Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Орексины и подкрепляюшие системы мозга (обзор литературы)
1.1. Роль орексина в организации адаптивного поведения
1.1.1. Орексин и орексиновые рецепторы .
1.1.2. Орексиновые нейроны гипоталамуса
1.2. Участие орексинов в механизмах подкрепления и зависимости
1.2.1. Ключевая роль орексинов в развитии аддиктивных форм поведения
1.2.2. Роль орексина в формировании зависимости от этанола.
1.3. Участие орексинов в регуляции стресса.
Глава 2. Материалы и методы исследования .
2.1. Выбор животных
2.2. Выращивание животных в условиях социальной изоляции .
2.3. Процедура хронической алкоголизации .
2.4. Метод моделирования психической травмы
2.5. Методы исследования поведения
2.5.1. Условная реакция предпочтения места .
2.5.2. Исследование поведения крыс в тесте "открытое поле" .
2.5.3. Исследование агрессии в тесте "чужак-резидент"
2.5.4. Исследование поведения крыс в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" .
2.6. Методы иммуннохимического анализа (ИФА)
2.7. Фармакологические вещества, используемые в работе
2.8. Статистические методы анализа
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Исследование действия орексина и селективного антагониста OX1R SB-408124 на условную реакцию предпочтения места этанола, эмоционально 3 исследовательскую активность и его содержание в структурах головного мозга у крыс при хронической алкоголизации
3.1.1 Исследование действия орексина и селективного антагониста OX1R SB-408124 на условную реакцию предпочтения места этанола
3.1.2. Исследование участия орексина А в организации эмоционального и исследовательского поведения у крыс
3.1.3. Исследование удельного содержания орексина А в структурах головного мозга крыс при экспериментальной хронической алкоголизации
3.2. Исследование условно подкрепляющих свойств орексина и его участия в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции
3.2.1. Исследование условно подкрепляющих свойств орексина у животных, выращенных в условиях социальной изоляции .
3.2.2. Исследование участия орексина в организации эмоционально-исследовательского поведения и двигательной активности у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции
3.3. Исследование участия орексина в организации эмоционально исследовательского поведения, двигательной активности и его содержание в структурах головного мозга у крыс с психической травмой .
3.3.1.Исследование участия орексина в организации эмоционально исследовательского поведения и двигательной активности у крыс с психической травмой
3.3.2. Исследование удельного содержания орексина А в структурах головного мозга крыс с психической травмой
Глава 4. Обсуждение полученных результатов .
Выводы .
Практические рекомендации
- Орексиновые нейроны гипоталамуса
- Методы исследования поведения
- Исследование участия орексина А в организации эмоционального и исследовательского поведения у крыс
- Исследование участия орексина в организации эмоционально исследовательского поведения, двигательной активности и его содержание в структурах головного мозга у крыс с психической травмой
Введение к работе
Развитие фундаментальной нейробиологии предоставляет для
фармакологических исследований новые перспективные мишени. В последнее время большое внимание привлекает работа систем нейропептидной регуляции и возможность воздействия на нее фармакологическими средствами (Шабанов П.Д. и др., 2012). Одной из мишеней, представляющих заметный практический интерес, является система орексиновой регуляции. Орексин представлен в головном мозге двумя пептидами, орексином А и В, которые синтезируются преимущественно в гипоталамусе (Sakurai T., 2010). Из латерального гипоталамуса они транспортируются в другие отделы ЦНС, где модулируют различные функции, такие как поддержание циркадианного ритма, регуляция пищевого поведения, системы подкрепления и стресса (De Lecea L., 2012). Согласно современным представлениям, орексины выполняют ключевую роль в развитии аддиктивных форм поведения, включая поведение, связанное с активацией системы положительного подкрепления. Особенно важна роль орексинов в реализации условных реакций (зло)употребления веществ с наркогенным потенциалом на фоне стрессорных факторов. Структурной основой данного действия орексинов является, по-видимому, обширная проекционная сеть связей орексинпродуцирующих нейронов со структурами мезокортико-лимбической системы и системой расширенной миндалины. Эти связи опосредуют поведение, связанное с аддикцией (De Lecea L., 2012; Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2012, 2016). Ряд недавних исследований выявили роль орексинов в регуляции стресс-зависимых процессов в ЦНС (Flores A. et al., 2014). Обоснованием этой роли орексиновой регуляции служит взаимодействие орексиновых нейронов с эмоциогенными структурами головного мозга, такими как ядро ложа конечной полоски, голубоватое место, центральное и дорзомедиальное ядра миндалины, гиппокамп, медиальная префронтальная кора (Peyron C. et al., 1998).
