Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние исследований в области седативных лекарственных средств и лекарственных форм на их основе (обзор литературы) 11
1.1. Лекарственное растительное сырье седативного действия – перспективный источник получения фитопрепаратов .
1.2. Анализ номенклатуры седативных средств и их лекарственных форм .. 12
1.3. Микрокапсулирование – один из основных способов пролонгирования действия лекарственных средств 15
1.4. Твердые желатиновые капсулы – резервуар для лекарственных средств 21
Заключение по обзору литературы 27
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследования 28
2.2. Методы исследования 34
2.3. Дизайн исследования 45
ГЛАВА 3. Общие фитохимические исследования основных объектов и получение промежуточного комплексного извлечения (экспериментальная часть)
3.1. Теоретическое обоснование состава фитокомпозиции при конструировании седативного фитопрепарата 48
3.2. Получение комплексного извлечения: выбор экстрагента и оптимальной технологии 61
3.3. Фитохимические исследования полученного извлечения из корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой 69
Заключение по главе 78
ГЛАВА 4. Разработка микрокапсул на базе комлексного извлечения из рассмотренных сырьевых объектов 80
4.1. Выбор вспомогательных вещества для микрокапсулирования 80
4.2. Выбор оптимального способа получения микрокапсул 81
4.3. Оптимизация состава и размера микрокапсул 84
4.4. Изучение влияния покрытий на кинетику высвобождения биологически активных веществ из полученных микрокапсул 86
4.5. Количественное определение байкалина в полученных микрокапсулах методом спектрофотометрии 91
Заключение по главе 93
ГЛАВА 5. Разработка капсул с микрокапсулами на основе спирто-водного извлечения из корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой. фармакотехнологические исследования предложенной лекарственной формы
5.1. Разработка состава капсулированной лекарственной формы и составление технологической схемы производства 95
5.2. Биофармацевтические исследования полученной лекарственной формы 103
5.3. Влияние комплексного фитоизвлечения и микрокапсул на ориентировочно-исследовательское и эмоциональное поведение крыс в тесте «открытое поле» 105
5.4. Определение микробиологической чистоты лекарственной формы и ее нормы качества 110 Заключение по главе 117
Общее заключение 118
Обозначения и сокращения 120
Список литературы
- Анализ номенклатуры седативных средств и их лекарственных форм
- Методы исследования
- Получение комплексного извлечения: выбор экстрагента и оптимальной технологии
- Изучение влияния покрытий на кинетику высвобождения биологически активных веществ из полученных микрокапсул
Введение к работе
Актуальность исследований. На сегодняшний день технология изготовления фитопрепаратов является интереснейшим направлением современной фармации. Особенно значима составляющая, связанная с технологией соответствующих лекарственных форм. Лекарственные формы на основе лекарственного растительного сырья менее токсичны по сравнению с их синтетическими аналогами, вместе тем они обладают широким фармакотерапевтическим спектром действия. Нативные вещества лекарственных растений более мягко включаются в естественные процессы организма человека, что ведет к уменьшению возможных аллергических реакций и побочных эффектов.
Расширение ассортимента отечественных лекарственных средств, в
особенности с гарантированной сырьевой базой, является одним из
перспективных направлений фармацевтической науки Российской
Федерации, что во многом определяет успех программы «Фарма 2020».
В гериатрической терапии, которая занимается проблемами в отношении эффективного лекарственного обеспечения людей пожилого возраста, выделяют следующие группы востребованных препаратов: гипотензивные, ноотропные, кардиотонические, противоревматические, а также седативные.
По данным Всемирной организации здравоохранения, заболевания, связанные с работой центральной нервной системы обусловлены ухудшением общего ритма жизни, стрессами, а также полным или частичным нарушением сна.
В этом отношении весьма привлекательны некоторые фитообъекты: трава пустырника, корневища с корнями синюхи голубой и корни шлемника байкальского.
Проанализировав химические составы вышеописанных растений, можно сделать выводы, что седативный эффект при нарушениях сна и
повышенной утомляемости наступает благодаря сумме действующих веществ, содержащихся в данных растениях, однако, соответствующих лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке пока нет.
