Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Коррекция вторичных иммунодефицитов растительными лекарственными средствами 11
1.2. Иммунотропные свойства биологически активных веществ лекарственных растений 23
1.3. Характеристика Gentiana algida Pall 30
Глава 2. Материалы и методы исследований 33
Глава 3. Влияние экстракта gentiana algida на состояние иммунной системы у интактных животных 44
ГЛАВА 4. Фармакотерапевтическая эффективность экстракта gentiana algida при экспериментальной иммуносупрессии, вызванной азатиоприном 52
4.1. Оценка влияния экстракта Gentiana algida на массу и клеточность
иммунных органов мышей при азатиоприновой иммуносупрессии 52
4.2. Исследование влияния экстракта Gentiana algida на состояние гуморального звена иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии 53
4.3. Оценка воздействия экстракта Gentiana algida на состояние клеточного звена иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии. 55
4.4. Изучение фагоцитарной активности макрофагов под действием экстракта Gentiana algida при азатиоприновой иммуносупрессии 56
4.5. Влияние экстракта Gentiana algida на морфофункциональное состояние тимуса и селезенки при азатиоприновой иммуносупрессии 57
4.6. Определение антиоксидантных свойств экстракта Gentiana algida при азатиоприновой иммуносупрессии 72
ГЛАВА 5. Иммуномодулирующие свойства индивидуальных извлечений, выделенных из gentiana algida, при азатиоприновой иммунодепрессии 75
5.1. Влияние фракций (этилацетатной, полисахаридной, хлороформной и бутанольной), выделенных из Gentiana algida, на состояние гуморального, клеточного и макрофагального звеньев иммунного ответа 75
5.2. Оценка воздействия индивидуальных извлечений (ориентина, гентиопикрозида и олеаноловой кислоты), полученных из Gentiana algida, на состояние основных звеньев иммунитета 78
ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 82
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы
- Иммунотропные свойства биологически активных веществ лекарственных растений
- Исследование влияния экстракта Gentiana algida на состояние гуморального звена иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии
- Изучение фагоцитарной активности макрофагов под действием экстракта Gentiana algida при азатиоприновой иммуносупрессии
- Оценка воздействия индивидуальных извлечений (ориентина, гентиопикрозида и олеаноловой кислоты), полученных из Gentiana algida, на состояние основных звеньев иммунитета
Введение к работе
Актуальность темы. В клинической практике все чаще возникает необходимость в дополнении медикаментозной базовой терапии основного заболевания иммунотропными препаратами. Вызвано это ухудшением экологической обстановки, возникновением «вспышек» новых особо опасных вирусных заболеваний, бесконтрольным использованием антибиотиков, оказывающих ингибирующее действие на иммунную систему, «убыстрением» темпов жизни, что ведет к усилению стрессового воздействия на организм (Корнева Е.А. и др., 2010; Ходжимухамедова Н.А., 2010; Любошенко Т.М., 2014; Glaser R., Keicolt-Glaser J., 2005; Webster Marketon J.I., Glaser R., 2008; Dhama K. et al., 2015). Патогенез многих заболеваний, в том числе социально значимых, сопровождается развитием вторичных иммунодефицитных состояний. В связи с их широким распространением и ограниченным перечнем лекарственных средств для профилактики и лечения, поиск новых эффективных иммуномо-дулирующих средств является актуальной задачей медицинской науки и практического здравоохранения (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2005; Сепиа-швили Р.И., 2015; Patil U.S. et al., 2012; Saroj P. et al., 2012).
Одновременно и рационально назначенные этиотропные, патогенетические, симптоматические и иммунокорригирующие методы терапии в итоге приводят к скорейшему выздоровлению пациентов без продолжительного реабилитационного периода и других осложнений (Астафьева Н.Г., 2008; Корепанов С.В., Опенко Т.Г., 2012; Зинченко С.В., 2014). Для достижения полного выздоровления, без перехода основного заболевания в хроническое течение и предотвращения развития рецидивов, необходимо добиться нормализации показателей всех звеньев иммунной системы (Фомин В.В. и др., 2008; Балыкова Л.А., 2010; Ревякина В.А., 2013; Савенкова М.С., 2014; Karaulov A.V., Kokushkov D.V., 2005).
