» (ВФС ТJ – 23 – 0004 – 16 от 21 июня 2016 г) и «Топинамбура экстракт сухой, капсулы - 0,600 г» (ФС – 23 – 0005 – 16 от 02 сентября 2016 г);
Также разработаны и составлены проекты ФС «Клубни топинамбура свежие», «Настойка гомеопатическая матричная из свежих клубней топинамбура». Проекты разработанных документов приняты для рассмотрения (письмо ФГБУ НЦ ЭСМП Минздрава РФ № 54.03.06 – 28/18 от 02. 07. 2015).
Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической технологии Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино Министерства здравоохранения и социальной защиты населения Республики Таджикистан (ТГМУ) по темам «Экстракция, технология изготовления, направления совершенствования и оценка их качества» и «Медицинские капсулы» (Акт внедрения от 25-04-2016 г).
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспортам научных специальностей 14.04.01 – Технология получения лекарств и 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют областям исследования специальностей, конкретно пунктам 3 – 4, 7 – 8 паспорта специальности «Технология получения лекарств», а также пунктам 2 – 4, 6 и 7 паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научных исследований Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино (номер государственной регистрации 0110РК069 от 16.11.2012).
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 231
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
главы «Объекты исследования», четырех экспериментальных глав,
библиографии 172 из них 142 наименований отечественных, 30 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 38 рисунками и 48 таблицами, содержит 7 приложении.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 статьи - в профильных журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.
Анализ углеводов в лекарственном растительном сырье
Топинамбур широко используется в народном хозяйстве и промышленности. Вегетативная часть топинамбура является сырьем для получения этилового спирта и широко используется в сельском хозяйстве [35,42]. Клубни топинамбура используются как пищевой продукт [22,43,63,93,97].
В народной медицине клубни топинамбур широко используется при сахарном диабете, атеросклерозе, тахикардии, гипертонии, ишемической болезни сердца, тромбофлебите, анемии (малокровии), лейкозе, туберкулезе, воспалительных заболеваниях мочевыводящих путей, болезнях желудочно-кишечного тракта, интоксикации, отложении солей, болях в позвоночнике и конечностях (остеохондроз, радикулит, подагра), ряде дерматологических заболеваний [21, 46,68, 109,118,121].
В результате медико - биологических и клинических испытаний топинамбура и лечебно - профилактических продуктов на его основе установлен выраженный сахаро и холерестиноснижающий эффект [2,29,67]. Описаны результаты исследований [46,60,92], указывающие на улучшении состояния больных сахарным и несахарным диабетом и с заболеваниями печени при употреблении в течение полугода сиропов из земляной груши, содержащих фруктозу. Отмечается нормализация обмена веществ, функций печени и почек.
Применение биологически активных добавок к пище является одним из путей коррекции питания [14,100]. В этой связи имеется ряд разработок в области создания биологически активных добавок на основе топинамбура [6,11,12,22,29,46,48,118].
В качестве БАД разработан концентрат топинамбура (сушеный), растворимый порошок и криопорошок из клубней топинамбура [10,13,22,49,95,100,126]. Экспериментальные фармакологические исследования подтвердили широкий спектр биологической активности полученных продуктов: адаптогенную антистрессорную, иммуноактивную [2,13,100]. Как считают венгерские ученые противораковый эффект, иммуностимулирующее действие топинамбура обеспечивается высоким содержанием ионов магния, цинка, селена, а инулин способствует усвоению организмом кальция, железа, активирует работу поджелудочной железы и оказывает влияние на сахарный обмен в печени [28,29,67]. Пектин, содержащийся в топинамбуре, обладает противоязвенной, гемостатической, антифибринолитической, гинохолеотеринемической активностью и др. [11,29,46,67,93,154,166,167]. Экспериментально определено, что пектин снижает уровень холестерина и сахара в крови, нормализует внутриклеточные процессы обмена веществ, повышает устойчивость к аллергическим реакциям [29,46,67,93].
