Фармакологические свойства и радиобиологические эффекты линейных и циклических производных изотиомочевины – конкурентных ингибиторов синтаз оксида азота Филимонова Марина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Биологические и физиологические функции оксида азота. NO-синтазы, регулирование их активности в организме в норме и при патологии

1.1. Свойства, эндогенный синтез и пул оксида азота в организме 21

1.2. Семейство синтаз оксида азота 28

1.3. Биологические и физиологические функции оксида азота

1.3.1. Участие в регуляции тонуса сосудов и других гладкомышечных клеток 36

1.3.2. Участие в регуляции адгезии клеток крови, защите эндотелия, сократимости и тонуса кардиомиоцитов и скелетных мышц 39

1.3.3. Нейромедиаторные функции 42

1.3.4. Участие в ангиогенезе и регенераторных процессах 44

1.3.5. Участие в регуляции процессов апоптоза 47

1.3.6. Участие в иммунных и воспалительных реакциях 48

1.4. Химические субстрат-подобные ингибиторы эндогенного синтеза оксида азота 51

Глава 2. Материалы и методы исследований 70

Глава 3. Химическое строение, токсичность и NOS-ингибирующая активность изучаемых производных ИТМ 88

3.1. Обоснование химической области фармакологического скрининга 88

3.2. Химическое строение и физико-химические свойства изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ 90

3.3. Токсикологическая характеристика изучаемых соединений 92

3.4. Исследование NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений 94

Глава 4. Исследование влияния 1Ч,8-замещённых ИТМ на сердечно сосудистую систему нормотензивных крыс и животных с различными моделями гипотонических состояний 101

4.1. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику нормотензивных животных 101

4.2. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику животных в состоянии острого тяжёлого геморрагического шока 105

4.3. Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс на модели острого эндотоксемического шока 116

4.4. Изучение влияния производных ИТМ на гемодинамику крыс при гипотонии, вызванной ганглиоблокадой 122

4.5. Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс с рефрактерной гипотонией при эндотоксемии 125

4.6. Оценка перспективности разработки на основе наиболее активных производных ИТМ вазопрессорных средств 129

Глава 5. Исследование радиозащитных свойств изучаемых ]Ч,8-замещённых ИТМ 133

5.1. Радиозащитные свойства и NOS-ингибирующая активность производных ИТМ 133

5.2. Показатели противолучевой активности и особенности радиозащитного действия изучаемых N,S-замещённых ИТМ 144

5.3. Исследование действия изучаемых производных ИТМ в качестве средств профилактики осложнений лучевой терапии 154

5.4. Перспективность применения изучаемых производных ИТМ в качестве радиозащитных средств и средств профилактики осложнений лучевой терапии 164

Глава 6. Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности производных ИТМ 168

6.1. Влияние изучаемых соединений на рост и метастазирование перевиваемой карциномы лёгких Льюис 169

6.2. Исследование механизмов противоопухолевой активности изучаемых производных ИТМ 174

6.3. Исследование эффективности противоопухолевого действия изучаемых производных ИТМ при сочетании с радио- и химиотерапией 184

Заключение 189

Выводы 199

Рекомендации 201

Перспективы дальнейшей разработки темы 202

Список цитируемой литературы

• Участие в регуляции тонуса сосудов и других гладкомышечных клеток
• Химическое строение и физико-химические свойства изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ
• Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс на модели острого эндотоксемического шока
• Показатели противолучевой активности и особенности радиозащитного действия изучаемых N,S-замещённых ИТМ

Введение к работе

Актуальность исследования. Наличие оксида азота (N0) в биологических тканях было описано ещё в первой половине XIX века. Но только спустя 150 лет, когда было установлено, что эндогенный N0 является фактором релаксации сосудов (Furchgott, R.F., Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine II Nature. - 1980. - Vol.288, N.5789. - P.373-376; Palmer R.M, Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor II Nature. - 1987. - Vol.327, N.6122. -P.524-526.), присутствует в активированных макрофагах (Stuehr D.J., KwonN.S., Gross S.S. et al. Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol: requirement for inducible and constitutive components II Biochem. Biophys. Res. Common. - 1989. -Vol.161, N.2. - P.420-426.) и тканях мозга (Garthwaite J. New insight into the functioning of nitric oxide-receptive guanylyl cyclase: physiological and pharmacological implications II Мої. Cell Biochem. - 2010. - Vol.334, N.1-2. - P.221-23.), оксид азота привлёк большое внимание специалистов в различных областях биологии и медицины.

Объём научных данных о биологической роли N0, накопленный к настоящему времени, столь велик, что затруднительно осознать даже общую картину, создаваемую ими. Оксид азота участвует в регуляции тонуса сосудов и адгезии клеток крови, сократимости миокарда и скелетных мышц, тонуса бронхов и моторики ЖКТ, модулирует процессы ангиогенеза и регенерации, является медиатором многих видов чувствительности и участвует в процессах высшей нервной деятельности, регулирует митохондриальную активность и редокс-гомеостаз, является эффектором иммунных реакций (Taylor СТ., Moncada S. Nitric oxide, cytochrome С oxidase, and the cellular response to hypoxia II Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2010. - Vol.30, N.4. -P.643-647; Forstermann U., Sessa W.C. Nitric oxide synthases: regulation and function II Eur. Heart J. - 2012. - Vol.33, N.7. - P.829-837; Vincent S.R. Nitric oxide neurons and neurotransmission II Prog. Neurobiol. - 2010. - Vol.90, N.2. - P.246-255; Niu X., Watts V.L., Cingolani O.H. et al. Cardioprotective effect of beta-3 adrenergic receptor agonism: role of neuronal nitric oxide synthase II J. Am. Coll. Cardiol. - 2012. - Vol.59, N.22. -P. 1979-1987; Tang L., Wang H., Ziolo M.T. Targeting NOS as a therapeutic approach for heart failure II Pharmacol. Ther. - 2014. - Vol.142, N.3. - P.306-315.). Эти знания расширили представления о механизмах многих физиологических и патологических процессов, и создали основу для развития новых подходов к лечению ряда заболеваний и патологических состояний путём модификации эндогенного синтеза оксида азота.

Однако, если фармакологические средства, стимулирующие продукцию оксида азота - химические доноры NO, вошли в клиническую практику задолго до открытия биологической роли оксида азота (в частности, нитроглицерин применяется при лечении стенокардии уже около 150 лет (Brunton T.L. On the use of nitrite of amyl in angina pectoris II Lancet. - 1867. - N.2. - P.97-98.), то становление фармакологических средств, подавляющих продукцию NO - ингибиторов синтаз оксида азота (NOS), происходит только в последние десятилетия.

Данные многих исследований свидетельствуют о том, что ингибиторы NOS могут иметь практическое значение в лечении патологических состояний, протекающих с избыточной продукцией NO (сепсис, эндотоксемии, воспалительные и дегенеративные заболевания) и способны проявлять широкий спектр фармакологических свойств - оказывать вазопрессорное, кардио- и нейрозащитное,

противовоспалительное действие (Hernandez G., Bruhn A., Ince C. Microcirculation in sepsis: new persprctives II Curr. Vase. Pharmacol. - 2013. - Vol.11, N.2. - P. 161-169; Moncada S., Bolanos J.P. Nitric oxide, cell bioenergetics and neurodegeneration II J. Neurochem. - 2006. - Vol.97, N.6. - P. 1676-1689; Calcerrada P., Peluffo G., Radi R. Nitric oxide-derived oxidants with a focus on peroxynitrite: molecular targets, cellular responses and therapeutic implications II Curr. Pharm. Des. - 2011. - Vol.17, N.35. - P.3905-3932; Rochette L., Lorin J., Zeller M. et al. Nitric oxide synthase inhibition and oxidative stress in cardiovascular diseases: possible therapeutic targets? II Pharmacol. Ther. -2013.- Vol.140, N.3. - P.239-257; Omar S.A., Webb A.G. Nitrite reduction and cardiovascular protection II J. Мої. Cell Cardiol. - 2014. - Vol.73. - P.57-69; Leiper J., Nandi M. The therapeutic potential of targeting endogenous inhibitors of nitric oxide synthesis II Nat. Rev. Drug Discov. - 2011. - Vol.10, N.4. - P.277-291.). Вместе с тем, несмотря на большие усилия, разработка NOS-ингибирующих фармакологических средств пока не получила удовлетворительного воплощения - в настоящее время известно более 600 различных соединений, способных подавлять активность NOS, но на стадию клинических испытаний смогли выйти лишь единицы из них.

