Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ состояния проблемы (обзор литературы) 17
1.1. Общие сведения об интерферонах 17
1.1.1. Роль интерферонов в формировании противовирусной резистентности 21
1.1.2. Применение интерферонов в терапевтической практике 25
1.2. Иммобилизированные биологически активные вещества 28
1.2.1. Физико-химические свойства 29
1.2.2. Фармакологические свойства 31
1.3. Технология электронно-лучевого синтеза 38
1.3.1. Общие принципы 38
1.3.2. Фармакологические свойства получаемых веществ 41
1.4. Общие сведения об энтеровирусной инфекции 44
1.4.1. Классификация 44
1.4.2. Распространённость и клинические проявления энтеровирусной инфекции 45
1.4.3. Размножение энтеровирусов в культуре клеток. 47
1.4.4. Современные подходы к терапии энтеровирусной инфекции. 48
1.5. Общие сведения о хроническом гепатите C 49
1.6. Резюме 51
Глава 2. Предлагаемые способы решения проблемы 54
2.1. Выбор условий электронно-лучевой иммобилизации интерферона альфа 2b 55
2.1.1. Материалы и методы 56
2.1.2. Результаты и их обсуждение 57
2.1.3. Резюме 71
2.2. Исследование устойчивости интерферон-полимерных конъюгатов к воздействию протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта 71
2.2.1. Материалы и методы 72
2.2.2. Результаты и их обсуждение 73
2.2.3. Резюме 77
2.3. Исследование специфической противовирусной и иммунотропной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 77
2.3.1. Исследование специфической противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 77
2.3.2. Исследование специфической иммунотропной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 80
2.3.3. Резюме 95
2.4. Исследование специфической противовирусной активности и иммунотропного действия лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона лямбда-1 96
2.4.1. Исследование специфической противовирусной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона лямбда-1 96
2.4.2. Исследование специфической иммунотропной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона лямбда-1 105
2.4.3. Резюме 123
2.5. Оценка биоадгезии и абсорбции иммобилизированного интерферона альфа-2b в разных отделах желудочно-кишечного тракта 124
2.5.1. Материалы и методы 125
2.5.2. Результаты и их обсуждение: 126
2.5.3. Резюме 130
2.6. Создание лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 130
2.6.1. Теоретические основы выбора оптимального состава лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 130
2.6.2. Практическая реализация создания лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 134
2.6.3. Резюме 140
2.7. Резюме 140
Глава 3. Проверка и подтверждение результатов исследования 142
3.1. Этические аспекты 142
3.2. Исследования фармакокинетики лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 1 144
3.2.1. Материалы и методы 144
3.2.2. Дизайн исследования 147
3.2.3. Результаты исследования 148
3.2.4. Резюме 156
3.3. Изучение специфической противовирусной активности и иммунотропного действия лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 158
3.3.2. Изучение иммунотропного действия лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 161
3.4. Исследование острой токсичности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 199
3.4.1. Исследование острой токсичности фармацевтической субстанции иммобилизированного интерферона альфа-2b 200
3.4.2. Исследование острой токсичности лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 210
3.4.3. Резюме 218
3.5. Исследование хронической токсичности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 219
3.5.1. Исследование хронической токсичности фармацевтической субстанции иммобилизированного интерферона альфа-2b 220
3.5.2. Исследование хронической токсичности лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 251
3.5.3. Резюме 283
3.6. Исследование иммунотоксичности 284
3.6.1. Материалы и методы 285
3.6.2. Результаты исследования 290
3.6.3. Резюме 295
3.7. Исследование аллергенности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b 297
3.7.1. Материалы и методы 297
3.7.2. Результаты исследования 303
3.7.3. Резюме 307
3.8. Резюме 309
Заключение и выводы 315
Обобщение полученных результатов 315
Сопоставление полученных результатов с имеющимися данными 322
Выводы 324
Список сокращений 328
Список литературы 330
- Общие сведения об интерферонах
- Исследование специфической иммунотропной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона лямбда-1
- Изучение иммунотропного действия лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b
- Исследование хронической токсичности лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В свете современных приоритетных задач отечественной фармацевтики, декларирующих необходимость обеспечения лекарственной независимости как части национальной безопасности, разработка новых средств терапии социально значимых заболеваний, несомненно, актуальна.
В Государственной программе «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности» точкой достижения 50 % импортозамещения обозначен 2020 год. В соответствии с постановлением Правительства РФ от 15 апреля 2014 г. № 305 «Об утверждении государственной программы Российской Федерации "Развитие фармацевтической и медицинской промышленности" на 2013-2020 годы» к 2020 году на территории России должно производиться не менее 90 процентов жизненно важных лекарств. Темп развития задан достаточно высоким и уже на сегодняшний день определены хорошие перспективы в решении проблемы импортозамещения. Другая ситуация складывается в направлении разработок новых оригинальных лекарственных средств. Действительно, историческая практика крупных фармацевтических компаний демонстрирует ежегодный вывод в клиническую практику лишь трёх-четырех лекарственных средств с выраженными отличительными признаками и имеющих патентную защиту [Итин А., 2007]. Такая ситуация складывается с учетом того, что в погоне за комплайенсом сложных схем терапии, за счет научных находок синергизма действия лекарственных средств к новым препаратам относят и комплексы уже существующих.
Несколько иная картина имеет место в разработке и продвижении на рынок биопрепаратов. Действительно, для таких препаратов мишени уже давно определены, а если и меняются, то в рамках общих знаний об агрессивных агентах (например, мутации вирусов). Однако в этом случае возможности получения патентной защиты разрабатываемого препарата значительно шире и могут быть основаны на особенностях продуцента, продуктивности штамма, особенностей очистки целевых белков. Сюда же можно отнести и совершенствование вспомогательных веществ для увеличения стабильности белковых субстанций, технологические приёмы, снижающие производственные затраты и т.д., и т.п. [Борисов Д.А. и др., 2011].
Объектом выполненного исследования явились средства терапии социально значимых заболеваний вирусной этиологии, научно обоснованные схемы терапии которых требуют использования интерферонов. В то же время общеизвестны негативные стороны применения интерферонов, наиболее значимыми из которых являются гриппоподобные симптомы. Одним из серьёзных факторов, снижающих комплаентность при интерферонотерапии, является необходимость инъекционного введения этих препаратов.