Как в отечественной, так и в зарубежной литературе подчеркивается, что одним из активно развивающихся направлений в создании иммунопротекто-ров является использование фитопрепаратов, поскольку они обладают более физиологическим действием, низкой токсичностью и отсутствием выраженных побочных эффектов (Лазарева Д.Н. и др., 2005; Авдеева Е.В., Куркин В.А., 2007; Коваленко Л.П. и др., 2008; Сакович Г.С. и др., 2010; Gertsch J. et al., 2011; Kumar S. et al., 2011; Karami B. et al., 2013). Многие из представленных научных данных по изучению иммунотропных фитосредств являются противоречивыми и, во многом, носят скрининговый характер (Угнич К.А. и др., 2008; Шмагель К.В., 2008; Yoshikazu M., Routes J.M., 2008; Sanz J.M. et al., 2009; Browne S.K., Holland S.M., 2010; Park H.J. et al., 2014).
В связи с необходимостью реализации программы по импортозамещению лекарственных средств перспективным направлением представляется создание оригинальных отечественных иммуномодуляторов, которые могли бы эффективно конкурировать с зарубежными препаратами, в настоящее время представляющими большую часть Российского фармацевтического рынка (Вельмяйкина Е.И., 2012; Куркин В.А. и др., 2014). Лекарственные растения, характеризующиеся значительными сырьевыми запасами и обладающие широким спектром фармакологической активности, являются наиболее перспективными для создания на их основе эффективных
препаратов. Преимущество лекарственных растений заключается еще и в том, что они действуют на организм всем комплексом содержащихся в них веществ (Митрофанова И.Ю. и др., 2013). С учетом имеющихся предпосылок, перспективным источником сырья для создания эффективных и безопасных иммуномодуляторов является горечавка холодная – Gentiana algida Pall. Исследования фармакологической активности суммарных препаратов и индивидуальных соединений из G. algida показали наличие антибактериального (Корнопольцева Т.В. и др., 2007), гемостатического (Шишкина Е.С. и др., 1975), противотрихомонадного (Рубинчик М.А., 1972), антифунгального (Tan R.X. et al., 1996) и противовоспалительного эффектов (Хоцаев Ж.Ц., 2001). Высокая эффективность извлечений, полученных на основе горечавки холодной, при хронических инфекционных процессах и заболеваниях, в патогенезе которых существенное значение имеют нарушения иммунологической реактивности организма, предполагает наличие у них иммуномодулирующей активности (Хоцаев Ж.Ц., 2001; Корнопольцева Т.В. и др., 2007).
Целью исследования явилось определение фармакотерапевтической эффективности экстракта сухого из надземной части Gentiana algida при экспериментальном вторичном иммунодефиците.
Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:
-
определить влияние экстракта из надземной части G. algida на функциональное состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета у интактных животных;
-
оценить фармакотерапевтическую эффективность экстракта G. algida при экспериментальной иммуносупрессии, вызванной азатиоприном;
-
изучить влияние фракций и индивидуальных соединений, выделенных из надземной части G. algida, на состояние основных звеньев иммунной системы организма при азатиоприновой иммунодепрессии;
-
сопоставить эффективность экстракта G. algida и препарата сравнения – «Иммунал».
Научная новизна. В работе впервые установлена выраженная фармакоте-рапевтическая эффективность экстракта сухого из надземной части Gentiana algida Pall. при экспериментальном вторичном иммунодефиците, вызванном цитостатиком азатиоприном. Показано, что курсовое введение per os животным экстракта G. algida в экспериментально-терапевтических дозах ослабляет супрессивное действие азатиоприна, что выражается в повышении массы и клеточности иммунных органов – тимуса и селезенки, абсолютного и относительного числа антителообразующих клеток, индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. При этом действие исследуемого экстракта сопоставимо с таковым препарата сравнения – «Иммунал». Введение мышам экстракта G. algida на фоне азатиоприна нормализует морфофункциональное состояние тимуса и селезенки, что выражается в ограничении деструктивных процессов за счет увеличения количества клеток лимфоидного ряда и восстановления структурных компонентов органов.
Установлено, что введение иммунодепрессированным мышам фракций (этилацетатной, полисахаридной, хлороформной и бутанольной), а также индивидуальных веществ (ориентина, гентиопикрозида и олеаноловой кислоты),
выделенных из G. algida, способствует восстановлению показателей иммунитета в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, антителообразо-вания и фагоцитоза перитонеальных макрофагов. Наиболее выраженным им-муномодулирующим эффектом из фракций обладают этилацетатная и поли-сахаридная; из индивидуальных веществ – ориентин и олеаноловая кислота. Этилацетатная фракция, ориентин и олеаноловая кислота оказывают преимущественное влияние на фагоцитарную активность макрофагов, а полисаха-ридная фракция проявляет выраженное действие в отношении клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа.