Препятствия для клинического применения ингибиторов NOS связаны не только с их токсическими и фармакокинетическими свойствами. В значительной мере они обусловлены сложностью самой организации эндогенного синтеза NO. В тканях организма оксид азота продуцируется семейством изоформ NOS, которые существенно отличаются участием в различных процессах (Dudzinski D.M., Michel Т. Life history of eNOS: Partners and pathway II Cardiovasc. Res. - 2007. - Vol.75, N.2. -P.247-260; Villanueva C, Giulivi С Subcellular and cellular locations of nitric-oxide synthase isoforms as determinants of health and disease II Free Radic. Biol. Med. - 2010. -Vol.49, N.3. - P.307-316; Ramadoss J., Pastore M.B., Magness R.R. Endothelial caveolar subcellular domain regulation of endothelial nitric oxide synthase II Clim. Exp. Pharmacol. Physiol. - 2013. - V.40, N.ll. - P.753-764.). И в этой связи практический интерес представляют, в первую очередь, соединения, избирательно ингибирующие изоформы NOS. Однако значимый уровень селективности проявляет не более 3-5% известных ингибиторов NOS.

Важным фактором также является механизм ингибирующего действия. Большинство известных ингибиторов NOS (или их метаболиты) частично или в полной мере необратимо инактивируют эти ферменты (Wolff D.J., Lubeskie А. Inactivation of nitric oxide synthase isofoms by diaminoguanidine and NG-amino-L-arginine II Arch. Biochem. Biophys. - 1996. - Vol.325, N.2. - P.227-234; Li H., Poulos T.L. Structure-function studies on nitric oxide synthases II J. Inorg. Biochem. - 2005. -Vol.99, N.l. - P.293-305; Lee K.S., Lee D.K., Jeoung D. et al. Differential effects of substrate-analogue inhibitors on nitric oxide synthase dimerization II Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2012. - Vol.418, N.l. - P.49-55.). Между тем, необратимое подавление активности NOS является далеко не всегда целесообразным и безопасным. По этой причине многие известные ингибиторы NOS, в том числе и селективные, остаются удобными инструментами исследований, но возможность их клинического применения представляется сомнительной (Alderton W.K., Cooper С.Е., Knowles R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition II Biochem. J. - 2001. - Vol.357, Pt.3. - P.593-615; Zhu Y., Nikolic D., Van Breemen R.B. et al. Mechanism of inactivation of inducible nitric oxide synthase by amidines. Irreversible enzyme inactivation without inactivator modification II J. Am. Chem. Soc. - 2005. - Vol.127, N.3. - P.858-868; Viteceek J., Lojek A., Valacchi G. et al. Arginin-based inhibitors of nitric oxide synthase:

therapeutic potential and challenges II Mediators Inflamm. - 2012. - Vol.2012. - Art.ID: 318087.).

При таких обстоятельствах перспективными могут оказаться селективные ингибиторы NOS с обратимым, субстрат-конкурентным действием. В связи с поиском химических соединений, обладающих такими свойствами, привлекают внимание линейные и циклические производные изотиомочевины (ИТМ), имеющие в своей молекулярной структуре тиоамидиновый фрагмент R_rNH-C(SR₂)=NRs, изостеричный гуанидиновой группе L-аргинина. Тиоамидиновый фрагмент, выполняя роль псевдосубстрата, может позволить таким соединениям конкурировать за активный центр NOS, что подтверждает наличие в ряду S-алкил-ИТМ чрезвычайно активных, неселективных ингибиторов NOS, являющихся в полной мере обратимыми, конкурентными ингибиторами (Garvey Е.Р., Oplinger J.A., Tanoury G.J. et al. Potent and selective inhibition of human nitric oxide synthases. Inhibition by non-amino acid isothioureas II J. Biol. Chem. - 1994. - Vol.269, N.43. - P.26669-26676; Wolff D.J., Gauld D.S., Neulander M.J. et al Inactivation of nitric oxide synthase by substituted aminoguanidines and aminoisothioureas II J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1997. - V.283, N.l. -P.265-273.).

Для поиска селективных ингибиторов NOS в этой области может представлять интерес мало изученный класс N,S-замещённых ИТМ - результаты единичных работ в этой области свидетельствуют, что строение N-замещающего радикала может оказывать существенное влияние на селективность соединений к изоформам NOS (Shearer B.G., Lee S., Oplinger J.A. et al. Substituted N-phenylisothioureas: potent inhibitors of human nitric oxide synthase with neuronal isoform selectivity II J. Med. Chem.

- 1997. - Vol.40, N.12. - P. 1901-1905; Проскуряков С.Я., Кучеренко Н.Г., Тришкина
А.И. и др. NO-ингибирующая и вазотропная активность некоторых соединений,
содержащих тиоамидиновую группу// Бюлл. экспер. биол. мед. - 2002. - Т. 134, №.10.

- С.393-396.).

Наряду с проблемами поиска приемлемых ингибиторов NOS остаются отрытыми и многие вопросы, связанные с их биологической активностью. Фармакологическим эффектом ингибиторов NOS, механизм которого на сегодня наиболее изучен, является вазопрессорное действие. Ожидается, что ингибиторы NOS могут иметь преимущества в сравнении с имеющимися вазопрессорами - большую длительность действия, отсутствие побочных эффектов, характерных для адреномиметиков, способность повышать тонус сосудов при резистентных вазоплегиях, что может позволить им занять важное место при лечении критических состояний и при оказании неотложной, экстренной помощи (Hernandez G., Bruhn A., Ince С. Microcirculation in sepsis: new persprctives II Curr. Vase. Pharmacol. - 2013. - Vol.11, N.2. - P. 161-169; Cauwels A. Nitric oxide in shock II Kidney Int. - 2007. - Vol.72, N.5. -P.557-565; Andrades M.E., Morina A., Spasic S. et al. Bench-to-bedside review: sepsis -from the redox point of view II Crit. Care. - 2011. - Vol.15, N.5. - P.230-241.). Однако гемодинамические эффекты ингибиторов NOS на моделях различных состояний и в клинических наблюдениях нередко носят противоречивый характер (Gamboa А., Shibao С, Diedrich A. et al. Contribution of endothelial nitric oxide to blood pressure in humans II Hypertension. - 2007. - Vol.49, N.l. - P. 170-177; Wecht, J.M., Weir J.P., Goldstein D.S., et al. Direct and reflexive effects of nitric oxide synthase inhibition on blood pressure II Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2008. - Vol.294, N.l. - P.H190-H197; Juffermans N.P., Vervloet M.G, Daemen-Gubbels C.R. A dose-finding study of methylene blue to inhibit nitric oxide actions in the hemodynamics of human septic shock II Nitric

Oxide. - 2010. - Vol.22, N.4. - P.275-280.). Это свидетельствует о необходимости детального изучения вазоактивных свойств ингибиторов NOS, поскольку неоднозначная трактовка и недооценка эффектов препятствуют внедрению таких средств в клиническую практику (Bailev A., Pope T.W., Moore S.A. et al The tragedy of TRIUMPH for nitric oxide synthesis inhibition in cardiogenic shock: where do we go from here? II Am. J. Cardiovasc. Drags. - 2007. - Vol.7, N.5. - P.337-345; Viteceek J., Lojek A., Valacchi G. et al. J. Arginin-based inhibitors of nitric oxide synthase: therapeutic potential and challenges II Mediators Inflamm. - 2012. - Vol.2012. - Art.ID: 318087.).