Весьма перспективными в этом плане могут оказаться капсулы пролонгированного действия, в качестве действующего комплекса которых будут выступать извлечения исследуемых растений в микрокапсулированной форме. Достоинства капсул, как лекарственной формы неоспоримы и известны. Но они будут еще более выражены, если в качестве их содержимого представить микрокапсулы – средства доставки БАВ, хорошо себя зарекомендовавшие.
С помощью микрокапсул можно решать вопросы пролонгирования и
уменьшения раздражающего действия лекарственных веществ, а также
обеспечить стабильность путем выбора соответствующих
пленкообразователей, толщины и размера микрокапсул.
Примером использования микрокапсулирования для увеличения стабильности лекарственных препаратов может служить заключение в оболочки спирто-водных извлечений лекарственного растительного сырья.
Однако, разработка капсул с микрокапсулами, содержащими спирто-
водные извлечения из ЛРС требует решения специфических технологических
вопросов: необходимо подобрать сбалансированный комплекс
вспомогательных веществ, которые обеспечат пролонгированный эффект и максимально полно сохранят биологическую доступность.
Решение этих вопросов в общем комплексе разработки седативных ЛС позволит в определенной степени обеспечить больных современными лекарственными препаратами, что является актуальной задачей для фармацевтической науки и практики.
Степень разработанности темы. В настоящее время исследования в отношении седативных лекарственных средств природного происхождения и их лекарственных форм существуют и, прежде всего, касаются лекарственных препаратов пустырника. Однако, такие интересные
растительные объекты, как шлемник байкальский и синюха голубая с этих
позиций практически не рассматривались. И в отношении лекарственных
форм фитокомпонентов и фитокомпозиций седативного действия также
исследований немного, особенно это касается пролонгированных структур, в
частности, сегодня микрокапсулированных лекарственных средств
природного происхождения просто нет. Поэтому, несмотря на определенную разработанность данного научного направления, исследования в этой области следует продолжать.
Цель работы. Разработка состава и технологии пролонгированных капсул с микрокапсулами, содержащих комплексное спирто-водное извлечение корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой, выбор оптимальной композиции вспомогательных веществ и стандартизация разработанной лекарственной формы.
Для реализации данной цели предстояло решить следующие задачи:
Определить компонентный состав сбора из корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой.
Разработать способ получения комплексного спирто-водного извлечения из корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой.
Разработать микрокапсулы на основе комплексного спиртоводного извлечения, обосновать состав и технологию процесса.
Выбрать способ дозирования и наполнения капсул микрокапсулами, предложить технологическую схему производства.
Провести фармакологические исследования по подтверждению седативной активности предложенной ЛФ.
Определить нормы качества разработанной лекарственной формы.
Составить нормативные документы на разработанную лекарственную форму (лабораторный регламент, проект ФСП, акты технологической апробации).
Научная новизна исследования. Впервые разработан композитный
фитопрепарат седативного действия на базе комплексного спирто-водного
извлечения из лекарственного растительного сырья: трава пустырника, корни
шлемника байкальского, корневища с корнями синюхи голубой. Выбрана
оптимальная схема экстракции растительного сырья фильтрационным
способом; разработана технология микрокапсулирования, а также
предложена и валидирована соответствующая технологическая схема.
Впервые адаптированы соответствующие методики количественного
определения для ЛФ действующих компонентов с использованием хромато-
масс спектрометра, планарной хроматографии, спектрофотометрии.
Методики также валидированы. Выполнены фармакологические
исследования полученных пролонгированных капсул с микрокапсулами,
которые подтвердили наличие седативного эффекта.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основании
выполненных комплексных экспериментальных и теоретических
исследований разработана технология новой лекарственной формы седативного действия.
Показана фармакологическая эффективность, технологическая
целесообразность и перспективность предложенной ЛФ для производства. На разработанные капсулы составлены и утверждены нормативные документы: ФСП для ООО НПФ «ФИТЭКО», г. Ростов-на-Дону; лабораторный регламент на производство капсул, утвержденный ООО НПФ «ФИТЭКО» (г. Ростов-на-Дону от 29.04.2015 г.). Технологическая апробация капсул подтверждена соответствующими актами ООО «Витаукт-пром» (р. Адыгея от 08.06.2015 г.) и ООО ООО НПФ «ФИТЭКО» (г. Ростов-на-Дону от 18.05.2015 г.). Технологическая апробация комплексного спирто-водного извлечения подтверждена соответствующим актом ООО «Флора Кавказа» (Карачаево-Черкесская Республика от 17.09.2015 г.).