Иммуномодулирующий эффект экстракта G. algida обусловлен способностью указанных биологически активных веществ ингибировать процессы сво-боднорадикального окисления биомакромолекул, стабилизировать мембраны иммунокомпетентных клеток и повышать активность ферментов антиокси-дантной защиты организма.
Показано, что экстракт G. algida не изменяет показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа у интактных животных, что характерно для иммуномодуляторов, обладающих эффективностью при нарушениях функций иммунной системы организма.
Практическая значимость. Экспериментально обоснована возможность и целесообразность коррекции вторичных иммунодефицитов растительными средствами – экстрактом сухим из надземной части Gentiana algida и выделенными из нее индивидуальными соединениями, что позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью создания новых эффективных и безопасных растительных иммуномодулирующих препаратов.
Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедрах общей патологии человека; фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского института ФГБОУ ВО «Бурятский государственный университет» Минобрнауки РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
экстракт G. algida не изменяет показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа у интактных животных;
введение мышам экстракта G. algida в условиях иммуносупрессии способствует ослаблению супрессивного действия цитостатика азатиоприна, восстанавливая массу и клеточность иммунных органов – тимуса и селезенки, показатели основных звеньев иммунного ответа (индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа, абсолютного и относительного числа АОК, фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа), нормализуя структуру и функции тимуса и селезенки на фоне повышения антиоксидантного статуса организма;
наиболее выраженным иммуномодулирующим действием при азатио-приновой иммуносупрессии обладают выделенные из надземной части G. al-gida этилацетатная и полисахаридная фракции, а также индивидуальные вещества – ориентин и олеаноловая кислота;
эффективность исследуемого растительного средства сопоставима с действием референтного препарата – «Иммунал».
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: XX всемирном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Нью-Йорк, 2014); Международном форуме
«Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань, 2014); IV Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 25-летию Центра Восточной медицины (Улан-Удэ, 2014); XIII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2015); Международном конгрессе «Инновационные технологии в иммунологии и аллергологии» (Москва, 2015); International scientific conference «Current situation and future trends of drug research and development from natural sources» (Ulaanbaatar, 2015); III научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых «Молодые ученые и фармация XXI века» (Москва, 2015); Объединенном конгрессе: Первый конгресс по традиционной медицине стран ШОС/БРИКС/ЕАЭС и Третий российский конгресс по комплементарной медицине (Москва, 2015); VI Международной научно-практической конференции «Экология. Здоровье. Спорт» (Чита, 2015); Fifth International Conference of Traditional Medicine «The best practices of Mongolian medicine» (Ulaanbaatar, 2016).
Связь задач исследований с проблемным планом НИР. Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН в соответствии с задачами по проекту № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», утвержденному президиумом СО РАН.
Личный вклад автора. Автором диссертационной работы проведен поиск и анализ данных по теме; осуществлены планирование и проведение экспериментальных исследований, обработка, интерпретация и обсуждение полученных результатов; подготовлены публикации по основным положениям диссертационной работы; оформлена рукопись диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 6 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 122 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных экспериментальных исследований (3 глав), обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, включающего 203 источника, из которых 59 – на иностранных языках. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 18 рисунками, включая микрофотографии.
Иммунотропные свойства биологически активных веществ лекарственных растений
Интерес исследователей к разработке иммуномодуляторов растительного происхождения объясняется тем, что вторичные иммунодефицитные состояния обычно развиваются на фоне и сосуществуют с другими хроническими или острыми заболеваниями. Поэтому при иммунокоррекции необходимо избежать побочного действия препаратов, чтобы не усугубить состояние; оказать как можно более мягкое действие на ослабленный организм, так как для достижения эффекта от терапии требуется длительный курс приема иммуномодуляторов, все это позволяет рекомендовать фитопрепараты для коррекции иммунных нарушений.
