Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современное состояние исследований по созданию суппозиториев иммуномодулирующего действия
1.1 Особенности суппозиториев как лекарственной формы. Ассортимент и характеристика современных суппозиторных основ 10
1.2 Использование суппозиториев в фитотерапевтической практике 37
1.3 Характеристика травы эхинацеи как источника биологически активных соединений иммуномодулирующего действия 41
Заключение по обзору литературы 48
Глава 2 Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования 52
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методы анализа лекарственного растительного сырья 53
2.2.2 Методы исследования экстракционных препаратов 54
2.3 Методы исследования суппозиторных масс и готовых суппозиториев.. 55
2.4 Анализ действующих веществ в спиртовых извлечениях и суппозиториях 58
2.5 Биофармацевтические методы исследования 58
2.6 Определение микробиологической чистоты 59
2.7 Статистические методы 60
Глава 3 Разработка оптимальных условий получения экстракта жидкого и настойки гомеопатической эхинацеи пурпурной
3.1 Получение и исследование Е. purpurea L. Moenh экстракта жидкого по ресурсосберегающей технологии 61
3.1.1 Обоснование способа получения эхинацеи экстракта жидкого 61
3.1.2 Разработка норм качества на экстракт эхинацеи жидкий... 70
3.2 Разработка технологической схемы производства настойки гомеопатической матричной эхинацеи пурпурной и ее стандартизация
3.2.1 Технология настойки гомеопатической матричной эхинацеи 823
2.2 Стандартизация эхинацеи настойки гомеопатической матричной 85
3.3 Сравнительный химический анализ биологически активных веществ эхинацеи пурпурной, содержащихся в спирто-водных извлечениях, полученных из травы высушенной и травы свежей 89
Выводы по главе 3 94
Глава 4 Разработка технологии суппозиториев с экстрактом и настойкой гомеопатической эхинацеи
4.1 Выбор суппозиторной основы и поверхностно-активных веществ для суппозиториев эхинацеи 96
4.2 Изучение влияния характера основы на степень и скорость высвобождения экстракта эхинацеи из суппозиториев 109
4.3 Оценка качества и стабильности суппозиториев с экстрактом эхинацеи и суппозиториев эхинацеи гомеопатических 120
4.4Валидация методики количественного определения цикориевой кислоты в суппозиториях с экстрактом эхинацеи 130
Выводы по главе 4 133
Заключение 134
Список литературы
- Использование суппозиториев в фитотерапевтической практике
- Анализ действующих веществ в спиртовых извлечениях и суппозиториях
- Обоснование способа получения эхинацеи экстракта жидкого
- Изучение влияния характера основы на степень и скорость высвобождения экстракта эхинацеи из суппозиториев
Использование суппозиториев в фитотерапевтической практике
Суппозитории как лекарственные формы известны с древних времен. Так, Гален предлагал использовать кусочки мыла в виде свечей в качестве слабительного средства при помещении их в прямую кишку. Папирус Эберса 1550 г. до н.э. имеет сведения о применении более 800 видов различных лекарственных форм в медицине Египта, в том числе свечей для лечения геморроя и запоров. Первые технологические описания изготовления свечей, рекомендуемых как болеутоляющее и при заболеваниях половых органов, приведены на глиняных плитках Месопотамии. Свечи готовили из смеси смол, лечебных трав и жиров. Перед введением в полость тела они смазывались кипарисовым маслом.
Само слово «суппозитории» появилось в медицинской практике лишь в XVII веке от латинского слова suppositorium - замещать, подставлять.
В последнее время суппозитории получают все большее распространение в медицинской практике ряда стран благодаря своим положительным свойствам и отсутствия негативных эффектов, присущих пероральным и инъекционным препаратам.
К преимуществам прежде всего относится быстрое поступление лекарственных веществ в большой круг кровообращения, и поэтому реальная возможность замены инъекционного пути введения многих лекарственных препаратов, что ценно как в педиатрии, так и в гериатрии. При ректальном пути введения снижается возможность развития аллергических реакций, кроме того, отсутствует проблема вкуса, запаха лекарственных препаратов, появляется возможность назначения лекарственных средств с разнообразными физико-химическим свойствами, отмечается простота и безболезненность введения [5]. Суппозитории состоят из основы и введенного в нее лекарственного вещества. В истории развития суппозиторных основ выделяют 3 периода: 1-ый период - до использования масла какао в качестве основы; 2-ой период - период преимущественного использования масла какао как основы (до начала XX века); 3-ий период - период широкого использования заменителей масла какао [93].