Менее изученной остаётся противолучевая активность ингибиторов NOS, хотя их способность к радиозащитному действию была показана более 20 лет назад (Liebmann J., DeLica A.M., Ciffin D. et al. In vivo radiation protection by nitric oxide modulation II Cancer Res. - 1994. - Vol.54, N. 13. - P.3365-3368.). Рост клинической потребности в эффективных противолучевых средствах в настоящее время обусловлен неуклонным расширением применения методов радиационной медицины в лечении онкологических заболеваний (Цыб А.Ф., Будагов Р.С, Замулаева И.А. и др Радиация и патология: учебное пособие / под общ. ред. А.Ф. Цыба. - М.: Высшая школа, 2005. -341 с; Иванов В.К., Цыб А.Ф., Метлер Ф.А. Радиационные риски медицинского облучения // Радиация и риск. - 2011. - Т.20, №.2. - С. 17-29; Prasanna P.G., Stone Н.В., Wong R.S. et al. Normal tissue protection for improving radiotherapy: Where are the Gaps? II Transl. Cancer Res. - 2012. - Vol.1, N.l. - P.35-48; Maier P., Wenz F., Herskind С Radioprotection of normal tissue cells II Strahlenther. Oncol. - 2014. - Vol.190, N.8. -P.745-752.). На сегодняшний день известно значительное число различных соединений, обладающих противолучевым действием (Владимиров В.Г., Красильников И.И., Арапов О.В.. Радиопротекторы: Структура и функция / Киев: Наукова думка, 1989. - 258 с; Hosseinimehr S.J. Foundation review: Trends in the development of radioprotective agents II Drags Discov. Today. - 2007. - Vol.12, N. 19/20. -P.794-805; Васин M.B. Противолучевые лекарственные средства (учебная монография) / М.: Изд-во Российской медицинской академии последипломного образования, 2010. - 180 с; Ильин Л.А., Ушаков И.Б., Васин М.В. Противолучевые средства в системе радиационной защиты персонала и населения при радиационных авариях // Мед. радиол, радиац. безоп. - 2012. - Т.57, №.3. - С.26-31.). Однако, плохая переносимость и токсичность этих радиопротекторов в эффективных дозах затрудняют их применение в онкологической практике - по существу, единственным допущенным к клиническому применению для профилактики осложнений радио- и химиотерапии является, разработанный в США, аминотиоловый радиопротектор амифостин (Kouvaris J.R., Kouloulias V.E., Vlahos L.J. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector II Oncologist. - 2007. - Vol.12, N.6. - P.738-747; Hensley M.L., Hagerty K.L., Kewalramani T. et al. American Society of Clinical Oncology 2008 clinical practice guideline update: use of chemotherapy and radiation therapy protectants II J. Clin. Oncol. - 2009. - Vol.27, N.l. - P. 127-145.). В этой связи изучение механизмов противолучевого действия ингибиторов NOS и их особенностей фармакодинамического взаимодействия с радиопротекторами различных классов может явиться основой для разработки эффективных, приемлемых для лучевой терапии радиомодифицирующих средств (Bourgier С, Levy A., Vozenin М.С. et al Pharmacological strategies to spare normal tissues from radiation damage: useless or overlooked therapeutics? II Cancer Metastasis Rev. - 2012. - Vol.31, N3-4. - P.699-712; Рождественский Л.М. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых средств // Радиац. биол. Радиоэкол. - 2013. - Т.53, №.5. - С.513-520; Fahl W.E. Effect

б

of topical vasoconstrictor exposure upon tumorocidal radiotherapy II Int. J. Cencer. - 2014. - Vol.135, N.4.-P.981-989.).

He меньший интерес представляет также изучение антиангиогенного и противоопухолевого действия ингибиторов NOS. Клинический опыт применения ангиостатиков свидетельствует, что такие средства подавляют рост и метастазирование новообразований, повышают эффективность радио- и химиотерапии (Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer II Nat. Clin. Pract. Oncol. - 2007. - Vol.4, N.5. - P.316-321; Schmidt В., Lee H.J., Ryeom S. Combining Bevacizumab with radiation or chemoradiation for solid tumors: A review of the scientific rationale, and clinical trials II Curr. Angiogenes. 2012. - Vol.1, N.3. - P. 169-179; Корчагина A.A., Шеин О.И., Турина В.П., Чехонин В.П. Роль рецепторов VEGFR в неопластическом ангиогенезе и перспективы терапии опухолей мозга // Вестник РАМН. - 2013. - № 11. - С. 104-114.). В то же время, в клинической практике и в экспериментальных исследованиях влияние VEGF-специфических и мультикиназных ингибиторов, как правило, прогрессивно ослабевает вследствие развития резистентности опухоли к таргетным препаратам через активацию альтернативных ангиогенных путей и усиление промиграционного фенотипа некоторых неоплазий (Maity A., Bernhard E.J. Modulating tumor vasculature through signaling inhibition to improve cytotoxic therapy II Cancer Res. - 2010. - Vol.70, N 6. - P.2141-2145; Plate K.H., Scholz A., Dumont D.J. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy in malignant gliomas revisited II Acta Neuropathol. - 2012. - Vol. 124, N.6. - P.763-775.).

Вместе с тем, данные о механизмах регуляции ангиогенеза позволяют рассматривать стойкое повышение синтеза NO в эндотелиоцитах и последующие NO-зависимые процессы как общие звенья в путях действия основных факторов опухолевого ангиогенеза (Isenberg J.S., Martin-Manso G., Maxhimer J.B. et al. Regulation of nitric oxide signaling by thrombospondin-1: implications for anti-angiogenic therapies II Nat. Rev. Cancer. - 2009. - Vol.9, N.3. - P. 182-194; Miller T.W., Isenberg J.S., Roberts D.D. Molecular regulation of tumor angiogenesis and perfusion via redox signaling II Chem. Rev. - 2009. - Vol.109, N.7. - P.3099-3124; Cheng H., Wang L., Mollica M. Nitric oxide in cancer metastasis II Cancer Lett. - 2014. - Vol.352, N.l. - P. 1-7.) и неспецифическое антиваскулогенное влияние на опухоль можно ожидать при подавлении синтеза оксида азота. В этой связи химические ингибиторы NOS могут стать эффективными адъювантами, способными расширить возможности существующих методов лечения злокачественных новообразований.

Сложности разработки лекарственных средств с NOS-ингибирующим действием и множественность нерешённых вопросов их фармакологии определили комплексный характер данной работы, которая предусматривала сочетание аналитических и экспериментальных исследований по поиску конкурентных ингибиторов NOS с изучением зависимости биохимической активности веществ от их химического строения и изучением особенностей их фармакологических свойств.

Цель исследования: поиск в ряду линейных и циклических N,S-замещённых производных изотиомочевины эффективных конкурентных ингибиторов синтаз оксида азота, изучение особенностей их NOS-ингибирующей активности и ряда фармакологических свойств - вазопрессорного, радиомодифицирущего и противоопухолевого эффектов.

Задачи исследования:

1. Провести анализ особенностей химического строения производных ИТМ, определяющих их NOS-ингибирующие свойства. Осуществить направленный синтез ряда новых, оригинальных N,S-замещённых изотиомочевин, потенциально способных к конкурентному ингибированию NOS.

2. Изучить in vitro способности полученных соединений к подавлению каталитической активности изоформ NOS, оценить селективность и обратимость ингибирования. Оценить показатели острой токсичности, дозовые и временные параметры NOS-ингибирующего действия in vivo. Выделить наиболее перспективные соединения для фармакологических исследований.

3. Изучить влияние отобранных соединений на гемодинамику интактных животных. Оценить их вазопрессорную активность на экспериментальных моделях различных гипотонических состояний.

4. Провести анализ взаимосвязи радиозащитной и NOS-ингибирующей активности производных ИТМ. Получить экспериментальные оценки показателей противолучевой активности изучаемых соединений по выживаемости подопытных животных и клоногенных гемопоэтических клеток при воздействии у-излучения. Изучить эффективность комбинированного действия производных ИТМ с известными радиопротекторами. Оценить их радиомодифицирующие способности на моделях лучевой терапии опухолей.

5. Изучить влияние отобранных соединений на рост и метастазирование карциномы лёгких Льюис и механизмы их противоопухолевого и антиметастатического действия. Оценить их противоопухолевую эффективность в комбинации с ангиостатическими препаратами, радио- и химиотерапией.

Научная новизна. Экспериментальным путём выявлены особенности молекулярной структуры N,S-замещённых ИТМ, определяющих их способность к конкурентному ингибированию NO-синтаз. Установлено влияние N-замещающего радикала на селективность таких соединений к изоформам NOS. Впервые показано, что N-замещающие изобутаноил, циклобутанкарбонил и пиклогексанкарбонил повышают селективность N,S-замещённых ИТМ к ингибированию eNOS и iNOS, что позволяет рассматривать эти соединения как перспективную основу для создания NOS-ингибирующих фармакологических средств, действие которых затрагивает, в первую очередь, сосудистый гомеостаз.