К настоящему времени единственным путем уменьшения выраженности нежелательных лекарственных реакций и повышение комплаентности при использовании интерферонов является применение их пегилированных форм
[Bailon P. et al., 1997, Gilbert C.W. et al., 1999, Yowell S.L. et al., 2002, Veronose F. et al., 2005, 2006, 2009]. Пегилированные интерфероны позволяют снизить кратность их введения до 1 раза в неделю, но при этом повышают стоимость терапии в 15-20 раз. Такая ситуация складывается в связи с высокозатратной технологией химического пегилирования белковых препаратов.
С другой стороны, разработана и применяется в производстве лекарственных средств отечественная технология электронно-лучевого пегилирования биологически активных веществ, позволяющая создавать устойчивые водорастворимые конъюгаты полимеров и белковых фармакологических препаратов, обладающих значительной биодоступностью при энтеральном приеме [Vereschagin E.I. et al., 2001, Бекарев А.А., 2006, Бекарев А.А. и др., 2011, Мадонов П.Г., 2012, Мадонов П. Г. и др., 2015 a, b]. Эта технология значительно снижает стоимость конечного продукта в сравнении с химическим пегилированием. Представляется, что использование электронно-лучевого пегилирования для создания лекарственных средств на основе рекомбинантных интерферонов могло бы разрешить сложившиеся противоречия.
Вместе с тем, необходимо учитывать, что иммобилизация белковых молекул на инертных носителях изменяет фармакологические свойства исходных белковых молекул [Wang Y.S. et al., 2002]. Воздействие ионизирующего излучения также может изменять структуру белков вплоть до их разрушения. В связи с этим фармакологические свойства интерферонов, модифицированных иммобилизацией с помощью технологии электроннолучевого синтеза, должны быть тщательно изучены.
Степень разработанности. К настоящему времени в клинической практике используется лекарственное средство, полученное с помощью электронно-лучевого пегилирования белковых молекул – Тромбовазим. Данное лекарственное средство имеет как инъекционную форму выпуска, так пероральную. Доклинические исследования, а также регистрационные и постмаркетинговые исследования показали безопасность и эффективность данного лекарственного средства, а также высокую биодоступность пероральной формы.
Проведенные исследования других белковых молекул, иммобилизированных на инертных носителях с помощью электронно-лучевой технологии, в частности, эритропоэтина, соматотропина, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, гиалуронат-эндо--N-ацетилгексозаминидазы показали их высокую биодоступность при пероральном применении, а также отсутствие общей и специфических видов токсичности. Вместе с тем, в некоторых случаях были отмечены изменения не только фармакокинетических параметров, но и фармакодинамических эффектов пегилированных молекул.
Таким образом, представляется актуальным изучение фармакологических свойств иммобилизированных рекомбинантных интерферонов. С учетом приведенных аргументов была сформулирована цель исследования.
Цель исследования: изучить фармакологические свойства и эффекты модифицированных иммобилизацией с помощью технологии электроннолучевого синтеза интерферонов и обосновать возможность их клинического применения в терапии вирусных заболеваний органов пищеварительного тракта.
Задачи исследования:
-
Изучить физико-химических свойства интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевого пегилирования, при использовании полиэтиленгликолей различной молекулярной массы и различных режимов облучения.
-
Оценить устойчивость интерферон-полимерных конъюгатов к воздействию протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта в сравнении с немодифицированным интерфероном.
-
Исследовать специфическую противовирусную активность лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов.
-
Исследовать специфическую иммунотропную активность лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов.
-
Оценить особенности распределения интерферон-полимерных конъюгатов в различных отделах желудочно-кишечного тракта.
-
Провести исследования фармакокинетики, специфической противовирусной активности и иммунотропного действия, острой и хронической токсичности, иммунотоксичности, аллергенности пероральных лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов. Научная новизна. Основные результаты исследования являются
приоритетными. Научная новизна результатов исследований состоит в следующем.
Выполненные исследования продемонстрировали, что в результате модификации интерферонов с помощью технологии электронно-лучевого синтеза при облучении растворов полиэтиленгликоля и интерферона, предварительно замороженных при минус 70 C не выявляется значимая деградация белка.
Впервые исследована протеолитическая стабильность лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации. Результаты биохимических исследований выявили у лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов устойчивость к гидролитическому действию трипсина почти в 20 раз выше чем у немодифицированного интерферона (сохранность белка 49,4 % против 2,1 %).
Впервые показано, что у лекарственного препарата на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных при режиме низкотемпературного облучения, и в котором в качестве наполнителя используется мальтодекстрин, обеспечивается теоретическая сохранность более года.
Впервые исследована специфическая противовирусная активность лекарственного средства на основе полимерных конъюгатов рекомбинантного интерферона альфа-2b, полученных с помощью технологии электронно-5
лучевого синтеза, в отношении вируса Коксаки А7 на культуре клеток RD. Выявлено, что специфическая противовирусная активность модифицированного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза интерферона альфа-2b сравнима с немодифицированным интерфероном.
Впервые исследована специфическая противовирусная активность лекарственного средства на основе полимерных конъюгатов рекомбинантного интерферона лямбда-1, полученных с помощью технологии электроннолучевого синтеза, в системе культуральный ВГС клон JFH1 – клетки гепатомы человека Huh7.5 методами Real time PCR, Western blot и иммуногистохимией. Результаты проведенных исследований показали высокую ВГС-ингибирующую активность с 50 %-ной эффективной дозой в диапазоне концентраций 0,008-0,08 нг/мл.
Впервые исследована иммунотропная активность лекарственных средств на основе полимерных конъюгатов рекомбинантных интерферонов альфа-2b и лямбда-1, полученных с помощью технологии электронно-лучевого синтеза. Курсовое применение этих полимерных конъюгатов рекомбинантного интерферона альфа-2b в терапевтической дозе статистически значимо повышалось среднее количество поглощенных одной клеткой бактерий. Кроме этого, введение лекарственного средства на основе иммобилизированного на полиэтиленгликоле интерферона альфа-2b, полученного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, повышает гуморальный иммунный ответ у высокоотвечающей на эритроциты барана линии мышей CBA/CaLac и на 4-е сутки у низкоотвечающей линии мышей C57Bl/6, что проявлялось в достоверном повышении числа спленоцитов, а также абсолютного и относительного количества АОК в селезенках мышей группы наблюдения в сравнении с контрольной и фоновой группами.
При внесении лекарственного средства на основе иммобилизированного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза интерферона лямбда-1 в высокой дозе в культуру перитонеальных макрофагов приводило к статистически значимому усилению спонтанной выработки ими NO в сравнении с контрольным значением.
Впервые получены фармакокинетические параметры лекарственного средства на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевого синтеза. Расчетное значение абсолютной биодоступности при пероральном введении составляет 29,7 %. Максимальные концентрации иммобилизированного интерферона были зафиксированы в печени.
