Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 К этиологии и патогенезу заболеваний органов гепатобилиарной системы
1.2 Современное состояние фармакотерапии для лечения и профилактики заболеваний органов гепатобилиарной системы
1.3 Характеристика растительных гепатозащитных средств 22
1.4 Общие сведения о лекарственных растениях, входящих в состав «Пентахолефита»
Глава 2. Материалы и методы исследований 33
2.1 Характеристика моделей повреждения печени 33
2.1.1 Модели повреждения печени и схемы назначения лекарственных средств
2.1.2 Характеристика методов, использованных для оценки состояния функции и структуры печени при ее повреждениях
2.2 Характеристика методов, использованных для определения фармакологических свойств фитосредства «Пентахолефит»
Глава 3. Определение фармакологических свойств комплексного фитосредства«пентахолефит»
3.1 Определение острой токсичности 43
3.2 Определение противовоспалительной активности многокомпонентного фитосредства «Пентахолефит»
3.3 Изучение мембраностабилизирующего действия «Пентахолефита»
3.4 Влияние «Пентахолефита» на желчевыделительную функцию печени
3.5 Влияние «Пентахолефита» на функциональное состояние почек
3.6 Влияние «Пентахолефита» на центральную нервную систему
3.6.1 Влияние «Пентахолефита» на ориентировочную и поведенческую активность крыс
3.6.2 Влияние фитосредства «Пентахолефит» на судорожное действие коразола и камфоры
3.7 Влияние «Пентахолефита» на сердечно-сосудистую систему 51
Глава 4. Фармакотерапевтическая эффективность фитоэкстракта «пентахолефит» при повреждении печени белых крыс этанолом
4.1. Гепатозащитное действие фитоэкстракта «Пентахолефит» при повреждении печени этанолом
4.2 Патоморфологические исследования печени при этаноловой интоксикации крыс
4.3. Патоморфологические исследования печени опытных животных при использовании «Пентахолефита» при этаноло-вом повреждении печени
4.4. Влияние «Холосаса» на патоморфологические изменения в печени опытных животных при этаноловом повреждении печени
Глава 5. Фармакотерапевтическая эффективность фитосредства «пентахолефит» при повреждении печени белых крыс, вызванном введением тетрахлорметана
5.1 Гепатозащитное влияние комплексного фитосредства «Пентахолефит» при повреждении печени, вызванном введением тетрахлорметана
5.2 Патоморфологические исследования печени опытных животных при повреждении печени тетрахлорметаном
5.3 Патоморфологические исследования печени опытных животных при использовании «Пентахолефита» при тетра-хлорметановом повреждении печени 5.4 Влияние Холосаса на патоморфологические изменения в печени опытных животных при тетрахлорметановом повреждении печени
Глава 6 Обсуждение результатов 82
Заключение 92
Выводы 94
Практические рекомендации 95
Список литературы
- Современное состояние фармакотерапии для лечения и профилактики заболеваний органов гепатобилиарной системы
- Характеристика методов, использованных для оценки состояния функции и структуры печени при ее повреждениях
- Влияние «Пентахолефита» на ориентировочную и поведенческую активность крыс
- Патоморфологические исследования печени опытных животных при использовании «Пентахолефита» при этаноло-вом повреждении печени
Введение к работе
Проблемы лечения и профилактики заболеваний печени остаются актуальными ввиду их почти эпидемической распространенности, что обусловлено загрязнениями внешней среды, в том числе воды и продуктов питания чужеродными химическими соединениями (ксенобиотиками), увеличением алкоголизации населения (Хазанов А. И., 2007; Ивашкин В. Т, 2009), неконтролируемым приемом медикаментов и нерациональным питанием (Полищук Л. О., 2009; Хазанов А. И., 2009; Занданов А. О. и др., 2010; Корсун В. Ф., 2014).
В настоящее время в мире насчитывается более 1 миллиарда человек, страдающих патологией печени, что превышает распространенность ВИЧ-инфекции (Ткач С. М., 2009; Плеханов А. Н., 2014; Brett А., 2013). Эпидемиологические исследования последних лет показали, что хроническим гепатитом страдает более 5 % взрослого населения (Сазонова Е. В., 2007).