Впервые показано, что изучаемые N,S-замещённые ИТМ, обладающие высокой NOS-ингибирующей активностью, в низких нетоксических дозах вызывают выраженное повышение сосудистого тонуса, которое сопровождается длительным гипертензивным эффектом при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессорных лекарственных средств.

Впервые исследована взаимосвязь NOS-ингибирующей и противолучевой
активности S- и N,S-замещённых ИТМ. Установлено, что основным механизмом их
противолучевого действия является индукция гипоксии. Экспериментально показано,
что активные ингибиторы NOS из класса N,S-замещённых ИТМ способны оказывать
эффективное противолучевое действие в менее токсических дозах, чем
аминотиоловые радиопротекторы. Впервые выявлено выраженное

фармакодинамическое взаимодействие ингибиторов NOS с существующими противолучевыми средствами различных классов. Показана способность

исследованных N,S-замещённых ИТМ значительно повышать противолучевую эффективность существующих серотонин- и адренергических радиопротекторов.

Впервые экспериментально показано, что гипоксический механизм противолучевого действия исследованных N,S-замещённых ИТМ способен обеспечивать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей.

Подтверждены данные о способности ингибиторов NOS проявлять антиангиогенное и противоопухолевое действие. Впервые установлено, что изученные N,S-замещённые ИТМ тормозят рост и подавляют метастазирование экспериментальных неоплазий, вызывая нарушение опухолевой васкуляризации, подавляя пролиферацию опухолевых клеток и усиливая их апоптотическую и некротическую гибель. Впервые показана способность этих соединений существенно повышать противоопухолевую эффективность радио- и химиотерапии опухолей.

Методы синтеза исследованных 1Ч-ацил-8-алкил-замещённых ИТМ и данные об их биохимических свойствах, вазапрессорной, противолучевой и противоопухолевой активности являются приоритетными и стали предметом 4 патентов Российской Федерации и одобренной заявки на изобретение.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные особенности молекулярной структуры оригинальных N,S-замещённых ИТМ, определяющие их способность к ингибированию NOS, установленная зависимость селективности изученных соединений к изоформам NOS от характера N-замещающего ацильного радикала создают основу для поиска и дизайна конкурентных ингибиторов NOS в ряду линейных и гетеро- циклических соединений, содержащих тиоамидиновыи фрагмент - производных ИТМ, тиазола, тиазолина, тиазина.

Проведённые исследования выявили способность ингибиторов NOS из класса N,S-замещённых ИТМ оказывать в нетоксических дозах выраженное сосудосуживающее действие при различных гипотониях, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессоров. Полученные результаты свидетельствуют, что конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут создать новые возможности в фармакотерапии гипотонических расстройств, при оказании экстренной и неотложной помощи, и в лечении критических состояний, а также позволяют рекомендовать соединение Т-1059 для дальнейшей разработки в качестве вазопрессорного и противошокового средства.

Результаты исследований показали, что конкурентные ингибиторы NOS из класса N,S-замещённых ИТМ обладают свойствами гипоксических радиопротекторов. Показатели противолучевой эффективности и радиозащитной широты этих соединений, данные о значительном повышении противолучевой эффективности при комбинированном взаимодействии с имеющимися серотонин- и адренергическими радиопротекторами, и способности к селективной защите немалигнизированных тканей свидетельствуют, что конкурентные тиоамидиновые ингибиторы NOS могут иметь важное практическое значение при разработке более безопасных противолучевых и радиомодифицирующих средств. Полученные результаты позволяют рекомендовать соединение Т-1023 для дальнейшей разработки в качестве радиопротектора экстренного действия и средства профилактики осложнений лучевой терапии.

Установлено, что изучаемые производные ИТМ при субхроническом применении подавляют рост и метастазирование злокачественных опухолей, оказывая антиангиогенное и проапоптотическое действие. Полученные данные о способности

этих соединений повышать эффективность радио- и химиотерапии позволяют рассматривать их как перспективную основу для разработки новых средств адъювантной терапии злокачественных новообразований.

Результаты проведённых исследований вошли в 5 патентов РФ на изобретение.

Методология и методы диссертационного исследования. Исследование носило комплексный характер, предполагающий сочетание экспериментальных исследований по поиску и дизайну эффективных ингибиторов NOS с изучением зависимости биохимической активности веществ от их молекулярной структуры, особенностей их биохимического действия и фармакологических свойств. При решении поставленных задач использован обширный арсенал методов исследований из различных областей - биохимии, клеточной биологии, морфологии, экспериментальной физиологии, радиобиологии, онкологии и фармакологии.

Исследования NOS-ингибирующей активности изучаемых соединений проведено in vitro - радиометрическим методом на изолированных изоформах NOS и методом проточной цитофлуориметрии на клеточных культурах; in vivo - методом ЭПР-спектрометрии и фотометрическим методом. Изучение токсических свойств соединений проведено по методу острой токсичности. Изучение вазоактивных свойств соединений проведено общепринятыми методами экспериментальной физиологии и фармакологии на интактных животных и экспериментальных моделях острого геморрагического шока, эндотоксического шока, гипотензии при ганглиоблокаде и модели рефрактерной вазоплегии при эндотоксемии. Изучение противолучевых свойств соединений проведено общепринятыми методами экспериментальной радиобиологии по выживаемости животных и выживаемости клоногенных гемопоэтических клеток. Для оценки способности изучаемых соединений к профилактике осложнений радиотерапии использована экспериментальная модель лучевой терапии саркомы М-1. Исследование противоопухолевой и антиметастической активности соединений проведено на карциноме лёгких Льюис с применением морфологических, иммуногистохимических и морфометрических методов. При анализе и обобщении полученных экспериментальных данных использованы адекватные методы статистики и прикладной математики.

Положения, выносимые на защиту

6. Соединения класса ]Ч-ацил-8-алкил-замещённых изотиомочевин обладают способностью к обратимому, конкурентному ингибированию NOS, если их S-замещающий радикал представлен низшим алкилом. Строение N-ацильных заместителей в этих соединениях оказывает существенное влияние на селективность их действия к изоформам NOS.

7. Ряд оригинальных ]Ч-ацил-8-алкил-замещённых изотиомочевин проявляют селективность к eNOS и iNOS, и в нетоксических дозах оказывают выраженную NOS-ингибирующую активность in vivo, что позволяет рассматривать данные соединения как перспективные для разработки на их основе новых фармакологических средств, влияющих, в первую очередь, на сосудистый гомеостаз.

8. Вазопрессорное действие исследованных производных ИТМ наблюдается на различных моделях гипотонических состояний, в том числе, резистентных к действию существующих вазопрессорных лекарственных средств, и отличается большой продолжительностью и отсутствием негативных эффектов, характерных для адреномиметиков.

4. Противолучевое действие алкил-замещённых изотиомочевин реализуется путём индукции циркуляторной гипоксии. Испытанные соединения обеспечивают эффективную радиационную защиту в менее токсических дозах, по сравнению с серосодержащими радиопротекторами, способны повышать противолучевую эффективность серотонин- и адренергических радиопротекторов, и проявляют селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей.

5. Исследованные ингибиторы NOS оказывают выраженное противоопухолевое и антиметастатическое действие, подавляя опухолевый ангиогенез и стимулируя апоптотическую и некротическую гибель опухолевых клеток и способны повышать эффективность радио- и химиотерапии новообразований.

6. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки на основе наиболее активных соединений лекарственных средств принципиально нового механизма действия, способных расширить возможности фармакотерапии при лечении ряда распространённых заболеваний, при оказании экстренной, неотложной помощи и терапии критических состояний.

Степень достоверности. Достоверность экспериментальных данных обеспечивалась применением адекватных, верифицированных методов исследований и экспериментальных моделей, кондиционностью химических, биологических материалов и лабораторных животных, величиной экспериментальных выборок и воспроизведением результатов в независимых экспериментах. Анализ данных и их обобщение проведены с применением методов математической статистики и прикладной математики, соответствующих характеру данных и задачам экспериментов. Все выявленные закономерности, эффекты, обобщения и выводы подтверждались сериями независимых экспериментов и результатами статистического анализа.