Таким образом, изучение значения системы орексина (орексин А / OX1R рецептор орексина), рассматриваемой в качестве молекулярной мишени действия наркогенных веществ, особенно при стрессе, является перспективным направлением исследований в нейрофармакологии и биологической наркологии.
Степень разработанности темы
В работах последних лет показано, что введение селективного антагониста OX1R рецепторов SB-334867 снижает потребление этанола у крыс линии Sprague Dawley в условиях свободного выбора между водой и этанолом (Moorman D.E., Aston-Jones G., 2009). Системное введение SB-334867 снижало частоту самовведения этанола у предпочитающих этанол крыс при использовании как фиксированного, так и прогрессивного режимов подкрепления (Lawrence A.E. et al., 2006; Jupp B. et al., 2011). Также показано участие орексиновой регуляции в механизмах реализации реакции на стресс. Так, блокада OX1R рецепторов
орексина с помощью SB334867 способствует ускорению угашения
индуцированного воздействием и обстановочного избегания (Flores A. et al.,
2014). Микроинъекции орексинов А и В в паравентрикулярное ядро таламуса
оказывают анксиогенное действие на животных в приподнятом крестообразном
лабиринте (Li Y et al., 2010). Оптогенетическая стимуляция орексиновых
нейронов индуцирует экспрессию OX1R рецепторов в клетках
паравентрикулярного ядра таламуса и повышает тревожность крыс в тесте социального взаимодействия (Heydendael W. et al., 2014). Все эти факты указывают на вовлечение орексиновой системы мозга в эмоциональные реакции, но не отвечают на вопрос о конкретном ее вкладе в эмоциональную регуляцию поведения, активируемого наркогенами, особенно после стрессогенных воздействий.
Цель исследования
Целью исследования был фармакологический анализ участия орексина и его антагониста SB-408124 в реализации механизмов подкрепления и зависимости от этанола у крыс, а также в эмоционально-исследовательской и двигательной активности в моделях аддиктивного поведения и стресса.
Задачи исследования
1) Исследовать условную реакцию предпочтения места (УРПМ) этанола при
активации (орексин А) и блокаде OX1R рецепторов орексина (SB-408124) в
головном мозге крыс.
-
Исследовать участие орексина А в организации эмоционально-исследовательского и двигательного поведения у крыс после интраназального введения орексина и антагониста OX1R рецепторов SB-408124 на фоне хронической алкоголизации.
-
Исследовать участие орексина А в организации эмоционально-исследовательского и двигательного поведения у крыс после интраназального введения орексина и антагониста OX1R рецепторов SB-408124 на фоне социальной изоляции.
4) Исследовать участие рецепторов орексина А в организации
эмоционально-исследовательского и двигательного поведения у крыс после
интраназального введения орексина и антагониста OX1R рецепторов SB-408124
при формировании посттравматического стрессового расстройства (ПТСР).
-
Оценить динамические изменения концентрации орексина А в структурах головного мозга (центральное ядро миндалины, гиппокамп и латеральный гипоталамус) у крыс на фоне хронической алкоголизации и отмены этанола.
-
Оценить динамические изменения концентрации орексина А в структурах головного мозга (центральное ядро миндалины, гиппокамп и латеральный гипоталамус) у крыс при формировании посттравматического стрессового расстройства (ПТСР).
Научная новизна
В результате проведенных исследований показано, что орексин А
модулирует подкрепляющие свойства этанола и реакции на острое стрессорное
воздействие, вовлекая структуры центрального ядра миндалины. Блокируя OX1R
рецепторы орексина интраназальным введением селективного антагониста SB-
408124, можно устранить подкрепляющие эффекты этанола, а также значительно
снизить патологические проявления посттравматического стрессового
расстройства (ПТСР). Результаты подтвердили важную роль системы орексина А в поддержании гомеостаза и реализации разнообразных поведенческих реакций, в том числе после хронической интоксикации этанолом, социальной изоляции или формировании ПТСР. Широкий спектр поведенческих реакций, инициируемых активацией или блокадой рецепторов орексина А в головном мозге, предполагает возможность создания фармакологических средств, влияющих на процессы орексиновой регуляции и направленных на лечение широкого спектра патологических состояний, таких как аддиктивные расстройства, расстройства фобического спектра и постстрессовые состояния. В настоящей работе получены конкретные данные о блокаде экспрессии и восстановления УРПМ этанола у крыс при хронической алкоголизации и социальной изоляции при интраназальном введении антагониста OX1R рецепторов SB-408124, действии орексина А и SB-408124 на эмоционально-исследовательское поведение при алкоголизации, социальной изоляции и постстрессовом расстройстве, а также динамике орексина в центральном ядре миндалины, гиппокампе и гипоталамусе при хронической алкоголизации и посттравматическом стрессовом расстройстве.