Полученные в диссертационной работе новые данные включены в учебно-методические материалы кафедры технологии лекарственных форм и
организации фармацевтического дела ФГБОУ ВПО «СОГУ им. К.Л. Хетагурова» от 07.09.2015 г.
Технологическая схема получения пролонгированных капсул
апробирована на кафедре технологии лекарств Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ВолгГМУ Минздрава России и технологии лекарственных форм и организации фармацевтического дела Северо-Осетинского государственного университета им. К.Л. Хетагурова.
Методология и методы исследований. В диссертационном
исследовании использованы технологические, биофармацевтические,
физико-химические, фармакологические, микробиологические и
статистические методы.
Методология исследования базируется на основных технологических и биофармацевтических условиях разработки лекарственных форм.
Положения, выносимые на защиту:
-
Результаты исследований по выбору оптимального компонентного состава лекарственной формы.
-
Результаты технологических и физико-химических исследований по выбору оптимального способа получения спирто-водного извлечения.
-
Результаты исследований по разработке микрокапсул из спиртоводного извлечения.
-
Результаты исследований по разработке пролонгированных капсул.
-
Фармакологическая обоснованность седативной активности разработанной лекарственной формы.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов определяется, прежде всего, комплексностью выполненных исследований и тщательностью проведенного эксперимента благодаря использованию современных технологических, химических, физико-химических, биологических и фармакологических методов, которые
позволили получить воспроизводимые и однозначные результаты. Все измерения обработаны статистически и являются достоверными.
Основные результаты диссертационной работы были доложены на
всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы
фармацевтической науки и практики», г. Владикавказ, 2013 г.; на
международных научно-практических конференциях «Молодые ученые в
решении актуальных проблем науки», г. Владикавказ, 2014-2015 гг.; на
всероссийских научно-практических конференциях «Инновационные идеи
молодежи Ставропольского края – развитию экономики России»
«У.М.Н.И.К.» (Участник молодежного научно-инновационного конкурса), г.
Ставрополь 2013-2014 гг.; на региональных конференциях «Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», г.
Пятигорск, 2014-2015 гг.
Личный вклад автора. Включает в себя сбор информации и обоснование темы диссертационной работы, публикации, выступления на научных конференциях. Все экспериментальные фрагменты диссертации выполнялись при личном участии. Из этого следует, что личный вклад при выполнении диссертационной работы составил не менее 85%.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста. Содержит 24 рисунка и 22 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, а также из 3 глав собственных экспериментальных исследований, списка литературы и приложений (проект ФСП, лабораторный регламент, акты технологической апробации и акт внедрения в учебный процесс). После каждой главы приведено заключение и имеется также общее заключение по итогам диссертации.
Анализ номенклатуры седативных средств и их лекарственных форм
Седативные средства (от sedatio - успокоение) с давних пор используются для лечения нервных болезней и невротических состояний. По сравнению с современными транквилизаторами, особенно бензодиазепинами, седативные средства оказывают менее выраженный успокоительный и антифобический эффект. Препараты этой группы могут оказывать регулирующее влияние на ЦНС, усиливая процесс торможения или понижая процесс возбуждения. Как правило, они усиливают действие снотворных, анальгетиков и других нейротропных успокаивающих средств. К седативным средствам относятся вещества различной природы и, прежде всего, препараты растительного происхождения [110, 126].
Несмотря на наличие современных транквилизаторов, седативные средства продолжают широко применяться в медицинской практике при различных невротических состояниях. Хорошая переносимость, отсутствие серьезных побочных явлений (они не вызывают миорелаксации, атаксии в отличие от гипно седативных средств – сонливости, явлений психической физической зависимости), позволяют пользоваться ими в повседневной амбулаторной практике, особенно при лечении больных пожилого и старческого возраста [26]. Растительные препараты отличаются от средств синтетического происхождения широтой терапевтического действия и относительной безвредностью. Их можно применять при лечении острых, хронических заболеваний, а также для профилактических целей, влияя на различные звенья патологического процесса. Привлекательны они для малообеспеченных категорий больных своей невысокой стоимостью [53, 63, 109].