Использование результатов исследований. Результаты исследований фармакологической активности соединения Т-1023 составили основу для разработки программы НИР МЗ РФ (№ гос. регистрации 01201461942) по проведению расширенного доклинического изучения Т-1023 в качестве средства лечения злокачественных новообразований, которая в настоящее время выполняется в МРНЦ им. А.Ф. Цыба.

Результаты изучения фармакологической активности соединения Т-1059 составили основу для разработки программы доклинических исследований вазопрессорного средства на основе ингибиторов NOS из класса N,S-замещённых производных ИТМ. Получено положительное решение на проведение этих исследований в рамках ФЦП «Фарма-2020» (протокол № ОП-4119/19 от 09 07-2014 г).

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001); Международная научно-практическая конференция «Активные формы кислорода, оксида азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); Третий съезд военных врачей медико-профилактического профиля Вооружённых сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 2010); Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Вторая международная

конференция «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Железноводск, 2011); Всероссийская конференция «Радиохимия - наука будущего», посвященной 100-летию со дня рождения А.Н. Несмеянова (Москва, 2011); Всероссийская конференция с международным участием «Современные проблемы химической науки и образования», посвященная 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева (Чебоксары, 2012); International conference «Radiation safety challengers in the 21th century» (Yerevan, 2012); Российская научная конференция «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012); Научно-практическая конференция «Перспективные технологии медицинского обеспечения вооружённых сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2013); Third International Conference on Radioecology & Environmental Radioactivity; ICRER 2014; (Barcelona, 2014); VII съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2014).

Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального радиологического сектора Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба - филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации 04.12.2014 г. (протокол № 279).

Публикации. Результаты диссертационного исследования опубликованы в 18 научных статьях, из них 11 - в рецензируемых изданиях перечня ВАК Минобрнауки РФ, 5 патентах РФ. Результаты доложены на научных мероприятиях, тезисы 21 доклада представлены в сборниках материалов.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 239 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырёх глав результатов исследований, заключения, выводов, рекомендаций и списка литературы. Работа содержит 45 таблиц и 33 рисунка. Список литературы содержит 569 источников, из которых 135 отечественных и 434 зарубежных изданий.

Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в обосновании и выборе направлений исследований, проведении большинства экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов, их публикации в научных изданиях, докладах и обсуждении на отечественных и международных конференциях, формулировании теоретических положений, выводов и рекомендаций. В экспериментальных работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим, состоящим в участии на всех этапах - от постановки задач и реализации до обсуждения результатов в публикациях и докладах. Написание диссертации выполнено автором лично.

Участие в регуляции тонуса сосудов и других гладкомышечных клеток

Одно из первых предположений о биогеном синтезе окислов азота было высказано еще в 1916 году [Mitchell O.W., 1916], но экспериментальное подтверждение было получено значительно позже. В исследованиях 1986-1989 годов было показано, что оксид азота (N0) синтезируется в эндотелии сосудов и, распространяясь на прилегающие гладкие мышцы, вызывает их релаксацию [Furchgott R.F., 1980; Palmer R.M.J., 1987]. Тогда же окись азота привлекла внимание иммунологов, обнаруживших синтез N0 в культуре активированных макрофагов [Stuehr D.J., 1989], а также нейробиологов, это вещество было обнаружено в препаратах мозга [Garthwaite J., 1988]. В результате этих исследований был выявлен новый вид межклеточного взаимодействия, где посредником при передаче сигнала служит столь простое неорганическое соединение, какМЭ.

В 80-90 годы проблема оксида азота привлекает внимание биологов и врачей самых разных специальностей, и исследования медико-биологических аспектов N0 охватывают беспрецедентно широкую область. Экспоненциальный рост числа публикаций в этой области позволил Американской ассоциации развития науки и журналу Science назвать N0 молекулой 1992 года [Koshland D.E., 1992]. А в 1998 году три американских ученых Роберт Фурчготт, Луис Игнарро и Ферид Мурад были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины за «открытие роли оксида азота как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы».

Объем научных данных о биологической роли N0, накопленных к настоящему времени, столь велик, что пока еще не осознана даже общая картина, создаваемая ими. При этом многие авторы проблемных и общетеоретических работ считают, что N0 является одним из древних и универсальных регуляторов систем внутриклеточной и межклеточной сигнализации, в то время как другие относят оксид азота к "изнанке метаболизма", связанной с неферментативными химическими процессами [Ванин А.Ф., 1998; Murad F., 1998; Hare J.M., 2005; Roe N.D., 2012; Tang L., 2014].

В нормальных условиях оксид азота находится в газообразном состоянии. Среди других неорганических молекул с некомпенсированным спином N0 отличается стабильностью в газообразном состоянии и практически не димеризуется. Имея низкую массу (28 Да) и являясь неполярной молекулой, оксид азота растворяется в липидах и легко диффундирует через клеточные мембраны. Растворимость N0 в воде составляет 1,9 мМ/л при 25С. В водной среде N0 легко окисляется кислородом 2NO + 02 2N02 (1.1.1) и далее трансформируется согласно уравнениям [Al-Sa Doni Н., 2000]: 2N02 N204 (1.1.2) NO + N02 N203 (1.1.3) N203 + Н20 -» 2N02" + 2Н+ (1.1.4) N204 + Н20 -» N02" + N03" + 2H+ (1.1.5) Реакции (1.1.3-4) протекают существенно быстрее, чем реакция (1.1.5), поэтому в водных растворах в основном образуется N02", но высокий окислительный потенциал биологической среды смещает равновесие N027N03 в сторону нитратов - как правило, соотношение N027N03" в биологических тканях и жидкостях составляет 1:10.

Имея нечётное число электронов, N0 активно взаимодействует с различными соединениями и свободными радикалами (рисунок 1.1). Высокая реакционная способность приводит к тому, что in vivo NO существует в трёх взаимно превращающихся формах: собственно радикала N0, нитрозоний-катиона (N0) и нитроксил-аниона (N0), которые образуются в ходе окисления и восстановления N0.

К числу наиболее важных реакций NO in vivo относят его взаимодействие с кислородом, свободными радикалами, металлами переменной валентности, тиолами и амидами. Скорость реакции N0 с супероксидным анион-радикалом (-() очень высока (выше скорости реакции -02 с СОД) и ограничена только скоростью диффузии частиц:

Эта реакция продуцирует высокоактивный пероксинитрит-анион (0N00), который проявляет как токсические свойства, нитрозилируя белки и нуклеиновые кислоты, и пероксидируя липиды, так и сигнальные, нитрозилируя тирозиновые остатки [Ferdinandy Р., 2006; Yamakura F., 2006;Calcerrada P., 2011; Poyton R.O., 2009; Roe N.D., 2012].

В физиологических концентрациях NO проявляет свойства антиоксиданта, тормозящего развитие радикальных окислительных процессов, разложение перекисей и ПОЛ [Keynes R.G., 2005; Hummel S.G., 2006]. Так, NO эффективно реагирует с другими радикалами, например, с гидроксильным радикалом:

В этих условиях большое значение приобретают процессы, протекающие с участием стабильных метаболитов NO, содержание которых в биологических тканях на 2-3 порядка превышает содержание самого оксида азота (таблица 1.1). За исключением пероксинитрата, все они способны при определённых условиях выделять в свободном виде N0 или его редокс-формы. Это обстоятельство позволяет рассматривать многие продукты трансформации N0 как формы его депонирования и транспорта in vivo [Stamler J.S., 1992; Ванин А.Ф., 1998; Suryo Rahmanto Y., 2012; Smith B.C., 2012; Parent M., 2013; Omar S.A., 2014]. В ходе метаболизма NO депонируется в виде низкомолекулярных DNIC и S-нитрозотиолов, а также присутствует в значительных количествах и транспортируется кровью в составе нитрозопротеинов (нитрозоальбумин, HbNO, HbS-NO). Нитрозопротеины, S-нитрозотиолы и DNIC, имея возможность к взаимному превращению: Fe2+ + 2R4SNO+ 2R2S" ± (R2S)2Fe(NO)2 + R SSRi (1.1.15) формируют обширный пул относительно стабильных продуктов NO в биологических тканях и способствуют взаимопревращению его редокс-форм.