Впервые показано, что лекарственное средство на основе иммобилизированного с помощью электронно-лучевой технологии интерферона обладает высокой абсорбцией в эпителии тонкого кишечника – в двенадцатиперстной и тощей кишке, в эпителии толстого кишечника – в слепой и прямой кишке.
Впервые показано, что лекарственные средства на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученные с помощью технологии электроннолучевой иммобилизации, при пероральном применении обладают высокой
биодоступностью в сочетании с низкой токсичностью и аллергенностью. Такое сочетание свойств обеспечивает оптимальное сочетание эффективности и безопасности применения лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электроннолучевой иммобилизации, при пероральном применении. Проведённые исследования служат основанием для представления новой группы лекарственных средств – пероральных пегилированных интерферонов.
Исследование соответствует «Приоритетным направлениям развития науки РФ», от 7 июля 2011 г. № 899, п.4. «Науки о жизни», целям и задачам научная платформа медицинской науки «Фармакология».
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведённой работы изучены фармакологические свойства лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации. Выявлено, что лекарственные средства на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации обладают специфической фармакологической активностью, присущей рекомбинантным интерферонам, благоприятными параметрами токсичности. Выявлено, что фармакокинетические параметры лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, при их пероральном приёме создают условия для успешного лечения вирусных заболеваний.
Проведённые исследования позволяют создать новую медицинскую технологию лечения вирусных заболеваний. Пероральное применение лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации способно заменить парентеральное введение интерферонов, что в свою очередь, существенно повысит комплаентность лечения острых и хронических вирусных заболеваний.
Применение лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации снизит стоимость лечения и приведёт к уменьшению нагрузки на государственный бюджет.
Проведённые исследования демонстрируют, что создание лекарственных средств на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, представляет собой инновационную отечественную концепцию создания лекарственных препаратов, не имеющих аналогов на фармацевтическом рынке.
Методология и методы исследования. Методология диссертационной работы основана на системном подходе к изучаемой проблеме. Материал диссертации системно-проблемно структурирован. В соответствии с поставленной целью и задачами использовались современные высокоинформативные методики исследования.
При химическом анализе прототипов лекарственных средств использовались гель-проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография (ГП-ВЭЖХ), электрофорез в полиакриламидном геле.
Протеолитическую стабильность иммобилизированного с помощью технологии электронно-лучевого синтеза интерферона (имм-ИФН) альфа ()-2b проверяли на устойчивости препарата к гидролитическому действию фермента трипсина при их совместном инкубировании при температуре +37 C. В качестве препарата сравнения был взята субстанция немодифицированного рекомбинантного человеческого интерферона (ИФН) -2b, которая также была подвергнута обработке трипсином. Сохранность исследуемых образцов оценивали методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) по изменению площади пика ИФН -2b в результате ферментативного гидролиза.
Дозиметрический контроль процесса облучения осуществляется с использованием радиохромных пленочных дозиметров, изменяющих свой цвет в видимом спектре в процессе проявки в зависимости от дозы облучения. Расчет производится в пакете программы «WINdose» («GEX», США).
Методы оценки специфической активности ИФН -2b основан на оценке способности подавления исследуемыми образцами тканевого цитопатического действия вируса везикулярного стоматита в культуре клеток легкого эмбриона человека Л-68 в сравнении с отраслевым стандартным образцом активности человеческого рекомбинантного ИФН -2b (ОСО 42-28-369-03). Определение специфической активности исследуемых образцов проводилось в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» согласно СМС № ОКБ 1-0212/012-01-09 «Определение противовирусной активности ИФН -2b человеческого рекомбинантного».
Исследование противовирусной активности в отношении вируса Коксаки А7 на культуре клеток RD проводилось с использованием схемы с преинкубацией клеток с различными концентрациями исследуемых препаратов согласно методике, изложенной Lu J. et al. [2012]. Эффективность подавления репликации вируса Коксаки А7 исследуемыми препаратами имм-ИФН -2b в инфицированных клетках RD также была исследована методом Real time PCR.
Оценку противовирусной активности ЛС на основе имм-ИФН лямбда ()-1 проводили несколькими методами – Real time PCR, Western blot и иммуногистохимия с использованием культурального штамма вируса гепатита С.
Основные методы оценки иммунотропной активности – иммунологические, биохимические, культуральные и иммуноферментные.
Для исследования особенностей биоадгезии и абсорбции исследуемого препарата имм-ИФН -2b, меченого флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) в разных отделах ЖКТ, крысам под инъекционным наркозом (смесь ксилозина и золетила) после срединной лапаротомии в кишке (duodenum, jejunum, ileum, caecum, rectum, colon ascendens, transversum, descendens, sigmoideum) с проксимальной и дистальной сторон фиксировали трубки для растворов (входящая, выходящая). Длина выбранного фрагмента кишечника составляла 10 см, далее просвет промывали физиологическим раствором для удаления
химуса и зашивали брюшную полость. Перед инкубированием растворов в кишке базальную температуру крысы повышали с +34 до +37 C путем нагревания тела крысы струей теплого воздуха. Для перфузии использовали ФСБ c содержанием препаратов по 30 мкг/мл (pH 7,4). После инкубации в кишке в течение 60 мин при постоянной температуре +37,7±1,0 C. Далее промывали кишечник ФСБ и фиксировали фрагмент на 60 мин в 4 % формалине на 0,01 М ФСБ (pH 7,3), дважды отмывали ФСБ. После чего помещали фрагменты в 30 % раствор сахарозы на ФСБ в течение 12 часов при 4 C. Далее извлекали образцы, удаляли избыток раствора фильтровальной бумагой и замораживали при температуре –20 C. В последующем ткань нарезали на криостате, на срезы наносили реактив, предохраняющий флуоресцентные образцы от выцветания с DAPI (ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI) и накрывали покровным стеклом. Дальнейшие исследования проводили на приборе LSM 710 («Zeiss», Германия) методом конфокальной микроскопии с использованием фильтров MBS 458/561, MBS 405, MBS 488.
Для определения фармакокинетических параметров был использован имм-ИФН -2b, меченый ФИТЦ в связи с тем, что существующие наборы для определения концентрации ИФН иммуноферментным методом могут давать недостоверные результаты при попытке определения концентрации интерферонов, иммобилизированных на инертных носителях. Количественное определение меченого имм-ИФН -2b в биологических объектах (сыворотка крови, органы и ткани животных) проводили с помощью спектрофлуориметрического метода по интенсивности флуоресценции меченого ФИТЦ имм-ИФН -2b. Иммобилизированный ИФН -2b, меченый ФИТЦ, был изучен на предмет флуоресцентных свойств, используя спектрофлюориметр «Hitachi-HPp-4». Раствор, содержащий изучаемый препарат, обладал специфическими флуоресцентными свойствами. Было выявлено, что оптимальная длина волны возбуждения флуоресценции соответствует 493,5 нм, а оптимальная длина волны для регистрации флуоресценции является 523,9 нм.