В России выпускается концентрат топинамбура – продукт переработки топинамбура элитных сортов по патентоохранным технологиям – под марками «топинамбур сушеный» и «Перуанская роза» (производства концерна «Отечественные инновационные технологии») и др., [11,48,62,94,95,96]. На основе концентрата топинамбура созданы биологически активные добавки; природный инулиновый комплекс с микроэлементами и препарат «Долголет» (производство Московского завода Диод, мелкодисперсный порошок из клубней топинамбура «Дар» [23, 47]. 1.4.Физико - химические свойства, методы анализа основных действующих веществ топинамбура
Исходя из литературных данных о химическом составе клубней топинамбура можно выделить основные группы веществ, которые определяют фармакологическое действие: углеводы, включая полисахариды, свободные и связанные сахара, аминокислоты, дубильные вещества, витамины и др.
Углеводы играют большую роль в жизни растительных и животных организмов. Они являются основными питательными и главным опорным материалом клеток и тканей. Их разделяют на 2 группы – монозы (моносахариды) и полиозы (полисахариды), которые находят разнообразное применение в медицине [103,110,116,118,124,131].
Белоусова А.Л. [11] свободные сахара в траве топинамбура определяла реакцией Бертрана по образованию осадка меди (I) оксида при нагревании равных объемом водного извлечения из травы топинамбура и реактива Фелинга, а также методом хроматографии. Таким образом были идентифицированы фруктоза, глюкоза и арабиноза. В продуктах гидролиза извлечения из травы топинамбура методом хроматографии в присутствии стандартных образцов идентифицировали связанные сахара галактозу, ксилозу, арабинозу и рамнозу.
В траве очанки после гидролиза водных извлечений серной кислотой методом бумажной хроматографии нисходящим способом коротковолосистой идентифицировали моносахариды. Способом сравнения со стандартами образцами установлено, что моносахаридами углеводных фракций являются глюкоза, галактоза, арабиноза и ксилоза [15,17,136].
Содержание свободных сахаров определяли методом прямофазной ВЭЖХ, связанных сахаров -методом капиллярного электрофореза. В почках черной смородины связанных сахаров (арабиноза, глюкоза и галактоза) больше (9,55%) чем свободных (6,85%), представленных глюкозой и фруктозой [102,134].
Все органы первоцвета лекарственного (цветки, листья, корневища с корнями) богаты углеводами. Свободные сахара содержатся только в цветках и представлены глюкозой, фруктозой и сахарозой. Сумма свободных сахаров (9,24%). Связанные сахара содержатся во всех частях растения: арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой. Наиболее богаты связанными сахарами корневища и корни первоцвета [17].
Методом прямофазной ВЭЖХ в траве звездчатки установлено содержание свободных сахаров, а методом капиллярного электрофореза доказано наличие связанных сахаров. Свободные сахара глюкоза - 0,32%, фруктоза - 0,52%, связанные углеводы арабиноза - 2,18%, ксилоза - 0,70%, глюкоза - 3,28%, галактоза - 2,10% [103].
Качественный и количественный анализ аскорбиновой кислоты
Для идентификации инулина предложен метод тонкослойной хроматографии, описанный Шматковым Д.А. [142]. Анализ проведен пластинках «Сорбфил- ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе растворителе: изопропанол-вода (4:1). Проявитель: 20% спиртовый раствор тимола и кислота серная разведенная. Количественное определение фруктозанов и фуктозидов проводили спектрофотометрическим методом по реакции фруктозидов и фруктозанов со спиртовым раствором резорцина, стандартом служил инулин (Sigma 12255) [142].
Эти методики явились основой для количественного определения полисахаридов (фруктозанов и фуктозидов) в сырье, извлечениях, сухом экстракте, а также содержимое капсулы и настойки гомеопатической матричной. Определение суммарного содержания полисахаридов в пересчете на инулин, проводили на спектрофотометре «Cary 50» (=483±2 нм), в кювете с толщиной слоя 10 мм, в качестве раствора сравнения использовали воду, в качестве стандарта использовали инулин (Sigma 12255).