Заболеваемость вирусными гепатитами А, В, С, D, Е, G и ТТ неуклонно увеличивается и в настоящее время в мире насчитывается около 350 млн. носителей НВV и не менее 150 млн. больных хроническим гепатитом С (Ивашкин В Т., 2005; Keefe В., 2007). Во многих странах продолжает возрастать употребление алкоголя. Установлено, что при алкогольной интоксикации повреждаются биологические мембраны клеток печени вследствие активации свободнорадикального окисления липидов (Абдурахманов Д. Т., 2007; Да-шинамжилов Ж. Б., 2014; Lumeng L., Grabb D. W., 2000). Большинство исследователей считают, что вирусные гепатиты отягощяют течение алкогольной болезни печени (Лопаткина Т. К., 2006; Маевская М. В., 2007; Ивашкин В. Т., 2008). Несмотря на то, что в последние годы достигнут значительный прогресс в диагностике и лечении заболеваний печени, связанный с использованием молекулярно-биологических методов диагностики, появлением возможности этиотропного лечения вирусных гепатитов и применением фармакологических препаратов, тормозящих развитие фиброза печени, тем не менее лечение в целом представляет собой сложную проблему (Широкова Е. Н. и др., 2007; Bartholomeuz A., Lokarnini A., 2006). Все эти факторы обусловливают необходимость поиска новых лекарственных средств, способных повысить резистентность печени к воздействию ксенобиотиков. При лечении и профилактике заболеваний печени целесообразно назначение гепатопротек-торов растительного происхождения (Корсун В. Ф., 2014), имеющих выраженный терапевтический эффект, постепенность наступления эффекта, минимум побочного влияния и возможность длительного курсового назначения (Соколов, 2006). С учетом этого, в Отделе биологически активных веществ ФБГУН ИОЭБ СО РАН разработано новое гепатозащитное растительное средство, условно названное «Пентахолефит», состоящее из экстрактов сухих: плодов Шиповника майского (Rosa majalis L.), соцветий Календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), корней и корневищ Девясила высокого (Jnula helenium L.), корней Одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.), плодов Кориандра посевного (Coriandrum sativum L.).
Целью настоящего исследования явилось определение фармакотера-певтической эффективности растительного средства «Пентахолефит» при экспериментальном повреждении печени.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
определить спектр фармакологических свойств «Пентахолефита»;
оценить фармакотерапевтическую эффективность «Пентахолефита» при повреждении печени этанолом;
изучить фармакотерапевтическую эффективность «Пентахолефита» при повреждении печени тетрахлорметаном;
выявить основные механизмы гепатозащитного влияния «Пентахоле-фита».
Научная новизна
В данной работе впервые изучено влияние нового растительного средства «Пентахолефит» при повреждениях печени тетрахлорметаном и этанолом, и определены механизмы его гепатопротекторного влияния.
Установлено, что курсовое введение крысам данного фитосредства в экспериментально-терапевтических дозах при тетрахлорметановом повреждении печени ограничивает развитие цитолиза и холестаза. При этаноловом повреждении печени «Пентахолефит», ограничивая проявления холестаза, предупреждает развитие вторичных некрозов в органе. При повреждениях печени этанолом и тетрахлорметаном показано, что указанное средство предупреждает развитие холестаза и цитолиза, повышая энергетический потенциал, ингибируя свободнорадикальное окисление биомакромолекул на фоне активации антиокислительной системы организма. В основе указанных явлений лежат способности данного средства оказывать мембраностабилизи-рующее, антиокислительное, желчегонное, антитоксическое и противовоспалительное действие. Более выраженный фармакотерапевтический эффект установлен при введении животным указанного средства при этаноловом повреждении печени, что обусловлено его выраженными холеретическим и антитоксическим действиями за счет значительного содержания веществ фе-нольной природы, а также других биологически активных веществ, способствующих нормализации морфо-функционального состояния печени.
Практическая значимость работы
На основе проведенных исследований направлена в Роспатент заявка на предполагаемое изобретение «Способ получения нового растительного средства, обладающего желчегонной, противовоспалительной активностью» от 24. 09. 2015. Результаты проведенных исследований включены в Руководство по клинической фитотерапии «Лекарственные растения и болезни печени» (Москва, 2014). Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре фармакологии и традиционной медицины медицинского института Бурятского государственного университета (Акт внедрения от 24. 09. 2015).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
«Пентахолефит» обладает широким спектром фармакологической активности: противовоспалительной, антиокислительной, мембраностабили-зирующей, дезинтоксикационной и желчегонной.
-
«Пентахолефит» обладает фармакотерапевтической эффективностью при повреждениях печени этанолом и тетрахлорметаном.
-
Указанное средство отличается наиболее выраженным фармакотера-певтическим эффектом при этаноловом повреждении печени и действие его сопоставимо с влиянием референтного средства – Холосаса.
-
Основной механизм в действии данного средства обусловлен угнетением процессов свободнорадикального окисления липидов в клетках печени с последующим ограничением развития холестаза и цитолиза.