Исследование фармакокинетики, иммунотропной активности, острой токсичности, хронической токсичности, иммунотоксичности, аллергенности проводилось в соответствии с методиками, изложенными в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [2012].
Исследования на животных выполнялись согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации № 708н от 23.08.2010) и «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.).
Содержание животных, участвующих в экспериментах, осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986), Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ
Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н). Все животные имели сертификат здоровья лабораторных животных.
Результаты исследований, содержащиеся в пятом разделе главы 2 диссертации, выполнены в соответствии с тематикой лаборатории «Моделирование физических процессов в биологии и медицине» Национального исследовательского Томского государственного университета, финансируемой в рамках повышения программы повышения конкурентоспособности ТГУ.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistica for Windows 7.0 и StatPlus. Для каждой выборки вычислено среднее значение величины признака X и ошибку средней величины m, проверена гипотеза нормальности распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критерия Даннета. Если распределение данных в группах не соответствовало нормальному закону или переменные относились к порядковой шкале, то проверка гипотезы о равенстве групп по уровню исследуемого признака проводилась с использованием непараметрического критерия Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к>2) и Манна-Уитни для 2 несвязанных выборок. Допустимым уровнем значимости принималось p < 0,05.
Положения, выносимые на защиту.
-
Лекарственные средства на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученные с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации, сохраняют специфическую фармакологическую активность, присущую интерферонам.
-
Лекарственные средства на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевой иммобилизации, в отличие от немодифицированных интерферонов обладают протеолитической устойчивостью к ферментам желудочно-кишечного тракта.
-
Интерферон-полимерные конъюгаты, полученные с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, обладают высокой (более 25 %) биодоступностью при пероральном приеме, не свойственной нативным белкам. Интерферон-полимерные конъюгаты, полученные с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, обладают адгезией к слизистой оболочке кишечника и их максимальные концентрации достигаются в печени, что необходимо для органоспецифической терапии вирусных заболеваний органов желудочно-кишечного тракта.
-
Фармацевтическая субстанция и лекарственный препарат на основе интерферон-полимерных конъюгатов, полученных с помощью технологии электронно-лучевого синтеза, по результатам исследований острой токсичности является малоопасным веществом. По результатам исследования хронической токсичности не выявлено токсического влияния
лекарственного средства на органы и системы экспериментальных
животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных в результате работы результатов определяется высоким научно-теоретическим уровнем работы, применением современных методов исследования, достаточным объемом проведенных экспериментов, соответствующей статистической обработкой экспериментальных данных. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на X международном научном конгрессе «Рациональная фармакотерапия». (С.-Пт., 2015), XXIII Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2016), XI международном научном конгрессе «Рациональная фармакотерапия». (С.-Пт., 2016), XII международном научном конгрессе «Рациональная фармакотерапия». (С.-Пт., 2017).
По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них: 1 патент, 11 работ в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 366 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, трех глав, заключения и выводов, списка литературы. Библиографический список включает в себя 294 источника, из них 99 отечественных и 195 иностранных. Работа содержит 30 рисунков и 196 таблиц.
Общие сведения об интерферонах
Интерферон был открыт в 1957 г. Линдеманном и Айзексом как фактор, определяющий явление интерференции. При заражении клеток зародыша цыплят вирусом гриппа в клетках стимулировалась выработка белка, способствовавшего резистентности клеток при последующем инфицировании. В последующие два десятилетия была открыта целая группа белков интерферонового ряда, продуцируемая в различных тканях и клетках животных [Pestka S., 2007]. Позднее, при заражении вирусами лейкоцитов, удалось получить человеческий лейкоцитарный ИФН.
Анализ собранных данных о структуре и строении ИФН, их рецепторов, кодирующих генов и физико-химических свойствах позволил классифицировать белки по 3 типам [Meager A., 2006]. Тип включает в себя ИФН альфа (), продуцируемые лейкоцитами, Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и нейтрофильными гранулоцитами, ИФН бета (), продуцируемый фибробластами, ИФН омега (). Первоначально предполагали, что ИФН представлен одним белком, но оказалось, что это целая группа белков, кодируемых 14 генами и имеющих отличия в 1-2 аминокислоты в первичной структуре. На данный момент выделяют 18 субтипов ИФН . Причем субтип ИФН -2 имеет 3 аллельные формы: 2a, 2b, 2c. ИФН -2a и ИФН -2b получили широкое распространение в клинической практике. Тип представлен ИФН гамма (), вырабатываемым естественными киллерными клетками и Т-клетками. ИФН лямбда () или интерлейкины 29, 28А и 28В формируют группу интерфероноподобных белков или тип .
Одним из объектов изучения данной работы является рекомбинантный человеческий ИФН -2b. Это кислый гликопротеид молекулярной массы 19 265 Да, состоящий из 165 аминокислотных остатков. Первичная последовательность его идентична нативному ИФН -2b, но белок не содержит сайта гликозилирования. Аминокислотная последовательность:
CDLPQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRHDFGFPQ EEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETL LDKFYTELYQ QLNDLEACVI QGVGVTETPL MKEDSILAVR KYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS FSLSTNLQES LRSKE.
Методом высокоэффективного ядерного магнитного резонанса было установлено, что молекула ИФН имеет кубовидную третичную структуру, сформированную пятью альфа-спиралями, именуемыми A, B, C, D и E. Спирали соединены одной длинной петлей и тремя короткими. ИФН -2b имеет 4 цистеина в положениях 1, 29, 99 и 139, формирующих две дисульфидные связи (Cys 1 – Cys 99 и Cys 29 – Cys 139), придающие дополнительную жесткость третичной структуре белка [Spanjaard R.A. et al., 1990]. На рисунке 1 представлено графическое изображение пространственного строения ИФН -2b.
Следует отметить, что разрыв S-S связи между 1 и 99 цистеинами не влияет на биологическую активность ИФН в отличие от связи Cys29-Cys139. Рекомбинантный ИФН -2b проявляет все биологические свойства, характерные для нативного человеческого ИФН -2b.