Основные положения, выносимые на защиту:
1) Блокада OX1R рецепторов орексина SB-408124 препятствует проявлению
реакций предпочтения этанола в тесте УРПМ (формирование и возобновление
реакций после угашения), нормализуют коммуникативную активность
хронически алкоголизированных животных, что указывает на вовлечение
системы орексина в регуляцию аддиктивного поведения, активируемого
этанолом.
-
У крыс, выращенных в условиях социальной изоляции от сородичей, блокада OX1R рецепторов орексина SB-408124 вызывает сходный эффект в модели УРПМ, при этом SB-408124 проявляет анксиолитическое и растормаживающее действие, снижает агрессивность и восстанавливает коммуникативное поведение.
-
Курсовое (7 дней) интраназальное применение антагониста орексина А SB-408124 у крыс после витального психострессорного воздействия (экспозиция с питоном) демонстрирует типичный анксиолитический профиль препарата, восстанавливая коммуникативную активность стрессированных животных.
-
Орексин А неравномерно распределён в различных структурах мозга и имеет различный динамический профиль на фоне алкоголизации, отмены этанола и психотравмирующего воздействия. Так, при алкоголизации концентрация орексина А повышается в центральном ядре миндалины, особенно при отмене
алкоголя. В гипоталамусе при этих же условиях концентрация орексина А снижается. Сходным образом, на 7-е сутки у крыс, переживших острый витальный стресс, концентрация орексина А в центральном ядре миндалины повышается, в гиппокампе понижается, а в гипоталамусе постепенно растет.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическое значение работы состоит в расширении представлений о
роли орекиновой регуляции в формировании аддиктивных форм поведения и
реакции на стресс, а также действии орексина А и антагониста его рецепторов SB-
408124 на эмоционально-исследовательское поведение и двигательную
активность крыс. Так, антагонист OX1R рецепторов SB-408124, введенный
интраназально, блокирует экспрессию УРПМ и ее возобновление после угашения
у алкоголизированных крыс, а также увеличивает коммуникативную активность
хронически алкоголизированных животных. Кроме того, SB-408124 блокирует
экспрессию и восстановление УРПМ этанола у животных, выращенных в
условиях социальной изоляции от сородичей. Интраназальное введение
селективного антагониста OX1R рецепторов SB-408124 оказывает
анксиолитическое и растормаживающее действие на крыс, снижает у них агрессивность и восстанавливает коммуникативное поведение, особенно после стресса социальной изоляции. Интраназальное введение орексина А, напротив, приводит к снижению коммуникативного поведения. Курсовое применение SB-408124 в течение 7 дней после витального психострессорного воздействия (экспозиция с питоном) вызывает типичный анксиолитический эффект и восстанавливает коммуникативную активность у крыс, то есть блокирует развитие у них ПТСР. Полученные результаты позволяют методически обосновать и адекватно оценить подкрепляющие свойства орексинов и их антагонистов в экспериментальных условиях с помощью относительно простых поведенческих тестов. Высокая анксиолитическая и антиагрессивная активность антагонистов орексина А предполагает возможность разработки среди аналогичных средств корректоров эмоционального поведения по типу дневных транквилизаторов, молекулярными мишенями которых могут рассматриваться OX1R рецепторы орексина. Такие средства могут быть полезны при лечении алкогольной зависимости и постстрессовых состояний.