Анализ данных литературы ЛС для лечения заболеваний нервной системы позволил разделить их на 3 самостоятельные группы: препараты синтетического, растительного происхождения и комбинированные. Первая группа, в которую входят в основном производные бензодиазепинов, самая многочисленная: доля этих препаратов составляет около 70%, доля фитопрепаратов составляет примерно 20 %, а комбинированных ЛС, сочетающих природные и синтетические компоненты не превышает 10 %. Наибольшее внимание в проведенном исследовании мы уделили ЛС растительного происхождения. В последнее десятилетие во всем мире отмечается повышенный интерес практической медицины к лекарственным препаратам, получаемым из растительного сырья. Эта тенденция наблюдается в странах, не только традиционно использующих лекарственные растения в большом ассортименте (Индия, Китай, Вьетнам и др.), но и с высокоразвитой химико-фармацевтической промышленностью, имеющей большие возможности для проведения широкомасштабных работ в области синтеза лекарственных веществ (США, Япония, ФРГ и др.) [7, 36].
Группа растительных препаратов седативного действия включает в себя 65 наименований (142 позиции). Номенклатура седативных ЛС растительного происхождения разнообразна по своему составу. Монопрепараты составляют 57,1% (50% отечественные препараты, 50% импортные), многокомпонентные составляют 42,9% (22,2% отечественные, 77,8% импортные), гомеопатические средства составляют 16,6% (25% отечественные, 75% импортные) [36, 113].
Анализируемая номенклатура препаратов характеризуется разнообразием выпускаемых форм. Наибольшее количество препаратов предлагается в виде жидких лекарственных форм (ЖЛФ) – 59,5%: капли, спиртовые растворы, настойки, жидкие экстракты, бальзамы, эликсиры (35 позиций). Значительная доля твердых лекарственных форм (ТЛФ) в основном базируется на отечественном сырье в виде фасованного сырья и успокоительных сборов – 55,9%, остальная часть представлена таблетками, порошками, гомеопатическими гранулами, капсулами. В основном (85%) это продукции зарубежных производителей [36, 119] .
ЖЛФ представлены каплями (76,6%). В основном эта группа состоит из традиционных настоек (настойки валерьяны, пиона, пустырника), жидких экстрактов, сложных настоек, спиртовых растворов. Не многочисленна группа эликсиров, бальзамов и микстур – 18,5% (15 позиций).
Не представлена эта группа традиционными сиропами, так как редко препараты назначаются такой возрастной категории как дети. Следует отметить, что среди отечественных препаратов преобладает фасованное лекарственное сырье, настойки, экстракты, капли, среди зарубежных 15 таблетки, гомеопатические гранулы, капли, композитные растворы, бальзамы. В состав ЛС для лечения заболеваний нервной системы входят почти 30 лекарственных растений. Высокий рейтинг имеют следующие растительные объекты: валериана (38 позиций), мята перечная (28 позиций), хмель и душица (по 10 позиций), пустырник (7), пассифлора (5 позиций), боярышника цветки и плоды (5 позиций), зверобой (4 позиции), шлемник байкальский (3 позиции), хохлатка полая, эшшольция калифорнийская, игнация (по 2 позиции), синюха голубая (1 позиция) [79].
Абсолютным лидером по частоте включения в ЛС является валериана лекарственная. Препараты, содержащие извлечения из валерианы или компоненты ее эфирного масла составляют 48,5% в анализируемой группе, из них 40% отечественные ЛС, 60% импортные.
Кроме того, сильны позиции отечественных производителей в отношении ЛС, содержащих траву пустырника, траву душицы, листья ландыша, траву горицвета, листья мяты. Сырье таких растений как мелисса, зверобой, пассифлора, эшшольции калифорнийской, хохлатки полой, хмеля, дудника входит в основном в состав импортных препаратов. На наш взгляд мало препаратов на основе сырья синюхи голубой, шлемника байкальского и отсутствуют их комбинации [36].
Методы исследования
Раствор байкалина использовали тот же, что и для спектрофотометрии. Хроматогафирование проводили на пластинках марки Sorbfil (ПТСХ-АФ-В-УФ) и Sorbfil (ПТСХ-П-А-УФ). Наиболее эффективными оказались пластинки для высокоэффективной хроматографии Sorbfil (ПТСХ-АФ-В-УФ), число теоретических тарелок 170 [6, 11, 64].