Методика. Аналитическую пробу высушенных клубней топинамбура измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Аналитическую пробу свежих клубней топинамбура измельчали ножом до размера частиц, не более 5 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного высушенного сырья или 5 г (точная навеска свежего сырье) помещали в коническую колбу вместимостью 300 мл, прибавляли 60 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин, охлаждали при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученное извлечение фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл, таким образом, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. Шрот в конической колбе промывали 10 мл воды и фильтровали в ту же мерную колбу.
Экстракцию повторяли еще дважды, приливая к шроту каждый раз по 30 мл воды очищенной и нагревая в течение 15 мин. По окончании процедуры, переносили шрот на ватный фильтр, и промывали коническую колбу дважды, используя каждый раз 10 мл воды очищенной, а затем промывали осадок на фильтре, используя каждый раз по 10 мл воды. Отжимали вату со шротом.
К полученному извлечению прибавляли 2 мл 10% раствора свинца ацетата, перемешивали и оставляли на 10 мин затем прибавляли 2 мл 5% раствора натрия фосфата, перемешивали, оставляли на 5 мин. Доводили объем раствора в колбе водой до метки, перемешивали (раствор А).
Раствор А фильтровали через фильтровальную лабораторную марки "Ф", отбрасывая первые 10 – 15 мл фильтрата. После чего 5 мл фильтрата из клубней топинамбура помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора в колбе водой до метки, перемешивали (раствор Б). В две конические колбы вместимостью 50 мл отмеривали по 5 мл 0,1% спиртового раствора резорцина и по 10 мл 30% раствора кислоты хлористоводородной. В первую колбу отмеривали 5 мл раствора Б (анализируемый раствор), во вторую 5 мл воды (раствор сравнения). Обе конические колбы нагревали до 80 С в течение 20 мин, охлаждали до комнатной температуры. Содержимое колб количественно переносили в мерные колбы вместимостью 25 мл, доводили объем раствора в колбах 30% раствором кислоты хлористоводородной до метки, перемешивали.
Оптическую плотность анализируемого раствора измеряли с помощью спектрофотометра при длине волны 483 нм относительно раствора сравнения, в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание суммы фруктозанов и фруктозидов в пересчете на инулин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле: Dх 200 х 100 х 25 х 100 _ Дх 2000000 498хшх5х5х(100-Г)"498хшхах(100-Г); D - оптическая плотность испытуемого раствора; 498-удельный показатель поглощения продуктов реакции взаимодействия инулина с резорцином в кислой среде; т - масса сырья в граммах; а - количество миллилитров извлечения, взятое на анализ; W -потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. 2. Количественное определение полисахаридов (фруктозанов и фруктозидов), в извлечениях клубней топинамбура. 10 мл полученного извлечения помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, добавляли 150 мл воды очищенной. К полученному извлечению прибавляли 2 мл 10% раствора свинца ацетата, перемешивали и оставляли на 10 минут, затем прибавляли 2 мл 5% раствора натрия фосфата, перемешивали, оставляли на 5 мин, доводили объем раствора в колбе водой до метки, перемешивали (раствор А). Далее поступали, как описано выше («Определение суммы полисахаридов в сухом сырье»).
Качественный состав и количественное содержание аминокислот в клубнях топинамбура
В качестве стандарта, при определении, использована аскорбиновая кислота фирмы (Sigma A-5960). Объектами исследования служили клубни топинамбура заготовленного в Таджикистане. Исследованиями при подборе оптимальных условий экстракции аскорбиновой кислоты из клубней установлено, что оптимальный выход аскорбиновой кислоты наблюдается при измельчении сырья до 2 мм, при использовании экстрагента – 70% этилового спирта, при соотношении сырья и экстрагента 1:50, и времени экстракции 1 час 30 минут при комнатной температуре. Полученные результаты были использованы при составлении методики.