Для того, чтобы лекарственные средства могли применяться ректально, они должны иметь подходящую форму и консистенцию, позволяющую пациенту применять ее самостоятельно. До середины XVIII века наиболее популярным был клистир, также называемый клизмой. Это были приспособления, которые позволяли вводить в толстую кишку человека водные, масляные растворы и суспензии. Эти приспособления представляли собой шприцы (клистирные шприцы) или сферические изделия с выходом в форме шприца.
До использования клистеров ректальными лекарственными формами древности, а отчасти, и начала средних веков были шерстяные лоскуты или пробки, которые обмазывались содержащими лекарственные субстанции массами, такими как мед, бычья желчь, жиры и сгущенные растительные экстракты. Однако обе формы - шерстяные лоскуты и клистиры - могли применяться пациентом только при помощи стороннего человека.
В процессе развития и открытия новых лекарственных форм и возможностей их производства в аптеках было найдено применение масла какао. Так как масло какао находится в твердом состоянии при комнатной температуре, и плавится при температуре человеческого тела, а также легко принимает любую форму, появилась возможность производить ректальные лекарственные формы, которые позволяли пациенту избавиться от дискомфорта, связанного с необходимостью прибегать к помощи сторонних лиц, и самостоятельно их вводить. Какао-масло было единственной используемой суппозиторной массой в течение почти 200 лет, и соответственно, было описано во всех национальных и международных фармакопеях в качестве основы для изготовления суппозиториев.
Из-за сложностей с приобретением масла какао во время Второй Мировой Войны в Европе, в 1939-1940 годах было рекомендовано использование полиэтиленгликолей (ПЭГ). Уже в 1941 году эта основа была включена в 1-е дополнение к DAB 6 (Немецкая Фармакопея). С этого момента начинается третий период в развитии суппозиториев как лекарственной формы.
В Российской практике начало применения ПЭГов относится к пятидесятым годам прошлого столетия. М.Х. Глузман с сотрудниками (1956, 1965 гг.) предложили в качестве суппозиторной основы смесь полиэтиленгликолей 4000 и 400. Ими было показано, что такая основа соответствует по твердости маслу какао. Полиэтиленгликоли и сегодня занимают прочное место среди вспомогательных веществ в качестве суппозиторной основы.
Однако гораздо более значимое место, чем полиэтиленгликоли, среди суппозиторных основ занимают основы жировые (или заместители масла какао).
В 1948 году был выпущен на рынок триглицерид из насыщенных жирных кислот в качестве первого заменителя и эквивалента какао-масла. За этим первым продуктом до сегодняшнего дня последовало большое число подобных жиров. Впервые подобные продукты были внесены в третье дополнение к DAB 6, на сегодняшний день описаны также во многих других национальных фармакопеях. Отечественные исследования в данном направлении ведутся с 30-х годов.
Анализ действующих веществ в спиртовых извлечениях и суппозиториях
Белая кристаллическая масса, жирная наощупь. Состоит из предельных высокомолекулярных углеводородов. Температура плавления 50-57С, нерастворим в воде и спирте, легко растворим в хлороформе, жирных и эфирных маслах. Применяется как добавка к основам с целью уплотнения их консистенции и повышения температуры плавления.
Кроме суппозиторных основ, в исследованиях использовали следующие вспомогательные вещества: Вода очищенная (ФС 42-2619-97) - бесцветная прозрачная жидкость без запаха и вкуса, рН 5,0-6,8. Используется как универсальный растворитель для лекарственных и вспомогательных веществ. Спирт этиловый 95% (ФС 42-3072-00) - широко применяют в различных разведениях для изготовления настоек, экстрактов и лекарственных форм для наружного применения. В медицинской практике спирт этиловый применяют преимущественно как наружное антисептическое (обеззараживающее) и раздражающее средство для обтираний, компрессов и т.п.