Исследуемые системы растворителей: бензол – этилацетат – муравьиная кислота (3 : 1 : 0,05); амиловый спирт – метиловый спирт – муравьиная кислота – вода (7 : 1 : 1 : 1); бензол – метиловый спирт – бутанон – муравьиная кислота (14 : 2 : 3 : 1); н-бутанол – уксусная кислота– вода (4 : 1 : 1) [124]. Наиболее оптимальное значение Rf в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1).
Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества – площадь пика» (линейная аппроксимация) [115]. Определение микробиологической чистоты Микробиологическую чистоту лекарственной формы изучали в соответствии с методикой, описанной в ГФ XII (ОФС 42-0067-07). Сравнительные биологические исследования Все биологические и фармакологические исследования проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» на базе вивария Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ВолгГМУ Минздрава России.
В фармакологии парамеции, как биологическую модель, используют для скрининга лекарственных средств антиоксидантного (регулирующего перекисное окисление липидов) и мембраностабилизирующего типов действия [41].
Эксперимент на парамециях - культуре Parametium caudatum. В качестве фармакологического индикатора (токсиканта), повреждающую преимущественно липидную часть мембраны, предлагается 1% водорода пероксид, который in vivo расщепляется до перекисных радикалов, инициирующих процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) мембран; фармакологическими индикаторами, повреждающими преимущественно белковую структуру биомембраны, - 14% этиловый спирт, приводящий к денатурации ферментных и мембранных белков [48].
В ходе эксперимента анализировали рост, размножение, характер движения и время остановки инфузорий.
Эксперимент был проведен на парамециях - культуре Parametium caudatum, выделенных из естественных мест обитания, из которой для дальнейшего исследования были получены отдельные клоны (от одной особи бесполым путем). Для культивирования парамеций используют синтетическую среду Л.К. Лозина-Лозинского (NaCl, пептон – по 0,01%, KCl, CaCl2, MgCl2 - по 0,001%, NaHCO3 - 0,002%), при рН водной среды 6,2 – 7,8 и температурном оптимуме 20 -26 С. Пищей для парамеций служат живые дрожжи - Rhadotorula gracilis с добавлением пшеничной муки.
Для подсчёта числа инфузорий используют гемоцитометрический способ (камера Горяева).
Подготовку биологического материала к проведению эксперимента (определение чувствительности парамеций) проводят следующим образом: на предметное стекло наносят две капли среды, содержащей парамеции (число особей в каждой капле не менее 5), одна капля служила контролем, ко второй тангенциально (сбоку) прибавляют каплю соответствующего объема 0,9% раствора хлорида натрия. При добавлении раствора натрия хлорида наблюдалось заметное ускорение движения по сравнению с контролем. Этот опыт повторяли 5 раз. При этом парамеции считаются чувствительными в случае ускорения движения не менее 4 особей из 5 по результатам 5 измерений. Для оценки чувствительности парамеций по параметру - замедление движений - использовали 0,5% раствор калия хлорида и проводили опыты по аналогичной методике. При этом парамеции считаются чувствительными в случае замедления движения не менее 4 особей из 5 по сравнению с контролем. Культура парамеций считается чувствительной по положительным результатам проб с 0,9% раствором натрия хлорида и 0,5% раствором калия хлорида. Проведенные эксперименты подтвердили чувствительность исследуемой культуры к обоим солевым растворам [68].
Сравнительные фармакологические исследования В экспериментах использовали метод «открытое поле», предназначенный для изучения основных параметров поведения и неврологического статуса в условиях кратковременного психоэмоционального статуса, обусловленного помещением животного на открытую площадку. Для объективизации сравнения показателей поведенческой активности и эмоциональности с целью исключения их фрагментарной оценки проводили тестирующее исследование в течение трех дней подряд. Эксперименты проводили в затемненном, ограниченном от поступления посторонних шумов помещении [23, 120, 121] .
Открытое поле представляло собой квадратную площадку размером 60х60 см с бортиками высотой 30 см, разделенную на квадраты 10х10 см. В качестве оценочных единиц выбраны дискретные поведенческие акты, регистрируемые с помощью наблюдения и хронометрически.