Интерфероны образуют семейство ИФН III типа, которое состоит из четырех членов – ИФН -1, ИФН -2, ИФН -3 и ИФН -4, обозначаемых также IL-29, IL-28A, IL-28B и ИФН -4 соответственно [Perez-Martin E. et al., 2012, Prokunina-Olsson L. et al., 2013, O Brien T.R. et al., 2014]. ИФН относятся к семейству цитокинов и выполняют функции, схожие с семейством ИФН в I типа (ИФН и/или ИФН ).
В отличие от ИФН и , которые впервые были описаны около 60 лет назад, ИФН открыты совсем недавно, в 2001 г. (открытые публикации появились в 2003 г.), двумя независимыми группами исследователей [Sheppard P.O., 2001, Kotenko S.V. et al., 2003, Sheppard P. et al., 2003].
Несмотря на сходные функции, ИФН отличаются от ИФН и . Во-первых, ИФН действуют, прежде всего, в эпителиальных клетках, что подтверждается их участием в специализированных иммунных механизмах, защищающих эпителиальные поверхности, которые подвергаются постоянному воздействию синантропных и патогенных микроорганизмов [Durbin R.K. et al., 2013, Hermant P. et al., 2014, Mahlakoiv T. et al., 2015]. Во-вторых, благодаря более целенаправленной передаче сигналов, ИФН может обладать существенными терапевтическими преимуществами, т.к. исключаются многие побочные эффекты, ограничивающие клиническое использование ИФН и [Hermant P. et al., 2014]. В-третьих, многочисленные исследования генома выявили множественный полиморфизм ИФН , который связан с клиренсом инфекции вируса гепатита С и возможным улучшением исходов других инфекций, включая вирус гепатита В, цитомегаловирус человека HCMV и вирус герпеса HCV-1 [Griffiths S.J. et al., 2013, Lampertico P. et al., 2013, Egli A et al., 2014, Galmozzi E. et al., 2014, Manuel O. et al., 2015].
В отличие от ИФН I типа, которые в той или иной степени продуцируются всеми ядерными клетками, ИФН при инфицировании различными вирусами in vitro и in vivo индуцируются только некоторыми типами клеток. Экспрессия ИФН III типа определяется в крови человека, легких, поджелудочной железе, слизистых, плаценте, яичниках, простате и тестикулярной ткани. Подобно ИФН I типа, ИФН III типа могут быть индуцированы in vitro двуспиральной РНК или при инфицировании разнообразными вирусами [Yang K. et al., 2005, Григорян С.С., 2011]. Сигнальные пути трансдукции ИФН и ИФН представлены на рисунке 2.
Исследование специфической иммунотропной активности лекарственного средства на основе иммобилизированного интерферона лямбда-1
Изучение иммунотропного действия ЛС на основе имм-ИФН -1 проведено в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению иммунотропной активности лекарственных средств» [Миронов А.Н., 2012].
Иммунотропное действие ЛС имм-ИФН -1 в опытах на животных in vivo была оценена при помощи следующих методик:
1) выявление иммунотропного потенциала исследуемого препарата при введении мышам в широком диапазоне доз;
2) оценка влияния препарата на гуморальный иммунный ответ;
3) изучение влияния исследуемого препарата на клеточный иммунный ответ (реакция ГЗТ);
4) исследование влияния препарата на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами. Согласно рекомендациям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [Миронов А.Н., 2012] при изучении иммунотропной активности лекарственного препарата способ введения препарата, как правило, должен соответствовать рекомендуемому способу применения в клинике. Таким образом, мышам ЛС имм-ИФН -1 после разведения вводили внутрижелудочно однократно в 1 ТД (2,6 мкг/кг), 10 ТД (26 мкг/кг) и 100 ТД (260 мкг/кг) в объеме 0,2 мл ФСБ («MP Biomedicals», США) для изучения влияния исследуемого ЛС на гуморальный и клеточный иммунный ответ и в дозах 10 ТД (26 мкг/кг), 50 ТД (130 мкг/кг), 250 ТД (650 мкг/кг) и 1250 ТД (3250 мкг/кг) для исследования иммунотропного потенциала изучаемого фармакологического препарата, контрольным животным давали растворитель (ФСБ) в эквивалентном объеме. В опытах in vitro ЛС имм-ИФН -1 после растворения в стерильном ФСБ добавляли в культуру клеток в дозах 0,026 нг/мл, 0,26 нг/мл, 2,6 нг/мл, 26 нг/мл, 260 нг/мл, 2600 нг/мл и 26000 нг/мл.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistica for Windows 7.0. Для каждой выборки проверена гипотеза нормальности распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения вычислено среднее значение величины признака X и ошибку средней величины m, проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критерия Даннета. Если распределение данных в группах не соответствовало нормальному закону или переменные относились к порядковой шкале, то проверка гипотезы о равенстве групп по уровню исследуемого признака проводилась с использованием непараметрического критерия Крускалла-Уоллиса для к-несвязанных выборок (к 2) и Манна-Уитни для 2 несвязанных выборок. Допустимым уровнем значимости принималось p 0,05.
Оценка проводилась в интегральном функциональном тесте: выработка антителообразующих клеток (АОК) при иммунизации мышей тимус-зависимым антигеном – эритроцитами барана.
Через 1 час после внутрижелудочного введения препарата в дозах 10 ТД, 50 ТД, 250 ТД, 1250 ТД или растворителя мышей опытных и контрольной групп иммунизировали ЭБ (ФГУП НПО «Микроген», Россия) в дозе 2107 на мышь. Определение АОК в селезенке осуществляли с помощью метода локального гемолиза на 4-е сутки после иммунизации [Cunningham A.I., 1965], основанном на способности антиэритроцитарных антител, секретируемых антителообразующими клетками иммунизированных животных, лизировать в присутствии комплемента ЭБ (антиген). Выделенную и очищенную от прилегающих тканей селезенку гомогенизировали в 5 мл раствора Хенкса производства ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия), с помощью стеклянного гомогенизатора и фильтровали через мелкую сеточку. Подсчитывали общее количество спленоцитов (ОКС), после чего к 0,5 мл полученной суспензии добавляли равное количество 10 % взвеси ЭБ и комплемента производства ФГУП НПО «Микроген» (Россия), разведенного в 5 мл раствора Хенкса. Заполняли камеру, приготовленную из двух покровных стекол, соединенных с помощью тонкого слоя парафина, и инкубировали при 37 С в течение 45 минут. Учет производили под световым микроскопом (объектив 20, окуляр 10) на 1000 клеток, выражая в дальнейшем количество антителообразующих клеток в относительных (выраженных в процентах) и абсолютных (106/орган) единицах.