Наиболее стабильными нитрозотиолами являются S-нитрозопротеины - так, концентрация нитрозотиолов в плазме на 3-4 порядка превышает концентрацию свободного NO, и более 95% из них составляет нитрозилированный альбумин. Наряду с альбуминами плазмы, NO может нитрозилировать и гемоглобин, взаимодействуя с Cys с образованием S-нитрозогемоглобина (HbS-NO). HbS-NO содержится в артериальной крови в концентрации 0,3-0,4 мМ и практически отсутствует в венозной. Высвобождение 02 из оксигенированного HbS-NO сопровождается разрывом нитрозильной связи и выделение свободного NO. В результате HbS-NO вызывает расширение сосудов и усиливает периферический кровоток, в отличие от НЬ02, который имеет вазопрессорное действие вследствие конвертации NO в нитрат [Stamler J.S., 1997]. NO может взаимодействовать не только с SH-группами НЬ, но и с гемом, образуя нитрозильные комплексы (HbNO). Образование HbNO существенно не измененяет структуру белка и не нарушает его кислородтранспортную функцию [Yonetani Т., 1998]. В физиологических условиях 40% NO, связанного с НЬ, находится в составе HbNO, а остальная - в составе HbS-NO [Gow A.J., 1998]. Содержание HbNO может повышаться при ишемии, гипертермии, активных иммуных и воспалительных реакциях.

Взаимодействие NO с тиолами и гемопротеинами необходимо рассматривать не только как реакции, ведущие к его депонированию, но и как реакции, реализующие биохимические и физиологические эффекты NO путем модификации активности ферментов, если тиолы и гем входят в состав их активного центра или регуляторных доменов [Bellamy Т.С., 2002; Осипов А.Н., 2007: Garthwaite J., 2010; Taylor СТ., 2010; Forstermann U., 2012; Derbyshire E.R., 2012]. Тем не менее, можно утверждать, что в ходе метаболизма N0 депонируется в клетках в виде низкомолекулярных DNIC и S-нитрозотиолов, а также присутствует в значительных количествах и транспортируется в составе нитрозопротеинов. Эта биотрансформация позволяет постоянно присутствовать N0 и его метаболитам в различных внутриклеточных структурах, межклеточной и тканевой среде, и непрерывно циркулировать в кровотоке, что придаёт оксиду азота черты не только внутри- и межклеточного, но и гуморального фактора [Ванин А.Ф., 1998; Реутов В.П., 1998; Murad F., 1998; Suryo Rahmanto Y., 2012; Smith B.C., 2012; Parent M., 2013; Omar S.A., 2014].

Существуют два основных механизма образования NO in vivo: ферментативный и неферментативный. Под неферментативным путём понимают восстановление нитритов и нитратов до N0. Эта реакция протекает либо как диспропорционирование нитрита или азотистой кислоты при закислении среды, либо как прямое восстановление нитрита.

Химическое строение и физико-химические свойства изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ

Методы синтеза использованных в исследованиях оригинальных линейных и циклических ]Ч-апил-8-алкил-замещённых производных ИТМ разработаны в лаборатории радиационной фармакологии Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф.Цыба - филиала федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А.Герцена» Министерства Здравоохранения Российской и защищены патентами РФ на изобретения RU2338538 от 20.11.2008; RU2353614 от 27.04.2009, RU2475479 от 20.02.2013 и заявкой на изобретение №082603 от 29.11.2013. Наработка этих соединений в количествах, необходимых для экспериментальных исследований, также была проведена в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ.

Методы синтеза использованных в работе 8-[2-алкил(арил)сульфонил]-монозамещённых производных 8-этил(винил)-ИТМ разработаны в ФГБУ науки «Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН» (а.с. №83085 от 1.11.1974, №90803 от 6.10.1975 и №97821 от 2.8.1976). Наработка соединений этого класса для исследований была проведена в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба.

Структуру всех исследуемых соединений идентифицировали и подтверждали методами физико-химического и химического анализа. Контроль чистоты соединений осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol UV-254 (Чешская Республика) в системах аммиак-хлороформ-изопропанол и бутанол-ацетон-муравьиная кислота. Спектры ЯМР Н получены в DMSO-d6 и D20 на спектрометре DRX-500 (Bruker, Германия) при частоте 500 МГц с использованием тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта. Масс-спектры регистрировали на квадрупольном массспектрометре LCMS-2010A (Shimadzu, Япония) с ионизацией в электроспрее. Температуры плавления определяли с помощью дифференциально-сканирующего колориметра DSC-822E (Mettler Toledo, Швейцария) в интервале температур 50-300С при скорости нагрева 10С/мин навесок массой 3-5 мг.

При проведении экспериментальных исследований все изучаемые соединения применялись в виде асептических водных растворов, приготовленных ex tempore. Исключение составляли соединение Т-1049, для приготовления раствора которого использовали Tween-80 (Sigma-Aldrich, кат.№ Р8074) в соотношении 1:10, и индралин, который растворяли в 1% растворе винной кислоты.

Препараты сравнения - радиопротекторы amifostine 8-[2-[(3-аминопропил) амино]этил]дигидрофосфотиоат (амифостин, Medlmmun Pharma BV, Нидерланды), дифетур (НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА, Россия), цистамина дигидрохлорид «Сигма-Алдрич» (Москва), серотонина адипинат «Сигма-Алдрич» (Москва), мексамин «Сигма-Алдрич» (Москва), индралин (Б-190) (НПЦ «Фармзащита» ФГУП ФМБА, Россия), аі-адреномиметик фенилэфрин (мезатон, ICN Полифарм, Россия), цитостатик пиклофосфамид (циклофосфан, ООО «Компания Деко», Россия) и ингибитор VEGF бевацизумаб (авастин, Roche Diagnostics GmbH, Германия) использовались в исследованиях в готовых лекарственных формах.

На первом этапе исследования изучаемых соединений для выбора доз и концентраций при тестировании биологической активности проводили оценку их острой токсичности при однократном внутрибрюшинном введении на 416 самцах белых аутбредных мышей SHK в возрасте 4-5 месяцев с массой тела 27-30 г [Хабриев Р.У., 2005; Курляндский Б.А., 2002]. Условия получения и содержания животных описаны в разделе 2.1. Объём вводимых растворов соединений составлял 0,1-0,5 мл. Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 15 суток после введения соединений. Регулярно фиксировали общее состояние, особенности поведения и двигательной активности, регистрировали сроки развития интоксикации и гибели животных. Показатели острой токсичности ЛД10, ЛД16, ЛД5о±т и ЛД84 определяли с использованием метода пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону [Litchfield J.Т., Wilcoxon F., 1949; Беленький М.Л., 1963]. Исследование влияния соединений на активность NOS и уровень NO

Изучение NOS-ингибирующей активности in vitro радиометрическим методом использовали в качестве скринингового теста для количественной оценки NOS-ингибирующей активности исследуемых соединений и селективности их действия к изоформам NO-синтаз. Исследования проведены на изолированных рекомбинантных изоформах NOS человека (Enzo Life Sciences Inc., США) с применением набора реагентов и протокола измерений NOS Activity Assay Kit (Cayman Chemical, США). При этом изучалось влияние различных концентраций исследуемых соединений на каталитическую активность изоформ NOS. Активность ферментов оценивали по скорости накопления [ Н]-Ь-цитруллина, образующегося в реакции окисления [ H]-L-аргинина, катализируемой NOS [van Eijk Н.М., 2007].