В настоящее время основным видом сырья для создания иммуномодуляторов является лекарственное растение Echinacea (сем. Asteraceae) (Дронов, Эрдес, 2011). В России для фармацевтической промышленности растительное сырье эхинацеи пурпурной произрастает на Урале, Самарской области и в Ставропольском крае (Брыкалов и др., 2009; Костылев и др., 2009, Куркин и др., 2010). Начали использовать это растение на его родине в Северной Америке, история применения его в Европе насчитывает около 1,5 веков. В качестве лекарственного сырья используют траву, заготовленную в фазу цветения, также корневища и корни, выкопанные осенью. Эхинацея пурпурная (Echinacea purpurea (L.) Moench) обладает выраженными иммуностимулирующими и противовоспалительными свойствами, ее значительная фармакологическая активность обусловлена наличием биологически активных веществ (БАВ): фенилпропаноиды, производные коричных кислот, цикориевая кислота, хлорогеновая и кофейная кислоты, полисахариды и их мономеры, инулин и фруктаны, фенолкарбоновые кислоты и их производные, флавоноиды: никотифлорин и рутин, ненасыщенные углеводороды, алкиламиды ненасыщенных кислот, смолы, дубильные вещества (Куркин и др., 2010; Фарниева, 2010). В литературе представлены многочисленные сведения об изучении иммуностимулирующих свойств и применении препаратов эхинацеи (Дронов, Эрдес, 2011; Капай и др., 2010; Литвинова, 2014; Сакович и др., 2010; Хорошилова, 2014; Barret, 2003; Bauer, 2002; Schwarz et al., 2002; Rininger et al., 2000). Оценка влияния препаратов «Ликопид» и «Иммунал» (сок из травы эхинацеи пурпурной) на клеточное звено иммунного ответа показала, что наиболее выраженную иммуностимулирующую активность проявил «Ликопид», в меньшей степени - «Иммунал» (Дугина и др., 2010).
В литературе имеется достаточно данных о влиянии лекарственных средств, полученных из различных видов лекарственных растений.
Так, в работе О. С. Борсук и др. (2009) представлены данные о выраженной иммуномодулирующей активности экстрактов, выделенных из календулы лекарственной, рябины сибирской и алтея лекарственного, при циклофосфановой иммуносупрессии. Применение экстрактов выявило их положительное действие на показатели неспецифической резистентности и гуморального звена иммунного ответа.
Родиола розовая, женьшень и элеутерококк (семейство аралиевых), широко применяющиеся в качестве адаптогенов, согласно некоторым исследованиям, обладают иммуностимулирующим действием (Крендаль и др., 2007).
По данным работы Е. И. Кондратенко и др. (2012) установлено иммуномодулирующее действие в отношении неспецифических иммунных реакций у экстракта из семян лотоса орехоносного.
В. В. Бортниковой и др. (2015) были проведены эксперименты на мышах линии СВА по изучению влияния экстракта, выделенного из красных листьев винограда, на гуморальный и клеточный иммунитет. Установлено, что при внутрибрюшинном введении экстракта из красных листьев винограда в дозе 100 мг/кг увеличивается число АОК в селезенке и титр гемагглютининов в сыворотке крови более чем в 3 раза по сравнению с контролем. При этом средство не оказывает стимулирующего действия на клеточный иммунитет при антигенной нагрузке эритроцитами барана. В работе С. Г. Зайчиковой (2002) было установлено стимулирующее влияние экстрактов чины посевной, луговой и лесной в дозе 0,1 мг/мл на фагоцитарную активность нейтрофилов человека. Также, в экспериментах на мышах было установлено повышение фагоцитоза стафилококков после внутрибрюшинного введения экстрактов. Результаты исследований по фагоцитарной активности экстракта чины посевной были сопоставимы с действием иммуномодулятора интерлейкина-2 (Пролейкин, Голландия).
Экспериментально выявлено, что экстракт из корня солодки голой усиливает фагоцитирующую способность перитонеальных макрофагов и миелопероксидазной системы у мышей, зараженных M. tuberculosis (Назарова и др., 2010).
В работе А. С. Аргынбековой (2007) выявлено иммунокорригирующее влияние экстракта из почек тополя бальзамического. В эксперименте при воздействии общего сублетального гамма-излучения после применения фитопрепарата увеличилось число лимфоцитов селезенки, костного мозга и тонкого кишечника.
Sh. Pandey (2012) установлено иммунотропное влияние экстракта из корней Saussurea lappa. В эксперименте на мышах установлено, что введение экстракта в дозе 200 мг/кг улучшает показатели клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа.
В работе Р. И. Лукашова (2013) исследовано иммуностимулирующее действие спиртового экстракта, полученного из цветков рудбекии шершавой. В опытах in vitro выявлено иммунотропное влияние экстракта на гуморальное звено иммунного ответа, что выражается в активизации выработки иммуноглобулинов.
Исследователи M. Kannan, R. Singh (2010) выявили иммуностимулирующие свойства у экстракта из листьев Nyctantes arborristis Linn. Животным, перенесшим анафилактический шок, вводили испытуемый экстракт из индийского лекарственного растения, что способствовало повышению массы и клеточности селезенки, стимуляции антителогенеза, пролиферации лейкоцитов и синтезу антител-гемагглютининов.