Методология и методы исследования
Методология исследования состояла в изучении у крыс подкрепляющих
свойств этанола, оцененных по условной реакции предпочтения места (УРПМ), а
также эмоционально-исследовательского и двигательного поведения крыс с
помощью ряда поведенческих тестов (приподнятый крестообразный лабиринт,
«открытое поле», «чужак-резидент»). Исследования выполнены на крысах при
хронической алкоголизации, социальной изоляции от сородичей и
постстрессовом расстройстве. Проводили фармакологический анализ УРПМ этанола, вводя интраназально пептидные агонисты и антагонисты рецепторов орексина. При хронической алкоголизации и последующей отмене этанола, а также при постстрессовом расстройстве с помощью иммуноферментного анализа
определяли концентрацию орексина А на общий белок в структурах головного мозга крыс. Исследования выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины и этических норм работы с животными.
Степень достоверности и апробация материалов исследования
Степень достоверности определяется большим количеством
экспериментальных животных (350 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, фармакологическими и биохимическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.
Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на Всероссийской
научной конференции «Фармакология экстремальных состояний», посвященной
150-летию Н.П. Кравкова (Санкт-Петербург, 2015), Всероссийской научной
конференции «Нейроэндокринология-2015», посвященной 90-летию А.Л.
Поленова (Санкт-Петербург, 2015), 8-й международной конференции «Steroids
and nervous system» (Турин, 2015), 28-м международном конгрессе Европейского
общества нейропсихофармакологии (ECNP, Амстердам, 2015), 29-м
международном конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии (ECNP, Вена, 2016), научных заседаниях отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (2015, 2016).
Работа рассмотрена и одобрена комитетом по этике ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах списка ВАК и 12 тезисов и статей в сборниках научно-практических работ.
Апробация диссертации прошла на заседании отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».
Личный вклад автора
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании и дизайне экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферата. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, в написании статей и тезисов – 90-93%, написании диссертации и автореферата – 95%.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, включающей 3 подраздела, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель содержит 169 наименований, в том числе 33 отечественных и 136 иностранных.
Орексиновые нейроны гипоталамуса
Орексинпродуцирующие нейроны (орексиновые нейроны) – немногочисленная группа клеток, расположенных исключительно в латеральном гипоталамусе крыс (Peyron C. et al., 1998; Date Y. et al., 1999; Nambu T. et al., 1999). Аксоны этих клеток образуют обширную проекционную сеть, охватывающую различные структуры головного мозга (Peyron C. et al., 1998; Date Y. et al., 1999; Nambu T. et al., 1999). Наиболее интенсивно имунногистохимическое окрашивание орексиновых нервных окончаний в головном мозге наблюдается в паравентрикулярном ядре таламуса, аркуатном ядре гипоталамуса, туберомаммилярном и латеральном мамиллярном ядрах, ядре шва и голубоватом месте (Nambu T. et al., 1999). Орексин колокализуется с динорфином (Chou T.C. et al., 2001), глутаматом (Abrahamson E.E. et al., 2001). Орексиновые нейроны иннервируются из латерального парабрахиального ядра, вентролатерального преоптического ядра, медиальной и латеральной преоптической областей, основания переднего мозга, заднего и дорсомедиального гипоталамуса, вентральной области покрышки и медиального ядра шва (Broberger C. et al., 1998; Elias C.F. et al., 1998). Данные структуры мозга регулируют активность орексиновых нейронов по нейромедиаторному механизму. Введение неизбирательного холиномиметика карбахола активирует 27% и ингибирует 6% орексиновых нейронов через М3-подтип мускариновых рецепторов (Yamanaka A. et al., 2003; Sakurai T. et al., 2005). Норадреналин и серотонин (5HT) вызывают гиперполяризацию мембран орексиновых нейронов через активацию G – белков, регулирующих состояние K+ каналов через альфа-2-адренорецепторы и 5HT1A-рецепторы (Yamanaka A. et al., 2006; Muraki Y. et al., 2004). Несмотря на то, что орексиновые нейроны и не экспрессируют дофаминовые рецепторы, дофамин может вызывать гиперполяризацию мембран орексиновых нейронов, опосредованно альфа-2-адренорецепторами (Yamanaka A. et al., 2006).Таким образом, серотониновые и катехоламиновые нейроны, по-видимому, осуществляют тормозную обратную связь с орексиновыми нейронами. Указанный механизм обратной связи может стабилизировать активность как орексиновых, так и моноаминергических нейронов.
Было также показано, что агонисты NMDA рецепторов возбуждают орексиновые нейроны, тогда как антагонисты NMDA рецепторов cнижают их активность (Yamanaka A. et al., 2003).