После однократного внутрижелудочного введения ЛС имм-ИФН -1 мышам-самкам линии CBA/CaLac в максимальной дозе 3250 мкг/кг (1250 ТД) наблюдалось статистически достоверное повышение числа спленоцитов, как по сравнению с показателем контрольной группы, так и с аналогичными значениями в группах, получивших препарат в дозах 26 мкг/кг (10 ТД), 130 мкг/кг (50 ТД) и 650 мкг/кг (250 ТД) (таблица 20).
Относительное содержание АОК было статистически значимо снижено в селезенках мышей с применением ЛС имм-ИФН -1 в дозах 130 мкг/кг (50 ТД) и 650 мкг/кг (250 ТД), как по сравнению с соответствующим показателем контрольной группы, так и с аналогичными значениями в группах, получивших препарат в дозах 250 ТД и 1250 ТД. При этом абсолютное число антителообразующих клеток было статистически значимо снижено относительно контрольных значений лишь в одной экспериментальной группе – с однократным введением исследуемого препарата в дозе 130 мкг/кг (50 ТД). В группах с применением имм-ИФН -1 в дозах 26 мкг/кг (10 ТД) и 650 мкг/кг (250 ТД) абсолютное количество антителопродуцентов было на уровне контрольных значений, а при использовании максимальной дозы препарата отмечалось достоверное увеличение абсолютного числа АОК относительно показателей группы контроля.
Таким образом, однократное применение ЛС на основе имм-ИФН -1 у мышей линии CBA/CaLac приводило к подавлению гуморального иммунного ответа лишь при использовании 50-ти кратной терапевтической дозы, при этом повышение дозы препарата не угнетало образование антителопродуцентов, а, напротив, стимулировало (1250 ТД).
Влияние препарата на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации ЭБ высокоотвечающей (CBA/CaLac) и низкоотвечающей (C57Bl/6) линии мышей.
Число АОК определяли с помощью локального гемолиза [Cunningham A.I., 1965], а титр гемагглютининов в реакции гемагглютинации (РГА) [Линг Н.Р и др., 1991]. Число IgM-АОК определяли на 4-е сутки (пик развития IgM-ответа), а IgG-АОК – на 7-е сутки (пик развития IgG-ответа) после иммунизации. При оценке действия препарата на гуморальный иммунный ответ изучали его влияние на индуктивную и продуктивную фазы этого ответа. В первом случае различные дозы препарата (1 ТД, 10 ТД, 100 ТД) вводили одновременно с антигеном, во втором случае – на 3-и или 5-е сутки после иммунизации при изучении IgM- и IgG-ответа соответственно.
Иммунизацию животных осуществляли минимальной дозой ЭБ – 5106 на мышь внутрибрюшинно. Оценивали влияние ЛС на основе имм-ИФН -1 на индуктивную и продуктивную фазы гуморального иммунного ответа. В первом случае ЛС имм-ИФН -1 вводили однократно внутрижелудочно в 1 ТД, 10 ТД и 100 ТД одновременно с антигеном, во втором случае – на 3-и или 5-е сутки после иммунизации при изучении IgM- и IgG-ответа соответственно. Определение АОК осуществляли на 4-е (пик развития IgM-ответа) и 7-е сутки (пик развития IgG-ответа) после иммунизации с помощью метода локального гемолиза [Cunningham A.I., 1965].
Уровень специфических антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, определяли с помощью реакции гемагглютинации (РГА) [Линг Н.Р. и др., 1991]. Для этого в 96-луночные круглодонные планшеты производства ОАО «Фирма Медполимер» (Россия), вносили по 50 мкл физиологического раствора производства ЗАО «Верофарм» (Россия). В первую лунку добавляли 50 мкл сыворотки крови, разведенной 1:16 и предварительно прогретой при 56 С в течение 30 минут для инактивации комплемента, перемешивали и переносили по 50 мкл из одной лунки в другую. Затем в каждую лунку приливали по 25 мкл 1 % суспензии ЭБ, встряхивали планшеты и инкубировали содержимое при комнатной температуре в течение трёх часов. Для определения изотипа антител к 50 мкл разведенной 1:16 инактивированной сыворотке крови добавляли 50 мкл 0,1 М раствора 2-меркаптоэтанола производства «Sigma» (США). Раствор 2-меркаптоэтанола, восстанавливая дисульфидные связи, вызывает диссоциацию IgM-антител на субъединицы, не способные агглютинировать ЭБ. При этом IgG-антитела резистентны к его действию, что позволяет сравнивать уровень специфических IgM и IgG-гемагглютининов. После инкубирования сыворотки с 2-меркаптоэтанолом при комнатной температуре в течение одного часа, осуществляли постановку реакции по описанной выше методике. На основании результатов реакции определяли наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдалась отчетливая агглютинация антигена. Титр антител выражали величиной log2Т.
Изучение иммунотропного действия лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b
В исследовании были использованы 440 мышей-самцов линии CBA/CaLac и 120 мышей-самцов линии C57Bl/6 6-8-недельного возраста с массой тела 18-20 г, полученные из питомника ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). При проведении опытов in vitro как источник материала использовалась периферическая кровь 10 здоровых доноров в возрасте 22-36 лет.
Мышам лекарственный препарат на основе имм-ИФН -2b и Реаферон-ЕС-липинт вводили перорально курсом в течение пяти суток в 1ТД (185714,3 МЕ/кг) и 10ТД (1857143 МЕ/кг) в объеме 0,2 мл стерильного физиологического раствора, контрольным животным давали растворитель (физиологический раствор) в эквивалентном объеме. В опытах in vitro лекарственный препарат на основе имм-ИФН -2b и Реаферон-ЕС добавлялся в культуру клеток в дозах 15 МЕ/мл, 150 МЕ/мл и 1500 МЕ/мл. Для изучения влияния исследуемых препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов в качестве фона использовали интактных животных соответствующего пола и возраста. При исследовании влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ, на интенсивность реакции ГЗТ в качестве фона использовали мышей, получивших антиген, но без курсового введения физиологического раствора. Умерщвляли животных декапитацией после CO2 камеры.
Методы оценки иммунотропной активности в опытах на животных in vivo
Изучение иммунотропной активности лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b в сравнении с реафероном-ЕС-липинт проведено в соответствии с «Методическими указаниям по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ» [Хабриев Р.У., 2005].
Иммунотропная активность лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b в сравнении с реафероном-ЕС-липинт в опытах на животных in vivo была оценена при помощи следующих методик:
- изучение влияния исследуемых препаратов на неспецифическую резистентность организма мышей;
- исследование влияния препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов;
- оценка влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ;
- изучение влияния исследуемых препаратов на реакцию ГЗТ, индуцированную эритроцитами барана.