D. G. Kanjwani (2008) исследовано иммунокорригирующее действие метанолового экстракта Piper betel, в состав которого вошли полисахариды, таннины, фенолы и флавоноиды. Установлено, что данный экстракт ингибировал пролиферацию лимфоцитов периферической крови, в результате был снижен ответ клеточного и гуморального звеньев иммунной системы. В работе предполагается возможность дальнейшего исследования и применения данного средства для терапии аутоиммунных заболеваний и коррекции других иммунных нарушений.
Исследователями А. Bussing (2006), E. Sriramulu (2006) установлено иммуностимулирующее действие экстрактов из Viscum album L.
Индийским ученым H. N. Shivaprasad (2006) доказано положительное влияние водного экстракта из Terminalia chebula на состояние иммунной системы.
Исследователи Л. А. Кумышева и др. (2009) установили иммуномодулирующие свойства сборов, состоящих из листьев подорожника большого, корневищ и корней синюхи голубой, кровохлебки лекарственной и девясила высокого, цветков ромашки аптечной, календулы лекарственной, корневищ лапчатки прямостоячей и травы тысячелистника обыкновенного. На фоне иммунодепрессии, вызванной антибиотиками, фитосборы проявили стимулирующее действие в отношении гуморального звена иммунного ответа.
Исследование влияния экстракта Gentiana algida на состояние гуморального звена иммунного ответа при азатиоприновой иммуносупрессии
Количество АОК определяли с использованием модифицированного A. J. Cunningham (1965) метода, предложенного N. Jerne, A. Nordin (1963). Метод основан на способности антиэритроцитарных антител, секретируемых АОК иммунизированных животных, лизировать в присутствии комплемента ЭБ. Если в монослое эритроцитов содержатся клетки-антителопродуценты, в месте их расположения формируются прозрачные зоны локального гемолиза — бляшки.
Мышей иммунизировали внутрибрюшинно в дозе 2 х 108 клеток на мышь. Реакцию ставили на 5-е сутки после иммунизации. Готовили смесь равных объемов суспензии лимфоидных клеток (1 селезенка гомогенизирована в 5 мл среды), ЭБ (10%) и комплемента (1:5) непосредственно перед постановкой реакции. Полученную смесь разливали в стеклянные камеры, представляющие собой два предметных стекла, соединенных между собой по краям парафином, учитывая объем входящей суспензии. Камеры инкубировали в течение 1 часа при 37 оС и подсчитывали с помощью лупы зоны гемолиза по всей камере. Реакцию характеризовали количеством АОК на 1 селезенку и на 106 клеток с ядрами. Формула для определения абсолютного числа АОК на селезенку: Число АОК на селезенку = n x A x B x C V n- число зон гемолиза, А - доля лимфоидных клеток в смеси лимфоциты: ЭБ: комплемент В - объем суспензии С - степень разведения лимфоцитов V - объем камеры Формула для определения числа АОК на 106 спленоцитов: Число АОК на = абсолютное число АОК на селезенку 106 спленоцитов количество клеток на селезенку Методы по оценке функциональной активности фагоцитов Фагоцитоз перитонеальных макрофагов (ПМ) в отношении частиц коллоидной туши Для изучения фагоцитоза перитонеальных макрофагов были использованы частицы коллоидной туши. Через 24 часа после окончания 14-дневного перорального приема экстракта G. algida фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов оценивали по интенсивности захвата ими частиц туши, введенной животным внутрибрюшинно в виде 0,05% суспензии, в объеме 2,0 мл. Через 10 минут брюшную полость промывали 5 мл NaCl 0,9%. Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) трижды отмывали и ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. В камере Горяева подсчитывали концентрацию ядросодержащих клеток (ЯСК) % фагоцитирующих клеток. Затем клетки осаждали центрифугированием, супернатант удаляли, а осадок КПЭ лизировали дистиллированной водой. Лизаты КПЭ помещали в плоскодонные планшеты и определяли с помощью спектрофотометра Uniscan (Финляндия) при = 620 нм оптическую плотность, отражающую количество туши поглощенной перитонеальными макрофагами (Руководство, 2005). Результаты выражали в у.е., отражающих оптическую плотность лизата КПЭ, соотнесенную с количеством фагоцитирующих клеток (фагоцитарный индекс).