Методика. Около 2,0 г (точная навеска) клубней, измельченных до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, добавляли 60 мл 70% этилового спирта и взбалтывали на вибрационном аппарате в течение 60 мин. Затем фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобы частицы сырья не попали на фильтр. В колбу со шротом добавляли 40 мл 70% этилового спирта и проводили извлечение при постоянном встряхивании в течение 30 мин. Извлечение фильтровали через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Шрот и фильтр промывали 10 мл 70% этанола и доводили объем раствора в колбе 70% этанолом до метки (испытуемый раствор А). 5 мл испытуемого раствора А фильтровали через микропористый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывали первые 2 мл фильтрата. Фильтрат (испытуемый раствор Б) хроматографировали с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа не менее 5 повторности при условиях описанных ниже:
По 10 мкл испытуемого раствора Б и раствора РСО аскорбиновой кислоты по отдельности вводили в жидкостной хроматограф высокого давления, укомплектованного системой градиентной подачи элюэнта, УФ диодноматричным детектором или с переменной длиной волны, а так же компьютерной системой сборки и обработки данных. Получали не менее 5 хроматограмм для каждого раствора в следующих условиях: - колонка 2504,6 мм, сорбент Kromosil 100–5С18 с размером частиц 5 мкм; - температура термостата 380С; - длина волны детектирования 280 нм; - подвижная фаза: ацетонитрил (А) /0,01% раствор фосфорной кислоты (В); - режим элюирования Этап № Продолжительность этапа, мин Раствор А% Раствор В % Режим 0 10 5 95 Изократ. 1 40 85 15 К = 1 2 5 85 15 Изократ. - скорость элюирования – 1 мл/мин; - время регистрации хроматограммы 5 минут. Содержание аскорбиновой кислоты в процентах (Х) на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле: Sобрxmx 400 х; где Х обрх100хтх1х100х100 Scтxax50x50x{l00-W) Scnxax{l00-W] Sобр. - среднее значение площадей пика на хроматограмме испытуемого раствора; Sст - среднее значение площадей пика на хроматограмме РСО аскорбиновой кислоты; а - навеска препарата в граммах; т - навеска стандартного образца аскорбиновой кислоты; W - потеря в массе при высушивании сырья в граммах. Примечание. 1.Приготовление подвижной фазы. Используют ацетонитрил для жидкостной хроматографии. Ацетонитрил используют как раствор А. В мерную колбу вместимостью 1000 мл отмеривают 500 мл воды очищенной (ФС 42-2119 96), прибавляют 1мл фосфорной кислоты концентрированной (о.с.ч.), доводят объем раствора водой очищенной до метки и фильтруют через микропористый фильтр, при необходимости дегазируют вакуумом в течение 1 - 2 мин при 15 мм атмосферного давления (раствор В). Водную фазу используют свежеприготовленной. 2. Приготовление раствора стандартного образца (РСО) аскорбиновой кислоты. Около 0,01г (точная навеска) аскорбиновой кислоты (Sigma A-5960) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл метанола, перемешивают до растворения. Затем доводят объем раствора метанолом до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора метанолом до метки и перемешивают. 3. Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографируют РСО аскорбиновой кислоты, получая не менее 5 хроматограмм в условиях описанных выше. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: - эффективность хроматографической колонки по техническому паспорту должна быть не менее 300 теоретических тарелок (ГФ ХI, вып. 1, с. 105); - степень разделения пиков, рассчитанная для пиков на хроматограмме РСО аскорбиновой кислоты должна быть не менее 0,63 (ГФ ХI, вып. 1, с. 105); - относительно стандартное отклонение, рассчитанное для площади пика аскорбиновой кислоты на хроматограмме РСО должно быть не более 3% (ГФ ХI, вып. 1, с. 199); - коэффициент асимметрии, рассчитанный по пику аскорбиновой кислоты на хроматограмме РСО должен быть не менее 1,0 и не более 1,5; - коэффициент асимметрии пика (Т) рассчитывают по формуле: Т = h0,05 /2 f, где h0,05 – ширина пика на высоте 5% от базовой линии, в мин; f, – расстояние от начала пика на высоте 5% от базовой линии до перпендикуляра, проведенного из его вершины, в мин. Хроматограммы аскорбиновой кислоты представлена на рис. 24. Хроматограммы и УФ- спектр аскорбиновой кислоты
Из табл.4. видно, что ошибка единичного определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ± 4,19%.