Определение действующей нормативной документации (ГФ XI, вып. 2, стр.160) [29], жидкие экстракты оценивают по содержанию тяжелых металлов, сухого остатка, спирта и плотности.
Методы исследования суппозиторных масс и готовых суппозиториев Органолептический контроль проводили визуально, оценивая форму, цвет, размер, однородность суппозиторной массы (отсутствие при продольном разрезе вкраплений, блесток или кусочков основы).
Среднюю массу суппозитория определяли согласно ГФ XI изд. (1990, вып. 2) [29] взвешиванием 20 суппозиториев с точностью до 0,01. Отклонения в массе не должны превышать ±5% и только 2 суппозитория могут иметь отклонение ±7,5%.
Определение температуры плавления проводили открытым капиллярным методом по ГФ XII изд. (2008, ч.І., ОФС 42-0034-07) [26]. Для этого расправленную суппозиторную массу помещали в пять стеклянных капиллярных трубок из легкоплавкого стекла (длина 80 мм, наружный диаметр от 1,4 до 1,5 мм, внутренний - от 1,0 до 1,2 мм) для формирования в каждой столбика высотой около 10 мм. Капилляр помещали в холодильник на 1ч, затем определяли температуру плавления с помощью прибора, описанного в ГФ XII изд. За температуру плавления (среднее значение пяти показаний) принимали ту, при которой исследуемый образец становится жидким и начинает подниматься по капиллярной трубке. Температура плавления не должна превышать 37С. Определение времени полной деформации проводили по методике, описанной в ГФ XI изд. (1990, вып. 2) [29]. Использовали прибор, состоящий из трубки, открытой с обеих сторон, с капиллярным переходом, металлического стержня и стеклянного штока. Трубку с короткого конца закрывали пробкой и заполняли водой очищенной и температурой 37±1С. В длинный конец опускали стержень и весь прибор помещали в сосуд с циркулирующей водой при температуре 37±1С.
Под стержень помещали суппозиторий, предварительно выдержанный на льду в течение 15 минут, и включали секундомер. Время от введения суппозитория в трубку до появления стержня внизу сужения трубки принимали за время полной деформации. Проводили по пять параллельных измерений.
Время полной деформации не должно превышать 15 минут. Определение времени растворения для суппозиториев на гидрофильных основах (ПЭО). Для этого один суппозиторий помещали на дно химического стакана вместимостью 100 мл, содержащего 50 мл воды очищенной с температурой 37±1С. Стакан через каждые 5 минут взбалтывали таким образом, чтобы жидкость и проба приобрели вращательное движение. За время растворения принимали величину с момента помещения суппозиториев в воду очищенную до полного растворения.
Время растворения не должно превышать 1 ч. Определение рН водной вытяжки из суппозиториев проводили потенциометрическим методом согласно ГФ XI изд. (1987, вып. 1) [28] на иономере универсальном ЭВ-74.
Извлечение из суппозиториев готовили по следующей методике: в колбу вместимостью 50 мл помещали один суппозиторий массой 1,5 г, добавляли 15 мл воды очищенной с температурой 60±5С и тщательно взбалтывали. После полного остывания полученную вытяжку отфильтровывали и определяли значение рН. Проводили по три параллельных опыта.
Определение температуры затвердевания Температуру затвердевания основ определяли на приборе Жукова. Расправленную при 50С основу наливали в прибор до заполнения его на 3/4 объема. Прибор закрывали пробкой, через которую проходит термометр с делением 0,1 С, установленный таким образом, чтобы ртутный шарик находился примерно на середине массы основы. Прибор помещали в сосуд с водой, имеющей постоянную температуру. Легкими периодическими встряхиваниями перемешивали расправленную основу до появления мути, после чего давали основе остыть без перемешивания.
Обоснование способа получения эхинацеи экстракта жидкого
На мировом фармацевтическом рынке представлено множество различных препаратов, содержащих водный и спиртовой экстракт эхинацеи, свежевыжатый и концентрированный соки, настойка и т.д., как монопрепарат или в комбинации.