Апробация материалов диссертации осуществлена на:
- III Всероссийской конференции с международным участием «Разви
тие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2010);
-International Scientific Conference «Current situation and future trends of drag research and development from naturel sources» (Ulanbaatar, 2010);
- Научной конференции с международным участием «Химия и биоло
гически активные вещества природного происхождения» (Улан-Удэ, 2011);
-The V International symposium «On present situation and future development of Mongolia traditional medicine», (Ulanbaatar, 2011);
- VI International scientific Сonference «Traditional medicine: ways of inte
gration with modern health caer» (Ulanbaatar, 2013);
-IV Всероссийской конференции с международным участием «Развитие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 4 статьи – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 монография.
Структура и объем диссертации
Современное состояние фармакотерапии для лечения и профилактики заболеваний органов гепатобилиарной системы
Матрицу всех биологических мембран составляют фосфолипиды (ФЛ). Это относится и к гепатоцитам, матрица которых на 65% состоит из ФЛ. Фосфолипиды играют важную роль в организме человека, основными из которых являются структурная функция, стимуляция активных ферментных систем, участие в процессах молекулярного транспорта, деления и дифференцировки клеток. Нормальное функционирование клеточных и субклеточных мембран зависит от целостности их фосфолипидных структур [76, 104]. Многие ксенобиотики химически очень активны и вызывают повреждение липи-дов биомембран, белков и нуклеиновых кислот. Повреждения липидного бислоя мембран, сопряженные с изменением вязкости, являются этапом некротического механизма гибели клетки и, как правило, связаны с активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ) [120, 201]. Известно, что пероксидному окислению подвергаются, в первую очередь, фосфолипиды, содержащие в своем составе значительно больше ненасыщенных жирных кислот, чем нейтральные липиды. Пероксид-ный и фосфолипазный механизмы повреждения липидов тесно взаимосвязаны, приводя совместно к нарушению целостности липидного бислоя мембран и активации процессов свободнорадикального окисления [234]. Перекисное окисление липидов сопровождается образованием свободных радикалов– молекул или атомов, имеющих неспаренный электрон на внешней орбите, что обуславливает их агрессивную способность нарушать барьерную и матриксную функции плазматической мембраны внутриклеточных органоидов гепатоцитов [93]. К числу этих агрессивных свободных радикалов относятся: пероксинитрит, синглетный кислород (О2), гидроперекиси липидов, хлорамин [186, 260]. При активации ПОЛ окисляются сульфгидрильные группы мембраносвязанных белков и ферментов. Инактивация кальций-зависимой АТФ-зы приводит к замедленному удалению Cа+2 из клетки, что повреждает митохондрии и лизосомы. В мембране митохондрий формируются каналы для входа ионов калия. Внутри митохондрий повышается осмотическое давление, что ведет к их набуханию. Продукты ПОЛ, увеличивая ионную проницаемость липидного бислоя митохондрий для ионов водорода и кальция, разобщают окисление и фосфорилирование, что создает энергетический дефицит. Из лизосом освобождаются протеолитические ферменты, что усугубляет патологические процессы в гепатоците [90]. Продуктами ПОЛ являются диеновые коньюгаты (ДК), представляющие собой гидроперекиси полиеновых жирных кислот, далее в процессе их распада образуется малоновый диальдегид (МДА). Конечными продуктами ПОЛ являются основания Шиффа, образующиеся в процессе взаимодействия N-концевых остатков белков, аминокислот и аминогрупп фос-фолипидов с альдегидами [90, 93, 103, 167].