Фагоцитоз перитонеальных макрофагов (ПМ) в отношении Staphylococcus aureus
Исследование реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов в отношении Staphylococcus aureus проводилось по методике И. С. Фрейдлин (1976). Популяцию клеток, богатую макрофагами, получали из перитонеальной полости мышей, которым за 3 суток до опыта вводили внутрибрюшинно 3-5 мл 1-2 % стерильного раствора крахмала. Брюшную полость мышей, забитых путем дислокации шейных позвонков, промывали 5 мл охлажденной среды 199, содержащей 5 % инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и 5 ед/мл гепарина. Смыв отсасывали из брюшной полости пастеровской пипеткой и фильтровали через капроновый фильтр в сосуд при температуре 4 С. Подсчитывали количество клеток в 1 мл суспензии в счетной камере Горяева. 2 мл макрофагов (1х10 6 клеток/мл) вносили в пенициллиновые флаконы с половинками покровных стекол и инкубировали во влажной камере с 5 % СО2 в воздухе при 37 С. Через 2 часа среду сливали, удаляя вместе с нею неприлипшие клетки. Во флаконы вносили по 2 мл свежей среды для культивирования, приготовленной на среде 199 с добавлением 15 % сыворотки крупного рогатого скота, 3 % глютамина. Через 24 часа среду меняли на свежую. В пенициллиновые флаконы с монослоем макрофагов на покровных стеклах вносили 1,8 мл питательной среды и 0,2 мл раствора суточной культуры на МПА St. aureus в стерильном физиологическом растворе (2.5х106 клеток/мл). Инкубировали в течение 1 часа при 37 С. Затем покровные стекла с монослоем макрофагов отмывали в стерильной среде Хенкса. Клетки фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.
Поглотительная активность фагоцитов в отношении Staphylococcus aureus
Поглотительную активность фагоцитов периферической крови человека оценивали методом цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США), используя в качестве объекта для фагоцитоза St. aureus, меченный зеленым флюорохромом флюоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ). Вычисляли фагоцитарный индекс – количество фагоцитов, поглотивших меченные микроорганизмы, к общему числу фагоцитов (Пинегин и др., 2001).
Продукция активных форм кислорода нейтрофилами
Продукцию активных форм кислорода нейтрофилами периферической крови здоровых доноров оценивали цитофлуориметрически в тесте кислородного «взрыва», индуцированного классическим стимулятором -форболмиристат ацетатом (ФМА) с флуорогенным субстратом дигидрородамином – 123 (ДГР-123). Активность нейтрофилов анализировали по интенсивности свечения красителя ДГР-123 с помощью проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500. Определяли процент активированных нейтрофилов, а также показатели спонтанной и стимулированной интенсивности флуоресценции (Пинегин и др., 2001).
Изучение фагоцитарной активности макрофагов под действием экстракта Gentiana algida при азатиоприновой иммуносупрессии
Изучение острой токсичности экстракта G. algida проводили на крысах обоего пола линии Wistar при внутрибрюшинном и внутрижелудочном однократном введении экстракта. В результате проведенных исследований установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении экстракта G. algida DL50 составила 3100 мг/кг. При внутрижелудочном введении высоких доз экстракта (от 2000 мг/кг до 5000 мг/кг) в течение первых 2 суток у животных наблюдались признаки общей интоксикации в виде гиподинамии, потери аппетита, учащения дыхания, при этом гибели животных не наблюдалось в течение 14 суток наблюдения. Таким образом, полученные данные позволяют отнести экстракт G. algida по классификации К. К. Сидорова (1973) к группе малотоксичных веществ.
Для выяснения возможного дозозависимого эффекта экстракта G. algida нами проведены исследования по влиянию испытуемого средства в дозах: 100, 200 и 500 мг/кг на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши при азатиоприновой иммуносупрессии. Установлено, что экстракт G. algida в дозах 200 и 500 мг/кг увеличивает фагоцитарный индекс в 1,5 и 1,3 раза, соответственно, по сравнению с данными у животных, получавших азатиоприн, тогда как под влиянием исследуемого средства в дозе 100 мг/кг не происходило существенного увеличения данного показателя (таблица 3.1).
На основании полученных данных в дальнейших экспериментах нами проведена оценка влияния экстракта G. algida на состояние иммунной системы организма с использованием экспериментально-терапевтической дозы 200 мг/кг.
Опыты проведены на мышах линии CBA массой 20-22 г. Экстракт G. algida вводили перорально в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг 1 раз в сутки в течение 14 дней. Препарат сравнения «Иммунал» вводили в дозе 5 мл/кг ежедневно в течение 14 дней. Интактная группа животных получала очищенную воду по аналогичной схеме. Данные о влиянии экстракта G. algida на относительную массу и клеточность центральных (тимуса) и периферических (селезенки) органов иммунной системы представлены в таблице 3.2. Таблица
Как видно из таблицы 3.2, экстракт G. algida в дозе 200 мг/кг и референтный препарат «Иммунал» не вызывали значимых изменений массы и клеточности тимуса и селезенки у интактных животных.