Биологическая активность готовых препаратов эхинацеи зависит от исходного сырья. Известно, что препараты из свежих растений по активности превышают экстракционные препараты из высушенных растений. Нашей целью было изучение состава фенольных соединений водно-спиртовых извлечений травы эхинацеи пурпурной в зависимости от камеральной обработки растительного сырья. Изучение качественного и количественного состава гидроксикоричных кислот травы эхинацеи пурпурной проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Условия проведения анализа: - Хроматограф Waters Alliance 2695 с ДМД 2996; - Колонка Zorbax SB-C18 150 4,6 + 12,5 4,6 mm 3.5 mkm; ПФ В:Вода:Ацетонитрил: кислота фосфорная (900:100:4); ПФ D: Вода: Ацетонитрил: кислота фосфорная (150:850:4); - Расход ПФ 1 мл/мин; -Объем пробы 20 мкл; - Температура колонки - 30 С; - Длина волны детектирования - 320 нм; -
Раствор А: Точную навеску стандартного образца кофейной кислоты растворяли во флаконе (предварительно взвешенном) в метаноле и количественно переносили в мерную колбу на 100 мл (после чего флакон высушили и взвесили — масса навески), перемешивали, доводили объем раствора в колбе до метки метанолом и помещали на ультразвуковую (УЗ) баню на 5 мин.
Исходя из точной массы навески кофейной кислоты (18.5 мг), 0,5 мл полученного раствора Б помещали в мерную колбу на 100 мл, доводили объем раствора до метки растворителем (метанол : вода 1:1), перемешивали, фильтровали через 0,45 мкм (С кофейной кислоты = 0,000925 мг/мл).
Стандарт кофейной кислоты Fluka lotl228735, содержание 99,6 %. Раствор для проверки пригодности хроматографической системы Раствор Б: Точную навеску стандартного образца хлорогеновой кислоты (содержание мин. 95 %) помещали в мерную колбу на 100 мл, добавляли метанол, растворяли на УЗ бане 5 мин., доводили до метки метанолом. Масса навески = 11,6 мг. Раствор В: Точную навеску стандартного образца феруловой кислоты помещали в мерную колбу на 50 мл, добавляли метанол, растворяли на УЗ бане 5 мин., доводили до метки метанолом. Масса навески = 4,3 мг. Приготовление раствора: В мерную колбу на 100 мл помещали 0,5 мл раствора А, 1,0 мл раствора Б и 1,0 мл раствора В, доводили объем раствора до метки растворителем, фильтровали через 0,45 мкм (С кофейной кислоты = 0,000925 МГ/МЛ, Сферуловой кислоты = 0,00086 МГ/МЛ, CMOporeHOBofi кислоты = 0,00116 Мг/мл). Для уточнения времени удерживания хлорогеновой кислоты был приготовлен раствор: В мерную колбу на 100 мл помещали 1,0 мл раствора Б, доводили до
Экстракционные препараты готовили в соотношении лекарственное сырье:экстрагент 1:2, метод экстракции — реперколяция — 3 ступени, в качестве экстрагента при экстракции сухого сырья использовали 40 % спирто-водный раствор, свежего сырья — на 1 ступени экстракции экстрагентом служит 90 % спирто-водный раствор, на 2 и 3 — 40 % спирто-водный раствор.
Как следует из данных таблицы 18, в извлечении из свежего сырья преобладает феруловая кислота, а в извлечении из сухого сырья преобладает хлорогеновая и кофейная кислоты, которые, по-видимому, образуются в растении как вторичные метаболиты в процессе высушивания [17].
Известно, что гидроксикоричные кислоты обладают выраженной антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью. Фармакологическая активность травы эхинацеи пурпурной объясняется кумулятивным действием всего набора присутствующих в растении гидроксикоричных кислот.
В результате проведенных исследований показано, что способ обработки травы эхинацеи пурпурной в процессе получения экстракционных препаратов влияет на количественное содержание извлеченных гидроксикоричных кислот.
Установлено, что извлечение из свежей травы преимущественно содержит феруловую кислоту, а из сухой травы — хлорогеновую и кофейную кислоты. Это свидетельствует о происходящих в процессе сушки растительного сырья биотехнологических процессах с накоплением вторичных метаболитов [79].