Для этого в центрифужные пробирки помещали по 43 мкл реакционной среды, содержащей 5 мМ Tris-HCl (рН 7,4); 10 мкМ ВН4; 5 мкМ FAD; 5 мкМ FMN; 1 мМ NADPH; 1 мМ 3H-L-Apr (0,1 мКи/мл); 50 нМ СаМ; 0,5 мМ СаС12. В подопытные пробирки добавляли 5 мкл фосфатно-солевого буфера (рН 7,4), содержащего исследуемый ингибитор в конечных концентрациях от 10" до 10 мкМ (по пять повторностей на каждую концентрацию), в контрольные - 5 мкл фосфатного буфера. Далее во все пробирки вносили по 2 мкл «стандартных» растворов рекомбинантных изоформ NOS. Инкубировали реакционную смесь в течение 60 минут при 37С. Реакцию останавливали, добавляя по 400 мкл охлаждённого буфера, содержащего 50 мМ HEPES (рН 5,5) и 5 мМ EDTA. Далее в каждый образец вносили по 100 мкл суспензии ионнообменной смолы Dowex AG50WX8 и центрифугировали 3 минуты при 20000 g. После чего по 100 мкл супернатанта переносили во флаконы, содержащие 5 мл спинтиляционной жидкости и проводили радиометрические измерения на спинтиляционном счётчике Beckman LS 6000 (Beckman Coulter, США). В каждом опыте, наряду с подопытными пробами, ставились пробы негативного контроля, в которые не вносили изоформы NOS, и в которых образование [ Н]-Ь-цитруллина не происходило. Результаты измерений каждого опыта корректировали по показателям радиоактивности негативного контроля.

Для количественной оценки ингибирующей активности изучаемых соединений по отношению к изоформам NOS использовали показатели IC50 - концентрации соединений, подавляющие активность ферментов на 50% (при постоянной для всех измерений концентрации L-аргинина). Рассчёт 1С5о проводили на основе результатов радиометрических измерений. О степени и характере селективности ингибирующего действия исследуемых соединений судили по отношениям значений IC50 для различных изоформМЖ

Оценка активности синтеза NO в клеточных культурах методом цитофлуориметрии использована в работе для исследования обратимости NOS-ингибирующего действия изучаемых соединений. В опытах применяли зонд DAF-2DA (4,5-диаминофлуоресцеин-2-диацетат) (Sigma-Aldrich, США), образующий при взаимодействии с N0 флуоресцирующий продукт DAF-2T (4,5-диаминофлуоресцеин-2-триазол), интенсивность флуоресценции которого коррелирует с внутриклеточным содержанием N0 в широком диапазоне концентраций.

В опытах использовали культуры клеток меланомы В16 и клеток HeLa, различающиеся по спектру экспрессируемых изоформ NOS. Клетки снимали с подложки, подсчитывали их концентрацию в камере Горяева и вносили в цетрифужные пробирки по 10 клеток. Клетки центрифугировали 5 мин при 200 g, к осадку добавляли 0,5 мл среды DMEM (Пан-Эко, Россия) без сыворотки. Далее в подопытные пробирки в 5 повторах вносили исследуемые соединения в конечных концентрациях от 0,02 до 0,4 мг/мл, а в контрольные пробирки - равный объём DMEM. В качестве препарата сравнения использовали известный гуанидиновый ингибитор NOS L-NMMA (Cayman Chemical, США), который вносили в таких же концентрациях. Все препараты инкубировали 2 часа при 37С и периодическом перемешивании. Затем клетки осаждали центрифугированием, отмывали в PBS (Sigma-Aldrich, США), добавляли раствор DAF-2DA в PBS и инкубировали ещё 1 час. После чего клетки ресуспендировали, фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 40 мкм. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BDIS, США) совместно с сотрудниками отдела радиационной биохимии МРНЦ им. А.Ф. Цыба. Содержание NO оценивали по флуоресценции DAF-2T на длине волны 525±30 нм (возбуждали при 488 нм). В каждой пробе анализировали не менее 200 тысяч клеток. На основе полученных данных при помощи программы CellQuestPro (BDIS, США) расчитывали средние показатели флуоресценции DAF-2T, по которым судили о внутриклеточном содержании NO в клетках исследованных образцов.

Изучение действия производных ИТМ на гемодинамику крыс на модели острого эндотоксемического шока

Таким образом, гипертензивный эффект соединения Т-1023, однократно, в\б 10 мг/кг; 1/25 ЛДіб существенно превосходил таковой, зарегистрированный для фенилэфрина (однократно 0,5 мг/кг в/б) - в 1,5-2 раза по степени подъёма АД, и в 5-6 раз - по продолжительности прессорного действия. При этом выраженное и длительное ослабление тяжести гипотонии под влиянием Т-1023 в данном исследовании качественно изменило течение ранней стадии геморрагического шока - из 9 крыс подопытной группы, получавших Т-1023, несмотря на массивную кровопотерю (50% объёма циркулирующей крови), в течение 120 минут наблюдения не погибло ни одно животное.

Сходное с Т-1023 влияние на гемодинамику животных, находящихся в состоянии тяжёлого геморрагического шока оказывали и соединения Т-1020 и Т-1049 (таблицы 4.6, 4.7). При однократном внутрибрюшинном введении этих соединений в дозе 10 мг/кг (1/30 и 1/40 ЛД16, соответственно) также развивался выраженный, длительный гипертензивный эффект. Начальный подъём АД под влиянием Т-1020 и Т-1049 развивался несколько быстрее, чем при воздействии Т-1023 - достоверное повышение АД отмечено уже на 2-й минуте, а максимальное развитие гипертензивного эффекта наблюдалось к 10-20 минуте после введения этих соединений. В этот период АДд достигало 90-100%, а АДС - 80-90% от уровня показателей до кровопотери. Вазопрессорное действие этих соединений начинало ослабевать с 100-й минуты от момента окончания их введения. Статистически значимый гипертензивный эффект сохранялся около 100-110 минут - со 2 по 110 минуту, а достоверно повышенное АДд сохранялось до конца эксперимента. У подопытных животных, получавших Т-1020 и Т-1049, также отсутствовала компенсаторная тахикардия на поздних сроках наблюдения.

Как и в случае Т-1023, длительное и существенное ослабление гипотонии под влиянием соединений Т-1020 и Т-1049 однократно, в/б в дозе 10 мг/кг в течение всего периода наблюдения статистически значимо ограничивало краткосрочную летальность, вызванную острым геморрагическим шоком - из 8 особей каждой подопытной группы, несмотря на клиническую тяжесть использованной модели, в течение 2 часов не погибло ни одного животного.

В ряду исследованных соединений наиболее выраженное и продолжительное вазопрессорное действие оказывало соединение Т-1059 (таблица 4.8). При однократном внутрибрюшинном введении этого соединения в дозе 10 мг/кг (1/25 ЛДі6; 1/38 ЛД5о) животным, находящимся в состоянии острого тяжёлого геморрагического шока развивался сильный и стойкий гипертензивный эффект. С 20 минуты после инъекции Т-1059 и до конца срока наблюдения показатели АД подопытных животных, потерявших половину объёма циркулирующей крови, стабильно сохранялись на уровне 90-100% от уровня АД до кровопотери. Прессорное действие Т-1059 начинало ослабевать с 130-140 минуты после введения (данные не отражены в таблице). Как и в случае других исследованных производных ИТМ, длительная стабилизация гемодинамики под влиянием Т-1059 ограничивала краткосрочную летальность состояния - из 9 особей подопытной группы в течение эксперимента не погибло ни одного животного.

Как показано в разделе 4.1, изучаемые N,S-замещённые производные ИТМ обладают выраженными вазопрессорными свойствами. Результаты исследований на модели тяжёлого геморрагического шока показали: эти соединения при острой гиповолемической гипотонии вызывают значительное и длительное повышение АД. При этом гипертензивный эффект, при однократном внутрибрюшинном введении этих веществ в нетоксической дозе 10 мг/кг (1/25-1/40 ЛДі6), качественно превосходит гипертензивный эффект при таком способе введения эталонного препарата -селективного аі-адреномиметика фенилэфрина (0,5 мг/кг) - в 1,5-2 раза по степени подъёма АД, и в 5-7 раз - по длительности эффекта.

Конечно, целесообразность применения вазопрессоров при геморрагическом шоке, протекающем, по крайней мере, на начальных стадиях, при повышенном тонусе периферических сосудов [Шутеу Ю., 1981; Волков В.Е., 2009], не очевидна. Избыточная централизация кровотока в этом случае способна отягощать течение критического состояния [Ремизова М.И., 2014]. Тем не менее, в данных исследованиях при однократной инъекции нетоксических доз изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ наблюдалось достоверное снижение краткосрочной летальности тяжёлого геморрагического шока (таблица 4.9). По нашему мнению, это свидетельствует о перспективности разработки на основе этих соединений лекарственных средств для оказания помощи при гипотонических расстройствах на догоспитальном этапе лечения [Макарчук В.М., Филимонова М.В., 20106; Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., 2010; Филимонова М.В., 20146].