В организме повреждающему действию продуктов ПОЛ и активных кислородных метаболитов (АКМ) противостоит антиокислительная система (АОС), составляющими которой являются глутатион, антиокислительные ферменты- су-пероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза глутатиона, металлосвязываю-щие протеиназы (ферритин и церуллоплазмин), витамины Е, С, бета-каротин[228]. Белки-альбумины рассматривают как ловушку для кислородных метаболитов [123, 173]. Выраженная активация процессов свободнорадикального окисления и следующая за ним реакция тканей и систем организма получила название окислительный стресс [47, 56, 227]. Окислительный стресс возникает в случае нарушения баланса между избыточной продукцией активных форм кислорода и антиокислительной защитой [255, 266]. Выявлено, что при хроническом гепатите С значительный вклад в индукцию окислительного стресса вносит и гиперпродукция фактора некроза опухоли- [31, 265]. Следует отметить, что интенсивность процессов ПОЛ в значительной мере зависит от уровня ионов металлов переменной валентности, в частности Fe+2, концентрация которых значительно увеличивается в условиях ПОЛ вследствие высвобождения из вне- и внутриклеточных депо, также разрушения Fe-S-кластера аконитазы супероксидным радикалом [153, 218, 228], в результате распада других Fe+2-содержащих белков и восстановления Fe+3в составе ферритина с помощью SH-соединенийсвободных аминокислот и аскорбаната [272]. Кроме того, ионы Fe+2 являются непосредственными участниками реакции Фентона, в ходе которой образуется одна из наиболее реакционно-способных активных форм кислорода- гидроксильный радикал [122, 271]. Известно, что снижение внутриклеточного уровня Fe+2может достигаться путем увеличения цитрата. Так, после выхода из трансферрина ионы Fe+2хелатируются цитратом, который осуществляет их доставку в различные клеточные компартменты [218].Как отмечают авторы [249], в процессе окислительного стресса наблюдается чрезмерная мобилизация свободных ионов железа из ферритина, что увеличивает содержание агрессивных гидроксильных радикалов. Свободные радикалы запускают реакции ПОЛ, а также продукцию провоспали-тельных цитокинов, представляющих из себя плеотропные регуляторные пептиды, которые могут продуцироваться большим числом ядерных клеток, включая и клетки печени, как паренхиматозные, так и непаренхиматозные (клетки Купфера и Ито). Наиболее изучены фактор некроза опухоли-, интерлейкины (-6,-8), ин-терфероны, хемокины и т.д. Ключевая роль в повреждении печени принадлежит фактору некроза опухоли- [270]. В настоящее время продемонстрирована его роль в собственно печеночном повреждении и стимуляции фиброза. Активация ковалентных рецепторов фактором некроза опухоли- ведет к активации большого числа активных пептидов, принимающих участие в реализации и формировании иммунного ответа- каспазы, киназы и протеазы. Основной субстрат индуцированной смерти фактором некроза опухоли- – митохондрии [113]. Как отмечает автор [215], продукты ПОЛ, некрозы гепатоцитов, фактор некроза опухоли-, ин-терлейкин-6 являются активаторами клеток Ито. Их стимуляция сопровождается избыточной продукцией компонентов соединительной ткани с развитием фиброза, а при длительном персистировании процесса – цирроза печени. Можно сделать вывод, что окислительный стресс через апоптоз, некроз, воспаление, иммунный ответ, фиброз, ишемию и изменение репаративных процессов с участием всех типов клеток печени способствует развитию и прогрессированию заболеваний печени независимо от их этиологии.
Характеристика методов, использованных для оценки состояния функции и структуры печени при ее повреждениях
Повреждение печени крыс этанолом воспроизводили введением peros40%-ного водного раствора этилового спирта по 0,7 мл на 100 г массы животных один раз в сутки в течение 21 дней [106]. Животным 1-й опытной группы внутрижелу-дочно вводили водный раствор экстракта сухого (ЭС) «Пентахолефит» в дозе 50 мг/кг в объеме 1мл/100 г массы животного1 раз в сутки на протяжении 21 дней. 2-й опытной группе животных по аналогичной схеме вводили препарат сравнения -Холосас в объеме 1,0 мл на 100 г массы. Крысам контрольной группы по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду в эквивалентном количестве. Интервалы между введениями этанола, лекарственных средств и дистиллированной воды соответствовали 6 ч. О функциональном состоянии печени оценивали на 7, 14, 21 сутки от начала эксперимента.
Острый токсический гепатит воспроизводили путем подкожного введения 50%-ного масляного раствора тетрахлорметана(CCl4)(V/V) в объеме 0,4 мл/100 г массы животных 1 раз в день в течение 4 дней [140].Животным опытной группы интрагастрально вводили водный раствор экстракта сухого (ЭС) «Пентахолефит» в течение 21 дней в дозе 50 мг/кг массы тела 1 раз в день за 30 мин до приема пищи. Животным контрольной группы внутрижелудочно вводили по аналогичной схеме дистиллированную воду. В качестве препарата сравнения использовали Холосас в объеме 1,0 мл на 100 г массы животных. Функциональное состояние печени оценивали в динамике на 7, 14, 21 сутки от начала эксперимента.
Для оценки гепатопротекторной активности «Пентахолефита» определяли биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние печени лабораторных животных: активность аланинаминотрансферазы (АлТ), аспартата-минотрансферазы (АсТ), содержание общего билирубина и щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови; показатели тимоловой пробы, -липопротеиды, общий белок, белковые фракции, соотношение альбумины/глобулины [89]. Экскреторно-поглотительную функцию печени оценивали по скорости выведения бромсульфа-леина с желчью [157].
Оценку желчеобразовательной и желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, по содержанию в ней холестерина [48], билирубина [150] и желчных кислот [70].