Каждое животное подвергали тестированию однократно в сутки. Тестирование проводилось в звукоизолированном помещении, в течение 3 минут. Проводились следующие манипуляции: животное вынимали за хвост из клетки содержания и помещали в стакан головой ко дну, крысу в перевернутом стакане переносили в центр освещенного «Открытого поля». В момент ее высадки запускали часы и секундомер, регистрировали в течение 3 минут время в центре (в секундах), горизонтальную активность (количество пройденных квадратов, штук), вертикальную активность (количество вертикальных стоек, штук), реакцию груминга (число проявлений и общую продолжительность, в секундах), мочеиспускание и дефекацию (по количеству болюсов) [51, 52, 143].
Содержание экспериментальных животных соответствовало правилам лабораторной практики и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального Комитета по биоэтике при Российской академии наук и этические нормы, признанные мировым сообществом и изложенные в «Международных рекомендациях по прооведению медико-биологических исследований с использованием животных», опубликованных в 1985 г. Советом международных медицинских организаций. Процесс декапитации крыс проводили под общим ингаляционным наркозом, убедившись, что у животных отсутствует болевая чувствительность и устранено сознание. Содержание и кормление животных проводилось в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) № 1045-73 от 06.04.1973 г. (ГОСТ Р 50258-92), а также Приказом № 1179 от 10.10.1983 г. Минздрава СССР «Об утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях здравоохранения».
Получение комплексного извлечения: выбор экстрагента и оптимальной технологии
Фитохимические исследования полученного извлечения из корней шлемника байкальского, травы пустырника и корневищ с корнями синюхи голубой
Согласно библиотекам веществ хромато-масс спектрометра доминирующими компонентами суммы веществ являются метил 3-(1-формил-3,4-метилендиокси) бензоат (25,796 %) и 5, 7-дигидрокси-8-метоксифлавон (26,227 %). При исследовании стандартного вещества байкалина (sigma-aldrich) нами было обнаружено, что пики 9 и 11 из исследования комплексного извлечения соответствуют пикам, полученным при изучении стандарта, что позволило заключить, что байкалин является доминантным соединением комплексного извлечения (рис 7).
Дальнейшие фитохимические исследования касались количественного содержания байкалина. Тонкослойная хроматография Исследование вели, согласно методике, описанной в главе 2. На линию старта длиной 15 см наносили 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 мкл раствора СО байкалина. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10. Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Длина пробега растворителя около 8 см. Детектирование проводили в УФ-свете и 5% NaOH. пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» и далее осуществляли ее цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар).
Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний».
Методом внутренней нормализации определено, что содержание вещества с Rf 0,26 составило 39,9%, а с Rf 0,43 – 60,1%. Полученные нами данные соответствуют результатам, полученным методом ГХ/МС (рис. 9). Исследования проводили по данным пика с Rf 0,43. Согласно рекомендации ГФ XII и международных стандартов любая аналитическая методика должна быть подвергнута валидации, т.е. экспериментальному подтверждению её пригодности к практическому использованию и получению достоверной информации об объекте анлиза. Валидацию методики определения байкалина проводили по следующим характеристикам: предел обнаружения (ПО), предел количественного определения, линейность, правильность. Предел обнаружения (ПО) рассчитывали по формуле ПО = 3,3 . S/b, где: S – стандартное отклонение сигнала; b – угловой коэффициент градуировочного графика. ПО = 0,197мкг. Предел количественного определения (ПКО), рассчитывали по формуле ПО = 10 . S/b, где: S – стандартное отклонение сигнала; b – угловой коэффициент градуировочного графика. ПКО = 0,6 мкг.
Линейность методики определяли экспериментально измерением аналитических сигналов для 5-и проб с разными концентрациями байкалина. При изучении зависимости площадей пиков от концентрации байкалина был получен следующий градуировочный график (рис. 10).
Уравнение регрессии и коэффициент корреляции были рассчитаны в электронных таблицах Microsoft Excel. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а) и углового коэффициента (b). 20000 18000 16000 у=в х у = 2734,9х 14000 + 12000 10000 8000 6000 » 4000 2000 0 ) 1 2 3 4 5 6 т, мкг Рисунок 10 - Градуировочный график СО байкалина.