Изучение влияния характера основы на степень и скорость высвобождения экстракта эхинацеи из суппозиториев
Полученные данные свидетельствуют о том, что суппозитории с экстрактом эхинацеи отвечают требованиям НД, т.е. введение жидкого экстракта не оказывает существенного влияния на физико-химические и структурно-механические свойства суппозиторных основ.
Существенное влияние на проявление фармакологической активности лекарственных субстанций в составе различных препаратов оказывает правильный выбор вспомогательных веществ, повышающих или снижающих скорость высвобождения действующих веществ, а также улучшающих качество некоторых технологических операций. Значительное влияние на полноту высвобождения действующих веществ из суппозиториев оказывает наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ) в составе основы [76].
Предварительный выбор ПАВ и их количества был осуществлен на основании данных литературы и нормативной документации на производство ректальных и вагинальных суппозиториев. Для исследования были использованы следующие ПАВ: эмульгатор № 1, эмульгатор Т2, моноглицериды дистиллированные, которые добавляли к основам бутирол и твердый жир в количестве 2,5%; 5% и 12%.
Введение вспомогательных веществ в состав суппозиториев осуществляли в соответствие с их свойствами и общими правилами технологии, согласно которым в состав основ их вводили при сплавлении компонентов в порядке уменьшения температуры их плавления. Экстракт эхинацеи в количестве 0,6 мл (0,8г) на один суппозиторий эмульгировали в теплой расплавленной основе. Суппозитории готовили методом выливания в формы по общепринятой схеме.
У полученных экспериментальных образцов суппозиториев на бутироле и твердом жире с различным содержанием используемых ПАВ определили физико-химические показатели качества по стандартным методикам: среднюю массу одного суппозитория, температуру плавления, а также структурно-механические свойства: время полной деформации и твердость. Полученные результаты, как среднее пяти определений, приведены в таблице.
Сравнительный анализ оценки качества суппозиториев по внешнему виду и основным структурно-механическим показателям - времени полной деформации, температуры плавления и твердости показал, что введение ПАВ в интервале концентраций 2,5-12% не ухудшает их физико-химических показателей. Все исследуемые составы суппозиториев соответствовали требованиям нормативной документации, предъявляемым к данной лекарственной форме. Однако по твердости оптимальным был состав с моноглицеридами дистиллированными в количестве 12%.
Из данных литературы выяснили, что такие показатели суппозиториев как: время полной деформации и твердость не имеют четкой связи с полнотой и выходом действующих веществ, т.е. биодоступностью.
Первым этапом изучения биодоступности препарата из исследуемой лекарственной формы является определение степени и скорости высвобождения вещества в опытах «in vitro». Полученные результаты позволяют определить наиболее подходящие вспомогательные вещества и определить зависимости целого ряда других фармацевтических факторов.
В настоящее время используют много способов определения скорости высвобождения лекарственных веществ из мягких лекарственных форм в опытах «in vitro» [12]. Мы использовали метод равновесного диализа через полупроницаемую мембрану, поскольку он позволяет не только качественно, но и количественно оценить высвобождение веществ из лекарственной формы.
Идентификацию действующих веществ в суппозиториях проводили по содержанию гидроксикоричных кислот [18].
Для определения скорости высвобождения лекарственных веществ из суппозиториев в опытах «in vitro» использовали метод равновесного диализа через полупроницаемую мембрану, поскольку он позволяет не только качественно, но и количественно оценить высвобождение веществ из лекарственной формы. Диализ проводили в термостате при температуре 37С.
В качестве среды использовали 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты. Диализную трубку, на одном конце которой находилась целлофановая мембрана, помещали в стакан с 50 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, с температурой 37 С так, чтобы мембрана находилась на 3-4 мм в среде. На мембрану помещали разрезанный вдоль суппозиторий. Отбор проб в объеме 5 мл проводили через 15, 30, 60, 120, 180, 240 минут с восполнением диализной среды. 5 мл диализата помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили до метки 0,1 моль/л раствором хлористоводородной кислоты. Измеряли оптическую плотность полученного диализата на спектрофотометре при длине волны 328 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см относительно растворителя.