В совокупности данные, полученные при таком выборе методов исследования, позволяют объективно оценить состояние печени, а также определить фар-макотерапевтическую эффективность исследуемого фитосредства «Пентахоле-фит». Выбор данных биохимических и патоморфологических методов обусловлен тем, что они несут специфическую информацию о глубине функциональных расстройств печени. Как известно, повышение активности трансаминаз, особенно АлТ, является признаком нарушения целостности клеточных мембран гепатоци-тов. В свою очередь, повышение активности щелочной фосфатазы, концентрации -липопротеидов и общего холестерина являются признаком развития синдрома холестаза [102]. Определение активности аланинаминотрансферазы (АлТ) и аспартатами-нотрансферазы (АсТ), щелочной фосфатазы, общего билирубина сыворотки крови, общего белка, белковых фракций, -липопротеидов проводили на автоматическом анализаторе Prestige 23i (США) с применением набора реактивов LiquickCor-ALAT, Cor-ASAT, CorIM,Cor-BIL, CorOTALPROTEIN, Cor-LIPOPROTEIN (Польша).
Влияние «Пентахолефита» на активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени по методике Стальной и Гаришвили (1977) и в сыворотке крови по методике Темирбулатова и Селезнева (1981). В основе определения МДА в гомогенате печени лежит свойство малонового диальдегида реагировать с 2-тиобарбитуровой кислотой при высокой температуре и в кислой среде, результате чего образуется окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Молярный коэффициент экстинции этого комплекса 1,56.105 см-1 м-1. Определение МДА в сыворотке крови [169] проводили спектрофотометрически по изменению концентрации ТБК-активных продуктов общепринятым методом.
Активность антиокислительной системы организма оценивали по активности каталазы в сыворотке крови [110], супероксиддисмутазы (СОД) -в плазме крови [194] и содержанию сульфгидрильных групп (SН-групп) в организме[188].
Активность каталазы сыворотки крови определяли спектрофотометриче-ским методом [110]. Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс. Интенсивность развившейся окраски измеряли на спектрофотометре при длине волны 410 нм. Активность каталазы сыворотки крови определяли по формуле: Е=(Ахол-Аоп) V.t.K (мкат/л), где: Е – активность каталазы (мкат/л); Ахол, Аоп-экстинция холостой и опытной проб; V – объем вносимой пробы (0,1 мл); t – время инкубации 600 с; К – коэффициент мМ экстинции перекиси водорода, равный 22,2- 103 мМ-1см-1.
Активность СОД определяли спектрофотометрическим методом [194]. Принцип основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолия (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия никотинамиддинуклеотида НАДН и феназинметасульфата. В результате данной реакции НСТ восстанавливается с образованием гидразинтетразолия. В присутствии СОД процент восстановления нитросиния тетразолия (НСТ) снижается [253].
Принцип метода определения сульфгидрильных групп (SН-групп) основан на эквивалентном взаимодействии молекулярного йода в среде 1 М КI при температуре 20-25ои рН среды 7,6 с SH- и восстановленными в SH-группы дисульфидами белков и низкомолекулярных соединений[188]. О содержании SH-групп в пробе судят по количеству эквивалентов йода, затраченного на титрование опытной пробы за вычетом контроля (на реактивы).
Действие «Пентахолефита» на желчеобразовательную и желчевыделитель-ную функции печени у животных оценивали по общепринятой методике [150]. Желчевыделительная функция является весьма тонким показателем функционального состояния печени, а спектр биохимических изменений в желчи четко коррелирует со степенью тяжести развития патологического процесса [126]. Опыты проводили в строго определенные часы, учитывая рекомендации авторов [151], при одном и том же пищевом и температурном режиме в соответствии с общепринятыми требованиями [143]. Желчь собирали с помощью специальной канюли, вставленной в общий желчевыводящий проток, через каждый час, на протяжении 4 часов.
Влияние «Пентахолефита» на ориентировочную и поведенческую активность крыс
Как следует из данных, проведенных в таблице 3.2.5, «Пентахолефит» в указанном объеме оказывает противовоспалительное действие, о чем свидетельствуют уменьшение степени альтерации тканей и активация регенераторных процессов в очаге воспаления. Введение белым крысам «Пентахолефита» оказывает антиальтеративное действие, снижая степень деструкции ткани при воздействии флогогенного агента. Так, на 7-, 14- и 21-е сутки эксперимента площадь повреждения тканей снижается на 12%, 16% и 20% соответственно по сравнению с контролем (табл.3.2.5).
Примечание: - здесь и далее различие достоверно по сравнению с контролем приР0,05 «Пентахолефит» оказывает существенное антиэкссудативное действие, о чем свидетельствует уменьшение выраженности отека конечности животных при асептическом воспалении, индуцированном формалином – на 40%, (табл. 3.2.6). При этом антиэкссудативная активность «Пентахолефита» превосходит таковую у препарата сравнения – Холосас.