Влияние экстракта G. algida на функциональное состояние основных звеньев системы иммунитета
При исследовании влияния экстракта G. algida и препарата сравнения - «Иммунал» на процессы антителообразования установлено, что данные средства значимо не изменяют как абсолютное число АОК, так и число АОК на 106 спленоцитов по сравнению с теми же показателями в интактной группе (таблица 3.3). Таблица 3.3 – Влияние экстракта G. algida на антителообразование
Группы животных Абсолютное число АОК на селезенку Число АОК на 106 спленоцитов Интактная, n=10 66591+4997 166,1+12,93 Опытная 1 (экстракт G. algida), n=10 59986+4845 151,3+11,64 Опытная 2 («Иммунал»), n=10 71242 + 5732 181,2 +14,78 При исследовании влияния экстракта G. algida и препарата «Иммунал» на клеточно-опосредованную реакцию ГЗТ установлено, что испытуемые средства не оказывают существенного влияния на индекс реакции ГЗТ по сравнению с таковым в интактной группе (таблица 3.4).
При исследовании влияния экстракта G. algida и препарата «Иммунал» на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши не наблюдали достоверно значимого изменения фагоцитарного индекса по сравнению с данными в интактной группе (таблица 3.5).
При оценке влияния экстракта G. algida на поглотительную активность нейтрофилов периферической крови человека в отношении St. aureus, меченного зеленым флюорохромом ФИТЦ, отмечено, что данное средство не оказывает существенного влияния на поглотительную активность нейтрофилов. Так, количество фагоцитирующих нейтрофилов под влиянием экстракта G. algida не изменялось по сравнению с таковым в контрольной группе (рисунок 3.1).
При исследовании влияния экстракта G. algida на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами установлено, что указанное средство значимо не изменяет процент ФМА-активированных нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода, по сравнению с данными в контрольной группе (рисунок 3.2).
Использование экстракта G. algida достоверно снижает интенсивность флуоресценции нейтрофилов в 1,6 раза по сравнению с введением в систему классического стимулятора ФМА, индуцирующего кислородный «взрыв» (таблица 3.6).
Оценка воздействия индивидуальных извлечений (ориентина, гентиопикрозида и олеаноловой кислоты), полученных из Gentiana algida, на состояние основных звеньев иммунитета
Поиск источников новых лекарственных препаратов для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний является одной из актуальных проблем иммунофармакологии. Современные исследования свидетельствуют о том, что нарушения в иммунной системе лежат не только в основе хронизации инфекционных заболеваний и персистенции возбудителей, но и являются основополагающими в патогенезе многих патологических процессов. В связи с этим, включение их в схему фармакотерапии иммуномодулирующих препаратов будет способствовать быстрому и эффективному излечению. Эффективность используемых в настоящее время иммунотропных препаратов часто оказывается недостаточной, точные механизмы их действия изучены не полно, что обусловливает сложности в определении показаний к их применению. Всё это диктует необходимость целенаправленного поиска новых источников иммуномодуляторов, что, несомненно, возможно среди лекарственных растений. Преимущество лекарственных растений заключается еще и в том, что они действуют на организм всем комплексом содержащихся в них веществ. Особенно актуальна разработка оригинальных отечественных иммунотропных препаратов в современных условиях необходимости обеспечения импортозамещения лекарственных средств. Отечественные лекарственные растения, характеризующиеся значительными запасами в природе и обладающие широким фармакотерапевтическим эффектом, являются наиболее перспективными для создания на их основе лекарственных препаратов. К таким растениям относится горечавка холодная. Высокая эффективность лекарственных средств, созданных на основе горечавки холодной, при хронических инфекционных процессах, воспалительных заболеваниях, в патогенезе которых существенное значение имеют нарушения иммунологической реактивности организма, предполагает наличие у них иммуномодулирующей активности (Корнопольцева и др., 2007; Хоцаев, 2001). Это послужило основной причиной выбора данного растения в качестве объекта исследования на предмет наличия иммунокорригирующих свойств.