Отсутствие систематической ошибки доказано проведением опытов с добавкой аскорбиновой кислоты. Результаты анализа представлены в табл. 5. Таблица 5 Результаты количественного определения аскорбиновой кислоты с использованием методов добавок (n=5) №образца Найдено аскорбиновойкислоты, мг/100г сырья Добавленоаскорбиновойкислоты, мг Должна бытьнайдена суммааскорбиновойкислоты, мг/100гсырья Найдена сумма аскорбиновойкислоты, мг/100г сырья Относительнаяошибка,%
Результаты табл.5, показывают отсутствие систематической ошибки, т.к. относительная ошибка метода добавок меньше относительной ошибки единичного определения. С помощью разработанной методики были проанализированы 3 образца клубней топинамбура. Полученные результаты представлены в табл.6. Определение содержания дубильных веществ проводили перманганатометрическим методом в модификации по Левенталю. Около 2 г (точная навеска) измельченного сырья, просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещали в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливали 250 мл нагретой до кипения воды и кипятили с обратным холодильником на электрической плитке с закрытой спиралью в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Жидкость охлаждали до комнатной температуры и процеживали около 100 мл в коническую колбу вместимостью 200 - 250 мл через вату так, чтобы частицы сырья не попали в колбу. Затем отбирали пипеткой 25 мл полученного извлечения в другую коническую колбу вместимостью 750 мл, прибавляли 500 мл воды, 25 мл раствора индигосульфокислоты и титровали при постоянном перемешивании раствором перманганата калия (0,02 моль/л) до золотисто - желтого окрашивания.
Получение гомеопатической матричной настойки
В дальнейшем, разработка процесса экстракции из клубней топинамбура осуществлялась с применением таких экстрагентов, как вода очищенная и спирт этиловый 20%.
При подборе оптимальных условий экстракции из клубней топинамбура также были изучены такие факторы, как: измельченность сырья, температура экстракции (в случае водных извлечений).
Фактором, оказывающим заметное влияние на выход биологически активных соединений, является степень измельчения растительного сырья. В то же время, при экстракции сильно измельченного сырья извлечения получаются мутными, коллоидные частицы плохо отделяются и, в конечном итоге, получаемый продукт помимо экстрактивных веществ оказывается загрязненным механическими частицами малого размера. Сырье, измельченное до различного размера частиц, отсеянное от пыли, заливали экстрагентом, помещали в колбу с обратным холодильником на водяную баню в соответствии с (ГФ XIII) ОФС.1.5.3.0006.15 (1 вариант) и получали извлечения.
Полученные извлечения анализировали по сумме полисахаридов (табл.31). Для контроля соотношения массы полисахаридов и сухого остатка, который включал в себя и другие соединения, количество полисахаридов выражали в процентах к массе выделенного, в том или ином случае, сухого остатка, по методики описанной в главе 2.2.5
Было отмечено, что с увеличением размера частиц изменяется цветность раствора, от темно-желтого цвета (частицы 1,0-2,0 мм) к светло-светло-желтому (частицы 4,0-5,0мм), уменьшается опалесценция. Содержание суммы полисахаридов в полученных извлечениях, отнесенное к массе сухого остатка, также в значительной степени изменяется в зависимости от размера частиц взятого сырья: от 72,77±0.34 % для воды очищенной и 69,39±0.21% раствора спирта этилового 20% (частицы 1,0-2,0) до 69,56±0.38% и 67,54±0.34% (частицы 4,0-5,0 мм) соответственно. Содержание полисахаридов в извлечениях в зависимости от вида экстрагента при сравнении мелких и крупных частиц падает на 4,23% и 2,6% соответственно.