Изучение влияния исследуемых препаратов на неспецифическую резистентность организма мышей
Лекарственный препарат на основе имм-ИФН -2b и Реаферон-ЕС-липинт вводили мышам перорально курсом в течение 5-ти суток в 1ТД (185714,3 МЕ/кг) и 10ТД (1857143 МЕ/кг) в объеме 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Для моделирования инфекционного процесса была использована суточная культура Staph. aureus, штамм ATCC 95923, которая обладает типичными свойствами данного вида микроорганизмов.
Перед началом эксперимента на основании дозы LD50 была высчитана инфицирующая доза LD90.
Для определения LD50 пяти группам мышей линии СВА/CaLac, по 6 животных в каждой группе, были введены внутрибрюшинно по 1 мл разведения Staph. aureus: 5105, 5106, 5107, 5108, 5109 микробных тел. LD50 определялась по методу Кербера в модификации И.Б. Ашмарина и составила 2109 микробных тел; соответственно LD90 составила 3,8109 микроорганизмов. Такая доза была использована для инфицирования животных. Staph. aureus, штамм ATCC 95923, вводили мышам внутрибрюшинно по 1 мл в указанной дозе через 48 часов после 5-дневного введения препарата, либо растворителя (контроль). Наблюдение за животными вели в течение 10 дней.
Исследование влияния препаратов на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов и нейтрофилов
Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов оценивалась через 24 часа после окончания 5-дневного курса введения лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b и Реаферона-ЕС-липинт по способности этих клеток поглощать суточную культуру Stah. aureus, штамм Р-209 (предоставена кафедрой микробиологии СибГМУ), концентрация взвеси микробов 20 млн/мл. Животным вводили внутрибрюшинно 3 % раствор пептона в объеме 4 мл, через 3-е суток животных умерщвляли с помощью CO2-камеры. Мышей вскрывали в асептических условиях и после этого вводили 3-4 мл среды 199 с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС). После легкого массажа брюшной полости отсасывали жидкость с помощью пастеровской пипетки, помещали полученную жидкость в силиконизированные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в среде 199, подсчитывали число клеток в камере Горяева и доводили их до концентрации 1-2 млн/мл по макрофагам. К клеткам добавляли равный объем бактерий в соотношении 1:10 и инкубировали в течение 30 минут при 37 С. Бактерии были предварительно опсонизированы пуловой мышиной сывороткой, опсонизацию проводили в течение 10 минут при 37 C с последующим отмыванием. После инкубации готовили мазки на предметном стекле, фиксировали этанолом 30 минут и окрашивали азур II–эозином в течение 30-40 минут. При микроскопии мазков учитывали фагоцитарный индекс – ФИ (процент нейтрофилов, поглотивших микробы) и фагоцитарное число – ФЧ (среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой) [Хабриев Р.У., 2005]. Через 24 часа после окончания введения мышам исследуемого препарата оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов мышей. Животным вводили внутрибрюшинно 3 % раствор пептона в объеме 4 мл, через 2 часа животных умерщвляли с помощью CO2-камеры. Мышей вскрывали в асептических условиях. Из брюшной полости с помощью пастеровской пипетки отсасывали жидкость, помещали ее в силиконизированные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспендировали в среде 199, подсчитывали число клеток в камере Горяева и доводили их до концентрации 1-2 млн/мл по нейтрофилам. К клеткам добавляли равный объем бактерий в соотношении 1:10 и инкубировали в течение 30 минут при 37 С. Бактерии были предварительно опсонизированы пуловой мышиной сывороткой, опсонизацию проводили в течение 10 минут при 37 C с последующим отмыванием. После инкубации готовили мазки на предметном стекле, фиксировали этанолом 30 минут и окрашивали азур II–эозином в течение 30-40 минут. При микроскопии мазков учитывали фагоцитарный индекс – ФИ (процент нейтрофилов, поглотивших микробы) и фагоцитарное число – ФЧ (среднее число стафилококков, поглощенное одной клеткой) [Хабриев Р.У., 2005].
Оценка влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ
Влияние препаратов на гуморальный иммунный ответ оценивали путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титров антител в сыворотке крови после иммунизации ЭБ высокоотвечающей (CBA/CaLac) и низкоотвечающей (C57Bl6) линии мышей. Иммунизацию животных осуществляли после окончания 5-дневного курса введения лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b и Реаферона-ЕС-липинт минимальной дозой эритроцитов барана – 5106 на мышь внутрибрюшинно. Определение АОК осуществляли на 4-е и 7-е сутки после иммунизации с помощью метода локального гемолиза [Cunningham A.I., 1965], основанном на способности антиэритроцитарных антител, секретируемых антителообразующими клетками иммунизированных животных, лизировать в присутствии комплемента эритроциты барана (антиген). Выделенную и очищенную от прилегающих тканей селезенку гомогенизировали в 5 мл раствора Хенкса с помощью стеклянного гомогенизатора и фильтровали через мелкую сеточку. Подсчитывали общее количество спленоцитов (ОКС), после чего к 0,5 мл полученной суспензии спленоцитов добавляли равное количество 10 % взвеси эритроцитов барана и комплемента, разведенного в 5 мл раствора Хенкса. Заполняли камеру, приготовленную из двух покровных стекол, соединенных с помощью тонкого слоя парафина, и инкубировали при 37 С в течение 45 минут. Учет производили под световым микроскопом (объектив 20, окуляр 10) на 1000 клеток, выражая в дальнейшем количество антителообразующих клеток в относительных (выраженных в процентах) и абсолютных (106/орган) единицах.
Исследование хронической токсичности лекарственного препарата на основе иммобилизированного интерферона альфа-2b
Исследуемое лекарственное средство представлено в виде лекарственного препарата на основе рекомбинантного интерферона -2b, иммобилизированного на ПЭГ-1500 по оригинальной технологии, в капсулах. Производитель ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологии», г. Новосибирск.
Цель данного раздела работы: Провести токсикологическую оценку безопасности лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b на крысах и кроликах.
Задачи данного раздела работы:
1. Исследовать безопасность лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b в хроническом эксперименте при внутрижелудочно введении на крысах течение 28 дней и 14 дней после отмены курса.
2. Исследовать безопасность лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b в хроническом эксперименте при внутрижелудочно введении на кроликах течение 28 дней.
Распределение используемых животных по группам
Распределение используемых животных по группам при исследовании хронической токсичности лекарственного препарата на основе имм-ИФН -2b представлено в таблице 142.