При оценке иммунотоксических свойств экстракта G. algida установлено, что исследуемое средство не оказывало значимого влияния на массу и клеточность тимуса и селезенки мышей, показатели клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа по сравнению с данными в интактной группе животных. Кроме того, при исследовании влияния экстракта G. algida на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами периферической крови здоровых доноров установлено, что указанное средство значимо не изменяет процент ФМА-активированных нейтрофилов, продуцирующих активные формы кислорода, по сравнению с данными в контрольной группе. Однако использование экстракта G. algida достоверно снижает интенсивность флуоресценции нейтрофилов в 1,6 раза по сравнению с введением в систему классического стимулятора ФМА, индуцирующего кислородный «взрыв». Данный эффект может быть обусловлен антиоксидантными свойствами экстракта благодаря преимущественному содержанию в нем веществ фенольной природы. Кроме того, есть данные, что вещества полифенольной структуры могут ингибировать активацию NADPH-оксидазы (H. Nishikawa, Wakano, S. Kitani, 2007). Также отмечено, что экстракт G. algida не оказывает влияния на поглотительную активность нейтрофилов периферической крови человека в отношении St. aureus, меченного зеленым флюорохромом ФИТЦ (количество фагоцитирующих нейтрофилов не изменялось по сравнению с таковым в контрольной группе). Поскольку экстракт G. algida значимо не угнетал, но и не стимулировал функции фагоцитов в отношении St. aureus, можно предположить, что эффект данного средства может быть обусловлен прямой антибактериальной активностью (Корнопольцева и др., 2007).
Как показали экспериментальные исследования по оценке иммунокорригирующего действия экстракта G. algida при вторичом иммунодефиците, вызванном введением азатиоприна, применение исследуемого средства позволило достоверно увеличить массу и клеточность иммунных органов, а также показатели клеточного, гуморального иммунитета и фагоцитоза макрофагов по сравнению с уровнем супрессии. Аналогичные результаты получены при использовании растительных лекарственных средств, полученных из пятилистника кустарникового (Pentaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz), молочая Фишера (Euphorbia fischeriana Steud.), софоры желтоватой (Sophоra flavеscens Soland), сабельника болотного (Cоmarum palиstre L.), лапчатки белой (Potentilla alba L.), ортилии однобокой (Orthilia secunda L.), астрагала перепончатого (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge), левзеи одноцветковой (Rhaponticum uniflorum L.), серпухи васильковой (Serratula centauroides L.) (Хобракова и др., 2007, 2008, 2010, 2011, 2012, 2015).
Введение экстракта G. algida на фоне азатиоприна приводило к стимуляции воспалительной реакции: индекс реакции ГЗТ увеличился в 1,5 раза, что, возможно, указывает на стимуляцию экстрактом синтеза провоспалительных цитокинов антигенспецифическими Т-лимфоцитами. Наши данные согласуются с результатами исследований Д. А. Ивановой и др. (2013), проведенных на морских свинках и белых беспородных мышах самцах, по оценке иммуномодулирующей активности в отношении развития реакции ГЗТ настоев из надземной части мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.), девясила высокого (Inula helenium L.), синюхи голубой (Polemonium caeruleum L.), тимьяна ползучего (Thymus serpyllum L.) и цетрарии исландской (Cetraria islandica L.). В литературе также отмечена стимуляция индекса реакции ГЗТ под влиянием экстракта корней алтея лекарственного (Althaea officinalis L.) (Борсук и др., 2009).
Как показали экспериментальные исследования, применение экстракта G. algida позволило достоверно увеличить количество антителопродуцентов в селезенках мышей на фоне снижения числа АОК, вызванного азатиоприном. Подобный эффект описан для растительных сборов, состоящих из листьев подорожника большого (Plantago major L.), корневищ и корней синюхи голубой (Polemonium caeruleum L.), кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) и девясила высокого (Inula helenium L.), цветков ромашки аптечной (Matricaria recutita L.), календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), корневищ лапчатки прямостоячей (Potentilla erecta L.) и травы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.). На фоне иммунодепрессии, вызванной антибиотиками, фитосборы проявили стимулирующее действие в отношении гуморального звена иммунного ответа (Кумышева и др., 2009). В. В. Бортниковой и др. (2015) также отмечено увеличение числа АОК в селезенке под влиянием экстракта, выделенного из красных листьев винограда. Кроме того, наши данные подтверждают работы О. С. Борсук и др. (2009) по установлению иммуномодулирующей активности в отношении гуморального звена иммунного ответа экстрактов, выделенных из календулы лекарственной, рябины сибирской и алтея лекарственного(Althaea officinalis L.), а также С. В. Дутовой и др. (2015) по оценке корригирующего действия суммарных препаратов из колюрии гравилатовидной (Coluria geoides (Pall.) Ledeb.) на гуморальный иммунный ответ при циклофосфановой иммуносупрессии.