Наиболее высокими показателями по сумме полисахаридов отличались извлечения, полученные из сырья с измельчением до размера 1,0-2,0, в то же время, они были прозрачными, светло-желтого цвета,
Таким образом, установлено, что для облегчения диффузионного процесса сырье должно быть измельчено до предела 1-2 мм. При измельчении частиц менее 1,0 мм наблюдалось увеличение количества разрушенных клеток, что повлекло за собой переход большого количества взвешенных частиц в жидкую фазу. В результате вытяжки получились мутные, трудно осветляемые и плохо фильтруемые. Исследование соотношения сырье: экстрагент (вода очищенная и спирт этиловый 20%) проводили в диапазоне 1:5 - 1: 10 на водяной бане, в колбе с обратным холодильником. В колбу с обратным холодильником помещали 50 г сырья, добавляли 250 или 500 мл экстрагента, выдерживали 1 час. Затем нагревали на водяной бане в течение 2-х часов. Затем извлечение отфильтровывали с использованием фильтра бумажного лабораторного марки "Ф", и анализировали. Измельченность сырья составляла 1-2 мм. Результаты эксперимента приведены в таблице 32.
Как можно отметить, анализируя данные таблицы, увеличение объема экстрагента в два раза, приводит к незначительному изменению в количествах извлеченных полисахаридов (0,4% и 0,2% соответственно), как в случае воды очищенной, так и спирта этилового 20%. Однако, при дальнейшей технологической обработке – выпариванию и сушке, удаление избыточных объемов экстрагента может представлять определенные проблемы, связанные с излишним расходом электроэнергии.
Одновременно в этом эксперименте определяли коэффициент спиртопоглощения сырья, используя гравиметрический метод. В ходе эксперимента выявлено, что этот показатель составляет 2,9 при использовании этанола 20%, как экстрагента.
Определение коэффициента водопоглощения растительного сырья проводили в соответствии с ОФС.1.5.3.0012.15. (ГФ XIII). Этот показатель составил 3,1, при использовании воды, как экстрагента.
При экстракции растительного сырья одним из определяющих факторов является температурный. Учитывая, что разработка процессов экстракции биологически активных соединений из клубней топинамбура привязана к имеющейся в Республике Таджикистан производственной базе, было необходимо оценить возможность использования водной экстракции при нагревании.
Исследованиями Зяблицевой Н.С доказано, что экстракция инулина из клубней топинамбура оптимальна при температуре 70-80оС [48]. Учитывая, что целью данного исследования являлось выделение суммы полисахаридов, а не только инулина, и принимая во внимание, полученные ранее данные, для проведения дальнейших исследований необходимо было выбрать возможные температурные условия процесса экстракции. В ходе эксперимента было исследовано влияние таких температурных режимов, как 40±1С, 60±1С, 80±1С (при нагревании на водяной бане). В эксперименте использовано соотношение 1:5, (сырье: экстрагент), т.е. 50 г сырья и 250 мл воды очищенной. Получение извлечения вели в инфундирном аппарате, время нахождения на водяной бане составило 30±1 мин, что соответствовало технологии получения настоев и отваров ОФС.1.4.1.0018.15 (ГФ XIII), результаты представление в таблице 33.
Несмотря на то, что описанный выше эксперимент вели в течение 30 минут, представлялось целесообразным исследовать возможность более длительной экспозиции растительного сырья при обработке экстрагентом. Для определения времени настаивания на водяной бане, сырье с частицами размером 1-2 мм, загружали в инфундирный аппарат в соотношении 1:5 (сырье: экстрагент), те. 50 г сырья и 250 мл воды очищенной, и помещали на водяную баню на 30, 45, 60 минут По окончании указанного времени отбирали пробы извлечений и проводили определение сухого остатка и полисахаридов.
Методом ТСХ доказывали наличие инулина и фруктозы (Rf 0,62 и 0,68 соответственно) с помощью методом описанной в главе 3.7.1.
Эксперимент повторяли 5 раз. Содержание полисахаридного комплекса (фруктозаны и фруктозиды) оценивали спектрофотометрически ( = 483 нм). Методика определения биологически активных веществ представлена в главе 2.2.5, Результаты обрабатывали статистически (табл. 34).