В хроническом эксперименте лекарственный препарат вводили крысам внутрижелудочно в трех дозах 85000 МЕ/кг, 425000 МЕ/кг, 850000 МЕ/кг. Первая доза сопоставима по величине с терапевтической дозой, третья превосходит терапевтическую в 10 раз, вторая доза – промежуточная. Кроликам лекарственный преапарат вводили внутрижелудочно в двух дозах, эквивалентных терапевтической и промежуточной дозам для крыс: 46500 МЕ/кг и 232500 МЕ/кг.
В хроническом эксперименте крысам и кроликам внутрижелудочно вводили раствор лекарственного препарата, доведенный до необходимой концентрации фосфатно-солевым буфером один раз в день на протяжении 28 дней. Введение лекарственного препарата осуществлялось утром с 10:00 до 11:00.
В течение исследования регистрировались интегральные показатели здоровья животных: внешнее состояние и отклонения в потреблении корма и воды (ежедневно, визуально), прирост массы тела (еженедельно).
Животные и уход за ними
В эксперименте использовались аутбредные животные. Общее количество животных, использованное в данном исследовании: 80 крыс CD (самцы, самки). Крысы конвенциональные, 1-й категории (имеется сертификат здоровья лабораторных животных, выданный НЦБМТ РАМН).
В соответствии с регулирующими стандартами, приведенными выше, минимальное количество животных в исследовании составляло по 10 животных в группе.
Использованы также 12 кроликов породы шиншилла (6 самок и 6 самцов массой 2600-3100 г, в возрасте 2,5-3 месяца).
Наблюдения и измерения в ходе эксперимента
Длительность наблюдения за лабораторными животными составила 28 дней и 2 недели после отмены препарата. В ходе эксперимента следили за их поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией на внешние раздражители. Наблюдение за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья и смертности проводилось один раз в день непосредственно перед введением препарата. Осматривался внешний вид животных, находящихся в клетке, поведение каждого, состояние экскрементов и др.
Масса тела определялась еженедельно перед введением исследуемого препарата. Массу тела выражали в г, прирост массы тела относительно первого дня исследования – в %. Потребление корма регистрировалось еженедельно, визуально.
Через 28 дней курса и после его отмены у крыс забиралась проба периферической крови для гематологических и биохимических исследований, проводилось ЭКГ-исследование. Через 28 дней курса и после его отмены животных подвергали эвтаназии, вскрывали, фиксировали внутренние органы и делали гистологические срезы. У кроликов через 28 дней введения испытуемого средства исследовали биохимические показатели сыворотки крови, показатели периферической крови, общую массу, а после эвтаназии проводили морфологическое исследование внутренних органов и костного мозга.
Клинические лабораторные исследования
Через 28 дней введения и через 2 недели после отмены лекарственного средства у всех животных в группе (предварительно на ночь лишенных корма) определяли гематологические и биохимические показатели. Кровь для определения гематологических показателей исследований брали из хвостовой вены у крыс и краевой вены уха у кроликов в объеме 0,2 мл. Забор крови для определения биохимических показателей (5-6 мл) осуществляли из сердца животного после остановки дыхания в СО2 камере.
Гематологическое исследование
Для определения гематологических показателей кровь объемом 0,2 мл помещали в пробирки с ЭДТА и на полуавтоматическом гематологическом анализаторе Mythic18 (Франция) определяли: количество эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина, гематокрит, показатели лейкограммы, СОЭ.
Состояние костномозгового кроветворения у крыс оценивали путем подсчета общего количества миелокариоцитов (ОКК) на бедренную кость (106/бедро) и миелограмм в мазках, приготовленных из гомогената фрагмента миелоидной ткани, взятой из сегмента грудины, и аутологичной сыворотки в соотношении 1:1, комбинированно окрашенных фиксатором-красителем Май-Грюнвальда и азур II-эозином по Нохту. Процентное содержание отдельных клеточных форм при подсчете миелограмм крыс переводили в абсолютные значения (106 клеток на бедро). У кроликов в костном мозге, взятом из сегмента грудины, определяли показатели миелограммы только в относительных единицах (выраженных в процентах) [Гольдберг Д.И. и др., 1973, Козинец Г.И. и др., 1997].
Биохимическое исследование сыворотки крови
Кровь объемом 5-6 мл собирали в пробирки без антикоагулянта, центрифугировали после свертывания для получения сыворотки. В сыворотке крови определяли активность аланин- и аспартат-аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ), щелочной фосфатазы, содержание глюкозы, белка, мочевины, креатинина, холестерина, билирубина по общепринятым методам, используя полуавтоматические биохимические анализаторы фирм Cormay и Erba Manheim (Германия), стандартные наборы фирм Cormay, biocon (Германия), Vital Diagnostics (Санкт-Петербург), Вектор-Бест (Новосибирск).
Почечный метаболизм
Определяли следующие показатели: суточный диурез, глюкоза, билирубин, кетоны, удельную плотность, скрытую кровь, белок, уробилиноген, нитриты, лейкоциты и рН мочи. Исследования проводилось на автоматическом анализаторе мочи CLINITEK-50 на полосках URS-10 (USA). Сбор мочи проводили в индивидуальных обменных клетках, в которых крысы находились в течение суток после предварительной адаптации и водной нагрузки. Дистиллированную воду вводили животным внутрижелудочно с помощью зонда из расчета 2 % от массы тела.
Сердечно-сосудистая система
Влияние препарата на функцию сердца оценивали по данным электрокардиографии. Электрокардиограмму у крыс регистрировали на электрокардиографе Поли-Спектр-8В, используя программу анализа «ПолиСпектр» во втором стандартном отведении при усилении 1mV=20 мм и скорости записи 50 мм/с, под эфирным наркозом, в положении животных спиной вверх. По снятой электрокардиограмме у крыс, самцов и самок, рассчитывали частоту сердечных сокращений (ЧСС), измеряли амплитуду зубцов P, R, T и длительность интервалов PQ, QT, QRS. Показатели опытных групп сравнивались с соответствующими показателями контрольных групп животных, для самок и самцов раздельно [Мартин М., 2005].
Оценка показателей ЦНС
О влиянии действия ЛС на ЦНС судили, исследуя ориентировочно-исследовательское поведение крыс с помощью экспериментальной установки «открытое поле», раздельно у самцов и самок, через 1,5, 3 и 3,5 месяца после начала эксперимента. Описание экспериментальной установки «Открытое поле» и условий проведения эксперимента представлено выше, в разд. 3.5.1.1, стр. 224.