При определении влияния исследуемого средства на пролиферативную стадию воспаления установлено, что масса соединительнотканной капсулы в очаге воспаления возрастает на 64%, по сравнению с показателями у животных с контрольной группы (табл. 3.2.7), т.е. обладает умеренным пролиферативным действием.
Опытная 2 Холосас (n=8) 1,0 мл/100 г 7,0±0,36 14 Инъекция крысам раствора серебра нитрата сопровождается развитием острого асептического воспаления, о чем свидетельствует выраженная экссудация в брюшную полость животных контрольной группы большого количества жидкости красновато-бурого цвета, обусловленного присутствием в ней значительного количества эритроцитов (табл.3.2.8). Введение на этом фоне другой группе крыс «Пентахолефита» в вышеуказанной дозе оказывало противовоспалительное действие, на что указывало уменьшение объема перитонеальной жидкости на 16,6%, по сравнению с данными у животных контрольной группы.
Опытная(нитрат сереб-ра+«Пентахолефит») (n=8) 0,61±0,03 47,8±3,50 При этом внутрибрюшинная жидкость у животных, получавших испытуемое средство, имела светло-серый цвет с опалесцирующим оттенком, свидетельствующим о практически полном отсутствии в ней эритроцитов. Наряду с этим в брыжейке крыс опытной группы, получавших «Пентахолефит», наблюдали снижение количества дегранулированных тучных клеток – в среднем на 30%, по сравнению с данными у крыс контрольной группы (табл. 3.2.9). Препарат сравнения оказывал однонаправленный менее выраженный эффект (табл.3.2.9).
При исследовании влияния «Пентахолефита» на проницаемость сосудов установлено наличие у испытуемого сбора сосудоукрепляющего действия. Так, у животных, получивших «Пентахолефит», количество брыжеечных окон без метки увеличивалось почти в 1,6 раз, по сравнению с контролем, а также наблюдали существенное уменьшение количества окон с более 10 «мечеными» сосудами и некоторое увеличение количества брыжеечных окон от 1 до 10 «меченых» сосудов (табл. 3.2.9). При исследовании проницаемости сосудов по интенсивности метки количество животных с самыми интенсивными метками, соответствующими III и IV степенями проницаемости, у группы крыс, получавшей «Пентахолефит», уменьшалось соответственно на 17% и 10%, по сравнению с контролем. При этом препарат сравнения – Холосас несколько уступал по эффективности «Пентахоле-фиту».
Мембраностабилизирующее действие «Пентахолефита» оценивали по степени гемолиза эритроцитов, который вызывали с помощью реактива Фентона (пе-рекисный гемолиз) и дистиллированной воды (осмотический гемолиз) [27].Как следует из данных, приведенных в таблице 3.3.10, испытуемое фитосредство оказывает выраженное мембраностабилизирующее действие, что характеризуется уменьшением степени перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов. При этом показано, что наиболее выраженное мембраностабилизирующее дейст-вие«Пентахолефита» отмечается при его использовании в дозе 5,0 мг/мл, о чем свидетельствует снижение перекисного гемолиза эритроцитов в 2,2 раза, а осмотического гемолиза в 1,8 раза, по сравнению с контролем. Увеличение дазы испытуемого фитосредства до 10,0 мг/мл сопровождается снижением устойчивости мембраны эритроцитов к действию реактива Фентона.
Исследование проведено на крысах обоего пола линии Wistar. Животным опытной группы вводили внутрижелудочно водный раствор сухого экстракта «Пентахолефита» однократно в дозе25 мг/кг, 50 мг/кг100 мг/кг, 200 мг/кг в объеме 1 мл/100 г веса животных. Животные контрольной группы получали эквиобъ-емное количество дистиллированной воды. Влияние «Пентахолефита» на желче-образовательную и желчевыделительную функции печени оценивали по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи по методике Скакуна Н.П. и Олейник А.Н., а также определяли количество выделенного с желчью билирубина по методу Ван-ден-Берга в модификации Скакуна Н.П. (1967), а концентрацию общего холестерина в желчи – по методу Дроговоз С.М. (1971) и суммарную концентрацию желчных кислот в печени по методу Карбач Я.И. (1961).
Результаты опыта приведены в таблице 3.4.11, из которых следует, что у крыс, получавших «Пентахолефит» в дозе 50 мг/кг массы тела, отмечалась наибольшая желчегонная активность. В ходе эксперимента отмечалось, что скорость секреции желчи через 2, 3, 4 часа возрастала на 19%, 18% и 21% соответственно, по сравнению с аналогичными данными в контрольной группе. Так, общее количество выделенной желчи за 5 часов наблюдения в опытной группе, получавшей «Пентахолефит», увеличилось на 24%, по сравнению с контрольной группой. Хо-леретическая реакция оставалась на высоком уровне в течение 5 часов. При этом «Пентахолефит» стимулировал выделение желчных кислот с желчью, суммарная концентрация которой превышала аналогичный показатель у крыс контрольной группы на 19%. Также данное фитосредство повышало выделение с желчью билирубина на 39% и холестерина на 59%.