Использование внутриклеточного кальциевого индикатора (Yc2.1) в орексинпродуцирующих нейронах на модели трансгенных мышей позволило обнаружить активность ряда биологически активных веществ, влияющих на активность данных клеток. Обнаружено, что холецистокинин, нейротензин, окситоцин и вазопрессин оказывают возбуждаюшее действие (Тsujino N. et al., 2005; Тsunematsu T. et al., 2008), тогда как ГАМК, глюкоза, серотонин, норадреналин, пролактин и лептин оказывают тормозное действие на орексиновые нейроны (Liu Z.W. and Gao X.B., 2007). Орексиновые нейроны также значительно подвержены колебаниям от уровня СО2 (Williams R.H. et al., 2007). Так как орексин влияет на респираторные функции, то он может играть важную роль и в регуляции дыхания (Nakamura A. et al., 2007).
Орексин А и орексин В (или гипокретин-1 и гипокретин-2, соответственно) были первоначально описаны как модуляторы пищевого поведения в связи с локализацией орексинпродуцирующих клеток в ограниченной области латерального гипоталамуса, известного центра насыщения головного мозга (Sakurai T. et al., 1998; Edwards C.M. et al., 1999; Haynes A.C. et al., 2000, 2002). Первые же детальные исследования позволили соотнести орексины с функцией регуляции цикла сон-бодрствование, в частности, с механизмами пробуждения и поддержания бодрствующего состояния (De Lecea L., 2012). В дальнейшем была обнаружена связь орексинов, наряду с другими нейропептидами головного мозга, и системы положительного подкрепления (De Lecea L., 2012). Отмечается, что регуляция циркадианного ритма в большей степени ассоциирована с функционированием OX2R, в то время как регуляция системы положительного подкрепления – с активацией OX1R (Akanmu M.A., Honda K., 2005; Aston-Jones G. et al., 2010; Smith R.J., 2010; Шумилов Е.Г. и др., 2014; Тиссен И.Ю. и др., 2015). Этот факт допускает возможность разработки средств фармакологической коррекции, избирательно изменяющих активность OX1R или OX2R рецепторов, для лечения аддиктивных расстройств и расстройств сна, соответственно (Gotter A.L. et al., 2012). Недостаточность выработки орексина или рецепторов к нему приводит к развитию нарколепсии. Таким образом, предполагается, что орексиновая регуляция критически важна для поддержания состояния бодрствования. Орексин активирует моноаминергические, холинергические и гистаминергические нейроны, необходимые для поддержания состояния бодрствования и получают обширную обратную связь от структур лимбической системы (Peyron C. et al., 2000; Thannickal T.C. et al., 2000; Nishino S., 2005; Sundvik M. et al., 2015). Орексиновые нейроны имеют реципрокные соединения с аркуатным ядром гипоталамуса, регулирующим потребление пищи. Также участие орексина в регуляции пищевого поведения и энергетического обмена подтверждается наличием у орексиновых нейронов чувствительности к лептину, грелину и колебаниям уровня глюкозы (Bonnavion P. et al., 2015; Hsu T.M. et al., 2015; Park J.H. et al., 2015). Орексиновые нейроны также имеют связи с дофаминергической подкрепляюшей системой мозга (Lin L. et al., 1999; Peyron C. et al., 2000; Шумилов Е.Г. и др., 2014; Тиссен И.Ю. и др., 2015). Таким образом, орексиновая регуляция играет роль в формировании эмоционального подкрепления, энергетическом гомеостазе, пищевом поведении и поддержании состояния бодрствования.
Методы исследования поведения
Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте чужак резидент в соответствии с описанием этологического атласа (Пошивалов В.П., 1986). Смысл методики состоит в том, что к крупному самцу, постоянно находящемуся в клетке (резиденту) подсаживают более мелкое животное (чужака). Регистрируют число поведенческих проявлений агрессивности и защиты, а также общее число поведенческих актов, описывающих взаимоотношение двух особей крыс (Вартанян Г.А., Петров Е.С., 1989). Изучение внутривидового взаимодействия производили в тесте «чужак-резидент» следующим образом. Подопытное животное – «резидент» в течение 1 часа находилось в клетке размерами 20x36x20 см, после чего к нему подсаживали на 5 мин второе животное – «чужака». «Чужаками» являлись крысы-самцы массой 170-180 г, то есть заведомо меньших размеров, чем «резиденты», что создавало условия для зоосоциального доминирования последних. В процессе 5-минутного совместного пребывания «резидента» и «чужака», помещаемого в клетку только на время опыта, посредством программного этографа регистрировали общее число, последовательность и длительность всех элементарных актов и поз, образующих внутривидовую общительность, агрессию, защиту и индивидуальное поведение «резидента». Общительность включала в себя следующие дискретные акты: приближение, следование за партнером, обнюхивание партнера, груминг загривка или тела, наползание или подползание под партнера. Агрессия проявлялась в виде вертикальных или боковых стоек (угроза) или атаки. Социальная пассивность выражалась различными актами индивидуального поведения: локомоцией, обнюхиванием, аутогрумингом, движениями на месте, вертикальными стойками, неподвижностью (рис. 4).