Установлено, что зависимость площадей пиков от содержания байкалина в аналитической области методики (от 2 до 6 мкг в водимой пробе) является линейной. Коэффициент корреляции r = 0,995. Уравнение регрессии имеет вид S=2,73.103 m.
Правильность методики определяли методом «введено-найдено». По уравнению градуировочного графика рассчитывали содержание байкалина на 5-и уровнях концентраций СО и определяли метрологические характеристики (табл. 12)
Результаты исследований свидетельствуют, что методика имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям линейность и правильность. Данную методику можно использовать для идентификации и количественного определения байкалина в растительном сырье.
Изучение влияния покрытий на кинетику высвобождения биологически активных веществ из полученных микрокапсул
Как видно из таблицы 20, у животных в контрольной группе число пройденных квадратов, характеризующих горизонтальную активность, составляла 35,7±3,9. Горизонтальная двигательная активность в группах, запоенных таблетками экстракта пустырника (препарат сравнения), комплексным извлечением и раствором микрокапсул имела значительную тенденцию к снижению, что может свидетельствовать об адаптации животных к новым условиям. Различия между контрольной группой и группами, запоенными препаратами были статистически достоверными (p0,05 ). Различия между группой, запоенной комплексным извлечением и раствором микрокапсул статистически не достоверны, что характеризует их соизмеримый эффект (p20,05).
Таким образом, исходя из указанного фармакологического анализа поведения экспериментальных животных, можно заключить, что спектр психофармакологической активности разработанных микрокапсул, и косвенно, капсул на их основе, характеризуется наличием седативного эффекта, при этом действие спирто-водного извлечения и микрокапсул на их основе сопоставимо, а в некоторых моментах и превосходит действие препарата сравнения – таблеток экстракта пустырника.
При анализе использовали по 1,0 г микрокапсул (1 капсула), которые помещали в стерильную колбу, содержащую 100 мл буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревали на водяной бане до температуры не выше 40С и энергично встряхивали до получения гомогенной эмульсии, которую использовали для количественного и качественного определения микроорганизмов.
Агаризованные питательные среды вносили в количестве 15 - 20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляли до застывания. Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносили в пробирку с 4 мл соответствующей расплавленной и охлажденной питательной средой, быстро перемешивали содержимое пробирки и переносили на поверхность застывшего и подсушенного агара в чашке Петри, равномерно распределяя верхний слой среды вращательными движениями. После застывания чашки переворачивали и помещали в термостат для инкубации.
Определение общего числа бактерий Приготовленный образец микрокапсул из капсул вносили по 1 мл в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленного и охлажденного до температуры 45-50С питательного мясопептонного агара (МПА). Быстро переливали содержимое пробирки и переносили в чашку Петри, содержащую 15 - 20 мл застывшего МПА. Покачиванием чашки равномерно распределяли верхний слой агара.
После застывания среды чашки переворачивали и инкубировали в течение 5 суток при температуре 37С. Посевы просматривали ежедневно. Через 48 часов и окончательно через 5 суток подсчитывали число бактериальных колоний на двух чашках, находили среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляли число бактерий в 1 г образца микрокапсул.
Определение общего числа грибов Испытание проводили двухслойным методом, описанным выше, используя среду Сабуро. Посевы инкубировали в течение 5 суток при температуре от 20 до 25С, через 72 часа и окончательно через 5 суток подсчитывали общее число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находили среднее значение и, умножая его на показатель разведения, т.е. на 10, вычисляли число грибов в 1 г образца.
Определение энтеробактерий и подобных им грамотрицательных микроорганизмов Для восстановления жизнеспособности микроорганизмов, поврежденных во время технологического процесса, использовали предварительную инкубацию образцов в жидкой питательной среде. 1,0 г микрокаспул переносили в 100 мл лактозного бульона (среда № 11), перемешивали и инкубировали в течение двух часов. После инкубации перемешивали содержимое флакона (гомогенат А) и переносили количество, соответствующее 1 г образца в 100 мл среды обогащения (среда № 3). Посев инкубировали в течение 18 - 48 ч при температуре 37 ± 1 С. Было обнаружено помутнение среды и сделан пересев бактериологической петлей на плотную среду (среда № 4), которую инкубировали при той же температуре в течение 18 - 24 ч.