При увеличении дозы экстракта до 100 мг/кг скорость секреции желчи на 2 час возрастала на 12% и при дальнейшем увеличении дозы экстракта отмечено снижение холеретической реакции у крыс. При введении экстракта в дозах 100 мг и 200мг/кг содержание билирубина в желчи повышалась на 24% и 25%, соответственно, и содержание холестерина – на 25% и 57% (табл.3.4.11).
Влияние водного отвара сухого экстракта «Пентахолефит» на функциональное состояние почек белых крыс изучали при однократном введении в желудок в дозе 50 мг/кг в объеме 1 мл на 100 г массы животных за 1 час до начала сбора мочи. Контрольной группе крыс внутрижелудочно однократно вводили в соответствующем объеме дистиллированную воду. Диуретическую активность фитос-редства оценивали по объему выделенной мочи за 4 часа [14] и удельному весу. Одновременно в полученной моче определяли содержание белка, желчных кислот и глюкозы, pН мочи. Результаты проведенных исследований приведены в табли-це3.6.12.
Из представленных данных следует, что введение «Пентахолефита» в указанной дозе сопровождалось увеличением диуреза через 4 часа на 32,5%, по сравнению с показателями животных интактной группы. Удельный вес мочи сохранялся в пределах физиологических колебаний и составлял 1011-1020. Белок в моче животных отмечался в незначительных количествах, и, как правило, концентрация его не превышала физиологических норм; рН мочи оставалась в пределах физиологических норм; у животных, получавших фитосредство, в моче глюкоза и желчные кислоты не обнаружены
Патоморфологические исследования печени опытных животных при использовании «Пентахолефита» при этаноло-вом повреждении печени
Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют, что повреждение печени крыс тетрахлорметаном сопровождается развитием синдрома цитолиза и холестаза (табл. 5.1.25). Так, к 7 суткам исследования под влиянием указанного гепатотропного яда отмечается повышение активности мембраносвязанных ферментов сыворотки крови белых крыс: активность АлТ возрастает на 78%, АсТ – на 65%, содержание щелочной фосфатазы повышается на 76% , а общего билирубина - в 2,9 раза, по сравнению с данными у интактных крыс. Показатели тимоловой пробы у крыс контрольной группы возрастают в 4,5 раза, содержание-липопротеидов на 85%, а содержание холестерина на 33%,по сравнению с интактной группой лабораторных животных.
При курсовом введении «Пентахолефита» в дозе 50 мг/кг на 7 сутки на фоне токсического гепатита активность АлТ и АсТ снижается, по сравнению с контролем соответственно на 32% и 28%; содержание щелочной фосфатазы и билирубина в сыворотке крови снижается в среднем на 32% и 23%, соответственно, по сравнению с показателями контрольной группы. Показатели тимоловой пробы снизились на 21%, а содержание холестерина и -липопротеидов снижается на 24% и 12%, соответственно, по сравнению с контролем. Такая же тенденция сохраняется и в последующие сроки наблюдения (14 и 21 сутки). При исследовании на 14 и 21 сутки эксперимента активность аминотрансфераз, показатели тимоловой пробы, общего билирубина у крыс опытной группы, получавших ЭС «Пентахолефит», также была достоверно ниже, чем у животных контрольной группы. В контрольной группе к концу эксперимента, через 21 сутки, остаются высокими показатели АлТ, АсТ, общего билирубина, щелочной фосфатазы и тимоловой пробы, что свидетельствует о продолжающемся патологическом процессе. Эффективность испытуемого фитосредства «Пентахолефит» по ряду показателей превосходила аналогичные показатели у препарата сравнения
Как следует из таблиц5.1.26, интоксикация тетрахлорметаном сопровождается выраженным нарушением секреторной функции печени белых крыс. Установлено, что курсовое введение «Пентахолефита» на 7 сутки опыта оказывает умеренное желчегонное действие, стимулируя скорость секреции желчи. Более заметное влияние «Пентахолефита» на скорость секреции желчи оказывает к 2,3 и 4 часу наблюдения, соответственно, на 24%, 28% и 35%, по сравнению с контрольной группой, при этом содержание в желчи желчных кислот возросло на 12%, билирубина на 16% и холестерина на 23%, по сравнению с контролем.