Поведение крыс в приподнятом лабиринте исследовали в установке, представлявшей приподнятый крестообразный лабиринт, который состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отрытым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга. Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. При помощи программного этографа и секундомера, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время свешивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продолжительность теста составляла 5 минут (рис. 6). Рис. 6. Исследование поведения в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»
Крыс декапитировали через 2 ч, 48 ч и 7 суток после отмены алкоголя либо на 10 сутки после формирования посттравматического стрессового расстройства как последствия перенесенной острой психической травмы. Непосредственно после декапитации производили тотальный забор крови и выделяли миндалину, гиппокамп и гипоталамус. Образцы крови инкубировали в течение 30 мин при +4С и далее центрифугировали при температуре +4С и ускорении в течение 10 мин. Полученные образцы сыворотки крови и структур головного мозга замораживали и хранили при – 80оС до проведения высокочувствительного иммуноферментного анализа. Затем проводили гомогенизацию выделенных образцов структур головного мозга с помощью вибрационной мельницы Cryomil (Retsch, Германия) при температуре -1980С с применением жидкого азота. Продукт криогенного размельчения образцов суспендировали в 0,5 мл забуференного физиологического раствора (калий-натрий-фосфатный буфер), рН = 7,4. Концентрации орексина в образцах структур головного мозга и сыворотке крови животных определяли путем твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-системы «Orexin A (human, bovine, canine, mouse, ovine, porcine, rat) – EIA Kit Peninsula Laboratories International, Inc.» (США), в полном соответствии с инструкцией производителя. Дальнейшую обработку результатов проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2003/2007, IBM SPSS Statistics 18 и GraphPad Prism 6.
Исследование участия орексина А в организации эмоционального и исследовательского поведения у крыс
В тесте «открытое поле» исследовали свободную двигательную активность. Регистрировали несколько простых двигательных актов: вертикальную и горизонтальную активность, груминг, заглядывание в норки. В контрольной группе животных число пересеченных секторов составило 17,8±4,1, число заглядываний в норки – 5,0±3,5 актов, число принюхиваний – 11,3±4,2 актов, число актов груминга – 4,0±2,3, число вертикальных стоек – 0,6±1,0 актов, число стоек с упором на стенку – 3,3±1,7 акта, число замираний – 7,7±2,3 актов, движений внутри секторов – 6,7±3,4 актов, болюсов дефекации – 2,1±1,3. В группе животных, получавших этанол внутрибрюшинно, число заглядываний в норки и движений внутри секторов сократилось до 1,2±1,8 и 3,9±2,2акта, соответственно. Число вертикальных стоек возрасло до 4,8±3,2. Прочие поведенческие паттерны достоверно не изменились по сравнению с контрольной группой. В группе животных, получавших этанол внутрибрюшинно и селективный антагонист OX1R рецепторов SB-408124 в дозе 10 мкг в 20 мкл, число актов груминга сократилось как по отношению к алкоголизированным животным, так и по отношению к контрольной группе до 0,9±1,2, замираний и движений внутри секторов не наблюдалось. В то же время достоверно возрасло число стоек с упором на стенку до 6,2±3,5. Прочие поведенческие паттерны достоверно не изменились по сравнению с контрольной группой. В группе животных, которые получали внутрибрюшинно этанол и интраназально орексин А, достоверно сократилось число заглядываний в норки и актов груминга (2,0±4,2 и 0,8±1,6, соответственно). Число пересеченных секторов сократилось по отношению к группе получавшей этанол внутрибрюшинно. Замираний и движений внутри секторов не наблюдалось. Прочие поведенческие паттерны достоверно не изменились по сравнению с контрольной группой. В группе животных, получавших селективный антагонист OX1R рецепторов SB-408124 в дозе 10 мкг в 20 мкл и не получавших этанол, удвоилось число вертикальных стоек (1,1±0,9). Иных изменеий в поведении животных в сравнении с контрольной группой не обнаруживалось. В группе животных, которые получали интраназально орексин А и не получали этанол полностью отсутствовали акты груминга и более чем двукратно сократилось число заглядывания в норки (2,0±0,7). Иных изменеий в поведении животных в сравнении с контрольной группой не обнаруживалось. (табл. 4.) Таблица 4 Влияние