Для исследования влияния изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ на гемодинамику при вазодилятационных гипотонических расстройствах была использована модель острого эндотоксемического шока, индуцированного высокими дозами липополисахарида E.Coli. Как показано в разделах 1.2 и 1.3.6, инфекционно-ассоциированные патогены неспецифически стимулируют фосфорилирование eNOS и индуцируют экспрессию iNOS. В результате этого при системном воздействии патогенов, например при эндотоксемии или септическом процессе, происходит значительное и стойкое повышение продукции NO в различных тканях. Гиперпродукция NO в эндотелии при этом приводит к падению сосудистого тонуса и развитию вазодилятационных гипотонии, вплоть до тяжёлых шоковых состояний [Dudzinski D., 2007; Cauwels А., 2007; Gkisioti S., 2011].

Как показано в таблице 4.10, внутривенное введение ЛПС E.Coli в дозе 18 мг/кг сопровождалось быстрым падением АД и через 10 минут у подопытных животных развивался острый вазодилятационный шок - показатели АД снижались до 45% от исходных значений. В отличие от геморрагического шока (см. раздел 4.2), на фоне вазодилятационного влияния эндотоксинов компенсаторного повышения тонуса сосудов у этих животных практически не наблюдалось - в течение последующих 90 минут АДд было стабильно низким и находилось в пределах 45-55% от исходного уровня. Тяжесть гипотонии у контрольных, не получавших лечения животных в дальнейшем частично компенсировалась за счёт повышения ЧСС - к концу наблюдения АДс повысилось до 60-65% от исходного уровня на фоне умеренной тахикардии.

Показатели противолучевой активности и особенности радиозащитного действия изучаемых N,S-замещённых ИТМ

Прямым подтверждением того, что действие ингибиторов NOS способно реализоваться не только на ранних стадиях опухолевого роста, явились результаты опыта, в котором соединение Т-1023 вводили с 7 суток, когда опухолевые узлы КЛЛ уже сформировались у всех животных. Как показано на рисунке 6.4, в этом случае к 4-6 суткам от начала применения Т-1023 также развивалась задержка роста карциномы примерно на 2 суток, и через 10 дней объём опухолей у животных опытной группы был достоверно ниже, чем в контроле (ИР снижался до 47-50%). Кроме того, обращало на себя внимание то, что воздействие Т-1023 на уже развившуюся карциному в данном опыте сопровождалось выраженным антиметастатическим эффектом - на 21 сутки опухолевого роста число лёгочных метастазов у опытных животных было в 5 раз ниже, чем в контроле. Причём, в этом случае Т-1023 не только эффективно ингибировало процессы метастазирования (ИИМ вырос до 79%), но статистически значимо подавляло рост метастазов - число крупных лёгочных метастазов снизилось у опытных животных почти в 3 раза.

Для оценки механизмов противоопухолевого действия изучаемых N,S-замещённых производных ИТМ было проведено сравнительное исследование влияния соединения Т-1023 и известного VEGF-ингибирующего антиангиогенного препарата бевацизумаб (авастин) на развитие КЛЛ при их раздельном и сочетанном применении. Авастин вводили животным-опухоленосителям внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг на 1, 5 и 12 сутки после перевивки опухоли. Т-1023 вводили ежедневно в дозе 60 мг/кг с 1 по 21 сутки опухолевого роста.

Результаты исследований показали, что субхроническое воздействие Т-1023 и авастина оказывают сходное влияние на развитие карциномы, проявлявшееся практически равным противоопухолевым и антиметастатически действием (рисунок 6.5). В обоих случаях развивалась начальная задержка роста опухолевого узла на 3-4 суток, в результате чего индекс торможения роста КЛЛ в опытных группах в течение всего времени наблюдения стабильно сохранялся на уровне 50-65%. Сходным был и антиметастатический эффект - число лёгочных метастазов снижалось в 2-2,5 раза в сравнении с контрольными животными. Кроме того, обращал на себя внимание тот факт, что сочетанное применение Т-1023 и авастина не изменяло противоопухолевого эффекта - сочетанное и раздельное воздействие этих соединений было практически равноэффективным.

Многочисленные данные о молекулярных механизмах дейстия различных проангиогенных факторов свидетельствуют, что важным и, во многом, общим звеном в этих процессах является перманентное повышение каталитической активности eNOS в эндотелии сосудов [Ignarro L.G., 2002; Miller T.W., 2009; Isenberg J.S., 2009; Ziche M., 2009; Burke A.J., 2013; Cheng H., 2014]. Большая часть биохимических путей, реализующих ангиогенное влияние VEGF, также предполагает активное участие оксида азота [Fulton D., 1999; Reihill J.A., 2007; Dudzinski D., 2007; Fulton D., 2008; Ramadoss J., 2013]. В этой связи наблюдаемое в этих опытах сходство и «самодостаточность» противоопухолевой активности VEGF-ингибитора бевацизумаба (авастин) и NOS-ингибитора Т-1023, на наш взгляд, свидетельствует в пользу того, что эти ингибиторы блокируют на различных участках один и тот же процесс - опухолевый ангиогенез.

Предположение об антиангиогенной природе противоопухолевого действия изучаемых производных ИТМ в значительной мере подтвердили результаты морфологических и гистологических исследований влияния авастина и соединения Т-1023 на функциональную морфологию КЛЛ, которые были проведены совместно с лабораторией радиационной патоморфологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба (зав. - канд. мед. наук В.В. Южаков) [Филимонова М.В., Южаков В.В., 2015].

В этих исследованиях использовалось три группы мышей-опухоленосителей Fi (CBAxC57BL6j) - контрольная и две опытных. Особям первой опытной группы вводили внутрибрюшинно авастин в дозе 15 мг/кг на 1, 5 и 12 сутки, второй - вводили внутрибрюшинно соединение Т-1023 в дозе 60 мг/кг ежедневно с 1 по 14 сутки. На 15 сутки от перевивки КЛЛ животных выводили из опыта и выделяли биологический материал для исследований.

Через две недели после перевивки карцинома лёгких Льюис у контрольных животных имела солидно-инфильтрующий тип строения с выраженным полиморфизмом гистологического рисунка. В проксимальной части опухолевых узлов отмечался инвазивный рост карциномы, при этом тяжи опухолевых клеток распространялись между волокнами мышц, вызывая их дистрофию, отёк и микрогеморрагии. Центральные участки опухолевых узлов были представлены оксифильными полями спонтанного некроза. На препаратах определялась зональная неоднородность распределения кровеносных сосудов в паренхиме. Относительно васкуляризированными были зоны инвазии опухолевых клеток в здоровые ткани (рисунок 6.6). Здесь опухолевые клетки диссоциированы друг от друга и образуют скопления в виде небольших агрегатов и трабекулярных тяжей. Зоны солидного строения опухолевой ткани располагались, как правило, в виде тяжей в области подкожной клетчатки и на границе с подлежащими поперечно-полосатыми мышцами. Здесь полиморфные клетки карциномы плотно упакованы. При микроскопическом исследовании в этих зонах видны многочисленные фигуры митозов и единичные опухолевые клетки, погибающие путём апоптоза (рисунок 6.7). Отдельные клетки подвергались цитолизу.

На препаратах, окрашенных антителами к PCNA, интенсивно пролиферирующие клетки располагались в периферических зонах опухолей, концентрируясь вокруг сосудов (рисунок 6.8). В зонах инвазивного роста карциномы отмечались расширенные сосуды, выстланные уплощёнными эндотелиальными клетками, ядра которых также давали PCNA-положительную окраску (рисунок 6.9), что свидетельствовало об активных процессах опухолевого ангиогенеза. На препаратах, окрашенных антителами к CD31, определялась неоднородность распределения кровеносных сосудов. Наиболее плотная сосудистая сеть выявлялась в перитуморальных областях, прилегающих к подкожной клетчатке (рисунок 6.10). От расширенных венул, располагающихся в соединительной ткани, ответвлялись короткие капиллярные петли, врастающие в паренхиму опухоли и в здоровую ткань.