Введение тетрахлорметана белым крысам сопровождается резко выраженным нарушением экскреторно-выделительной и детоксицирующей функции печени, на что указывает задержка элиминации ксенобиотиков из организма (табл. 5.1.27).Так, скорость выведения бромсульфалеина (БСФ) и антипирина с желчью у животных, получавших гепатотропный яд, резко снижается, период их полувыведения соответственно на 45% и 21% превышает показатели у интактных крыс. Таблица 5.1.27 - Влияние «Пентахолефита» на антитоксическую функцию печени белых крыс при повреждении тетрахлорметаном (7 сутки) (n=8)
На фоне курсового введения испытуемого средства скорость элиминации БСФ и антипирина с желчью повышается соответственно на 21% и 15% по сравнению с показателями у крыс контрольной группы. Полученные данные свидетельствуют об активации экскреторной функции печени под влия нием испытуемого средства.
Как следует из таблицы 5.1.28, повреждение печени тетрахлорметаном вызывает резкую активацию процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), о чем свидетельствуют повышение концентрации продуктов перок-сидации липидов в тканях, а также угнетение активности эндогенной антиокислительной системы организма животных контрольной группы. В частности, под влиянием указанного гепатотоксина в сыворотке крови и в гомогенате печени отмечается накопление одного из продуктов процесса перекис-ного окисления липидов – малонового диальдегида (МДА), снижение активности каталазы и уменьшение концентрации сульфгидрильных групп в сыворотке крови крыс контрольной группы. Также установлено, что курсовое введение «Пентахолефита» крысам с токсическим гепатитом сопровождается снижением интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Так, концентрация МДА в сыворотке крови и в гомогенате печени животных этой группы снижается соответственно на 59% и 52%, по сравнению с аналогичными показателями крыс контрольной группы. Одновременно с этим под влиянием испытуемого средства отмечается повышение мощности антиокислительной системы организма: активность каталазы возрастает в 2,0 раза, а содержание сульфгидриль-ных групп в сыворотке крови повышается на 20%, по сравнению с таковыми у крыс контрольной группы.
В печени животных на 7 день эксперимента наблюдали следующие деструктивные изменения (рис. 5.2.13): рисунок долек сглажен, балочное строение нарушено (а). В цитоплазме центрально расположенных гепатоцитов отмечаются признаки средне- и мелкокапельной жировой дистрофии (б).
Печень белой крысы. 7-е сутки эксперимента. Тетрахлорметан. Гематоксилин-эозин. Ок. 10. Об. 20. 14-й день эксперимента (рис 5.2.14) характеризуется дальнейшим развитием морфологических изменений. Балочное строение печеночной ткани полностью нарушено (а). Гепатоциты резко увеличены в размере, их цитоплазма представлена в виде крупных вакуолей (б). Ядро смещено к клеточной мембране (в). В отдельных клетках наблюдается полный лизис ядер (г).
Для 21-го дня эксперимента (рис. 5.2.15) характерно резкое нарушение балочного строения печеночной ткани (а). При этом гепатоциты не связаны друг с другом и в беспорядке расположены по всему полю зрения (б). Большинство центрально расположенных клеток находятся в состоянии крупнокапельной жировой дистрофии (в). Ядра смещены к клеточной мембране и находятся в состоянии пикноза или рексиса, многие ядра подверглись лизису (г). В печеночных клетках, расположенных по периферии долек отмечается средне- и мелкокапельная жировая дистрофия (д). д
На фоне применения препарата «Пентахолефит» деструктивные изменения в печени животных на 7 день эксперимента выражены менее, чем в группе животных, подвергшихся интоксикации тетрахлорметаном (рис. 5.3.16). Балочное строение умеренно выражено (а). В цитоплазме центрально расположенных гепатоцитов отмечаются признаки мелкокапельной жировой дистрофии (б). Размер ядер сохранен (в). Рисунок 5.3.16– Печень белой крысы. 7-е сутки эксперимента. Тетрахлорметан + «Пента-холефит» Гематоксилин-эозин. Ок. 10. Об. 20.
На 14-й день эксперимента значительных изменений гистологической структуры органа нами не выявлено (рис 5.3.17). Основным изменением на данном этапе явилось увеличение количества жировых капель в цитоплазме гепатоцитов (а – среднекапельная жировая дистрофия). Отмечены клетки с выраженной картиной митозов (б). б
Влияние Холосаса на патоморфологические изменения в печени опытных животныхпри тетрахлорметановом повреждении печени. На фоне применения препарата «Пентахолефит» в печени животных, подвергшихся интоксикации тетрахлорметаном, на 7 день эксперимента (рис 5.4.19) изменения характеризуются умеренно выраженной жировой дистрофией: балочное строение выражено (а), цитоплазма центрально расположенных гепатоцитов заполнена мелкими каплями жира (б), форма клеток и размер ядер сохранены (в).