орексина А и его антагониста SB-408124 на поведение хронически алкоголизированных крыс в «открытом поле» Показатель(число актов) Контрольнаягруппакрыс Крысы,получавшие этанолв/бр Крысы,получавшиеантагонист OX1Rрецепторов Крысы,получавшиеорексин А В тесте «чужак-резидент» определяли агрессию животных, оценивая коммуникативные поведенческие акты, акты агрессии, а также общее число двигательных актов. В данном тесте было 4 группы крыс: 1) контрольные животные, не получавшие ни этанол, ни препараты, 2) группа животных, получавшая этанол внутрибрюшинно, 3) группа животных, получавшая внутрибрюшинно этанол и интраназально антагонист орексина А, 4) животные, получавшие этанол внутрибрюшинно и орексин А интраназально.
В контрольной группе животных число актов коммуникации составило 14,7±6,9, актов агрессии не наблюдалось. В группе животных, получавших этанол внутрибрюшинно, число актов коммуникации составило 6,1±3,2, актов агрессии также не наблюдалось. В группе животных, получавших этанол и антагонист орексина, коммуникативное поведение составляло 21,7±4,5, агрессивное поведение не наблюдалось. В группе животных, получавших этанол и орексин А, коммуникативное поведение составляло 5,9±2,0, агрессивное поведение не наблюдалось (табл. 5).
Таким образом, резюмируя полученные данные, следует отметить, что в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» селективный антагонист OX1R рецепторов SB-408124 не обладал анксиолитической активностью: время нахождения в светлом и темном рукавах, а также число свешиваний достоверно не менялось по сравнению с контрольной группой. Антагонист орексина SB-408124 увеличивал коммуникативную активность животных в тесте «чужак-резидент». В свою очередь, орексин А, напротив, приводил к снижению коммуникативного поведения. Как сам орексин А, так и его антагонист SB-408124 снижали исследовательскую активность в тесте «открытое поле».
Всего в эксперименте были использованы 28 крыс, в том числе в контрольную группу вошли 7 крыс, которые получали воду, и 21 крыса, подвергшаяся полупринудительной алкоголизации 15%-ным раствором этанола в течение 6 месяцев. В первой экспериментальной группе (7 животных) структуры мозга были выделены через 2 ч после последнего приема алкоголя. Во второй и третьей экспериментальных группах (по 7 животных в каждой) забор структур головного мозга для определения орексина А осуществляли на 2-е и 7-е сутки после отмены алкоголя соответственно. Обозначение экспериментальных групп представлены в таблице 6.
Исследование участия орексина в организации эмоционально исследовательского поведения, двигательной активности и его содержание в структурах головного мозга у крыс с психической травмой
Таким образом, в результате интраназального введения селективного антагониста OX1R рецепторов SB-408124 на фоне выработки предпочтения места у хронически алкоголизированных крыс наблюдается снижении УРПМ при одновременном применении препаратов с этанолом и снижении, вплоть до аверсии, реакции предпочтения, вызванной ситуацией возобновления. Это согласунется с данными, согласно которым орексин А, вероятно, играет роль в развитии аддиктивных форм поведения, ассоциированных с различными веществами. Так, для кокаина и амфетамина – это сенсибилизация и мотивация к поиску, в особенности, вызванные внешними стимулами, такими как ассоциированные с введением препаратов условные раздражители или стрессовые факторы. В отношении никотиновой зависимости, орексин А участвует в формировании реакции предпочтения, но, по-видимому, не играет роли в ее стресс-индуцированном восстановлении. Орексин играет определенную роль в развитии условного предпочтения опиатов, но также может непосредственно модулировать их подкрепляющие свойства. В отношении этанола показано модулирующее действие на индуцированное внешними стимулами предпочтение и возобновление УРПМ (Mahler S.V. et al., 2012). Одной из причин таких различий могут быть дофаминергические механизмы, связанные с усилением высвобождения дофамина в эмоциогенных структурах, способные модулировать мотивационное и подкрепляющее поведение, в особенности, вызванное условными раздражителями. Никотин, опиаты и этанол увеличивают выброс дофамина (ДА), действуя на вентральную область покрышки, где они модулируют глутамат- и/или ГАМК-ергические нейроны (Cami, Farre, 2003). В противоположность этому, кокаин и амфетамин увеличивают выброс ДА в первую очередь напрямую, с помощью действий на уровне терминали (Cami, Farre, 2003; Aston-Jones et al., 2010).
Таким образом, понимание различных механизмов развития аддиктивного поведения и положения орексиновой регуляции в этой системе становится очень важным для оценки роли орексина в поисках наркотиков и награды. Интраназальное введение селективного антагониста OX1R рецепторов SB-408124 животным, выращенным в условиях социальной изоляции, также блокировало экспрессию УРПМ этанола. Восстановление УРПМ этанола у животных, выращенных в условиях социальной изоляции, после угашения аналогично блокировалось антагонистом OX1R. В связи с этим антагонисты орексина могут рассматриваться как возможные перспективные средства профилактики и лечения приема аддиктивных средств, индуцированного стрессом и окружающими стимулами среды.
Следует отметить важность социальной изоляции, как фактора, усугубляющего патологическое течение аддиктивных и стрессовых расстройств. Ряд авторов полагает, что полноценное формирование головного мозга невозможно без определенного уровня и качества афферентных поступлений в раннем онтогенезе. Выращивание в изоляции, как вариант афферентной депривации может вызывать ряд поведенческих эффектов при непосредственном включении центральных ДА-ергических механизмов (Jones et al., 1992). Крысы, выращенные в изоляции, демонстрируют набор поведенческих паттернов, обычно наблюдающихся после введения агонистов ДА, таких как фенамин. У них наблюдается спонтанная гиперактивность (Einon D.F., Sahakian B.J., 1979; Gentsch C. et al, 1988) и поведенческие стереотипии (Jones G.H. et al., 1992). На фоне введения d-амфетамина и апоморфина у изолированных животных повышается стереотипное поведение (Einon D.F., Sahakian B.J., 1979; Chitkara B. et al., 1984), увеличивается самовведение психостимуляторов (Schenk S. et al., 1982), локомоция (Oehler J. et al., 1985). Эти данные означают повышение чувствительности к агонистам ДА амфетаминового типа и другим подкрепляющим стимулам у крыс, выращенных в условиях социальной изоляции (Jones G.H. et al., 1992). У крыс, выращенных в изоляции от сородичей, после стимуляции и разрушения системы ВОП (Лебедев А.А., 1986; Панченко Г.Н., Лебедев А.А., 1992) наблюдается изменение различных форм поведения. Повышение гиперактивности после введения 6 гидроксидофамина, наблюдаемое у крыс-изолянтов, но не у социальных (выращенных в группах) животных, видимо, объясняется тем, что выраженное истощение катехоламинов после повреждения нейротоксином провоцирует у крыс «синдром катехоламиновой гиперчувствительности», и эффекты изоляции и нейротоксического воздействия потенцируются (Пошивалов В.П., 1986). Гиперсенситивность ДА-зависимых форм поведения, по-видимому, зависит от индивидуального опыта, и у крыс, выращенных в изоляции, эти формы поведения детерминируются мотивационными факторами (Jones G.H. et al., 1992). Социальная депривация изменяет чувствительность не только ДА-ергической, но и норадренергической системы мозга. Так, выращивание приматов в изоляции приводит к снижению уровня норадреналина в цереброспинальной жидкости. У крыс, выращенных в изоляции от сородичей, в структурах лимбической системы обнаружено увеличение количества пресинаптических 2-адренорецепторов, что приводит к гиперфункции данных рецепторов (Fulford A.J. et al., 1994). Установлено, что у крыс, подвергнутых длительной изоляции, происходит уменьшение концентрации серотонина в гиппокампе и фронтальной коре, но не прилегающем ядре (Jaffer E.H. et al., 1993).
Исследования показали, что при электрическом раздражении структур мезокортиколимбической системы у крыс - изолянтов, наблюдается повышение преимущественно негативных эффектов подкрепления (Лебедев А.А., 1986).